बँटवारा के दौरान कार्यात्मक कोशिका चक्र प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए Mitotic सेल तुल्यकालन और उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोप के संयोजन

Biology

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Summary

हम उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विश्लेषण के बाद हेला कोशिकाओं के दोहरे thymidine तुल्यकालन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । इस विधि से बड़ी संख्या में कोशिकाओं है कि एस चरण से बाहर का बँटवारा करने के लिए आगे बढ़ना है, बहुआयामी प्रोटीन जो भी चरण कार्यों के अधिकारी mitotic भूमिकाओं पर अध्ययन को सक्षम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Amin, M. A., Varma, D. Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis. J. Vis. Exp. (130), e56513, doi:10.3791/56513 (2017).

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Abstract

चरण-निर्भर तरीके से कोशिका चक्र की विभिन्न नियामकीय घटनाओं का अध्ययन कोशिका वृद्धि और विभाजन के बारे में स्पष्ट समझ प्रदान करता है । कोशिका चक्र के विशिष्ट चरणों में कोशिका की आबादी का तुल्यकालन ऐसे प्रायोगिक प्रयासों में बहुत उपयोगी पाया गया है. रसायनों के साथ उपचार के द्वारा कोशिकाओं के तुल्यकालन कि अपेक्षाकृत कम विषाक्त फलस्वरूप कोशिका चक्र की घटनाओं के अध्ययन के लिए औषधीय निरोधात्मक दवाओं के उपयोग पर लाभप्रद हो सकता है और चयनित mitotic चरणों के विशिष्ट संवर्धन प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं । यहाँ, हम सेल चक्र के विभिन्न चरणों में मानव कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, एक डबल thymidine ब्लॉक के साथ एस चरण और एम चरण में दोनों सहित और गुणसूत्र संरेखण में mitotic प्रोटीन की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए प्रक्रिया जारी और अलगाव । यह प्रोटोकॉल बहुआयामी प्रोटीन की mitotic भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए अत्यंत उपयोगी रहा है जो की स्थापना की है । हमारे मामले में, Cdt1 की mitotic भूमिका, एक प्रोटीन के G1 चरण में लाइसेंस प्रतिकृति मूल के लिए महत्वपूर्ण है, प्रभावी ढंग से अध्ययन किया जा सकता है केवल जब G2/ हम डबल thymidine तुल्यकालन का उपयोग G2/एम-विशिष्ट Cdt1 की कमी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । हम भी सेल निर्धारण के प्रोटोकॉल की व्याख्या, और लाइव सेल इमेजिंग thymidine रिहाई के बाद उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । विधि भी दोनों शारीरिक और परेशान स्थितियों जैसे Hec1, Ndc80 परिसर के एक घटक के तहत mitotic प्रोटीन के समारोह का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है, के रूप में यह एक निश्चित और जीवित सेल के लिए mitotic कोशिकाओं के बड़े नमूना आकार प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है विश्लेषण के रूप में हम यहां दिखाओ ।

Introduction

सेल चक्र में, कोशिकाओं को अपने जीनोम और प्रसार के सटीक दोहराव के लिए अत्यधिक विनियमित और अस्थाई नियंत्रित घटनाओं की एक श्रृंखला से गुजरना । स्तनधारियों में, कोशिका चक्र में चरणबद्ध और एम-फेज होते हैं । एक चरण में, जो तीन चरणों के होते है-G1, एस, और G2, सेल इसके जीनोम और बहोत वृद्धि है कि सामांय कोशिका चक्र प्रगति1,2के लिए आवश्यक है डुप्लिकेट । एम चरण में, जो बँटवारा (दौर, prometaphase, metaphase, anaphase, और telophase) और cytokinesis के होते हैं, एक माता पिता के सेल दो आनुवंशिक रूप से समान बेटी कोशिकाओं का उत्पादन. बँटवारा में, की बहन chromatids के डुप्लिकेट जीनोम गाढ़ा (चरण) कर रहे है और इकट्ठे mitotic धुरी (prometaphase) के microtubules द्वारा अपने kinetochores पर कब्जा कर रहे हैं, कि metaphase प्लेट (metaphase) पर उनके संरेखण ड्राइव उनके द्वारा पीछा बराबर अलगाव जब बहन chromatids की ओर विभाजित कर रहे है और विपरीत धुरी डंडे (anaphase) के लिए ले जाया । दो बेटी कोशिकाओं को शारीरिक रूप से एक actin आधारित सिकुड़ा अंगूठी की गतिविधि से अलग कर रहे है (telophase और cytokinesis) । kinetochore एक विशेष proteinaceous संरचना जो chromatids के centromeric क्षेत्र में इकट्ठे और धुरी microtubules के लिए लगाव साइटों के रूप में सेवा है । इसका मुख्य कार्य गुणसूत्र कब्जा, संरेखण, और अनुचित धुरी microtubule लगाव को सही करने में सहायता ड्राइव करने के लिए है, जबकि धुरी विधानसभा चौकी मध्यस्थता गुणसूत्र अलगाव3,4की निष्ठा को बनाए रखने के लिए ।

सेल तुल्यकालन की तकनीक आणविक और संरचनात्मक कोशिका चक्र प्रगति में शामिल घटनाओं को समझने के लिए एक आदर्श उपकरण के रूप में कार्य करता है । इस दृष्टिकोण के विश्लेषण के विभिंन प्रकार के लिए विशिष्ट चरणों में सेल की आबादी को समृद्ध किया गया है, जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा, सेलुलर जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का विश्लेषण, और प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने सहित । सिंक्रनाइज़ स्तनधारी कोशिकाओं न केवल व्यक्तिगत जीन उत्पादों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी जीन अभिव्यक्ति के microarray विश्लेषण सहित पूरे जीनोम के विश्लेषण को शामिल दृष्टिकोण के लिए5, miRNA अभिव्यक्ति पैटर्न6, शोधों विनियमन7, और प्रोटीन संशोधनों के proteomic विश्लेषण8. तुल्यकालन भी जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन दस्तक नीचे या नॉक आउट, या रसायनों के सेल चक्र प्रगति पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

कक्ष चक्र के विभिंन चरणों में कक्षों को सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है । दोनों भौतिक और रासायनिक विधियों व्यापक रूप से सेल सिंक्रनाइज़ेशन के लिए उपयोग किया जाता है । कक्ष सिंक्रनाइज़ेशन के लिए सबसे महत्वपूर्ण मापदंड है कि सिंक्रनाइज़ेशन noncytotoxic और प्रतिवर्ती होना चाहिए । औषधीय एजेंटों द्वारा कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के संभावित प्रतिकूल सेलुलर परिणामों के कारण, रासायनिक निर्भर तरीकों महत्वपूर्ण कोशिका चक्र की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए लाभप्रद हो सकता है । उदाहरण के लिए, hydroxyurea, amphidicolin, mimosine, और lovastatin, G1/एस चरण में सेल तुल्यकालन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन, क्योंकि वे बाधित जैव रासायनिक रास्ते पर उनके प्रभाव के, वे सेल चक्र चौकी तंत्र को सक्रिय करने और एक महत्वपूर्ण मार कोशिकाओं9,10के अंश । दूसरी ओर, thymidine वृद्धि मीडिया, "thymidine ब्लॉक" के रूप में जाना जाता है के लिए जोड़कर डीएनए प्रतिकृति की प्रतिक्रिया निषेध, कुछ अंक11,12,13पर सेल चक्र को गिरफ्तार कर सकते हैं । nocodazole और RO-३३०६9,14के साथ इलाज के द्वारा कक्ष G2/ Nocodazole, जो microtubule विधानसभा रोकता है, एक अपेक्षाकृत उच्च cytotoxicity है । इसके अलावा, nocodazole-गिरफ्तार कोशिकाओं mitotic फिसल द्वारा precociously चरण के लिए लौट सकते हैं । G1/S चरण पर डबल thymidine ब्लॉक गिरफ्तारी सेल और ब्लॉक से रिलीज के बाद, कोशिकाओं को G2 के माध्यम से तुल्यकालिक और बँटवारा में आगे बढ़ना पाया जाता है । thymidine ब्लॉक से जारी कोशिकाओं के लिए सेल चक्र के सामान्य प्रगति या तो सेल निर्धारण या लाइव इमेजिंग द्वारा उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया जा सकता है । mitotic प्रोटीन के गड़बड़ी का प्रभाव विशेष रूप से अध्ययन किया जा सकता है जब कक्ष दर्ज करें और डबल thymidine ब्लॉक से जारी करने के बाद बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ना. Cdt1, एक बहुआयामी प्रोटीन, G1 चरण में डीएनए प्रतिकृति मूल लाइसेंस में शामिल है और यह भी बँटवारा15के दौरान kinetochore microtubule संलग्नक के लिए आवश्यक है । बँटवारा के दौरान Cdt1 के समारोह का अध्ययन करने के लिए, एक एक तरीका है कि G1 चरण के दौरान प्रतिकृति लाइसेंस पर अपनी कमी के प्रभाव से बचा जाता है को अपनाने की जरूरत है, जबकि एक ही समय के दौरान विशेष रूप से अपनी कमी को प्रभावी G2/ यहाँ, हम दोनों फिक्स्ड और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा सेल चक्र के विभिन्न चरणों के दौरान कई कार्यों प्रदर्शन प्रोटीन की mitotic भूमिका का अध्ययन करने के लिए डबल thymidine ब्लॉक पर आधारित विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

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Protocol

1. डबल Thymidine ब्लॉक और रिलीज: एजेंट की तैयारी

  1. ५०० मिलीलीटर Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मध्यम 10% FBS, पेनिसिलिन, और streptomycin के साथ पूरक बनाओ ।
  2. -८० डिग्री सेल्सियस पर aliquots में बाँझ पानी और दुकान में thymidine के १०० mM स्टॉक बनाओ ।

2. Mitotic प्रगति के फिक्स्ड सेल इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल (चित्र 1a)

  1. 1 दिन पर, बीज ~ 2 x 105 हेला कोशिकाओं को कवर पर्ची के साथ एक 6-अच्छी तरह से थाली के कुओं में (७०% इथेनॉल और यूवी विकिरण के साथ निष्फल) और DMEM मध्यम के 2 मिलीलीटर । ३७ ° c और 5% CO2पर 24 घंटे के लिए एक humidified मशीन में कक्षों को बढ़ाएँ ।
  2. 1सेंट thymidine ब्लॉक: 2 दिन पर, अच्छी तरह से ताजा DMEM मीडिया (१०० mm स्टॉक, 2 मिमी अंतिम एकाग्रता) में thymidine की आवश्यक मात्रा में मिश्रण ।
  3. thymidine के 2 मिलीलीटर-6 अच्छी तरह से थाली और 18 एच के लिए मशीन के प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं को मीडिया युक्त जोड़ें ।
  4. 3 दिन, महाप्राण मध्यम और दो बार 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ और ताजा गरम DMEM के साथ कोशिकाओं को धो; ब्लॉक से कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए 9 एच के लिए ताजा गर्म DMEM माध्यम में कोशिकाओं को विकसित ।
  5. 2nd thymidine ब्लॉक: फिर से 6-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं को thymidine-युक्त मीडिया (2 मिमी अंतिम एकाग्रता) के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. एक और 18 एच के लिए मशीन ।
  7. 4 दिन, महाप्राण मध्यम और दो बार 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ और ताजा गरम DMEM के साथ कोशिकाओं को धोने ।
  8. siRNAs (नियंत्रण और Cdt1) और सीरम नि: शुल्क विकास मध्यम में अभिकर्मक रिएजेंट को पतला 10 मिनट के लिए अलग से उंहें एक साथ मिश्रण और आर टी पर 20 मिनट के लिए गर्मी । सिरना के अंतिम एकाग्रता प्रत्येक अभिकर्मक में इस्तेमाल किया १०० एनएम था । कोशिकाओं है कि Thymidine से बाहर धोया गया है के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें ।
  9. 9-10 एच के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं को अवरुद्ध करने से रिलीज और कवर पर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ फिसल जाता है ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है, उपयुक्त संरक्षण पहनते हैं ।
  10. Immunostain कोशिकाओं, ०.५% (वी/वी के साथ permeabilizing के बाद) आरटी में 10 मिनट के लिए डिटर्जेंट और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं धुलाई ।
    1. 1% BSA के साथ ब्लॉक सेल (डब्ल्यू/v) 1x पंजाब में 1 ज के लिए आरटी में प्राथमिक एंटीबॉडी के ५० µ एल के साथ कोशिकाओं के इलाज के बाद (माउस विरोधी α-tubulin एंटीबॉडी 1 पर पतला: 1000, खरगोश विरोधी Zwint1 एंटीबॉडी 1:400 पर पतला, और माउस विरोधी phospho-ɣ 1:300 में पतला H2AX) 1% (डब्ल्यू/ 1 ज के लिए 1x पंजाब में BSA में ३७ सी ।
    2. बाहर 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद तीन बार, ५० µ एल के साथ कोशिकाओं के इलाज के लिए प्रत्येक कवर ग्लास के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (Alexa ४८८ और Rhodamine लाल में 1:250 कमजोर पड़ने पर 1% (डब्ल्यू/वी) BSA 1x में 1 ज के लिए आरटी ।
    3. 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं धोने के बाद, RT में 5 मिनट के लिए DAPI (0.1 µ g/
    4. 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद, एक स्पष्ट सूक्ष्म स्लाइड पर उपयुक्त बढ़ते मीडिया के लिए कोशिकाओं का सामना करना पड़ कवर पर्ची जगह ।
  11. छवि 60X या 100X १.४ NA योजना के साथ immunostained प्रोटीन के लिए कोशिकाओं-Apochromatic उद्योग के तेल विसर्जन उद्देश्य एक औंधा उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोप आवश्यक छवियों की गुणवत्ता के लिए आवश्यक के रूप में एक उपयुक्त कैमरा के साथ सुसज्जित पर घुड़सवार ।
  12. ०.२ µm मोटाई के z-पोट के रूप में कमरे के तापमान पर छवियां प्राप्त माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ।

3. Mitotic प्रगति के लाइव सेल इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल (चित्र 3ए)

  1. 1 दिन, बीज लगभग 0.5-1 x 105 हेला कोशिकाओं छुरा mCherry-H2B और GFP-α-tubulin व्यक्त (थोड़ा सेल प्रकार और प्रोटीन वे एक्सप्रेस के आधार पर चर) में ३५ mm ग्लास नीचे व्यंजन DMEM मध्यम के १.५ मिलीलीटर के साथ और उंहें एक humidified में वृद्धि ३७ सी और 5% सह2पर 24 घंटे के लिए मशीन ।
  2. 1सेंट thymidine ब्लॉक: 2 दिन पर, पकवान (१०० mm thymidine, 2 मिमी अंतिम एकाग्रता,) में कोशिकाओं को thymidine-युक्त मीडिया के १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. 18 एच के लिए मशीन ।
  4. 3 दिन पर, thymidine युक्त माध्यम महाप्राण और तीन बार, 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ और नए सिरे से गर्म DMEM के साथ फिर से धोने की कोशिकाओं ।
  5. siRNAs (नियंत्रण और Hec1) और अभिकर्मक रिएजेंट सीरम मुक्त विकास माध्यम के साथ अलग से 10 मिनट के लिए पतला । उंहें एक साथ मिश्रण और आर टी पर 20 मिनट के लिए गर्मी । सिरना के अंतिम एकाग्रता प्रत्येक अभिकर्मक में इस्तेमाल किया १०० एनएम था । कोशिकाओं है कि Thymidine से बाहर धोया गया है के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें ।
  6. ब्लॉक से कोशिकाओं को जारी करने के लिए 8 घंटे के लिए ताजा गरम DMEM मध्यम के १.५ मिलीलीटर में कोशिकाओं को विकसित ।
  7. 2nd thymidine ब्लॉक: डिश में कोशिकाओं के लिए thymidine-युक्त मीडिया (2 मिमी अंतिम एकाग्रता) के १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. एक और 18 एच के लिए मशीन ।
  9. 4 दिन पर, मध्यम महाप्राण और तीन बार, 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ और ताजा गरम DMEM के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । फिर ताजा गर्म Leibovitz में कोशिकाओं को विकसित (एल-15) मध्यम से 10% FBS और 20 मिमी HEPES पीएच ७.० में 8 ज के लिए ब्लॉक से कोशिकाओं को रिहा करने के साथ पूरक ।
  10. उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोप में सेट तापमान नियंत्रण कक्ष में पकवान जो पहले से ही इमेजिंग शुरू करने के लिए मंच और प्रयोगात्मक तापमान को स्थिर करने से पहले कम से कम 30 मिनट पर बंद कर दिया है प्लेस ।
  11. 60x उद्देश्य के साथ उज्ज्वल क्षेत्र में ध्यान केंद्रित जब तक कोशिकाओं को दिखाई दे रहे हैं, तो मैंयुअल रूप से पसंद के क्षेत्र में मंच पर झारना ।
  12. प्रकाश और लेजर शक्ति/एक्सपोजर, छवि अधिग्रहण मापदंडों, और पसंद के माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रयोग की अवधि निर्धारित करें । छवियों को प्राप्त करने के लिए GFP (४८८ उत्तेजना; ३८५ एनएम उत्सर्जन) और mCherry (५६१ एनएम उत्तेजना और ३८५ एनएम उत्सर्जन) के लिए फ़िल्टर का उपयोग करें ।
  13. समय-चूक प्रयोग अलग से स्पंदित प्राप्त करने के द्वारा प्रसारित प्रकाश और प्रतिदीप्ति छवियों को एक अवधि के लिए हर 10 मिनट के लिए 16 ज ।
  14. बारह १.० µm के रूप में छवियों का अधिग्रहण-9 ज डबल thymidine ब्लॉक से रिहाई के बाद जेड विमानों अलग माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ।
  15. विश्लेषण छवियों mitotic प्रगति के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं पर नज़र रखने और अंत में स्रोत सॉफ्टवेयर फिजी के साथ इसी फिल्म को इकट्ठा/ImageJ ।

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Representative Results

डबल thymidine ब्लॉक से रिलीज के बाद तय की कोशिकाओं में mitotic प्रगति और microtubule स्थिरता का अध्ययन
Cdt1 G1 चरण में डीएनए प्रतिकृति मूल के लाइसेंस में शामिल है । यह S चरण के दौरान नीचा है, लेकिन फिर से G2 में जमा/ बँटवारा में अपनी भूमिका का अध्ययन करने के लिए, अंतर्जात Cdt1 सबसे उपयुक्त सेल तुल्यकालन तकनीक का उपयोग कर जी/एम चरण में विशेष रूप से समाप्त करने की जरूरत है, डबल thymidine ब्लॉक15. कक्षों को 2nd thymidine ब्लॉक से रिलीज़ करने के तुरंत बाद siRNAs के साथ transfected किया गया था, जब कक्ष एस चरण में होते है और जिसके द्वारा समय के साथ ही G1 में प्रतिकृति मूल के लाइसेंसिंग, जो भी Cdt1 फ़ंक्शन की आवश्यकता होती है, को लंबा पूरा किया गया है । siCdt1 अभिकर्मक और डबल thymidine ब्लॉक रिलीज के 9 ज के बाद Cdt1 की कमी पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 1b) द्वारा मान्य किया गया था । कोशिकाओं का निर्धारण 9 ज डबल thymidine ब्लॉक से रिलीज के बाद पता चलता है कि अधिकांश कोशिकाओं नियंत्रण और Cdt1 सिरना transfected कोशिकाओं में metaphase चरण में हैं । लेकिन कोशिकाओं का निर्धारण 10 h डबल thymidine ब्लॉक से रिहाई के बाद पता चलता है कि सबसे Cdt1 सिरना-इलाज कोशिकाओं को अभी भी देर prometaphase चरण में गिरफ्तार कर रहे हैं, जबकि नियंत्रण कोशिकाओं anaphase दर्ज करें और आम तौर पर अपने गुणसूत्रों अलग उंमीद के रूप में (चित्रा 1C ). kinetochore-microtubule (kMT) स्थिरता पर Cdt1 कमी के प्रभाव को समझने के लिए, कोशिकाओं को ठंड उपचार, जो केवल स्थिर thymidine-kinetochore (microtubules) बनाए रखने के बाद डबल kMTs ब्लॉक से रिलीज के बाद 9 घंटे में तय किया गया । नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में ठंडा उपचार के बाद Cdt1-घट कोशिकाओं के kMTs अपेक्षाकृत कम मजबूत कर रहे है (चित्रा 1 डी) । इस प्रकार, इस दृष्टिकोण का उपयोग, mitotic प्रोटीन (एस) के कार्य के गड़बड़ी के बाद सामान्य mitotic कोशिकाओं की प्रगति प्रभावी ढंग से अध्ययन किया जा सकता है, यहां तक कि लाइव सेल इमेजिंग के उपयोग के बिना.

चित्र 2 दिखाता है कि डीएनए प्रतिकृति मूल के लाइसेंस परेशान नहीं है जब कक्ष Cdt1 के दौरान G2/एम चरण के दौरान हमारे प्रोटोकॉल, जो भी नियंत्रण कोशिकाओं में मनाया गया था का उपयोग कर समाप्त कर रहे हैं । g2/एम चरण के दौरान Cdt1 के समाप्त कोशिकाओं phosphorylated ɣH2AX, डीएनए क्षति के लिए एक मार्कर, बाद G2 चरण के दौरान के संचय के लिए प्रेरित नहीं किया; एसिंक्रोनस संस्कृतियों के सिरना अभिकर्मक जबकि phospho के Cdt1 प्रेरित संचय चूस-ɣH2AX-सकारात्मक घावों, संभवतः डीएनए अनुचित डीएनए प्रतिकृति लाइसेंस द्वारा प्रेरित नुकसान की वजह से ।

लाइव सेल इमेजिंग द्वारा डबल thymidine ब्लॉक से रिलीज के बाद कोशिकाओं में mitotic प्रगति का अध्ययन
परमाणु लिफाफा टूटने (नेब) के बाद, सामान्य कोशिकाओं (एक कार्यात्मक mitotic प्रोटीन द्वारा गड़बड़ी के अभाव में) बँटवारा दर्ज करें और anaphase के बारे में 30-60 मिनट (चित्र बी) के भीतर बँटवारा से बाहर निकलने की शुरुआत से गुजरना. लेकिन RNAi-मध्यस्थता पछाड़ना Hec1, एक प्रमुख kinetochore प्रोटीन है कि मजबूत kMT लगाव गठन के लिए आवश्यक है, सामांय mitotic प्रगति में देरी पाया जाता है । इस परिदृश्य में, अधिकांश कक्ष नेब के बाद बँटवारा दर्ज करते हैं, लेकिन anaphase शुरुआत या बँटवारा से बाहर निकलने के बाद भी बँटवारा में देरी के कई घंटे (चित्रा 3/ इसी प्रकार, किसी भी अन्य प्रोटीन के RNAi-मध्यस्थता पछाड़ना का प्रभाव है कि kinetochores या बँटवारा के दौरान एक समारोह होने के लिए स्थानीयकरण इस प्रकार डबल thymidine ब्लॉकों से रिलीज के बाद लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करके प्रभावी ढंग से मनाया जा सकता है । mitotic प्रगति की प्रकृति का अध्ययन करने के अलावा, देरी, और गिरफ्तारी, अंय प्रमुख mitotic घटना है कि इस विधि का उपयोग कर परख किया जा सकता है में से कुछ गुणसूत्र संरेखण, mitotic धुरी गठन शामिल है, और स्थिति सक्रियकरण और मुंह के धुरी विधानसभा चौकी ।

Figure 1
चित्र 1: mitotic प्रगति का विश्लेषण और डबल thymidine सिंक्रनाइज़ेशन के बाद निश्चित कक्षों में kinetochore microtubules की स्थिरता. (A) कक्ष सिंक्रनाइज़ेशन, निर्धारण, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का एक योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । () 2 thymidine ब्लॉक से रिहाई के 9 ज के बाद Cdt1 के पछाड़ना के लिए पश्चिमी दाग । (C) इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोग्राफ डबल thymidine ब्लॉक और नियंत्रण (ऊपर) या Cdt1 सिरना (नीचे) के साथ उपचार से जारी करने के बाद mitotic कोशिकाओं को निर्धारित 9 और 10 ज दिखाने के लिए । α-tubulin धुंधला लाल रंग में है, डीएनए GFP-citrullinated H2B एक्सप्रेस कोशिकाओं के रूप में हरे रंग में है । स्केल बार = 10 µm. Prometaphase और metaphase कोशिकाओं क्रमशः पीले और सफेद ऐरोहेड का उपयोग कर संकेत दिया जाता है । () नियंत्रण सिरना (शीर्ष पैनल) के साथ उपचार के बाद हेला कोशिकाओं और डबल thymidine ब्लॉक से रिलीज के बाद 9 एच के लिए Cdt1 कमी (नीचे पैनल) के बाद बर्फ के साथ उपचार के बाद ठंड Leibovitz के (एल-15) मध्यम और निर्धारण । कोशिकाओं प्रतिरक्षा-धुरी मीट्रिक टन (हरा) और एक kinetochore मार्कर, Zwint1 (लाल) और DAPI के लिए काले और सफेद में डीएनए के लिए दाग थे । स्केल बार = 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: G2/M चरण के दौरान Cdt1-कमी प्रतिकृति लाइसेंसिंग perturb नहीं है । एसिंक्रोनस हेला कक्ष नियंत्रण luciferase (शीर्ष पैनल) या cdt1 siRNAs (मध्य पैनल) या डबल thymidine सिंक्रनाइज़ हेला कोशिकाओं के साथ 2nd cdt1 वाश-आउट के दौरान इलाज के दौरान सिरना thymidine के साथ व्यवहार किया 10 ज पर निर्धारण के बाद रिलीज के बाद (नीचे पैनल) DAPI (छद्म रंग का हरा) और विरोधी phospho-ɣH2AX एंटीबॉडी (लाल) के साथ दाग थे । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: सिंक्रनाइज़ किए गए कक्षों में लाइव सेल इमेजिंग द्वारा mitotic प्रगति का विश्लेषण. () सेल तुल्यकालन और लाइव सेल इमेजिंग का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । हेला कोशिकाओं छुरा mCherry-citrullinated H2B और GFP-α-tubulin एक्सप्रेस 8 ज के लिए डबल thymidine ब्लॉक से जारी किए गए उंहें एस के चरण गिरफ्तारी से G2/ लाइव इमेजिंग एक उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोप thymidine ब्लॉक से कोशिकाओं को रिहा करने और उस बिंदु से 16 घंटे के लिए जारी करने के बाद 8 ज शुरू का उपयोग कर बाहर किया गया था । यहां दिखाया गया है वीडियो से अभी भी छवियों को किसी भी mitotic प्रोटीन की गड़बड़ी बिना नियंत्रण कोशिकाओं के लिए हर 10 मिनट पर कब्जा कर लिया (बी) या कोशिकाओं के लिए Ndc80 परिसर (सी) के Hec1 उपइकाई के समाप्त । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

डबल thymidine तुल्यकालन का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह एक सामंजस्य में बँटवारा में प्रवेश कोशिकाओं के कई के साथ एक कम समय विंडो में mitotic कोशिकाओं का एक बढ़ा नमूना आकार प्रदान करता है, इस प्रकार भी गुणसूत्र संरेखण के विश्लेषण को सक्षम करने, द्विध्रुवी धुरी गठन, और बहुत अधिक दक्षता के साथ गुणसूत्र अलगाव ।

कई नियामक प्रोटीन परिसरों और संकेत रास्ते बँटवारा और इस प्रक्रिया के विनियमन के माध्यम से सामान्य प्रगति सुनिश्चित करने के लिए समर्पित कर रहे हैं tumorigenesis करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हेला कोशिकाओं के लाइव सेल इमेजिंग छुरा mCherry-H2B और GFP-tubulin व्यक्त और डबल thymidine ब्लॉक से जारी पता चलता है कि अधिकांश नियंत्रण कोशिकाओं anaphase पर नेब (चित्र बी) के बाद लगभग ६० मिनट के भीतर अपने गुणसूत्रों अलग । दूसरी ओर, Hec1 फ़ंक्शन के साथ परेशान हेला कक्षों की लाइव सेल इमेजिंग से पता चलता है कि अधिकांश कोशिकाएं anaphase शुरुआत या apoptosis (आरेख 3सी) द्वारा फ़ॉलो की गई डिग्रियों वाले गुणसूत्रों के साथ लंबी अवधि के लिए mitotic चरण में रहती हैं.

अतिरिक्त thymidine एस चरण के दौरान डीएनए संश्लेषण को रोकता है, इस प्रकार G1/एस चरण11में कोशिकाओं को अवरुद्ध । हालांकि डबल thymidine ब्लॉक तुल्यकालन कोशिका चक्र और mitotic प्रगति के अध्ययन में सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है, एक इस पद्धति की सीमाओं में से कुछ के महत्वपूर्ण होने की जरूरत है । महत्वपूर्ण बात यह सुनिश्चित करने की जरूरत है कि रासायनिक बाहर धोया गया है अच्छी तरह से (के लिए 7-8 ज) इतना है कि प्रभाव पूरी तरह से प्रतिवर्ती है और कोशिकाओं को सेल चक्र के बाकी के माध्यम से सामांय रूप से आगे बढ़ना कर सकते हैं । कोशिकाओं अंयथा गलत प्रगति हालांकि बँटवारा के कारण दूसरे चक्र में प्रवेश नहीं कर सकते । सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं का अनुपात पर्याप्त रूप से एक एकल thymidine ब्लॉक के साथ उच्च नहीं हो सकता है और एक डबल thymidine ब्लॉक सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए आवश्यक हो सकता है, खासकर अगर एक बँटवारा के एक विशिष्ट चरण का अध्ययन करने में रुचि है. thymidine उपचार की अवधि पीढ़ी के समय के आधार पर कोशिका प्रकार के बीच अलग संवेदनशीलता के कारण अनुकूलित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, हंसटर कोशिकाओं की पीढ़ी के समय के 16 ज है और thymidine के साथ 11 के लिए इष्टतम तुल्यकालन17के लिए एच का इलाज किया । इस अध्ययन में, हम thymidine के साथ 16-18 एच के लिए हेला कोशिकाओं का इलाज किया । इसके अलावा, अतिरिक्त thymidine न केवल डीएनए संश्लेषण को रोकता है, लेकिन यह भी कोशिकाओं के महत्वपूर्ण भागों को मार सकता है11,12,18 और करीब ध्यान इस नुकसान की निगरानी करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए । इस अध्ययन में प्रयुक्त thymidine स्टॉक समाधान बाँझ आसुत पानी में तैयार किया जाना चाहिए और यह सिरना transfected कोशिकाओं के मीडिया को जोड़ने के बाद अपनी वर्षा से बचने के लिए सेल संस्कृति मीडिया में अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए और यह भी अपने समरूप सुनिश्चित करने के लिए कल्चरल कोशिकाओं के आसपास वितरण ।

mitotic प्रगति के दौरान एक लक्ष्य mitotic प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं को आदर्श सिरना के साथ इलाज किया जाएगा या तो 1सेंट thymidine ब्लॉक के दौरान या 1 सेंट से जारी करने के दौरान ब्याज की प्रोटीन के स्तर को पछाड़ना करने के लिए thymidine ब्लॉक, कुशल प्रोटीन प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय पर निर्भर करता है पछाड़ना19,20,21। दूसरी ओर, इस तरह के बँटवारा के दौरान Cdt1 के रूप में बहुआयामी प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, यह 2एनडी thymidine ब्लॉक से रिलीज के दौरान siCdt1 के साथ कोशिकाओं का इलाज करने के लिए आवश्यक है G2/ Cdt1 डीएनए प्रतिकृति मूल15के लाइसेंस में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है । को लाइसेंस में अपनी भूमिका के साथ हस्तक्षेप के बिना बँटवारा के दौरान इसकी विशेष भूमिका को समझने के लिए, Cdt1 को G2/एम चरण, जो कुशलता से डबल thymidine तुल्यकालन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है पर विशेष रूप से समाप्त होने की जरूरत है, इस प्रकार अंय के लिए सहारा की जरूरत से परहेज बँटवारा-विशिष्ट गड़बड़ी दृष्टिकोण जो निष्पादित करना कठिन है. अतुल्यकालिक संस्कृतियों में Cdt1 की कमी डीएनए प्रतिकृति मूल है, जो बदले में इस प्रोटीन के लिए एक संभव समारोह का बँटवारा के दौरान विश्लेषण muddled है के लाइसेंस के व्यवधान के कारण dna क्षति प्रतिक्रिया प्रेरित । इस प्रकार, डबल thymidine तुल्यकालन तकनीक एक अद्वितीय प्रयोगात्मक करने के लिए कोशिकाओं है कि एक सामांय G1 और एस चरण है, लेकिन G2 और एम चरण के दौरान Cdt1 समारोह कमी आई उत्पंन दृष्टिकोण प्रदान करता है । हमारे तुल्यकालन प्रोटोकॉल का विशेष महत्व का बँटवारा के दौरान उनके उपंयास कार्यों का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट चरण (G2/मी) में बहुआयामी प्रोटीन की अपनी बाधा में निहित है । इस प्रकार, इस विधि न केवल प्रोटीन की भूमिका है कि विभिंन कोशिका चक्र चरणों के दौरान कई कार्य किया है लेकिन यह भी गुणसूत्र संरेखण, kMT संलग्नक की प्रक्रिया में किसी भी mitotic प्रोटीन की है, और गुणसूत्र अलगाव के अध्ययन के लिए उपयोगी होगा ।

लाइव सेल इमेजिंग के लिए, डबल thymidine ब्लॉक से जारी करने के बाद, कोशिकाओं पूर्व गर्म है Leibovitz (एल-15) मध्यम इमेजिंग की शुरुआत तक 10-20% FBS के साथ पूरक में किया जाना चाहिए । कोशिकाएं कक्ष प्रकार के आधार पर thymidine ब्लॉक से जारी करने के बाद चर समय बिंदुओं पर बँटवारा दर्ज करती हैं. छवि कैप्चरिंग या निर्धारण के प्रारंभ समय को कक्ष प्रकार के आधार पर ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता होती है. लाइव सेल इमेजिंग के लिए, पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग दीर्घकालिक इमेजिंग के दौरान photobleaching के कारण हो सकता है । दूसरी ओर, उच्च संकल्प फोकल microcopy photobleaching प्रभाव की कम से हद के साथ एक स्पष्ट और उच्च संकल्प छवि देता है ।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम thymidine उपचार की अवधि, thymidine के उचित वॉशआउट, सिरना अभिकर्मक के समय, और इमेजिंग के शुरू होने के समय कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास वित्तीय हित की कोई होड़ नहीं है ।

Acknowledgements

हम Tohoku विश्वविद्यालय के डॉ॰ Kozo तनाका के आभारी हैं, हेला कोशिकाओं को छुरा बांटने के लिए जापान mCherry-citrullinated H2B और GFP-α-tubulin का इजहार कर रहे हैं । यह कार्य DV (R00CA178188) को NCI अनुदान द्वारा और पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंडों द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1x) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C
DPBS (1x) Life Technologies 14190-144 Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium Life Technologies 21083-027 Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM) Life Technologies 319-85-070 Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin Life Technologies 15070-063 (Pen Strep) 1:1,000 dilution
Dharmafect2 GE Dharmacon T-2002-02 Store at 4 °C
Thymidine MP Biomedicals LLC 103056 Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA Life Technologies Ref 10
Hec1 siRNA Life Technologies Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich Corporation F8775 Toxic, needs caution
DAPI Sigma-Aldrich Corporation D9542 Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin Santa Cruz Biotechnology Sc32293 1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1 Bethyl A300-781A 1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) Upstate Biotechnology 05-626, clone JBW301 1:300 dilution
Alexa 488 Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
Rodamine Red-X Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
BioLite 6 well multidish Thermo Fisher Scientific 130184
35 mm Glass bottom dish MatTek Corporation P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope Nikon Instruments
Spinning disc for confocal Yokagawa CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera Andor iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes Tokai Hit TIZB
NIS-elements software Nikon Instruments

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References

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