अलगाव साल्मोनेला typhimurium-मैक्रोफेज से युक्त Phagosomes का

Immunology and Infection

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Summary

हम यहां के अलगाव के लिए एक सरल और त्वरित विधि का वर्णन साल्मोनेला typhimurium-मैक्रोफेज से युक्त phagosomes द्वारा बायोटिन और streptavidin के साथ बैक्टीरिया कोटिंग ।

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Gutiérrez, S., Wolke, M., Plum, G., Robinson, N. Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (128), e56514, doi:10.3791/56514 (2017).

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Abstract

साल्मोनेला typhimurium एक facultative intracellular जीवाणु है जो मनुष्यों में आंत्रशोथ का कारण बनती है । लेमिना propria के आक्रमण के बाद एस. typhimurium बैक्टीरिया जल्दी से पता चला और मैक्रोफेज द्वारा phagocytized हैं, और phagosomes के रूप में जाना जाता बुलबुले में निहित क्रम में नीचा होना करने के लिए. एस के अलगाव typhimuriumयुक्त phagosomes व्यापक रूप से अध्ययन करने के लिए किया गया है कैसे एस । typhimurium संक्रमण phagosome परिपक्वता की प्रक्रिया जीवाणु क्षरण को रोकने के लिए बदल जाता है । प्रतिष्ठित, बैक्टीरिया युक्त phagosomes के अलगाव सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक द्वारा किया गया है । हालांकि, इस प्रक्रिया को समय लेने वाली है, और विशेष उपकरणों और निपुणता की एक निश्चित डिग्री की आवश्यकता है । यहां वर्णित है के अलगाव के लिए एक सरल और त्वरित विधि है एस. बायोटिन-streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ जीवाणुओं को कोटिंग द्वारा मैक्रोफेज से phagosomes युक्त typhimurium। Phagosomes इस विधि द्वारा प्राप्त की पसंद के किसी भी बफर में निलंबित किया जा सकता है, की अनुमति परख की एक व्यापक रेंज के लिए अलग Phagosomes के उपयोग, जैसे प्रोटीन, metabolite, और लिपिड विश्लेषण के रूप में । संक्षेप में, एस के अलगाव के लिए इस विधि . typhimuriumयुक्त phagosomes विशिष्ट है, कुशल, तेजी से, ंयूनतम उपकरण की आवश्यकता है, और अधिक सुक्रोज ढाल-ultracentrifugation द्वारा अलगाव की शास्त्रीय विधि से बहुमुखी है ।

Introduction

मैक्रोफेज विशेष phagocytic कोशिकाओं है कि पता लगाने, निगल जाना, और परिधीय ऊतकों में मौजूद किसी भी विदेशी कण नीचा, अपोप्तोटिक कोशिकाओं से लेकर ऐसे बैक्टीरिया के रूप में सूक्ष्मजीवों पर हमला करने के लिए घूम रहे हैं । सतह पर रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता रोगजनकों की सतह पर सामान्यतः मौजूद सूक्ष्मजीवों (रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न या PAMPs के रूप में जाना जाता है), मैक्रोफेज सेलुलर झिल्ली के एक जटिल पुनर्गठन शुरू आदेश को चारों ओर और phagocytize रोगज़नक़1

घिरा हुआ रोगज़नक़ तो phagosome के रूप में जाना जाता पुटिका एक intracellular में macrophage द्वारा निहित है । ऐसे endosomes और lysosomes के रूप में अंय बुलबुले के साथ फ्यूजन और विखंडन की घटनाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से, रोगज़नक़ युक्त phagosome phagosomal सामग्री के उंमूलन के लिए आवश्यक प्रोटीन का एक सेट का अधिग्रहण । इसलिए, इस प्रक्रिया के दौरान, phagosome परिपक्वता2के रूप में जाना जाता phagosome की एंजाइमी संरचना उच्च चर है ।

शीघ्र ही phagocytosis के बाद, multimeric जटिल vacuolar ATPase (वी-ATPase) phagosome झिल्ली में शामिल किया गया है के साथ फ्यूजन द्वारा के रूप में3. इस जटिल phagosome के लुमेन के लिए cytosol से प्रोटॉन पंप करने के लिए एटीपी का उपयोग4. phagosome के अंलीकरण अन्य बुलबुले के साथ फ्यूजन की घटनाओं के लिए आवश्यक है5 और पीएच-निर्भर degradative एंजाइमों की एक बड़ी संख्या के सक्रियण के लिए6. phagosome झिल्ली पर जल्दी इकट्ठे होने वाला एक अन्य multimeric एंजाइमी कॉम्प्लेक्स NADPH-oxidase (NOX) कॉम्प्लेक्स है. NOX जटिल ऑक्सीकरण NADPH के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) है कि phagosome लुमेन में स्रावित कर रहे हैं और महत्वपूर्ण है कि काफी मारे गए सूक्ष्मजीवों की हत्या करने के लिए योगदान का उत्पादन करने के लिए7.

परिपक्वता के प्रारंभिक चरणों के दौरान, phagosomes वर्तमान मार्करों आम तौर पर ऐसे Rab5 और Rab7 के रूप में जल्दी और देर endosomes के वी0 उप इकाई के साथ क्रमशः वी ATPase8। lysosomes के साथ phagosomes का फ्यूजन और देर से endosomes परिणाम phagocytized रोगज़नक़ के जोखिम में hydrolytic एंजाइमों की एक विस्तृत विविधता जैसे cathepsin के लिए, lipases, और β-galactosidase9. लुमेन के अंलीकरण भी इन एंजाइमों के सक्रियकरण के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, cathepsin डी की दरार सक्रिय लघु फार्म का उत्पादन करने के लिए पीएच-निर्भर10है । इन एंजाइमों रोगज़नक़ नीचा और रोगज़नक़ के उत्पादन-व्युत्पंन लघु पेप्टाइड्स कि macrophage मेजर histocompatibility परिसर (MHC) वर्ग द्वितीय के अणुओं टी कोशिकाओं के लिए एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं11

इसलिए, phagosome परिपक्वता सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है और प्रतिरक्षा प्रणाली के सहज और अनुकूली हथियार लिंक । यह कोई आश्चर्य की बात है कि रोगज़नक़ों रणनीतियों विकसित किया है इसके बाद के संस्करण phagosome परिपक्वता की प्रक्रिया वर्णित के माध्यम से मैक्रोफेज द्वारा उंमूलन पर काबू पाने के । उदाहरण के लिए, intracellular बैक्टीरिया माइकोबैक्टीरियम तपेदिक और Legionella pneumophila बाधित वी phagosome विधानसभा और फलस्वरूप लुमेन ATPase12,13 से अंलीकरण परिपक्वता को रोकने . लिस्टिरिया monocytogenes या शिगेला flexneri के रूप में अन्य बैक्टीरिया, phagosome झिल्ली में cytosol14,15में बचने के लिए ताकना गठन प्रेरित । दूसरी ओर, साल्मोनेला enterica serovar typhimurium (एस. typhimurium) vacuole के भीतर phagosome के गुणों को संशोधित करने के लिए इसे अपनी प्रतिकृति16के लिए एक उपयुक्त स्थान में रूपांतरित करने में सक्षम है । यह क्षमता बनाता है एस । typhimurium एक बहुत ही दिलचस्प मॉडल रोगज़नक़ phagosome परिपक्वता के मध्यस्थता हस्तक्षेप का अध्ययन करने के लिए ।

एस typhimurium एक facultative intracellular जीवाणु है जो मनुष्यों में आंत्रशोथ का कारण बनता है । लेमिना propria के आक्रमण के बाद, एस. Typhimurium बैक्टीरिया जल्दी से पता चला और मैक्रोफेज द्वारा phagocytized हैं, और phagosomes17के भीतर समाहित । कुछ रिपोर्ट्स पहले बताई गई है कि S. typhimurium-युक्त phagosomes दोनों endosomes और lysosomes18के लिए वर्तमान निर्माताओं, और अंय अध्ययनों से पाया है phagosome-lysosome फ्यूजन पर रोक लगा एस । Typhimurium संक्रमण१९.

प्रारंभ में, phagosome परिपक्वता पर एस । typhimurium संक्रमण इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई है । बैक्टीरिया युक्त phagosomes के अलगाव के लिए तकनीक का विकास endosome और lysosome मार्करों के मामले में phagosome सामग्री का एक और अधिक सटीक अध्ययन सक्षम होना चाहिए । तिथि करने के लिए, बैक्टीरिया युक्त phagosomes के अलगाव के लिए इस्तेमाल मुख्य विधि सुक्रोज कदम ढाल पर उपसेलुलर अंश है18,20. हालांकि, इस विधि phagosomes करने के लिए यांत्रिक क्षति पैदा कर सकते हैं, जो कई केंद्रापसारक चरणों की आवश्यकता है, phagosomal घटकों की स्थिरता (प्रोटीन और लिपिड) को प्रभावित कर सकते हैं, और समय लेने वाला है । इसके अलावा, यह एक ultracentrifuge के उपयोग की आवश्यकता है: विशेष उपकरणों का एक टुकड़ा है कि हर प्रयोगशाला के लिए सुलभ नहीं है ।

हाल ही में, बैक्टीरिया युक्त phagosomes के अलगाव के लिए एक नया दृष्टिकोण लागू किया गया है, जिसमें बैक्टीरियल रोगजनकों biotinylated lipopetide (Lipobiotin) के साथ लेबल और बाद में streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोती का उपयोग कर निकाले जाते हैं21 . हम बैक्टीरियल सतह अमीन-एन एच एस-बायोटिन के साथ अणुओं युक्त streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों द्वारा पीछा लेबल द्वारा एक वैकल्पिक पूरक पद्धति का प्रस्ताव । इस विधि द्वारा प्राप्त Phagosomes अत्यधिक endosome और lysosome मार्करों में समृद्ध कर रहे है और परख की एक व्यापक रेंज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रोटीन विश्लेषण से ओमिक्स विश्लेषण के लिए । इसके अतिरिक्त, यह विशेष उपकरणों जैसे ultracentrifuges की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, केंद्रापसारक कदम को नष्ट करने से, दोनों phagosomes को यांत्रिक क्षति और कार्यरत समय की राशि काफी कम कर रहे हैं । इस पद्धति को अन्य जीवाणुओं से युक्त phagosomes के अलगाव के लिए आसानी से रूपांतरित किया जा सकता है, जैसे चना-पॉजिटिव Staphylococcus स्ताफ्य्लोकोच्चुसभी इस पांडुलिपि में शामिल है. संक्षेप में, एस के अलगाव के लिए इस विधि . typhimuriumयुक्त phagosomes एक सरल, लागत प्रभावी है, और सुक्रोज ढाल-ultracentrifugation द्वारा शास्त्रीय अलगाव की तुलना में कम समय लेने, अत्यधिक समृद्ध बैक्टीरिया युक्त phagosomes प्रतिपादन ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > सभी कदम रोगजनक एस के उपयोग से जुड़े typhimurium को बीएसएल-2 या उच्चतर जैविक सुरक्षा स्तर की सुविधा में कार्यांवित किया जाना चाहिए । एस की संस् कृति और कोटिंग Typhimurium, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अस्थि मज्जा के संक्रमण-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) एक लामिना प्रवाह हुड के तहत किया जाना चाहिए दूषण को रोकने के लिए । एस का अलगाव typhimurium -युक्त phagosomes किसी भी बीएसएल-2 प्रयोगशाला पीठ पर प्रदर्शन किया जा सकता है ।

< p class = "jove_content" > मैक्रोफेज में इसके विभेदन के लिए चूहों से अस्थि मज्जा का निष्कर्षण पशु कल्याण पर संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था और प्रकृति के लिए उत्तर राइन-Westphalian राज्य एजेंसी द्वारा अनुमोदित, पर्यावरण, और उपभोक् ता संरक्षण [Landesamt f & #252; r नत्र, Umwelt and Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; फ़ाइल नहीं: 84-02.05.40.14.082 और 84-02.04.2015. A443] और कोलोन विश्वविद्यालय.

< p class = "jove_title" > 1. संवर्धन s. typhimurium

  1. लगाना s. typhimurium (SL1344 तनाव) में एक जीवाणु कॉलोनी से 5 मिलीलीटर ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) शोरबा एक जीवाणु पाश का उपयोग कर ।
  2. एक मशीन में जीवाणु निलंबन की मशीन ३७ & #176; सी रात भर के साथ मिलाते हुए ।
  3. अगले दिन पर, एक शंकु कुप्पी और ३७ & #176 पर में, एक मशीन में मिलाते हुए के रूप में एक
  4. में 19 एमएल शोरबा के जीवाणु निलंबन के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण ।
  5. मॉनिटर द एस. typhimurium ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) को मापने के द्वारा ६०० एनएम (आयुध डिपो ६०० ) एक spectrophotometer के साथ वृद्धि हुई है । माप लगभग हर 30 min.
  6. लिया जाना चाहिए
  7. जब आयुध डिपो ६०० १.० तक पहुंचता है, मशीन से बैक्टीरियल सस्पेंशन को हटाने और ५० मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण । ५,४०० पर 15 मिनट के लिए एक्स जी में बैक्टीरिया केंद्रापसारक 4 & #176; C.
  8. निकालें supernatant और बाँझ फॉस्फेट-खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर में पुनर्स्थगित.
  9. केंद्रापसारक पर ५,४०० x g के लिए 15 मिनट में 4 & #176; C.
  10. निकालें supernatant और बाँझ पंजाबियों के ४.९ मिलीलीटर में बैक्टीरिया reसस्पेंड.
< p class = "jove_title" > 2. एस typhimurium की कोटिंग के साथ एन एच-बायोटिन/Streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोती

  1. Add १०० & #181; 10 मिलीग्राम/एमएल बायोटिन जोड़ने समाधान (एन एच एस-बायोटिन भंग dimethyl sulfoxide, DMSO) हौसले से तैयार, बैक्टीरियल सस्पेंशन करने के लिए पिछले चरण में तैयार किया । उदाहरण के लिए, पतला 5 एन एच-बायोटिन की मिलीग्राम बाँझ DMSO के ०.५ मिलीलीटर में । ऊपर और नीचे कई बार pipetting करके ठीक से मिलाएं ।
  2. पांच १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में मिश्रण विभाजित ।
  3. ३५० rpm पर लगातार मिलाते के साथ एक thermoblock पर कमरे के तापमान (आरटी) में 2 घंटे के लिए मशीन ।
  4. १५,००० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब केंद्रापसारक और supernatant.
  5. त्यागें
  6. बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड, आरटी में 10 मिनट के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant.
  7. त्यागें
  8. दोहराएं २.५ कदम दो बार पूरी तरह से अतिरिक्त बायोटिन जोड़ने समाधान निकालने के लिए ।
  9. अंतिम धोने के बाद, बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  10. Transfer १०० & #181; एल के 10 मिलीग्राम/एमएल streptavidin-एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में संयुग्मित चुंबकीय मोती समाधान और यह 5 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर छोड़.
  11. एक पिपेट के साथ विलायक निकालें, चुंबकीय रैक से streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोती समाधान ले लो, और यह बायोटिन लेपित के 1 मिलीलीटर-बैक्टीरियल निलंबन चरण २.७ में तैयार के साथ reसस्पैंड ।
  12. thermoblock पर आरटी में 1 एच के लिए ३५० rpm पर लगातार मिलाते के साथ मशीन ।
  13. चुंबकीय रैक पर समाधान जगह; 5 मिनट के लिए रुको और फिर एक पिपेट बैक्टीरिया है कि दीवार पर पालन नहीं किया था के साथ निकालें (यह एक ट्यूब में रखने के रूप में लेबल & #34; गैर-लेपित जीवाणु & #34;) । चुंबक के साथ संपर्क में ट्यूब की दीवार का पालन अंश बायोटिन/streptavidin-लेपित बैक्टीरिया है ।
  14. चुंबकीय रैक से लेबल बैक्टीरिया युक्त ट्यूब को हटाने और बाँझ पंजाब के 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड.
  15. यह फिर से चुंबकीय रैक पर जगह है, 5 मिनट के लिए रुको, और एक पिपेट का उपयोग करने के लिए पंजाबियों को हटा दें ।
  16. दोहराने कदम २.१३ और २.१४ दो बार सभी बैक्टीरिया है कि streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ लेपित नहीं कर रहे है हटाने के लिए ।
  17. के बाद पिछले धो, ५०० में लेपित-बैक्टीरिया reसस्पेंड & #181; बाँझ पंजाबियों के एल और लेबल ट्यूब के रूप में & #34; लेपित जीवाणु & #34;.
  18. गणना कॉलोनी बनाने की इकाइयां (cfu) दोनों & #34; गैर लेपित जीवाणु & #34; व & #34; लेपित जीवाणु & #34; BHI आगर प्लेट्स पर धारावाहिक कमजोर पड़ने से समाधान । लगभग 2 x 10 8 cfu/एमएल के लेपित-बैक्टीरिया १.० के आयुध डिपो ६०० के साथ प्रारंभिक जीवाणु निलंबन के 20 मिलीलीटर से प्राप्त कर रहे हैं । 4 & #176 पर लेपित-बैक्टीरियल सस्पेंशन रखें, संक्रमित मैक्रोफेज के लिए निम्नलिखित दिन पर इस्तेमाल किया जाने वाला प.
< p class = "jove_title" > 3. BDMDs

  1. का संक्रमण उसी दिन जब जीवाणु बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ लेपित हैं, प्लेट पूरी तरह से विभेदित BMDMs < सुप वर्ग = "xref" > २२ ६ सेमी डिश में ५ x १० कोशिकाओं के घनत्व पर.
  2. अगले दिन पर
  3. , 5 मिनट के लिए १५,००० x g पर लेपित-बैक्टीरियल निलंबन केंद्रापसारक पर 4 & #176; C.
  4. निकालें supernatant और रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 10 x 10 6 cfu/एमएल
  5. की एकाग्रता पर पूरक
  6. संक्रमण (मुि) की बहुलता पर मैक्रोफेज को संक्रमित करने के लिए, BMDMs से मध्यम निकालें और 5 मिलीलीटर लेपित-बैक्टीरियल सस्पेंशन तैयार जोड़ें । इष्टतम मुि हर कोशिका प्रकार या अलग phagosomes के प्रयोगात्मक प्रयोजन के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।
  7. phagocytosis. सिंक्रनाइज़ करने के लिए 10 मिनट के लिए RT पर
  8. मशीन
  9. में ३७ & #176; सी में एक 5% सह 2 मशीन के लिए 30 phagocytosis आरंभ करने के लिए मिनट । अंय प्रकार के सेल विभिंन मशीन समय की आवश्यकता के लिए बैक्टीरिया की internalization सुनिश्चित कर सकते हैं ।
  10. व्यंजन से बैक्टीरिया युक्त माध्यम को दूर करें और गैर-आंतरिक जीवाणुओं को दूर करने के लिए तीन बार RPMI के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  11. अंत में 10 मिलीलीटर RPMI युक्त 10% FBS और ५० & #181; g/एमएल गेन्तमयसीं किसी भी गैर phagocytized बैक्टीरिया को मारने के लिए जोड़ें ।
  12. के संक्रमित BMDMs पर ३७ & #176; ग के साथ 5% कं 2 वांछित समय बिंदु तक । वांछित समय बिंदु प्रयोग बैक्टीरिया और कोशिका प्रकार और विश्लेषण के प्रयोजन के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए । एस में अर्ली phagosome-endosome फ्यूजन इवेंट्स के अध्ययन के लिए Typhimurium-संक्रमित BMDMs, एक 30 मिनट की मशीन की सिफारिश की है । बाद की घटनाओं के विश्लेषण के लिए, phagosomes 2 ज या 4 मशीन के एच के बाद निकाला जा सकता है । एस के साथ मैक्रोफेज की लंबे समय तक की मशीन Typhimurium से परे 24 ज मैक्रोफेज की मौत में परिणाम । phagosome निष्कर्षण से पहले विस्तारित intracellular संक्रमण शायद बायोटिन अणुओं के क्षरण के लिए नेतृत्व कर सकता है । हालांकि, हम 24 ज.
  13. तक लेपित-बैक्टीरिया पर बायोटिन की हानि का निरीक्षण नहीं किया
< p class = "jove_title" > 4. एस का अलगाव typhimurium -युक्त Phagosomes

  1. आवश्यक phagosome आइसोलेशन बफ़र की मात्रा एक (५० mm पाइप, pH .7, ५० mm MgCl 2 , 5 mm EGTA) को dithiothreitol (डीटीटी) जोड़कर तैयार करें 1 mM, Cytochalasin B की अंतिम एकाग्रता 10 & #181; M, और चिढ़ाने और फॉस्फेट अवरोधकों की एकाग्रता के रूप में निर्माता द्वारा अनुशंसित ।
    नोट: डीटीटी और Cytochalasin B हमेशा तुरंत उपयोग करने से पहले phagosome आइसोलेशन बफ़र के लिए जोड़ा जाना चाहिए । Cytochalasin बी cytoskeleton बाधा, कोशिका झिल्ली का टूटना की सुविधा ।
  2. वांछित समय बिंदु पर
  3. , संक्रमित कोशिकाओं से मध्यम निकालें और
  4. के लिए गरम बाँझ पंजाबियों के साथ धो
  5. Add ७५० & #181; phagosom के एलई अलगाव एक डिश प्रति बफर और बर्फ पर 20 मिनट की मशीन । भिन्न कक्ष संख्याओं का उपयोग करते समय, आइसोलेशन बफ़र का वॉल्यूम आनुपातिक रूप से समायोजित किया जाना चाहिए ।
  6. Add २५० & #181; L का phagosome आइसोलेशन बफ़र B (५० mm पाइप्स, pH .7, ५० mm MgCl 2 , 5 mm EGTA, २२० mm Mannitol, and ६८ mm सुक्रोज). थाली रॉक सुनिश्चित करें कि बफर पकवान की पूरी सतह तक पहुंचता है । भिन्न कक्ष संख्याओं का उपयोग करते समय, आइसोलेशन बफ़र B का वॉल्यूम आनुपातिक रूप से समायोजित किया जाना चाहिए ।
  7. धीरे एक रबर पुलिसकर्मी का उपयोग कर scraping द्वारा पकवान से कोशिकाओं को हटाने और उंहें एक पूर्व ठंडा १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  8. एक 26G सुई के माध्यम से सेल निलंबन पास एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक बार कम से कम 15 बार (एक आकांक्षा प्लस सेल निलंबन के एक इंजेक्शन के रूप में एक समय के रूप में गिना जाता है) । यह BMDMs की cytosolic सामग्री जारी करने के लिए पर्याप्त है । सुई के माध्यम से गुजरता की संख्या हर कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
  9. जगह चुंबकीय रैक पर सेल निलंबन और 5 मिनट रुको । चुंबक से जुड़े कण हैं phagosomes युक्त लेपित- S. typhimurium. निलंबन सेलुलर घटकों के बाकी हैं ।
  10. १.५ मिलीलीटर ट्यूब में निलंबन के रूप में स्थानांतरित & #34; cytosol & #34;.
  11. चुंबकीय रैक से अलग phagosomes के साथ ट्यूब निकालें और उंहें बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड ।
  12. जगह चुंबकीय रैक पर phagosome निलंबन, 5 मिनट के लिए रुको, और पंजाबियों को हटा दें ।
  13. दोहराएं चरण ४.९ और ४.१० अलग S. धोने के लिए typhimurium -युक्तं phagosomes
  14. अंत में पंजाबियों को हटाने और आवश्यक बफर में phagosomes reसस्पेंड; उदाहरण के लिए, एक radioimmunoprecipitation परख (RIPA) में प्रोटीन विश्लेषण के लिए बफर । लगभग 50-200 & #181; प्रोटीन की जी इस प्रोटोकॉल के बाद नमूना प्रति प्राप्त की है, कोशिकाओं की प्रारंभिक राशि और संक्रमण के मुि पर निर्भर करता है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल द्वारा बैक्टीरिया युक्त phagosomes का अलगाव पहले कदम के रूप में बैक्टीरिया की biotinylation की आवश्यकता है । हम इसलिए की प्रभावशीलता का मूल्यांकन S. typhimurium biotinylation BMDMs के फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण द्वारा biotinylated mCherry-एसके साथ संक्रमित । typhimurium Cy5-Streptavidin के साथ लेबल । संक्षेप में, BMDMs mCherry-Sके साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संक्रमित थे । typhimurium पहले biotinylated लेकिन streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ मशीन नहीं है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की मशीन के बाद, कोशिकाओं गर्म पंजाबियों के साथ धोया और आरटी में 20 मिनट के लिए 4% formaldehyde के साथ तय कर रहे थे सेल तो आरटी में 5 मिनट के लिए पंजाब में 3% ट्राइटन के साथ permeabilized थे । संक्रमित BMDMs तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए Cy5-Streptavidin के साथ मशीन थे । व्यापक धुलाई के बाद, नमूनों को फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार किया गया था । नहीं biotinylated mCherry-S। Typhimurium नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । Cy5 से फ्लोरोसेंट संकेत-Streptavidin biotinylated mCherry में विशेष रूप से मनाया गया था-एस typhimurium, पुष्टि है कि बैक्टीरिया के biotinylation सफल रहा था । Microscopical विश्लेषण "60X O2 NA: 1.40" उद्देश्य का उपयोग कर एक फोकल माइक्रोस्कोप पर किया गया था । fluorochromes के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य थे ४०५ एनएम (DAPI), ५५९ एनएम (mCherry), और ६३५ एनएम (Cy5), और पीएमटी वोल्टेज 574v, 565v, और 443v, क्रमशः पर सेट किया गया था ।

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बाद से मैक्रोफेज में ट्रिगर एस typhimurium काफी हद तक बैक्टीरियल लाइगैंडों द्वारा macrophage सतह रिसेप्टर सक्रियण पर निर्भर है, हम अगले परीक्षण अगर एसकी कोटिंग. बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ typhimurium संक्रमित BMDMs में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बदल सकता है । हमने पहले आकलन किया कि Sकी कोटिंग । typhimurium फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा BMDMs की phagocytic क्षमता को बदल सकता है । BMDMs mCherry-Sके साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संक्रमित थे । Typhimurium बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ या unकोट mCherry के साथ लेपित-S typhimurium। ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की मशीन के बाद, कोशिकाओं गर्म पंजाबियों के साथ धोया और आर टी पर 20 मिनट के लिए 4% formaldehyde के साथ तय किया गया । पंजाबियों के साथ व्यापक धुलाई के बाद नमूनों को फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार किया गया । जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, मैक्रोफेज phagocytized लेपित और अनकोट mCherry-एसtyphimurium समान रूप से ।

इसके बाद, हमने Sद्वारा ट्रिगर की गई भड़काऊ प्रतिक्रिया का विश्लेषण किया । typhimurium बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोती (चित्रा 3) के साथ लेपित । लेपित और अनकोट से संक्रमित BMDMs से Supernatants typhimurium के बाद एकत्र किए गए थे एंजाइम के लिए संक्रमण के 24 एच जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) गुप्त interleukin-6 (IL-6) । की कोटिंग S। बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ typhimurium काफी मैक्रोफेज की भड़काऊ प्रतिक्रिया को बदल नहीं किया ।

बैक्टीरिया-युक्त phagosomes की शुद्धता का आकलन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को रोजगार के द्वारा प्राप्त हम अलग mCherry-एसका विश्लेषण किया. typhimurium-युक्त phagosomes द्वारा immunoblotting. mCherry टैग के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी का प्रयोग, हम mCherry के महत्वपूर्ण संवर्धन पाया-व्यक्त एस। एक ही नमूना (चित्रा 4) से प्राप्त cytosolic अंश की तुलना में पृथक phagosomes में typhimurium . पृथक phagosomes युक्त mCherry- एस. typhimurium कि पहले बायोटिन के साथ लेपित नहीं था एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । इन परिणामों का प्रदर्शन है कि इस प्रोटोकॉल phagosomes कि अत्यधिक बैक्टीरिया में समृद्ध कर रहे है की शुद्धि के लिए अनुमति देता है ।

हम अगले अलग phagosomes युक्त में endosome और lysosome मार्करों के immunoblot विश्लेषण प्रदर्शन किया एसtyphimurium (चित्र 5) । endosome और lysosome मार्करों के अधिकांश स्पष्ट रूप से 4 एच पद पर अलग phagosomes में मनाया गया 30 मिनट की तुलना में संक्रमण । endosomal मार्करों Rab5 और Rab7 के संवर्धन, साथ ही साथ lysosome मार्करों वी-ATPase (दोनों v0 और v1 उप यूनिटों) और cathepsin डी, मनाया गया । दिलचस्प है, केवल cathepsin डी के अलग phagosomes में 4 एच पद संक्रमण मनाया गया । प्रो cathepsin डी (४८ केडीए) के क्लीवेज कम सक्रिय रूप (३३ केडीए) का उत्पादन करने के लिए केवल phagosomes में नहीं बल्कि cytosol में होता है, phagosome अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल की विशिष्टता का प्रदर्शन.

mitochondria या endoplasmic जालिका (एर) जैसे organelles से मार्करों अक्सर बैक्टीरिया की तैयारी में पता लगाया जाता है-पृथक phagosomes, एसयुक्त । typhimurium-पृथक phagosomes युक्त mitochondrial ट्रांसपोर्टर Tomm20 और एर प्रोटीन calnexin (चित्रा 6) के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जांच की गई । हम भी उंहें glycogen एंजाइम GAPDH के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ परीक्षण के लिए अलग phagosomes में cytosolic संक्रमण का आकलन । हमें Sमें mitochondria और ईआर मार्कर दोनों मिले । typhimurium-पृथक phagosomes लेकिन कोई cytosolic संदूषण ।

जीवाणु-युक्त phagosomes के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा का अध्ययन करने के लिए, बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोती कोटिंग प्रक्रिया ग्राम पॉजिटिव जीवाणु एस स्ताफ्य्लोकोच्चुसकरने के लिए लागू किया गया था । mCherry-Sके लिए वर्णित समान निर्धारण और दाग प्रोटोकॉल को नियोजित करके । typhimurium (चित्रा 1) हम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एक्सप्रेस-एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस (चित्रा 7) के सफल biotinylation की पुष्टि की । इसके अलावा, हम endosome मार्कर Rab7 और lysosome मार्करों वी-ATPase (v0 उपइकाई) और cathepsin डी के immunoblot विश्लेषण से संवर्धन का पता लगाया GFP-स्ताफ्य्लोकोच्चुस युक्त (चित्रा 8) । अपने परिपक्व रूप में cathepsin डी की दरार अलग phagosome नमूनों में नहीं बल्कि cytosolic भागों में संक्रमण के 4 ज के बाद ही detectable था । पृथक एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस-युक्त phagosomes को GAPDH के immunodetection द्वारा दर्शाए अनुसार cytosolic संदूषण से मुक्त किया गया.

संक्षेप में, हमने दिखा दिया है कि हमारे phagosome अलगाव प्रोटोकॉल उच्च समृद्ध बैक्टीरिया युक्त phagosomes, cytosolic संदूषण से मुक्त के अलगाव में सक्षम बनाता है । पृथक phagosome तैयारी के ्ह् अध्ययन करने के लिए endosome और lysosome मार्कर के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैgosome परिपक्वता । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि इस प्रोटोकॉल दोनों ग्राम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और है कि लेबलिंग प्रक्रिया मैक्रोफेज की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में परिवर्तन नहीं करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: biotinylated के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण S. typhimurium Cy5-Streptavidin का उपयोग करना. BMDMs mCherry-Sके साथ 30 मिनट के लिए संक्रमित थे । typhimurium कि biotinylated ("biotinylated एस. T."), जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है । नहीं biotinylated mCherry-Styphimurium ("नहीं biotinylated Sटी.") एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । निर्धारण और कोशिकाओं के permeabilization के बाद, नमूनों 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए Cy5-Streptavidin के साथ मशीन थे । नाभिक से प्रतिदीप्ति संकेत (DAPI), mCherry-एस. typhimurium, और Cy5-Streptavidin फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । Cy5 से संकेत-Streptavidin केवल पहले बायोटिन के साथ लेबल बैक्टीरिया में पता लगाया जा सकता है, इस प्रकार की पुष्टि कुशल biotinylation । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: mCherry-Sसे संक्रमित BMDMs का Microscopical विश्लेषण । typhimurium बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ लेपित । BMDMs mCherry-S. typhimurium के साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ लेबल संक्रमित थे । मैक्रोफेज 30 मिनट के लिए बैक्टीरिया phagocytize करने के लिए अनुमति देने के बाद, कोशिकाओं 4% formaldehyde के लिए आर टी पर 20 मिनट के लिए तय किया गया । लेपित बैक्टीरिया मैक्रोफेज द्वारा phagocytized तो फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । विश्लेषण से पता चला है कि लेपित बैक्टीरिया का सेवन ("लेपित । टी.") unलेबल्ड mCherry बैक्टीरिया का सेवन करने के लिए तुलनीय है ("नहीं लेपित । टी."), का प्रदर्शन है कि बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ लेबल एसके phagocytosis बदल नहीं है । typhimurium ने मैक्रोफेज. नाभिक सूक्ष्म दृश्य के लिए DAPI के साथ दाग थे । डेटा को माध्य ± S.E.M. के रूप में दिखाया जाता है, और विद्यार्थी t-परीक्षण का उपयोग करके परिकलित सांख्यिकीय महत्व * = p & #60; ०.०५; * * = & #60; ०.०१; = & #60; ०.००१. स्केल बार = ४० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: BMDMs द्वारा IL-6 स्राव बायोटिन के साथ संक्रमित-और-streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोती, लेबल एस typhimurium की तुलना में अनलेबल्ड एस. typhimurium . BMDMs से संक्रमित थे इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ लेपित typhimurium । संक्रमण के 24 ज के बाद, एलिसा द्वारा IL-6 स्राव के आगे विश्लेषण के लिए supernatants एकत्र किए गए थे । Supernatants फार्म BMDMs अनकोट के साथ संक्रमित Styphimurium एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया । लेपित एसद्वारा आईएल-6 स्राव की प्रेरण । typhimurium को अनकोट एसकी तुलना में काफी अलग नहीं किया गया । typhimurium। डेटा को माध्य ± S.E.M. के रूप में दिखाया जाता है, और छात्र t-test का उपयोग करके परिकलित सांख्यिकीय महत्व * = p & #60; ०.०५; * * = & #60; ०.०१; = & #60; ०.००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पृथक phagosomes में बैक्टीरियल संवर्धन । mCherry के संवर्धन-टैग एस. अलग phagosomes में 30 मिनट के बाद एकत्र और संक्रमण के 4 एच cytosolic अंश की तुलना में किया गया था typhimurium । β-actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । नकारात्मक नियंत्रण unphagosomesd Sका उपयोग कर पृथक करने के लिए संदर्भित करता है । 30 मिनट के बाद में typhimurium संक्रमण । अपेक्षा के अनुरूप, phagosome आइसोलेशन का अंतिम आउटपुट अनलेबल्ड S का उपयोग कर रहा है. typhimurium mCherry या β-actin की महत्वपूर्ण मात्रा मौजूद नहीं है, प्रोटोकॉल की विशिष्टता का प्रदर्शन । प्रति नमूना 20 µ ग्राम प्रोटीन की मात्रा भरी हुई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पृथक Sमें endosome और lysosome मार्कर का विश्लेषण । typhimurium-युक्त phagosomes. endosome मार्करों Rab5 और Rab7 के संवर्धन, और lysosome मार्करों वी-ATPase (v0 और v1 उपयूनिटों) और cathepsin डी अलग एसमें विश्लेषण किया गया था । typhimurium-युक्त phagosomes 30 मिनट और संक्रमण के 4 ज के बाद निकाली गई । β-actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । प्रति नमूना 20 µ ग्राम प्रोटीन की मात्रा भरी हुई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: mitochondria, एर, और पृथक Sमें cytosolic मार्कर का विश्लेषण । typhimurium-युक्त phagosomes. cytosolic मार्कर GAPDH, ईआर मार्कर calnexin, और एस में mitochondrial मार्कर Tomm20 . typhimurium phagosomes 30 मिनट और 4 एच के बाद संक्रमण immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया गया और इसी cytosolic भागों की तुलना में अलग । प्रति नमूना 20 µ ग्राम प्रोटीन लोड किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा ७: GFP-एस. स्ताफ्य्लोकोच्चुस संक्रमित मैक्रोफेज का Microscopical विश्लेषण. BMDMs से संक्रमित थे । स्ताफ्य्लोकोच्चुस एक्सप्रेस ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) लेबल वाईके रूप में लेबलिंग के लिए क्रियाविधि विज्ञान में वर्णित गु बायोटिन . typhimurium। मैक्रोफेज 30 मिनट के लिए बैक्टीरिया phagocytize करने की अनुमति देने के बाद, कोशिकाओं को ठीक किया गया. अनकोट एस. स्ताफ्य्लोकोच्चुस ("Not biotinylated s. A.") नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । निर्धारण और कोशिकाओं के permeabilization के बाद, नमूनों 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए Cy5-Streptavidin के साथ मशीन थे । नाभिक से फ्लोरोसेंट संकेत (DAPI), GFP-एसस्ताफ्य्लोकोच्चुस, और Cy5-Streptavidin फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । Cy5 से संकेत-Streptavidin केवल पहले बायोटिन के साथ लेबल बैक्टीरिया में देखा जा सकता है, कुशल biotinylation की पुष्टि । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: पृथक Sमें endosome और lysosome मार्कर का विश्लेषण । स्ताफ्य्लोकोच्चुस-युक्त phagosomes. एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस-युक्त phagosomes 30 मिनट, 2 एच, और 4 एच के बाद संक्रमण, immunoblotting द्वारा phagosomal मार्करों Rab5, Rab7, और वी-ATPase के लिए इसी cytosolic अंश की तुलना में विश्लेषण किया गया । प्रति नमूना 20 µ ग्राम प्रोटीन लोड किया गया । नमूने भी GAPDH के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ परीक्षण किया गया, कि पृथक एसका प्रदर्शन । स्ताफ्य्लोकोच्चुस-युक्त phagosomes cytosolic संदूषण से मुक्त हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एस के अलगाव के लिए एक नई विधि . typhimurium-युक्त phagosomes कोटिंग द्वारा बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ बैक्टीरिया यहाँ वर्णित है. कोशिका झिल्ली के कोमल विघटन के बाद, बैक्टीरिया युक्त phagosomes आसानी से एक चुंबकीय रैक का उपयोग कर निकाला जा सकता है । हम बताते हैं कि बैक्टीरिया की लेबलिंग सूजन पैदा करने के लिए रोगज़नक़ की क्षमता को बरकरार रखता है और मेजबान सेल के phagocytic गुण में परिवर्तन नहीं करता है । महत्वपूर्ण बात, इस विधि द्वारा प्राप्त phagosomes बैक्टीरिया और endosome/lysosome मार्करों और cytosolic संदूषण से रहित में समृद्ध कर रहे हैं ।

यह विधि सुक्रोज ग्रेडिएंट पृथक्करण को नियोजित करने वाले पारंपरिक phagosome आइसोलेशन विधि की तुलना करते समय कई लाभ प्रस्तुत करती है. यह समय लेने वाली कई केंद्रापसारक कदम समाप्त, शोधकर्ता कम समय में और अधिक नमूनों को संभालने के लिए और आसानी से धुलाई कदम की संख्या में वृद्धि से purer phagosome नमूने प्राप्त करने की अनुमति । इस प्रोटोकॉल का उपयोग ultracentrifugation जैसे विशेषीकृत और संवेदनशील उपकरणों की आवश्यकता को समाप्त करता है । उच्च गति केंद्रापसारक बुलबुले की विशेषताओं को बदल सकता है और अंतिम उपज को कम22, जो इस प्रोटोकॉल में बचा है । हम यह भी दिखा दिया है कि एस की कोटिंग बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ typhimurium मैक्रोफेज की phagocytic क्षमता में परिवर्तन नहीं करता है । इसके अलावा, मैक्रोफेज द्वारा आईएल-6 की प्रेरण लेबल Sसे संक्रमित है । अनलेबल्ड बैक्टीरिया से संक्रमित मैक्रोफेज की तुलना में typhimurium अनछुए था । इसलिए, एस के कोटिंग Typhimurium उनके pathogenicity में महत्वपूर्ण परिवर्तन उत्पंन नहीं करता है । हमारे ज्ञान के लिए, एस के कोटिंग typhimurium सामांय प्रयोगशाला विश्लेषण तकनीकों में से किसी के लिए अलग phagosomes के उपयोग के लिए एक बाधा का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।

एस typhimurium-युक्त phagosomes इस विधि से अलग बैक्टीरिया और वर्तमान विशिष्ट endosomal और लाइसोसोमल मार्करों में समृद्ध कर रहे हैं, जैसे वी ATPase उपइकाई v0 और v1 और सट परिपक्व को छेड़ो cathepsin डी, जो केवल पृथक phagosome अंशों में ही पता लगाया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, हमने पाया mitochondria और एर मार्करों पृथक S. typhimurium-युक्त phagosomes. एर के साथ phagosomes की बातचीत व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है, हालांकि रोगज़नक़-युक्त phagosomes में मौजूद एर से प्रोटीन की मात्रा रोगज़नक़ अध्ययन और कोशिका प्रकार के साथ भिन्न हो सकते हैं । उदाहरण के लिए, phagosomes युक्त ब्रूसिला abortus पेशेवर फ़ैगोसाइट से पृथक एर मार्करों में अमीर है23 लेकिन नहीं लोगों मैक्रोफेज24से अलग । Calnexin में पहले से पता लगाया जा चुका है S. Typhimurium-युक्त phagosomes सुक्रोज ग्रेडिएंट18द्वारा पृथक की गई । निष्क्रिय मनका युक्त phagosomes और mitochondria के करीब बातचीत भी पहले25की सूचना दी गई है, अलग phagosomes में Tomm20 की उपस्थिति समझा । Mitochondrial प्रोटीन को पृथक phagosomes में पाया गया है जिसमें एल pneumophila26 या माइकोबैक्टीरियम27हैं । हालांकि, सुक्रोज ग्रैडिएंट केंद्रापसारक विधि का उपयोग करके अलग रोगज़नक़-युक्त phagosomes की तैयारी में mitochondria घटकों का पता लगाने अक्सर इस organelle के समान घनत्व के कारण माना गया है और रोगज़नक़ युक्त phagosome और, इसलिए, विशिष्ट28। हमारी विधि इस तरह के एक संदूषण मुद्दे से बचा जाता है और अधिक विश्वसनीय mitochondrial झिल्ली phagosomal झिल्ली के साथ आपस में मिलना हो सकता है कि सुझाव जानकारी प्रदान करता है । सारांश में, यह मुश्किल हो जाएगा एर और mitochondrial मार्करों रोगज़नक़ युक्त अलग phagosomes की तैयारी में, मेजबान सेल प्रकार और रोगज़नक़ के आधार पर से बचने के लिए । पृथक phagosomes की शुद्धता के सत्यापन के लिए अनुशंसित विधि पश्चिमी दाग द्वारा बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए टैग-बैक्टीरिया और विशिष्ट टैग एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए है. हम यह भी बताते है कि इस अलगाव विधि उपलब्ध सतह अमीन समूह है कि biotinylated जा सकता है के साथ अंय सूक्ष्मजीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के रूप में, हमने अपने प्रोटोकॉल को S. स्ताफ्य्लोकोच्चुस-युक्त phagosomes को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया है । Phagosomes युक्त एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग lysosome और endosome मार्करों जैसे वी-ATPase (v0 उपइकाई) और Rab7, क्रमशः में समृद्ध कर रहे हैं, लेकिन cytosolic मार्करों इस तरह के रूप में उपस्थित GAPDH नहीं है ।

Endosomal/phagosomal बुलबुले रोगजनकों के क्षरण के लिए अद्वितीय वातावरण प्रदान करते हैं, लेकिन अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली संकेतन के लिए एंटीजन की रक्षा । हालांकि, phagosomes और परिपक्वता प्रक्रिया बड़े पैमाने पर जांच की गई है, विभिंन रोगजनकों की मेजबानी पर phagosome में microenvironment मायावी रहता है । यह भी स्पष्ट नहीं है कैसे कोशिकाओं में चयापचय परिवर्तन phagosome परिपक्वता और उसकी सामग्री को बदल । इसलिए, यहां विस्तृत प्रोटोकॉल phagosome उत्पत्ति और विभिंन विकृतियों के संदर्भ में अपने कार्य के अध्ययन के लिए और अधिक अवसर देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

है रॉबिंसन प्रयोगशाला में अनुसंधान में सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं पर कोलोन उत्कृष्टता क्लस्टर से धन द्वारा समर्थित है उंर बढ़ने-जुड़े रोगों, कोलोन विश्वविद्यालय, जर्मनी (CECAD; जर्मन संघीय की उत्कृष्टता पहल के भीतर DFG द्वारा वित्त पोषित और राज्य सरकारों) और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB ६७०), Köln फॉर्च्यून, और मारिया-Pesch कोलोन, जर्मनी के विश्वविद्यालय के फाउंडेशन से अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Link NHS Biotin Thermo Fisher Scientific 20217
FluidMag Streptavidin Chemicell 4205
PIPES Carl Roth 9156.2
MgCl2 Carl Roth A537.4
EGTA Carl Roth 3054.3
Sucrose Carl Roth 4621.1
Mannitol Carl Roth 4175.1
DTT Sigma 43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 1861280
Cytochalasin B Sigma C6762
DYNAL or DynaMag Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
SmartSpec 3000 Spectrophotometer Bio-Rad 170-2501
Bacterial loop (10µl) Sarstedt 86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMI Biochrom FG1415
PBS Biochrom L1825
Cy5-streptavidin Invitrogen SA1011
anti-beta-actin antibody Santa Cruz Biotechnology sc-47778
anti-mCherry antibody Thermo Fisher Scientific PA5-34974
anti-Rab5 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-46692
anti-Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibody Santa Cruz Biotechnology sc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20943
anti-cathepsin D antibody Santa Cruz Biotechnology sc-6486
anti-Tomm20 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-17764
anti-calnexin antibody Santa Cruz Biotechnology sc-46669
anti-GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20357

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References

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