Обобщение и оценка ингибитор поглощения на основе рутений митохондриальной кальция

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Протокол для синтеза, очистки и характеристика рутений основе ингибиторов митохондриальных кальция поглощения представлен. Демонстрируется процедура для оценки ее эффективности в permeabilized клетках млекопитающих.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nathan, S. R., Wilson, J. J. Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor. J. Vis. Exp. (128), e56527, doi:10.3791/56527 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мы подробно синтеза и очистки ингибиторов митохондриальных кальция поглощения, [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)]5 +. Оптимизированный синтез этого соединения начинается от [Ru (NH3)5Cl] Cl2 в 1 М NH4OH в закрытом контейнере, давая зеленый раствор. Очистка осуществляется с катионообмен хроматографии. Это вещество характеризуется и UV-vis и ИК-спектроскопии проверены, чтобы быть чистым. В permeabilized клетки HeLa митохондриальной кальция поглощение ингибирующих свойств оцениваются флуоресцентной спектроскопии.

Introduction

Митохондриальной Кальций является ключевым регулятором для целого ряда процессов, которые имеют решающее значение для нормальной клеточной функции, включая производство энергии и апоптоз. 1 , 2 , 3 Унипорт митохондриальных кальция (MCU), Ион транспортер белок, который находится на внутренней митохондриальной мембраны, регулирует приток ионов кальция в митохондрии. 4 , 5 , 6 химических ингибиторов MCU являются ценными инструментами для продолжения усилий для изучения функции и клеточных роли этого транспортного белка и митохондриальной кальция. Соединения [(2HCO) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, является одним из только известных селективных ингибиторов для Микроконтроллера с заявленной стоимостьюd K 24 µM.7 ,8,9,10 этот комплекс является общей примеси в коммерческих препаратах Рутения красный (RuRed), triruthenium ди µ оксо мост hexacation формулы [(NH-3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, который также использовался как ингибитор поглощение кальция. Хотя Ru360 является коммерчески доступных, это очень дорого. Кроме того обобщение и изоляции Ru360 оспаривается трудно очистительные процедуры и методы неоднозначными характеристике.

Недавно мы сообщили альтернативные процедуры для доступа к аналоговых, Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Ru3605. 11 это соединение подавляет MCU с высоким сродством, похож на Ru360. В этом протоколе мы будем описывать наши наиболее эффективным синтез этого соединения, который начинается от [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Очистки продукта с помощью настоятельно кислой катионообменной смолы подробно, а также распространенных ошибок для этой процедуры. Мы также методы для характеристики и оценки составных чистоты и определить простой подход к проверить его эффективность в блокирует поглощение митохондриальной кальция.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: в этом синтезе используются концентрированных кислот и щелочей. Используйте все практики безопасности при выполнении реакции, включая использование инженерного управления (Зонта) и средств индивидуальной защиты (СИЗ) включая защитные очки, перчатки, лаборатории пальто, брюки полной длины и закрыты носок обуви.

1. подготовка [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5

  1. синтез Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12
    1. распустить 1.00 g RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru по весу, 4,1 ммоль) в 5 мл H 2 O. Cool темно коричневый решение до 0 ° C в ледяной бане. Добавьте 11 мл (0.23 моль) 80% Гидразина гидрат решения в духе прикапывают. Первоначальная реакция будет энергичные с эволюции газа, что приводит к коричневый решения. Пусть полученный раствор перемешать при комнатной температуре для 16 h; окончательное решение будет темно Ред
      Предупреждение: Гидразина остро токсичными и канцерогенными. Кроме того безводный формы этого реагента взрывоопасны. Как всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и дыма вытяжки при обработке. Не концентрируйтесь эти решения к сухости.
    2. В этот раствор добавить примерно 5-10 мл концентрированной HCl для регулировки рН до 2. На данный момент, решение будет желто коричневого цвета.
    3. Тепло это решение при 105 ° C помешивая для 1-2 ч. Желтое тело будет выпадать в осадок из раствора. Когда не более заметно осадок форм, удалить от жары.
    4. Позволяют реакционной смеси остыть до комнатной температуры, а затем поместить в ледяной бане 0 ° C на 10 минут собрать желтого тела вакуумной фильтрации и мыть с 5 мл этанола и диэтиловом эфире.
    5. Полностью растворить сырой продукт в 15-25 мл горячей воды. Холод 10 мл концентрированного раствора HCl в колбу фильтра, поместив его в ледяной бане. Фильтр желтый раствор в охлажденный раствор HCl побудить осадков бледно желтый чисто твердого тела. Фильтровать этот преципитат и мыть с 5 мл 0,5 М HCl, этанола и эфира.
    6. Характеризуют соединения с помощью ИК-спектроскопии. Проверьте чистоту, выявление растяжения частот на 3226 см -1, 1604 см -1, 1297 см -1 и 801 см -1. [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3 назначается общим незначительные примеси на 2069 см -1.
  2. Синтез [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5
    1. растворить 100 мг (0,34 ммоль) [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 CL в 50 мл 1 M NH 4 OH в 200 мл толстостенных круглодонные давления судна. Слабо крышка колбу с пробкой и тепла реакционной смеси при 75 ° C для 6 h. удалить от жары и перемешать при комнатной температуре в течение 4 дней, чтобы принести темно зеленый раствор.
      Внимание! Отопление запечатанный сосуд результаты в давления. Убедитесь в том использовать соответствующие давления Сейф посуда. Для этой реакции герметизация судно призвана свести к минимуму потери газообразных NH-3. Таким образом, место пробку слабо для того, чтобы позволить для выпуска избыточного давления в.
  3. Очистки хромотографией катионообмен
    1. в 25 мл стакан, приостановить 5 g-катионообменной смолы (например, Dowex 50WX2 200-400 сетки (форма H +) в 10 мл 0,1 М HCl.
    2. Загрузить этот раствор в столбец 10 мл (диаметр 10 мм, высота 15 см) с 50 мл растворителя водохранилище. Мыть смолы с приблизительно 20-30 мл 0.1 М HCl, до тех пор, пока элюата бесцветен.
    3. Возвращение к зеленому реакция решение изолированы в шаг 1.2.1. В этот раствор добавить концентрированной HCl для регулировки рН 2, в этот момент решение цвет изменится на Браун.
    4. Загрузить этот подкисленных решение столбце смолы-катионообмен, подготовленный на шаге 1.3.2 нежно закупорить поверх смолы. Пусть элюата полностью слейте воду и продолжить загрузку решения. Повторите этот процесс, пока будут добавлены все решение. В верхней части смола будет темно-коричневый/черный. Смола будет уменьшаться в объеме слегка.
    5. Использовать стеклянные бусины для покрытия верхней части смолы. Это будет препятствовать нарушался при добавлении новых решений смолы.
    6. Элюировать столбец с 20 мл 1 М HCl.
    7. Элюировать столбце с повышенной концентрацией HCl 1,5 м (≈ 50 мл). Желтый раствор начнет сходить в столбце. Увеличение концентрации HCl до 2 М и продолжить элюирующие до тех пор, пока элюата бесцветен или очень бледно-зеленый желтый. Для этого процесса потребуется суммарный объем 150-200 мл.
    8. Увеличение концентрации HCl до 2,5 М (20-50 мл). Соберите элюата фракций в пробирках. Увеличить до 3 М HCl. Продукт будет элюировать из столбца как решение зелено коричневый. Красно коричневый фракция может также начать прийти прочь в столбце. Как эти фракции окисленных рутений красный примесей, не бассейн с зелено коричневый фракций.
  4. Характеристик и проверки чистоты [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5
    1. тест всех фракций от Шаг 1.3.8. по отношению к УФ спектроскопия. Для выполнения этой задачи, 100 мкл данной дроби в 2 мл 3 M NH3 и анализировать, UV-vis спектроскопии. Фракций, содержащих чистый продукт будет иметь большой поглощения группы на 360 Нм и менее интенсивного поглощения на 600 Нм. Поглощения в 480 или 533 Нм свидетельствует о окисленных рутений красный и красный рутений примесей, соответственно.
    2. Бассейн фракций, содержащих чистый продукт и испаряются решение сухости Ротари испарением. Продукт будет изолирован как прочной зелено коричневый. Урожаи, обычно порядка 5-15 мг (10-20% доходности). Одноместный кристаллы, подходит для рентгеновской дифракции, могут быть получены путем диффузии паров этанола в водных растворах соединения.
    3. Для проверки чистоты, анализировать комплекса спектроскопия UV-vis в растворе рН 7,4 фосфат амортизированное saline (PBS). Чистота может оцениваться, принимая отношение интенсивности 360 Нм и 600 Нм пиков. Это соотношение является 31 для чистого соединения. Для нечистых соединений, соотношение будет меньше,.
    4. Анализ образца в твердотельных методом ИК-спектроскопии. Диагностических групп находятся на 3234 см -1, 3151 см -1, 1618 см -1, 1313 см -1 и 815 см -1. Общие примеси полос видны в 1762 см -1 и 1400 см -1, характерные для NH 4 Cl. рутений красный может быть идентифицирован полос в 1404 см -1, 1300 см -1, 1037 см -1 и 800 см -1.
  5. Оценки митохондриальной кальция флуоресцентной спектроскопии поглощения ингибирования
    осторожно! В следующих процедурах используются mammalian клеток. Работа должна осуществляться в соответствующих ламинарные шкафы, которые сертифицированы для биологической безопасности уровня 2 исследований (BSL2).
    ​ Примечание: [(2 OH) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (2 OH)] Cl 5 будет именоваться как [Ru] в этом разделе
    1. сделать буфер глюкозы содержащих солевой раствор (BGSS) пробирного СМИ. BGSS это решение состоит из 110 мм KCl, 1 мм х 2 PO 4, 1 мм MgCl 2, 20 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), сукцинат натрия 5 мм, 30 мкм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tetraacetic кислота (EGTA). Объединить все за исключением EGTA, скорректировать рН 7,4. Добавить EGTA и скорректировать рН 7,4. Для 50 мл пробы СМИ добавить 0,5 мл 1 мг/мл глюкозы.
    2. Культура НеЬа клетки в 500 см 2 чашки Петри в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в увлажненные инкубатор с 5% CO 2 при 37 ° C. усиливают НеЬа клетки, растущих в 100 мм Петри путем посева их в чашке Петри 2 500 см. Объем всего СМИ в большое блюдо-115 мл. Каждое большое блюдо даст около 18 миллионов клеток, достаточно для двух экспериментов флуоресцентной спектроскопии.
      1. Расти ячейки до тех пор, пока они достигают 90-95% confluency. Удалите средства массовой информации и промойте клетки с 15 мл рН 7,4 PBS. Добавляют 15 мл 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS и проинкубируйте втечение 10 мин для отсоединения клетки. Перевести 14 мл вокруг трубки сокола нижней клетки
    3. подсчитать ячейки с помощью Трипановый синий и Горяева с инвертированным микроскопом и рассчитать общее количество клеток и объем средств, необходимых для достижения 7.5 миллион клеток в объем 1.8 мл среды. Центрифуга клетки для 10 мин на 5310 × g. Decant супернатант и добавьте вычисляемый объем BGSS. Нежно ресуспензируйте клетки.
      1. Для этого анализа, подготовка запасов решения digitonin 40 мм в диметилсульфоксида (ДМСО), 1 мм кальция Грин 5N H 2 O, и 10 мм CaCl 2 H 2 O. [Ru] акций решения, подготовленные в чистой воде, может варьироваться от 1-3 мм.
        ​ Примечание: кальция Грин 5N чувствителен к свету. Хранить в темноте и сведения к минимуму воздействия света.
    4. Установка fluorimeter для возбуждения в 506 Нм и чтения выбросов на 532 нм с держатель кювет, контролируемых на 37 ° C. Prepare акриловые кювета с перемешать бар или колесо, 1.8 мл суспензии клеток от 1.5.2 выше, 1.8 мкл digitonin решение, 3.6 & #181; L кальция Грин 5N (решения) и 9 мкл [Ru] (для 1 мм раствор, 5 мкм конечная концентрация). Инкубируйте клетки за 15 мин в fluorimeter.
      1. Прочитать данные как отношение возбуждения/выбросов вместо сырой поглощения. Эта практика минимизирует ошибки, связанные с колебаниями в интенсивность источника света.
      2. Проведения первого анализа проб в отсутствие [Ru], чтобы измерить эффект добавления CaCl 2 на ответ клетки.
      3. Начать анализ на fluorimeter с использованием параметров, описанных в 1.5.4. Подождите около 2 минут, чтобы установить стабильной выбросов базового, а затем добавьте 1.8 мкл CaCl 2 (конечная концентрация 10 мкм). Интенсивность выбросов увеличится сразу же после добавления CaCl 2 и затем распадается в течение минут, как ионы кальция введите митохондрий. Дождитесь завершения распада (≈ 5 мин). Добавьте дополнительные кальция болюсов для определения реакции поглощение митохондриальной кальция клеток, не получавших [Ru].
    5. В другой кювета, содержащий 5 мкм [Ru], повторить эксперимент, как описано выше в 1.5.4.3. В присутствии ингибиторов интенсивности выбросов будет увеличить, но не гниет. Это наблюдение указывает, заблокирован поглощение кальция митохондриальной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот метод описывает синтез митохондриальной кальция поглощения ингибиторы [(2OH) (NH-3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 начиная с [Ru (NH3)5Cl] Cl2, хорошо известна ruthenium(III) исходного материала. [Ru (NH3)5Cl] CL2 характеризуется ИК-спектроскопии, с колебательных режимах на 3200 см-1, 1608 см-1, 1298 см-1и 798 см-1 (рис. 1). Небольшие примеси на 2069 см-1 может объясняться [Ru (NH3)5N2] Cl3. Реакция этого вида Ru(III) с 1 М NH4OH дает [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5. Ход этой реакции свидетельствует резкое изменение цвета раствор от желтого к зеленому. Реакция окончательное решение-темно-зеленый цвет. Подкисление этого решения с концентрированной HCl приводит к изменению цвета до коричневого; побочный эффект этого нейтрализации-аммония хлорид, который может загрязнить конечного продукта, если не осторожность. Очистка соединение осуществляется через катионообмен хроматографии с использованием настоятельно кислой сетки (форма H+ ) смолы. С 0,10 М HCl смола является достижение равновесного уровня впервые, и решение [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 загружается на столбце. Хлорид аммония побочного elutes с мойки HCl 1 M. Рутений содержащих соединений элюировать при более высоких концентрациях HCl. Серия желтые фракций, которые содержат Cl непрореагировавшего [Ru (NH3)5Cl]2 исходного материала, прийти прочь столбце, когда концентрации HCl 1,5 М. Желаемый продукт elutes между 2,5-3,0 М HCl и результирующей дроби появляются зеленый зеленый коричневого цвета.

До объединения фракции продукта, следует проверить их чистоты. Потому что желаемый комплекса экспонатов некоторые рН зависимость в своем спектре UV-vis, мы предлагаем добавить небольшой аликвоты фракций для очень основные 3 M NH3 решения для обеспечения что спектральные характеристики одинаковы для всех фракций. Чисто фракций должны отображать только интенсивный пик на 360 Нм и слабый пик на 600 Нм (рис. 2). Вершины около 480 и 533 Нм указывают на наличие рутений коричневый и красный, соответственно и значительный пик на 260 Нм, с плеча на 290 Нм, означает наличие [Ru (NH3)5Cl] Cl2 исходного материала (рис. 3 ). Ротари испарения чистого фракций дает нужное соединение как твердое тело зелено коричневый.

Изолированных соединения можно далее характеризоваться UV-vis и ИК-спектроскопии. UV-vis спектра (рис. 2) отображает 360 Нм и 600 Нм полос поглощения, как описано выше. Коэффициент вымирания для 600 Нм band-850 M-1см-1 и для группы 360 Нм-27000 М-1см-1. Отношение интенсивности 360 Нм-группы, по сравнению с 600 Нм группы должно быть 31 в PBS рН 7,4, и этот показатель могут быть эффективно использованы для оценки чистоты соединения. ИК спектра должна выглядеть, как показано на рисунке 4. Ru-O-Ru натяжные частоту, например, диагностические в 850 cm-1. ИК спектра был использован для определения Ru-O-Ru стрейч и чтобы убедиться, что не хлорид аммония присутствовал в конечный продукт. Аммония хлорид, общего содержания примесей, имеет колебательных режимов в 1762 см-1 (слабо) и 1400 см-1 (сильный), можно легко различить от ИК спектра (рис. 5). Рутений красный является общим побочным продуктом реакции и могут быть идентифицированы в ИК спектра с тянется в 1404 см-1, 1300 см-1, 1037 см-1 и 800 см-1, хотя некоторые совпадают с желаемого продукта будет происходить) Рисунок 6).

Ответ поглощение кальция в digitonin-permeabilized клеток HeLa наблюдается (рис. 7). Звездочки показывают добавлением болюсным2 CaCl. При наличии [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 увеличение интенсивности выбросов наблюдается после добавления кальция, но не распад из-за митохондриальной кальция поглощения наблюдается.

Figure 1
Рисунок 1 : Инфракрасные спектры [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Инфракрасные спектры [Ru (NH3)5Cl] Cl2 с очень небольшой примесью3 Cl [Ru (NH3)5N2]. Красная стрелка указывает примеси на 2 069 см-1Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель UV-vis спектры для чисто материал. [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) (OH2) Ru (NH3)4] Спектры поглощения5 UV-vis CL и вблизи инфракрасного (вставка) в рН 7,4 PBS. Коэффициент вымирания для основных поглощения в 360 Нм-27000 М-1 см-1Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : UV-vis спектры сырой реакционной смеси. [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) (OH2) Ru (NH3)4] Спектры поглощения5 UV-vis CL сырой реакционной смеси до очистки в рН 7,4 PBS. Красные стрелки указывают общие примесей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Представитель ИК спектры для чисто материал. Инфракрасные спектры Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)]5. Ru-O-Ru растянуть на 850 cm-1, другие тянется от NH3 осцилляторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5/>
Рисунок 5 : Инфракрасные спектры, содержащих NH4Cl примеси. Инфракрасные спектры [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 с примесью хлорида аммония. Красная стрелка указывает хлорид аммония в 1400 см-1Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Инфракрасные спектры коммерческих рутений Ред Инфракрасный спектр [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 (черный след) и коммерческие рутений красный (красный след). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Представитель кальция поглощения результатов. Флуоресценции увеличение связано с добавлением кальция коктейль из digitonin-permeabilized клетки HeLa, кальция Грин 5N и [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 в BGSS. Бланк содержит5 Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] и флуоресценции уменьшение благодаря Ca2 + поглощения в митохондрии можно увидеть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] митохондриальной кальция поглощение ингибитор5 может быть синтезированным из [Ru (NH3)5Cl] Cl2, хорошо известна ruthenium(III) исходный материал, как описано в этой процедуре. Синтез [Ru (NH3)5Cl] Cl2 легко достигается без особых трудностей. После перемешивания3 RuCl для 16 h в гидразин гидрат, рН раствора следует скорректировать значение 2 с HCl. Падение РН имеет решающее значение для достижения желаемого продукта. При желании, этот синтез можно изменять форму [Ru (NH3)5Br] Br2 путем орошения в HBr вместо HCl.

Мы наблюдали несколько стратегий для минимизации образования нежелательных побочных продуктов во время синтеза поглощения ингибиторы митохондриальной кальция. Примечательно сохраняя колбу максимум имеет решающее значение для успеха этой реакции; Если колба открыт, ряд других побочных продуктов, включая рутений красный (RuRed), формируются в заметных количествах. Предположительно газообразного аммиака теряется от открытой реакции судна и это событие компромиссы формирования желаемого продукта. Размер колбы и объем водного раствора аммиака являются также важные параметры, которые не должны изменяться значительно от тех, которые описаны в настоящем Протоколе, как мы уже заметили, что эффективность этой реакции уменьшается в небольших колбы. Этот метод не резко увеличить доходность этого соединения по сравнению с двумя другими методами, которые мы ранее раскрыты. Он, однако, содержат меньше шагов и привести к формированию продукта меньше сторона, например RuRed. Низкая доходность может объясняться наличием небольшое количество непрореагировавшего [Ru (NH3)5Cl] Cl2 , а также неизвестные высоко взимается примесей, которые сохраняются в верхней части столбца. Хотя мы еще не изучили многие условия дополнительные реакции, вполне возможно, что улучшения могут быть реализованы путем изменения времени реакции и концентрации реагентов, для получения более высоких урожаев.

Очистки [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Cl5 является наиболее трудоемкой и сложной частью настоящего Протокола. Хорошо упакованные столбец будет значительно способствовать разделения; Загрузка смолы как навозной жижи является эффективным подходом для обновления столбца. Следует отметить, что как HCl концентрация увеличивается в течение элюции столбца, смола будет контракт в размер. Чтобы успешно получить чистый материал, скорость, с которой увеличивается концентрация кислоты не должно отклоняться от заявленных процедуры. Конечный продукт будет прочной зелено коричневый; Базовое решение будет темно-зеленый, но кислой решения будет коричневый. Если наблюдается яркие розово красный раствор, рутений красный примесей присутствуют. Количество RuRed может определяться с помощью Коэффициент вымирания (62000 М-1·cm-1 на 533 Нм). Этот процесс очистки является относительно общих для сильных катионообменной смолы столбцов.

Ингибирование поглощение митохондриальной кальция может испытываться с использованием permeabilized клетки HeLa, флуоресцентный кальция датчик кальция Грин 5N и Спектрофлуориметр. 13 , 14 этот assay требуется большое количество клеток и поэтому требуют усиления культуры в очень больших 500 см2 Петри. Эти большие культуры колбы предотвратить дополнительные проблемы в минимизации микробной контаминации, потому что очень большие открытые площади поверхности. Работа должна осуществляться в поток Ламинарный шкаф для поддержания стерильности. Флуоресценции ответ Грин 5N кальция в клетки HeLa permeabilized контролируется флуоресцентной спектроскопии. Добавление внешних болюс кальция в кювет вызывает немедленное увеличение в флуоресцировании, вытекающих из ионов кальция, взаимодействующих с датчиком. В течение нескольких минут в отсутствие ингибитор интенсивность распадается из-за поглощения этих ионов кальция в митохондриях, органеллы, которые не могут быть достиганы красителя. Когда этот assay осуществляется в присутствии ингибиторов добавлением болюсным ионов кальция приводит к увеличению интенсивности выбросов. Распад из-за поглощения митохондриальной кальция, однако, отсутствует, проверка митохондриальной кальция поглощение ингибирующих свойств этого соединения. Этот процесс может использоваться как общий экран для поглощения ингибиторы кальция. Кроме того эта процедура может применяться для других эукариотических клеток интерес. Этот assay зависит от permeabilization внешней клеточной мембраны таким образом не предоставляет информацию о способности сотовой усвоение комплекса.

Таким образом этот протокол описывают синтеза и очистки ингибитора поглощение Роман на основе рутений митохондриальной кальция. Это соединение имеет важное значение для изучения биологии митохондриальной кальция и его роль в физиологии mammalian клетки. Относительно простой assay для тестирования митохондриальной кальция поглощения также предназначена для проверки и расследования новых ингибиторов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Корнельского университета. Эта работа использовала центра Корнелл для материалов исследований общий зал, которые поддерживаются через программу NSF MRSEC (Грант DMR-1120296). S.R.N. признает поддержку стипендий исследований NSF (Грант DGE - 1650441) и доктор Дейв Holowka для помощи с кальция экспериментов. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале являются те из авторов (s) и не обязательно отражают взгляды национального научного фонда.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruthenium Trichloride hydrate Pressure Chemical 3750
Concentrated hydrochloric acid J.T. Baker 9535
Concentrated ammonium hydroxide Mallinckrodt Chemical Works A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh Alfa Aesar 13945
Calcium Green 5N Invitrogen C3737
Digitonin Aldrich 260746
DMSO Aldrich 471267
EGTA Aldrich E3889
KCl USB 20598
KH2PO4 Aldrich P3786
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
HEPES Fluka 54466
Sodium Succinate Alfa Aesar 33386
EDTA J.T. Baker 8993-01
Glucose Aldrich G5000
200 Round bottom flask ChemGlass CG-1506-14
Glass stopper ChemGlass CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs Custom - similar to Chemglass columns Similar to CG-1203-20
DMEM Corning 10-017-CV
FBS Gibco 10437028
PBS Corning 21-040-CV
Round bottom Falcon tubes Fisher Scientific 14-959-11B 
500 cm2 petri dishes Corning 431110
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Hemacytometer Aldrich Z359629
Acrylic Cuvettes VWR  58017-875
UV-Vis spectrometer Agilent Model Cary 8454 
Spectrofluorimeter SLM Model 8100C
IR spectrometer Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge ALC Model PM140R
Inverted light microscope VWR  89404-462

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797, (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12, (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30, (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115, (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273, (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533, (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56, (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45, (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics