Synthese en evaluatie van een Ruthenium gebaseerde mitochondriale Calcium opname Inhibitor

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Een protocol voor de synthese, zuivering en karakterisering van een ruthenium gebaseerde remmer van mitochondriale calcium opname wordt gepresenteerd. Een procedure voor de evaluatie van de werkzaamheid bij zoogdiercellen permeabel is aangetoond.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nathan, S. R., Wilson, J. J. Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor. J. Vis. Exp. (128), e56527, doi:10.3791/56527 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

We detail de synthese en de zuivering van een mitochondriale calcium opname inhibitor, [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]5 +. De geoptimaliseerde synthese van dit samengestelde begint uit [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1 M NH4OH in ongeopende verpakking, een groene oplossing oplevert. Zuivering wordt bereikt met catie-uitwisseling chromatografie. Deze compound is gekenmerkt en geverifieerd als puur door UV-vis en IR spectroscopie. De mitochondriale calcium opname remmende eigenschappen worden beoordeeld in permeabel HeLa cellen door fluorescentiespectroscopie.

Introduction

Mitochondriale calcium is een belangrijke regulator voor een aantal processen die essentieel voor normale cel functie zijn, met inbegrip van energieproductie en apoptosis. 1 , 2 , 3 de mitochondriale calcium uniporter (MCU), een ion vervoerder eiwit dat zich op de innerlijke mitochondriale membraan bevindt, regelt de toestroom van calciumionen in de mitochondriën. 4 , 5 , 6 chemische inhibitoren van de MCU zijn waardevolle hulpmiddelen voor de voortzetting van de inspanningen om de functie en cellulaire rollen van dit vervoer eiwit en mitochondriale calcium te studeren. De samengestelde [(HCO2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, is een van de enige bekende selectieve inhibitors voor het MCU met een gerapporteerde Kd waarde van 24 µM.7 ,8,9,10 dit complex een gemeenschappelijk onzuiverheid gevonden in commerciële formuleringen van ruthenium rood (RuRed), een triruthenium di-µ-oxo is hexacation van de formule [(NH3) overbrugd 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, die ook is gebruikt als een calcium opname inhibitor. Hoewel Ru360 commercieel beschikbaar is, is het zeer duur. Bovendien, de synthese en de isolatie van de Ru360 wordt uitgedaagd door moeilijk zuiveringsprocedures en dubbelzinnige karakteriseringsmethoden.

Alternatieve procedures voor toegang tot een Ru360 analoge, [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5hebben we onlangs gemeld. 11 deze stof remt de MCU met hoge affiniteit, vergelijkbaar met Ru360. In dit protocol beschrijven we onze meest effectieve synthese van dit samengestelde, die met [Ru (NH3)5Cl] Cl2 begint. Zuivering van het product met behulp van sterk zure kationenwisselingshars is gedetailleerd, samen met de gemeenschappelijke valkuilen voor deze procedure. Wij presenteren methoden voor karakterisering en evaluatie van samengestelde zuiverheid, en een eenvoudige benadering om te testen zijn werkzaamheid in het blokkeren van mitochondriale calcium opname af te bakenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: geconcentreerde zuren en basen worden gebruikt in deze synthese. Gebruik van alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van de reactie met inbegrip van het gebruik van technische controles (zuurkast) en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) met inbegrip van veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en schoenen van gesloten-teen.

1. voorbereiding van [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. synthese van [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
    1. los 1,00 g van RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru gewichtsprocent, 4,1 mmol) in 5 mL H 2 O. Cool de donker bruine oplossing tot 0 ° C in een ijsbad. Toevoegen van 80% hydrazine hydraat 11 mL (0,23 mol) op een dropwise manier. De eerste reactie zal zijn krachtige met het gas van de evolutie, wat resulteert in een bruine oplossing. Laat de resulterende oplossing roer bij kamertemperatuur gedurende 16 uur; de uiteindelijke oplossing zullen donkere red.
      Let op: Hydrazine is acuut toxisch en kankerverwekkend. Daarnaast zijn de watervrije vormen van dit reagens explosieve. Zoals altijd, gebruik juiste PPE en fume hoods wanneer afhandelt. Deze oplossingen voor droogte niet doen concentreren.
    2. Toevoegen aan deze oplossing, ongeveer 5-10 mL geconcentreerde HCl om te Breng de pH op 2. Op dit punt, de oplossing zal zijn geel-bruine kleur.
    3. Warmte deze oplossing bij 105 ° C terwijl roeren gedurende 1-2 uur. Een gele vaste stof zal precipiteren uit oplossing. Wanneer niet meer neerslag zichtbaar formulieren, verwijder uit hitte.
    4. Laat de reactiemengsel afkoelen tot kamertemperatuur, en plaats dan in een ijsbad van 0 ° C voor 10 min. verzamelen de gele vaste stof door vacuüm filtratie en wassen met 5 mL ethanol en diethylether.
    5. Volledig los van het ruwe product in 15-25 mL warm water. 10 mL van een geconcentreerde HCl-oplossing in een filtreerkolf chill door deze te plaatsen in een ijsbad. Filtreer de gele oplossing in de gekoelde HCl-oplossing voor het opwekken van de neerslag van een bleke geel pure vast. Filteren van deze neerslag en wassen met elk 5 mL 0,5 M HCl, ethanol en ether.
    6. Characterize de samengestelde met behulp van IR spectroscopie. Controleer of zuiverheid door de identificatie van stretching frequenties op 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 en 801 cm -1. Een gemeenschappelijke kleine onreinheid bij 2069 cm -1 is toegewezen aan [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
  2. Synthese van 5 Cl [(OH 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)]
    1. los 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 in 50 mL 1 M NH 4 OH in een 200 mL zware muur Rondbodemkolf drukvat. Losjes cap de kolf met een stop en verwarm het reactiemengsel bij 75 ° C gedurende 6 h. verwijderen van het vuur en roer bij kamertemperatuur voor 4 dagen naar een donker groene oplossing opleveren.
      Let op! Verwarming een verzegelde vaartuig resulteert in een druk opbouw. Zorg ervoor dat u juiste druk-safe glaswerk. Voor deze reactie is het doel van de sluiting van het vaartuig te minimaliseren verlies van gasvormige NH 3. Daarom plaatst de stop losjes om vrijlating van overdruk.
  3. Zuivering door catie-uitwisseling chromatografie
    1. schorten In een bekerglas van 25 mL, 5 g kationenwisselingshars (bijvoorbeeld, Dowex 50WX2 200-400 mesh (H + formulier) in 10 mL 0,1 M HCl.
    2. Laden deze drijfmest in een kolom van 10 mL (diameter 10 mm, hoogte 15 cm) aangebracht met een 50 mL oplosmiddel reservoir. Wassen van de hars met ongeveer 20-30 mL 0,1 M HCl, totdat het eluaat kleurloze.
    3. Terug naar de oplossing van de groene reactie geïsoleerd in stap 1.2.1. Toevoegen aan deze oplossing, geconcentreerde HCl om Breng de pH op 2, op dat moment de kleur van de oplossing tot bruin verandert.
    4. Laden deze aangezuurde oplossing voor de catie-hars wisselingskolom bereid in stap 1.3.2 zachtjes waarbij het op de top van de hars. Laat het eluaat volledig drain, en doorgaan met het laden van de oplossing. Herhaal dit proces totdat de hele oplossing is toegevoegd. De top van de hars zal zijn donker bruin/zwart. De hars zal licht dalen in volume.
    5. Gebruik glaskralen ter dekking van de bovenkant van de hars. Dit zal verhinderen dat de hars worden verstoord wanneer nieuwe oplossingen worden toegevoegd.
    6. Elueer de kolom met 20 mL 1 M HCl.
    7. Elueer de kolom met een verhoogde HCl concentratie van 1,5 M (≈ 50 mL). Een gele oplossing zal beginnen te komen uit de kolom. Verhoog de HCl concentratie tot 2 M en blijf eluerende totdat het eluaat kleurloos is of een zeer groene-lichtgeel. Een totaal volume van 150-200 mL nodig zal zijn voor dit proces.
    8. Verhogen de HCl concentratie 2,5 m (20-50 mL). Het verzamelen van het eluaat als breuken in proefbuizen. Oplopen tot 3 M HCl. Het product zal Elueer uit de kolom als een groen-bruin-oplossing. Een rood-bruin-fractie kan ook beginnen te komen op de kolom. Aangezien deze breuken geoxideerde ruthenium rode onzuiverheden, doen niet zwembad met het groen-bruin-breuken.
  4. Karakterisering en controle op de zuiverheid van 5 Cl [(OH 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)]
    1. testen al de breuken uit stap 1.3.8. door UV-vis-spectroscopie. Deze taak volbrengen, voeg 100 µL van een bepaalde fractie in 2 mL 3 M NH3 en analyseren door UV-vis-spectroscopie. Breuken met puur product zal hebben een grote extinctie band op 360 nm en een minder intens extinctie op 600 nm. Absorptie bij 480 of 533 nm is indicatief van geoxideerde ruthenium rode en ruthenium rode onzuiverheden, respectievelijk.
    2. Pool van breuken met puur product en ingedampt tot droogte door roterende verdamping. Het product zal worden geïsoleerd als een groen-bruine vaste stof. Opbrengsten zijn meestal over de volgorde van 5-15 mg (10-20% rendement). Single-kristallen, geschikt voor röntgendiffractie, kunnen worden verkregen door de verspreiding van de damp van ethanol in waterige oplossingen van de compound.
    3. Om te controleren of de zuiverheid, analyseren de compound met UV-vis-spectroscopie in een oplossing van pH 7.4-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Zuiverheid kan worden beoordeeld door middel van de verhouding tussen de intensiteit van de 360 nm en 600 nm pieken. Deze verhouding is 31 voor een zuivere stof. Voor onzuivere verbindingen, zullen de ratio kleiner.
    4. Analyseren het monster in de solid-state door IR spectroscopie. Diagnostische bands zijn op 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 en 815 cm -1. Gemeenschappelijke onzuiverheid bands zijn gezien in 1762 cm -1 en 1400 cm -1, karakteristiek van NH 4 Cl. Ruthenium rood kan worden geïdentificeerd door balken 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 en 800 cm -1.
  5. Evaluatie van mitochondriale calcium opname remming door Fluorescentiespectroscopie
    Let op! De volgende procedures gebruiken zoogdiercellen. Werkzaamheden moet worden verricht in passende laminaire flow afzuigkappen die zijn gecertificeerd voor biologische veiligheid-niveau 2 (BSL2) onderzoek.
    ​ Opmerking: [(OH 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 zal worden genoemd als [Ru] in deze sectie
    1. Make gebufferd glucose-bevattende zoutoplossing (BGSS) de assay media. BGSS is een oplossing, bestaande uit 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 5 mM natrium succinaat, 30 µM ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA). Combineer alles behalve de EGTA, breng pH op 7.4. Voeg EGTA en pH aan 7.4 passen. Voor 50 mL assay media toevoegen 0,5 mL 1 mg/mL glucose.
    2. Cultuur HeLa cellen in 500 cm 2 petrischalen in Dulbecco ' s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C. Amplify HeLa cellen groeien in een 100 mm petrischaal door zaaien hen in een petrischaal van 500 cm 2. Het volume van de totale media in de grote schotel is 115 mL. Elke grote schotel zal opleveren ongeveer 18 miljoen cellen, genoeg voor twee fluorescentie spectroscopie experimenten.
      1. Groeien de cellen totdat ze bij 90-95% confluency. Media verwijderen, en spoel de cellen met 15 mL pH 7.4 PBS. Voeg toe 15 mL 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS en incubeer gedurende 10 min om de cellen los te maken. Overdracht van de cellen tot 14 mL ronde onderkant falcon buizen
    3. cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer met een omgekeerde Microscoop tellen, en het totale aantal cellen en de omvang van de media die nodig zijn voor het bereiken van 7,5 miljoen cellen per 1.8 mL volume berekenen van medium. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 5310 × g. Decant het supernatant en voeg de berekende hoeveelheid BGSS. Resuspendeer de cellen zachtjes.
      1. Voor deze assay, bereiden van stamoplossingen van 40 mM digitonin in dimethylsulfoxide (DMSO), 1 mM Calcium groen-5N in H 2 O en 10 mM CaCl 2 in H 2 O. [Ru] voorraadoplossingen, bereid in zuiver water, kan variëren van 1-3 mM.
        ​ Opmerking: Calcium groen-5N is lichtgevoelig. Opslaan in het donker en lichte blootstelling te minimaliseren.
    4. De fluorimeter setup om te prikkelen op 506 nm en lees de uitstoot op 532 nm met de cuvette-houder gecontroleerd op 37 ° C. voorbereiden een acryl Cuvet met een roer staaf- of wiel, 1.8 mL celsuspensie van 1.5.2 bovenstaande, 1.8 µL digitonin oplossing, 3.6 & #181; L Calcium groen-5N (oplossing), en 9 µL [Ru] (voor 1 mM stockoplossing, 5 µM eindconcentratie). Incubeer de cellen gedurende 15 min. in de fluorimeter.
      1. De gegevens lezen als de verhouding van de excitatie/emissie in plaats van de rauwe absorptie. Deze praktijk minimaliseert fouten die zijn gekoppeld aan de schommelingen in de intensiteit van de lichtbron.
      2. Uitvoeren van de eerste analyse van het monster in de afwezigheid van [Ru] voor het meten van het effect van de toevoeging van CaCl 2 op de reactie van de cellen.
      3. Begin analyse op de fluorimeter met de instellingen die zijn beschreven in 1.5.4. Wacht ongeveer 2 minuten om een stabiele emissie basislijn op en voegt 1.8 µL van CaCl 2 (eindconcentratie is 10 µM). De emissie-intensiteit onmiddellijk na de toevoeging van de CaCl 2 zal toenemen, en zal dan verval in de loop van minuten, terwijl de calciumionen de mitochondriën invoert. Wacht totdat het verval is voltooid (≈ 5 min). Toevoegen van extra calcium bolussen om te bepalen van de mitochondriale calcium opname reactie van cellen niet behandeld met [Ru].
    5. In een ander cuvette bevattende 5 µM [Ru], herhaal het experiment, zoals hierboven beschreven in 1.5.4.3. In aanwezigheid van de Inhibitor van de omwenteling, zal emissie-intensiteit toenemen, maar niet vergaan. Deze opmerking betekent geblokkeerd mitochondriale calcium opname.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methode beschrijft een synthese van de mitochondriale calcium opname remmer [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] Cl2, vanaf een bekende ruthenium(III) grondstof. [Ru (NH3)5Cl] Cl-2 wordt gekenmerkt door IR spectroscopie, met vibrationele modi op 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1en 798 cm-1 (Figuur 1). Een kleine onreinheid bij 2069 cm-1 kan worden toegeschreven aan [Ru (NH3)5N2] Cl3. De reactie van deze soort Ru(III) met 1 M NH4OH biedt5Cl [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]. De voortgang van deze reactie blijkt uit een dramatische verandering in kleur van de oplossing van geel tot groen. De uiteindelijke reactie-oplossing is donkergroen van kleur. Verzuring van deze oplossing met geconcentreerd HCl leidt tot een kleurverandering tot bruin; een bijproduct van deze neutralisatie is ammoniumchloride, die het eindproduct besmetten kunnen als zorg niet wordt uitgeoefend. Zuivering van de verbinding verloopt via catie-uitwisseling chromatografie met behulp van sterk zure mesh (H+ formulier) hars. De hars is eerst geëquilibreerd met 0,10 M HCl en de oplossing van5 Cl [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] wordt geladen op de kolom. Het bijproduct van ammoniumchloride GC met het waswater 1 M HCl. Ruthenium-bevattende verbindingen elueren bij hogere concentraties van HCl. Een aantal gele breuken, die spoorverontreiniging [Ru (NH3)5Cl] Cl2 grondstof bevatten, komen off van de kolom wanneer de HCl concentratie is 1,5 M. Het gewenste product GC tussen 2.5-3.0 M HCl, en de resulterende breuken verschijnen groen aan groen-bruin van kleur.

Voorafgaand aan het bundelen van de breuken van het product, moet hun zuiverheid worden geverifieerd. Aangezien de gewenste compound enkele pH-afhankelijkheid in het spectrum van de UV-vis vertoont, raden we het toevoegen van kleine porties van de fracties aan zeer basische 3 M NH3 oplossingen om ervoor te zorgen dat de spectrale kenmerken hetzelfde zijn voor alle van de fracties. Pure breuken moeten alleen een intens hoogtepunt worden weergegeven bij 360 nm en een zwakke piek op 600 nm (Figuur 2). Pieken in de buurt van 480 en 533 nm wijzen op de aanwezigheid van ruthenium bruin en rood, respectievelijk, en een belangrijke piek op 260 nm, met een schouder naar 290 nm, betekent de aanwezigheid van [Ru (NH3)5Cl] Cl2 grondstof (Figuur 3 ). Roterende verdamping van pure breuken biedt de gewenste verbinding als een groen-bruine vaste stof.

De geïsoleerde compound kan verder worden gekarakteriseerd door zowel UV-vis en IR spectroscopie. De UV-vis spectrum (Figuur 2) geeft de 360 nm en 600 nm extinctie bands zoals hierboven beschreven. De coëfficiënt van de extinctie van de 600 nm band is 850 M-1cm-1 en voor de 360 nm band 27000 M-1cm-1. De verhouding van de intensiteit van de 360 nm band ten opzichte van de 600 nm band moet 31 in PBS pH 7.4, en deze statistiek kan effectief worden gebruikt voor het meten van de zuiverheid van de stof. Het IR-spectrum wordt weergegeven, zoals weergegeven in Figuur 4. De uitrekkende frequentie van Ru-O-Ru, is bijvoorbeeld diagnostische op 850 cm-1. Het IR-spectrum werkte om de Ru-O-Ru rekken en om ervoor te zorgen dat geen ammoniumchloride was aanwezig in het eindproduct. Ammoniumchloride, een gemeenschappelijk onzuiverheid, heeft vibrationele modi op 1762 cm-1 (zeer zwak) en 1400 cm-1 (sterk) die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van het IR-spectrum (Figuur 5). Ruthenium rode is een gemeenschappelijk bijproduct van de reactie en kan worden geïdentificeerd in de IR spectrum met rek op 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 en 800 cm-1, hoewel sommige met het gewenste product overlappen zal optreden) Figuur 6).

De reactie van de opname calcium in digitonin-permeabel HeLa cellen wordt waargenomen (Figuur 7). De sterretjes geven aan dat de toevoeging van een CaCl2 bolus. In aanwezigheid van [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] wordt Cl5 een toename van de emissie-intensiteit op calcium toevoeging, maar geen verval door mitochondriale calcium waargenomen opname wordt waargenomen.

Figure 1
Figuur 1 : Infrarood spectra van [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Het infrarood spectra van [Ru (NH3)5Cl] Cl2 met een zeer kleine [Ru (NH3)5N2] Cl3 onreinheid. De rode pijl geeft de onzuiverheid bij 2,069 cm-1Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Vertegenwoordiger UV-vis spectra voor zuiver materiaal. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 UV-vis extinctie spectra en nabij infrarood (inzet) in PBS pH 7.4 genomen. Het uitsterven coëfficiënt voor de grote absorptie bij 360 nm is 27.000 M-1 cm-1Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : UV-vis spectra van de ruwe reactiemengsel. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 UV-vis extinctie spectra van de ruwe reactiemengsel voor zuivering genomen in PBS pH 7.4. De rode pijlen geven aan gemeenschappelijk onzuiverheden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Representatief infrarood spectra voor zuiver materiaal. Het infrarood spectra van5Cl [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]. Het traject van de Ru-O-Ru bedraagt 850 cm-1, de andere stukken van de NH3 oscillatoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5/>
Figuur 5 : Infrarood spectra NH4Cl onzuiverheden bevatten. Het infrarood spectra van [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 met ammoniumchloride onreinheid. De rode pijl geeft ammoniumchloride op 1.400 cm-1Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Infrarood spectra van commerciële ruthenium red. Het infraroodspectrum van [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 (zwarte sporen) en commerciële ruthenium rode (rode trace). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Representatief calcium opname resultaten. De verhoging van fluorescentie als gevolg van de toevoeging van calcium op een cocktail van digitonin-permeabel HeLa cellen, Calcium groen-5N en5 Cl [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] in BGSS. De blanco bevat geen [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 en daling van de fluorescentie als gevolg van Ca2 + opname in de mitochondriën kan worden gezien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mitochondriale calcium opname remmer [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 kan worden gesynthetiseerd uit [Ru (NH3)5Cl] Cl2, een bekende ruthenium(III) grondstof, zoals beschreven in deze procedure. De synthese van [Ru (NH3)5Cl] Cl2 wordt gemakkelijk bereikt met weinig moeite. Hydrateren na roeren RuCl3 voor 16u in hydrazine, de pH van de oplossing moet worden aangepast aan een waarde van 2 met HCl. De daling van de pH is cruciaal voor het bereiken van het gewenste product. Indien gewenst, kan deze synthese aan formulier [Ru (NH3)5van Br] Br2 worden gewijzigd door refluxen in HBr in plaats van HCl.

Wij hebben geconstateerd dat sommige strategieën om te minimaliseren van de vorming van ongewenste bijproducten tijdens de synthese van de mitochondriale calcium opname-remmer. Met name het houden van de kolf afgetopt is cruciaal voor het succes van deze reactie; Als de kolf geopend is, worden een aantal andere bijproducten, met inbegrip van ruthenium-rood (RuRed), gevormd in aanzienlijke hoeveelheden. Gasvormige ammoniak is vermoedelijk verloren van de open reactievat, en deze gebeurtenis compromissen vorming van het gewenste product. De grootte van de kolf en de hoeveelheid waterige ammoniak zijn ook belangrijke parameters die mogen niet worden gewijzigd aanzienlijk uit die worden beschreven in dit protocol, zoals we hebben gemerkt dat de efficiëntie van deze reactie is gedaald in kleinere kolven. Deze methode vergroot niet drastisch het rendement van dit samengestelde in vergelijking met de andere twee methoden die we eerder had vermeld. Het doet, maar bevat minder stappen en aanleiding geven tot minder productvorming kant, zoals RuRed. Het lage rendement kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid spoorverontreiniging [Ru (NH3)5Cl] Cl2 evenals onbekend zeer betalen onzuiverheden die worden bewaard op de top van de kolom. Hoewel we niet veel extra reactie voorwaarden onderzocht, is het mogelijk dat er verbeteringen kunnen worden gerealiseerd door het variëren van de reactietijd en de reactieve concentraties, verkrijgen van hogere opbrengsten.

De zuivering van [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 is de meest vervelende en moeilijk deel van dit protocol. Een goed gevulde kolom zal sterk bijstaan bij de scheiding; laden van de hars als gier is een effectieve aanpak voor de verpakking van de kolom. Opgemerkt moet worden dat de HCl concentratie is toegenomen in de loop van de kolom-elutie, de hars in omvang krimpen zal. Voor het succesvol verkrijgen pure materiaal, moet het tarief waartegen de zuurconcentratie wordt verhoogd niet afwijken van de vermelde procedure. Het uiteindelijke product zal worden een groen-bruine vaste stof; een basisoplossing zullen donkergroen zal zure oplossingen echter bruin. Indien een helder roze-rood-oplossing wordt waargenomen, zijn ruthenium rode verontreinigingen aanwezig. Het bedrag van de RuRed kan worden bepaald met behulp van de coëfficiënt van uitsterven (62.000 M-1•cm-1 op 533 nm). Dit zuiveringsproces is vrij algemeen voor sterke catie-hars wisselingskolommen.

De remming van de opname mitochondriale calcium kan worden getest met behulp van permeabel HeLa cellen, de fluorescerende calcium sensor Calcium groen-5N en een spectrofluorimeter. 13 , 14 deze test vereist een grote hoeveelheid cellen en versterking van de cultuur in een zeer grote 500 cm2 petrischaal daarom dienen te worden. Deze grote cultuur kolven voorkomen extra uitdagingen bij het minimaliseren van bacteriële besmetting omdat de blootgestelde oppervlakten erg groot zijn. Werk moet worden uitgevoerd in een laminaire flow kabinet te handhaven van de steriliteit. De reactie van de fluorescentie van Calcium groen-5N in permeabel HeLa cellen wordt gecontroleerd door fluorescentiespectroscopie. De toevoeging van een externe bolus van calcium aan de cuvette triggert een onmiddellijke stijging in de fluorescentie, die voortvloeien uit de calciumionen interactie met de sensor. In de loop van enkele minuten bij gebrek aan een inhibitor van de omwenteling, de intensiteit vervalt als gevolg van opname van deze calciumionen in de mitochondriën, een organel dat de kleurstof niet toegankelijk. Wanneer deze bepaling is uitgevoerd in de aanwezigheid van een toevoeging van een bolus van calciumionen-remmer geeft aanleiding tot een verhoging van de emissie-intensiteit. Het verval als gevolg van mitochondriale calcium de opname, is echter niet aanwezig, de mitochondriale calcium opname remmende eigenschappen van dit samengestelde controleren. Dit proces kan worden gebruikt als een algemene scherm voor calcium opname remmers. Daarnaast kan deze procedure worden toegepast op andere eukaryotische cellen van belang. Deze bepaling is afhankelijk van de permeabilization van de buitenste cellulaire membraan dus biedt geen informatie over de cellulaire opname mogelijkheid van een complex.

Kortom, dit protocol beschrijven de synthese en de zuivering van een roman ruthenium gebaseerde mitochondriale calcium opname-remmer. Deze compound is van grote waarde voor de studie van de biologie van mitochondriale calcium en haar rol in de Fysiologie van de zoogdieren cel. De relatief eenvoudige assay voor het testen van mitochondriale calcium opname is ook van nut voor de screening en het onderzoek van nieuwe remmers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door de Cornell University. Dit werk maakte gebruik van de Cornell Center voor materialen gedeelde onderzoeksfaciliteiten, die worden ondersteund door de NSF MRSEC programma (Grant DMR-1120296). S.R.N. erkent ondersteuning via een NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) en Dr. Dave Holowka voor hulp bij de calcium-experimenten. Mening, bevindingen, en conclusies of aanbevelingen uitgedrukt in dit materiaal zijn die van de auteurs (s) en weerspiegelen niet noodzakelijk de standpunten van de National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruthenium Trichloride hydrate Pressure Chemical 3750
Concentrated hydrochloric acid J.T. Baker 9535
Concentrated ammonium hydroxide Mallinckrodt Chemical Works A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh Alfa Aesar 13945
Calcium Green 5N Invitrogen C3737
Digitonin Aldrich 260746
DMSO Aldrich 471267
EGTA Aldrich E3889
KCl USB 20598
KH2PO4 Aldrich P3786
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
HEPES Fluka 54466
Sodium Succinate Alfa Aesar 33386
EDTA J.T. Baker 8993-01
Glucose Aldrich G5000
200 Round bottom flask ChemGlass CG-1506-14
Glass stopper ChemGlass CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs Custom - similar to Chemglass columns Similar to CG-1203-20
DMEM Corning 10-017-CV
FBS Gibco 10437028
PBS Corning 21-040-CV
Round bottom Falcon tubes Fisher Scientific 14-959-11B 
500 cm2 petri dishes Corning 431110
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Hemacytometer Aldrich Z359629
Acrylic Cuvettes VWR  58017-875
UV-Vis spectrometer Agilent Model Cary 8454 
Spectrofluorimeter SLM Model 8100C
IR spectrometer Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge ALC Model PM140R
Inverted light microscope VWR  89404-462

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797, (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12, (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30, (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115, (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273, (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533, (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56, (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45, (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics