さまざまな地域と発展途上と大人の脳のラミナを明らかにするシナプス亜鉛化学の使用

Neuroscience

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Summary

パターンの異なる脳の領域を染色特性の層流および面積の亜鉛を明らかに組織化学的手順をについて説明します。レイヤーと領域を開発、大人の脳を確実に区別するためにその他の解剖学的マーカーと亜鉛染色パターンは組み合わせて使用可能性があります。

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Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

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Abstract

解剖学的および機能的な脳組織および開発の評価には、異なる神経回路と未熟な大人の脳の領域の正確な同定が必要です。ここで別のレイヤーと脳の間で染色パターンの違いを明らかにする亜鉛の組織化学的染色手順をについて説明します。他の人は亜鉛含有ニューロンと脳の回路の分布を明らかにするだけでなく、正常にいくつかの種の開発と大人の脳の面積と層流境界の線引きにもこのプロシージャを利用しています。ここで我々 は説明これ開発から画像とプロシージャを汚すと大人のフェレット脳。我々 はエリアのレイヤー、解剖学的マーカーとして機能する亜鉛染色パターンを明らかにして開発および成人の視覚野における視覚皮質を区別するために安心して使用できます。このプロトコルの主な目的は、レイヤーと他の方法がように失敗する発展途上と大人の脳の領域の正確な同定を可能にする組織化学的方法を提示することです。第二に、デンシトメトリーの画像解析と併せて、この方法により開発中の潜在的な変化を明らかにするためのシナプスの亜鉛の分布を評価するために 1 つです。このプロトコルは、試薬、ツール、および順次冷凍脳のセクションを染色に必要な手順の詳細について説明します。フェレット脳組織を使用してこのプロトコルを解説していますが、それは簡単に、齧歯動物、猫、または他の頭脳領域のように同様にサルでの使用に適応できます。

Introduction

組織学的汚れは伝統的建築の機能の違いを明らかにして様々 な種の皮質領野の同定の支援するために使用されています。ニッスル物質、チトクロム酸化酵素 (CO) 反応性ミエリンを組織化学的手法の併用は、成人の脳と同様の面積境界を明らかにする証明実り。しかし、これらの組織化学的汚れは皮質と未熟な脳の層の間の明確な境界を常に十分に明らかに行います。

中枢神経系における亜鉛の多数規制機能に参加してシナプス小胞の存在を通して神経調節物質として作用する酵素の補足因子としての DNA 構造の安定化を含むいくつかの重要な機能1。 それが視覚化できること組織学的手法を用いた蛋白結合亜鉛は可視化2をすることはできません一方、シナプス亜鉛はユニークな。この機能は、異なる皮質のシナプス亜鉛パターンを明らかにするために悪用されているし、組織化学シナプスの亜鉛は、多くの研究で使用されています。大脳皮質のグルタミン酸作動性ニューロンのサブセットには、その軸索ターミナル3,4内シナプス小胞中の亜鉛が含まれています。組織化学的研究は、大脳皮質の5,6,7でのシナプスの亜鉛の不均質分布を明らかにしました。異なる皮質領域 (例えば、体性感覚野と視覚的)、または層中の亜鉛の組織化学的反応性の異なる面積と層流分布をするようです (例えば亜鉛量は、顆粒と一次視覚野のではレイヤーが視床入力層 IV シナプス亜鉛の比較的低レベルでより大幅に高い)5,8,9。シナプスの亜鉛は、大脳皮質にみられる染色の不均一性は、面積と層流の識別を容易に特に有利であります。

Danscher の 1982年法10の修正版は、シナプスの亜鉛の化学プロシージャの詳細な説明をご紹介します。このメソッドは、キレート剤として、動物に亜セレン酸注入腹腔内 (IP) を利用しています。亜セレン酸は、脳内でグルタミン酸作動性シナプスのサブセットの小胞は、亜鉛のプールと反応する脳へ移動します。この反応は銀の開発2,,1011後高めることができる沈殿物を生成します。

この手順は、シナプス亜鉛の汚損; の層流および面積のパターンを明らかにします。デンシトメトリー分析は、感覚や環境、薬理学的、遺伝的操作など、他の介入の効果を研究する大人と未熟な脳で定性的・定量的にこれらのパターンを評価するために使用可能性があります。また、1 つはまた他のモデル系シナプス亜鉛その他の皮質や皮質下構造の分布の潜在的な発達的変化を評価しすることも。デンシトメトリーの分析を提供するこの方法で定量的な情報を時間をかけて次の脳の発達のために有利にすることができます。このプロトコルは、層流と地域の境界を明らかにする他の免疫・組織化学的マーカーにコンパニオンを提供します。

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Protocol

次のプロトコルによってすべての適切な州および連邦政府のガイドラインに準拠している施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、都市大学のニューヨークで、動物のケア ガイドラインに従います。麻酔、フェレットに適しており勉強の種に従って修正されるべき

Figure 1
図 1: このプロトコルの 3 フェーズで主要な手順の概要を示すフローチャート各ステップの完了に要する時間。完全に乾燥するにはセクションを必要とする期間は、他のすべての手順は、白いテキスト円中緑のテキスト円で表示されます。緑のダイヤモンド形のテキスト ボックスは意思決定ポイント赤い四角形の重要なステップは、余分な注意を払って実行する必要があります。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

1 です。 (スライド Subbing とソリューションを作る) の準備手順

  1. お湯で洗剤とユーチュッブ スライドを洗浄し、ほこりやゴミを徹底的に削除する蒸留水リンス後ぬるま湯で数回をすすぎ。室温または 37 のオーブンで乾かすのスライドを許可する ° C
  2. 卵白の薄もコート層の
  3. スライドが完全に乾燥して指や絵筆を使用して各スライドに。20-30 分の 60 ° C のオーブンで乾燥することができます。最適な結果を得るのため、セクションをオフに滑りを避けるために、卵白の第 2 コートを追加し、60 のオーブンでもう一度乾燥させて ° C
  4. 1 グラムの 100 mL のお湯 (60 ° C) にゼラチンを溶解することにより 1% ゼラチン液を準備し、部屋の温度に冷やすことができます
  5. セクション 4 で使用するため下記のとおりの開発者溶液 200 mL を準備します
    1. (この方法で溶けやすい) お湯 120 ml ずつゆっくりと 40 g を追加することによって準備アラビアゴム ソリューション。ガラス攪拌棒で攪拌ソリューションを続けます。ソリューションを完全に溶かし、一度暑さから削除し、いくつかの分間冷却し、漏斗にガーゼ布の 6-8 層をフィルター処理できるようにします
    2. 準備クエン酸バッファー 20 mL dH 2 O で 5.04 g クエン酸プラス 4.7 g ナトリウム クエン酸を追加し、混合物を溶解します。この溶液の pH が 4.0 で 25 分であることを確認 ° c. 水酸化ナトリウムや塩酸をソリューションに追加することで必要に応じて pH を調整します
    3. が 30 mL dH 2 O を加熱した後にハイドロキノンの 1.7 g 溶解ヒドロキノン溶液を準備します
      。 注意: は、ハイドロキノンは常温の水に容易に溶ける水に容易に溶解するように重要ですヒドロキノン溶液を加熱します。ハイドロキノンが酸化するかもしれないがそれ以外の場合、60 ° C 以下の水の温度を保つために注意してください。解決策は黄色する場合、は破棄し、別の新鮮なソリューションを準備します
    4. 準備銀が 0.22 g dH 2 o. の 30 mL の溶解液を乳酸
    5. ミックス ソリューション (1.4.1 - 1.4.4) (すなわち、区分、乾燥、および修正後) の反応を実行する準備ができたらを記述されている順序で ( 図 2)。最後に銀の乳酸ソリューションを追加します。この手順は、短時間で完了、乳酸銀は感光性のセクションを反応する時間まで、開発者解決が暗闇の中で置かれることを確認します

Figure 2
図 2: 手順のシーケンスを示す模式図プロトコルの亜鉛化学段階で試薬を混合します この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

2 です動物治療と麻酔

  1. 動物を鎮静前準備 1 mL dH 2 o ・亜セレン酸ナトリウム 10 mg を溶解することにより 1% ナトリウム亜セレン酸 (Na 2 SeO 3) ソリューション
  2. 麻酔のケタミン (25 mg/kg) とキシラジン (2 mg/kg の筋肉内注射を動物
    。 メモ: は、ペダル反射応答を使用して麻酔の適切なレベルを達成することを確認します
  3. 注入亜鉛キレート剤ナトリウム亜セレン酸溶液 (15 mg/kg 腹腔内 (IP).
    注: 異なる年齢でまたは他の種の亜セレン酸ナトリウムの毒性が変わる可能性があります
  4. は、脳への旅行に亜セレン酸ナトリウム 60 に 90 分を許可します。この期間中に動物が正しく鎮静が応答しないことを確認、だから 5 分ごとに麻酔の深さを確認することが不可欠だ
  5. 亜セレン酸期間中に動物を麻酔すると中を確認または湿潤を保つために眼軟膏を管理する、乾燥を防ぐために目が閉じられている

3。ティッシュの準備と染色

  1. ペントバルビ タール ナトリウム (100 mg/kg、i.p) の過量投与により、動物を安楽死させる
  2. 生理食塩水 1 分と 20 分の 4% パラホルムアルデヒド実行 transcardial の灌流は、最後に、4% パラホルムアルデヒドと 10% スクロース (1 h の合計固定期間) ソリューションを管理します
  3. 大きなはさみのペアを使用して頭を削除します
  4. 首に鼻からメスを使って頭蓋骨を公開する正中線切開します
  5. 慎重に脳を削除し、ブレードで半球を区切ります
  6. 脳の後部をブロックし、数時間に 0.1 M のリン酸バッファー (PB) で 4% パラホルムアルデヒドで後置します
  7. 0.1 M PB で 30% ショ糖液にブロックを配置でき、シンクに脳
    。 注意: 脳をシンクする鉛を 0.1 M で 30% ショ糖液 4% パラホルムアルデヒドと 30% ショ糖液に置き換える脳を制限 ' これとしてパラホルムアルデヒドに s 露出することができます組織染色質に影響します
  8. 脳回シンク カット半接線視覚野や凍結、スライド式ミクロトームやクライオスタットに関心領域を 40 μ m 厚セクションを。これは下面と優しくスライド ガラスの平坦化、内側のブロックを配置することによって実現できます
  9. 絵筆とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を含むタックル ボックス ストアのセクションを収集します
  10. は、別の番号のシリーズにセクションを区切ります。すぐに 1 つをマウントまたは卵白话スライド (セクション 1) 上の脳のセクションの 2 つのシリーズ、室温で一晩乾燥できるようにし、組織化学的シナプス亜鉛のセクションを処理します
    。 注: 他のシリーズは、ミエリン 12 13 の修正されたプロトコルを用いたチトクロム酸化酵素などの比較のため他のマーカーの処理可能性があります: 3% スクロース、0.015% シトクロム C、40 ° C で 2 8 時間インキュベート0.015% のカタラーゼと 0.1 M PB で 0.02% ジアミノベンジジン。ニッスル物質は、視覚皮質領域を区別するため組織学的マーカーとして使用する場合があります。伝統的なゼラチン コーティング スライド可能性があります代わりに使用するので、脳が卵白话スライド、マウントされているこれらの他の組織の汚れは必要ありません

4。シナプスの亜鉛化学

  1. 15 分の無水アルコールでマウント スライド セクションを修正し室温 1 時間で完全に乾燥させて
  2. < l私 > 10 のセクションを簡単に浸し 1% のゼラチン溶液 (セクション 1) s 室温で一晩乾燥できるようにと
    。 注: 最適な結果を得るのため、一晩乾燥してセクションを許可します。一晩乾燥してセクションを許可するより良い組織染色が得られます。
  3. セクションが反応する準備ができているとすぐに 1.8 の手順で説明するように、一緒に解決策をミックスします
    1. セクションをスライド ガラスまたはプラスチック製のトレイ、サイド バイ サイドの配置とスライド上に現像液を注ぐことによって反応します。そのスライド ソリューションに完全に沈んでいると暗い空間にトレイを転送または光タイト ボックスとカバーを確認します
      。 注意: プラスチック製のトレイは約 12 インチ 8 インチ ワイドで長期の使用される、まさに 18 スライドに適合。200 mL 開発者ソリューションの総容積はスライドが完全に水没、反応するし、レシピを調整するスライドの数を適切なボリュームがされていることを確認するのに十分です。ある開発者ソリューションで銀の乳酸および鉄の交叉反応の程度やその他金属の金属トレイとは、金属製のトレイを使用してではなくプラスチックまたはガラスのトレイの使用をお勧めします
  4. セクション 30 分毎を視覚的に調べることによって、反応の開発を監視します。セクションでは、完全な開発の 120-180 分通常必要があります
  5. セクションは、( 図 3 a を参照)、overstained になる場合は 2% で区別して農民 ' s ソリューション (9 パーツ dH 2 O で 1部 2% チオ硫酸ナトリウム 2% dH 2 O にフェリシアン化カリウム) 1-2 分の
    メモ: 不十分なステンド グラス サンプル セクションは 図 3 b に示されています
  6. 一度目的の強度を達成すると、スライドを削除することによって反応を停止させますトレイからスライド ラックにスライドを配置するセクションをマウントします
  7. 皿を汚す大きなガラスのスライド ラックを配置し、ゼラチン コートと外側の銀の預金を削除する 10 分間流水暖かい (40-50 ° C) にスライドを洗うです
    。 注: セクションをオフに滑りを防ぐためにスライド ラックを扇動するためにしないように気をつけてください。十分な層流の変化が明らかとセクションが暗い十分過剰反応しない (参照 図 4 a) セクションの目的の強度を実現します
  8. は常温で乾燥させると、100% の脱水のスライドを許可するエタノール (5 分)、キシレン (5 分)、およびメディアをマウントをカバー スリップで明らか。また、アルコールの昇順シリーズのスライドを配置し、脱水、明確にし、coverslip
  9. ネガティブ コントロールとして機能する以前の亜セレン酸治療せず動物からセクションを使用します。染色以下の銀増幅をもたらす必要がありますない

Figure 3
図 3: 染色少年フェレット脳シナプスの亜鉛。) Overstained、b) 少年フェレット脳内 understained 半接線の亜鉛染色切片の顕微鏡写真。地域の境界は、層流のバリエーションが不足するいるとを見分けることは困難です。白質は染色も大きく。Ssy Suprasylvian 皮質、WM ホワイト問題、前方、D 背。スケール バー = 500 μ m (b)。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

5 地域の境界を区別すると画像取得

  1. 使用面積と層流の識別のための異なる脳領域の建築機能します。
    。 注: たとえば、発展途上ラット後板状皮質の 14、著者明らかに亜鉛が大人に存在しないが、皮質を記述するために利用できる重い染色によって特徴付けられる一時的なモジュール性この種の開発時の組織。別研究 15, 著者らは、これらの部門の識別を容易にするサル扁が見つかりました別の核のシナプス亜鉛分布の特異性を明らかにしました。前述の 16 , 17 , 18, における大脳新皮質のアーキテクチャーの細分化をされている開発および大人のフェレット脳の視覚皮質野灰色リスは記述されていた 19.さらに、亜鉛化学以前に成人サル視覚野 8、開発および大人猫視覚野 5 ラット体性感覚野の開発の区域の間で区別するために使用しました。 9, 20、および成体マウス体性感覚野 6 , 21。利用可能な場合は、ミエリン染色、染色、チトクロム酸化酵素 (CO) とシナプス亜鉛大人の面の境界を確認するための脳のセクションを染色の染色パターンを比較します。フェレット視覚野のシナプス亜鉛のステンド グラスの半接線部に面積の識別を容易にする視覚皮質の間で顕著な違いがあります。たとえば、17 大人のフェレットの 18 の領域を明らかにすることシナプス亜鉛染色レイヤー III の高五層六汚れないより激しく、4 層にほぼ亜鉛が不足している中。亜鉛層 IV または暗く汚されたバンドとエリア 17 と 18 は対照的に染色の顕著な欠乏層 co IV 染色標本が見つかりました。ただし、染色標本領域 co 17 の 4 層保持層 III および V、鋭い境界層地区 18 IV は染色の微妙な減少によって特徴付けられる、その上限は、レイヤー III はボーダレス
  2. 低消費電力目的と明視野顕微鏡を使用してセクションを調べる (2 X または 4 X 倍率) 写真の関心のある分野と
  3. 効果を高めるコントラストと顕微鏡写真の画像処理ソフトウェアを使用しての明るさ。画像取得の光学密度計測を何らかの方法で変更しないようにします

Figure 4
図 4: シナプス亜鉛大人のフェレット脳で染色を区別します。異なる視覚皮質野。隣接する半接線断面の顕微鏡写真は、() シナプス亜鉛または (b) チトクロム酸化酵素 (CO) 大人のステンド グラス。矢印は、面の境界をマークします。Ssy Suprasylvian 皮質、前方、D 背。スケール バー = 500 μ m. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

6 (オプション) デンシトメトリー

注: Densitom。研究分析は、関心領域のセクションを染色代表的な亜鉛の光学密度を測定することによって脳のシナプスの亜鉛の分布を評価するために使用可能性があります。この方法は、開発中のシナプスの亜鉛レベルの潜在的な変化を追跡するのに役立ちます

  1. 選択使用亜鉛ステンドのセクションでは、ランダムに関心領域の取得顕微鏡写真から適切な幅 (450 μ m 幅の広い列を使用することができます) の皮層のコラム (円柱顕微鏡写真) を選択します。皮質の列は白質軟膜の表面からすべての皮質層にまたがる地域
  2. 興味の各地域でいくつかの異なる脳セクションからサンプルの列の適切な数を選択します
  3. 代表的な列のサンプル画像を画像処理ソフトに転送します
  4. 皮質列全体を包含する長方形選択ツールを使用します
  5. では、反転ツールを使用して、列の写真のネガのようなコントラストの反転イメージを作成します
    。 メモ: イメージのコントラスト反転は高いシナプス亜鉛レベルの高い光学濃度値と低シナプス亜鉛レベルの低濃度値を生成するため実行されます。これはプロファイルをプロットしたグラフを 図 5 に示すものと同様にレンダリングするより直感的な方法です
  6. 線に沿ってピクセル強度の二次元グラフを生成するプロットのプロファイル ツールを使用して、これらの画像から光の密度分布を生成します
  7. 鉛直分布をプロット断面図グラフを変換してプロットをクリックしてプロット オプションを使用プロファイル一度以上
    。 注: 行と y 軸に沿って x 軸を表す距離ピクセル強度を表します。したがって、各プロットのプロファイル値が列の幅を各水深平均グレースケール値を反映します
  8. 。 ワークシートでは、テキスト ファイルとして
  9. オープン プロット プロファイル値正常化し、( 図 5 参照) のグラフとしてプロットします
    。 注: 結果は、別の反応時間、他のプロパティと同様に、組織の持続可能性の結果として全体的な染色強度の変化によって混同することができます、定量的測定の比較のためシナプスの亜鉛の相対的な密度を使用することをお勧めです。変数
  10. は、データを滑らかにするプロットのプロファイル値の有蓋車の平均を行い相対亜鉛密度を計算します
    。 注: これは、たとえば、連続 20 または 30 ピクセルごとの平均 (1 ピクセル = 2.5 μ m) の深さ、および各サンプルの最大強度に正規化しで。したがって、各平均のプロットのプロファイル値はその深さ (階調値の範囲は 0 から 255 の範囲) で平均グレースケール値を反映します。関心分野の基になる白質を含むサンプルの地域からの最初取得白質 (WM) 光学密度値によって異なる正規化法が使えます。理想的には、WM の値の平均値を取得することが可能として軽く黒ずんでいるいくつかの地域を選択してください。光学密度の平均値が、WM の正規化された値を取得する平均の WM 値で割ります
  11. を決定する定量的な比較のための関心領域の特定の層に光学濃度値の平均です
    。 メモ: たとえば、フェレットの視覚皮質の層 IV の平均最小光密度値 ± 5 ピクセルによって少なくとも染色領域を包含によって決まりますがします
  12. 平均の最大値を決定する ± 5 ピクセルで暗い染色領域を包含するフェレットの視覚皮質野の顆粒とでは層で計算平均光密度の値します
  13. 。 光学濃度値の平均
  14. ことを確認特定の層内から取得されます
    。 注: 隣接する CO セクションと同様、元の顕微鏡写真を比較することによってコントラスト反転画像にこれらの層の限界を確認することが不可欠です。これは 1 つは隣接するレイヤーを侵害していないことを保証します

Figure 5
図 5: さまざまな視覚皮質のシナプスの亜鉛の薄層の分布大人のフェレットの領域。大人の対応する正規化された光学濃度プロファイルを持つすべての皮質層の列の代表的な顕微鏡写真。大人の領域 17 と 18 の 4 層で低シナプス亜鉛濃度は、プロファイルのプロットでトラフによって示されます。各プロット プロファイル層 IV のトラフの塗りつぶされた楕円形は平均最小のピクセルの輝度の値を決定する値を示します。スケール バー = 200 μ m. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Representative Results

図 1のフローチャートのシナプス亜鉛の脳のセクションを染色するこのプロトコルに関連する主要な手順が掲載されています。プロトコルは 3 つのフェーズに分けることができます: 1) 血流や組織の採取、2) ティッシュの準備と染色と 3) 亜鉛化学。簡潔に、プロトコルの最初のフェーズは、動物は麻酔をかけられ、亜セレン酸ナトリウムの適切な投与量と IP を注入します。十分な時間の経過の (理想的には 60-90 分) 後、は、動物がその後安楽死させた後 4% パラホルムアルデヒド溶液に 0.9 %nacl 水溶液の灌流が。頭は首し、脳が頭蓋骨からすぐに削除されます。脳は、4% パラホルムアルデヒド プラス保護剤の検討として 30% ショ糖液でシンクできます。プロトコルの 2 番目のフェーズで凍結切片をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に切断 40 μ m での滑走式ミクロトームで、番号のシリーズに分けます。最適な結果を得るのための一晩乾燥してセクションを残して断面、直後後卵白话スライド セクションをマウントすることが重要です。ゼラチン话 subbing のソリューションで通常使用される硫酸カリウム クロム cross-reacts 銀の乳酸と最適染色につながるよう、スライドは推奨されません。セクションを無水アルコールと室温で完全に乾燥を左で 15 分間インキュベーションします。この手順は、早めに、準備 1% ゼラチン液でマウントされたセクションの簡単な水没に続いては、最適な結果を得るのために一晩乾燥させています。プロトコル (亜鉛化学) の最後の段階で開発者溶液を調製して、メソッドのセクションで説明する手順に従って、スライドは、ソリューションに沈んでプラスチックまたはガラスのトレイに配置されます。汚れの開発は通常 2-3 日間かかりますが、近い外観検査はセクションを overstaining を避ける必要があります。適切な強度を達成したとき、スライドの削除、スライド ラックに配置および外側の銀の預金を削除する 5-10 分のために暖かい水で洗浄する必要があります。常温、クリア、coverslipped セクションを乾燥し、ことができます。プロトコルの亜鉛化学フェーズを完了するために必要な具体的な手順の概略を図 2に示します。

このプロトコルは、フェレット脳の視覚皮質の間で染色レベルの面積と層流の変動を明らかにするのに組織化学シナプスの亜鉛を使用します。このプロトコルは、他の頭脳領域のように同様に他の種で使用するために合わせることができます。たとえば、フェレットや他のモデル システムの体性感覚、聴覚、または前頭皮質など他の感覚野を調査している研究は、この組織化学的染色を使用してから大きく恩恵。この手法の主な利点は、齧歯動物、フェレット、猫、猿などの動物の子供で皮質を確実に区別し同様、大人の地域識別を容易にするために区域間の明確な転移を提供することです。

図 3 aは、プロセスでステンド グラスのセクションも長い、従って、我々 は誤って用に開発された overstained 亜鉛の例を示します。Overstained 組織は、非常に濃い茶色色、層流の変化の欠如によって特徴づけられるし、白質を強く染色です。ただし、図 3 bに示すように亜鉛ステンドの脳のセクションは understained 時。Understained セクションは、脳への旅からすべての挿入されたセレンを排除する時間 (60 分以上) の十分な量の動物が生存しなかった場合を生じる場合があります。亜セレン酸は正しく投与しない、したがって脳へ旅行していなかった組織の understaining があります。

大人のフェレットの複数の視覚皮質野における染色シナプスの亜鉛の不均質分布を図 4 aの代表的な半接線のセクションに示します。矢印は、面の境界をポイントします。17 と 18 の分野でシナプス亜鉛の染色強度は一般的に高層の I、II、III、および V、低層 IV (thalamorecipient 層)、および層 VI で中程度の。エリア 17 と 18 間の明確に識別できる転移の存在は、図 4 aで明らかです。地区 18 層 IV 染色強度が若干増加して変数の強度は V 層減少します。図 4 bは、チトクロム酸化酵素 (CO) 我々 は亜鉛染色で観察された地域の境界のような場所を示すため隣接するセクションです。CO 染色の低レベルを持っている 17 と亜鉛の高レベルを一般に持っている 18 の領域の領域が表示されます。

エリア 19 と 21 のシナプスの亜鉛の分布は、両方の領域 17 と 18 の分野でより少ない層流のバリエーションがあるつーことです。エリア 19 と 21 の 4 層は、それが適度にステンド グラス エリア 17 と 18 の 4 層とは明らかに違います。エリア 19 の顆粒とでは層似たような強さの V 層のわずかにより暗い汚れ。エリア 21 は、エリア 19 に匹敵するシナプス亜鉛分布。ただし、エリア 21 の VI 層は地域 19 の 4 層よりも大きいのシナプスの亜鉛レベルによって特徴付けられます。レイヤー VI と Suprasylvian IV (Ssy) 染色する適度に見えるし、匹敵する強度ですが、V 層はシナプスの亜鉛のより高いレベルによって特徴付けられる顆粒層は、シナプスの亜鉛レベルの変動パターンによって示されます。

だから必要な場合、異なる脳の領域は、さまざまな治療法や、さまざまな年齢層でシナプスの亜鉛の分布の定量的評価を実現できます。例えば、シナプス亜鉛大人でまたは第一次視覚野、聴覚、開発全体の分布の変化と任意の系における体性感覚野を評価することも 1 つ。デンシトメトリー分析を使用して、我々 は以前に、シナプスの亜鉛の分布複数の視覚野で (17、18、19、21、および Suprasylvian) フェレット脳の発達の年齢17の 6 週に 5 から大幅減少します。ここで我々 はプロセスを説明するために大人のフェレットから採取した代表的なサンプルのシナプスの亜鉛の分布の違いを評価するために必要な手順を説明します。これらの手順は、種や脳の他の地域と同様に少年フェレット視覚野を同様のシナプスの亜鉛の分布の変化を追跡することができます。大人の脳のセクション、相補的な正規化された光学密度プロット プロファイルと一緒に亜鉛化学処理から代表的な柱状の顕微鏡写真を図 5に示します。光学濃度値の正規化されたプロットは、皮質の深さに応じた変更を反映するように生成されました。したがって、各プロットのプロファイル値は、連続した皮質水深平均グレースケール値を反映します。例えば、エリア 17 と 18 は、亜鉛層 IV (トラフによって表される)、彼らのプロットのプロファイルから明らかになっている染色で顕著な減少によって特徴付けられます。エリア 17 と 18 の最小の光学密度値はいっぱい黒い楕円形で示されますを意味します。染色, 低亜鉛 19、21、および Ssy のエリアの亜鉛で微妙なディップ層 IV のみとエリア 17 と 18 は対照的のレベルします。総称して、エリア、レイヤー全体の亜鉛レベルは、17 と 18 の地域よりもより均一な 19、21、および Ssy が 17、18 のエリアよりも質的に異なる。また、顆粒層とエリア 17 と 18 の V 層通常染色しない層の VI よりももっと激しく。

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Discussion

現在の研究では、Danscher (1982) 法10、シナプス亜鉛の局在が検出され、脳で可視化するという修正版に基づく組織化学的手法を採用しています。このメソッドは本質的に亜鉛キレート剤ナトリウム亜セレン酸 (Na2SeO3) 動物 (15 mg/kg) を注入することによって動作します。注入後、亜セレン酸は脳に移動し、亜鉛亜鉛含有ニューロンのシナプス小胞にローカライズされたバインドします。亜鉛イオンはシナプス小胞の沈殿物内の分子にバインドされ、その後物理的な開発2,11的に視覚化できます。元のティムの硫化銀染色法は、検出し、生体組織22Au、Ag、Pt、Fe、Cd、Cu、Ni、Zn など重金属の数を視覚化する意図されていた。このメソッドに使用されるキレート剤は、硫化ナトリウムです。したがって、ティムの硫化物法を用いた主要な問題は、金属硫化物に変換することができます任意の金属に銀の物理的な開発によって増幅されるかもしれない確かに特異性の欠如です。ただし、現在の研究で使用されている Danscher メソッドの修正版は、亜鉛とは他の重金属に固有です。Danscher の 1982年法と本法の本研究で述べるいくつかの違いがあります。Danscher のメソッドは、我々 は凍結するティッシュを使用して固定されていない新鮮な脳組織を使用します。Danscher はまた、血流のパラホルムアルデヒドを使用する免疫組織化学的、我々 は定期的に私たちの研究室での染色他組織学的マーカーとの互換性これが、グルタルアルデヒドを使用します。Danscher はまた、トルイジン ブルー (1%)、我々 は本手法では実行しないなどの poststaining のプロシージャを使用します。

本手法の 1 つの制限は、ナトリウム亜セレン酸耐性を持つ動物に関連付けられている予測です。我々 は、亜セレン酸ナトリウム投与、時々 動物残らない 30 分以上を見つけます。亜セレン酸、脳への旅行には十分な時間ができないし、脳のセクションのそれに続く開発は通常不均一な組織染色につながるこのような状況が問題します。もう一つの潜在的な制限は、亜セレン酸ナトリウムの腹腔内投与の適切な管理に関連付けられます。1 つはより低い腹部キャビティの上の皮膚にプルする必要があります、腹壁だけを貫通 15-20 度の角度でを針ベベル側を挿入します。針必要がありますに引き戻され少し腹部臓器が浸透していない材料が吸引されていないことを確認します。針を破棄し、これが発生した場合は交換する必要があります。

高品質な染色結果と再現性を確保するため、次の警告措置をお勧めします。動物の動物、および最大生存期間に亜セレン酸ナトリウムを適切に管理 (90 60 分が最適)、安楽死させる前に脳への旅行にセレンに十分な時間を確保するために欠かせない。我々 はその短い生存期間を発見した (30 分以内) 通常不均一な組織染色に 。同様に、重要なステップは、ブロックを切断した直後に卵白话スライド セクションを装着します。日数の間、PBS の凍結切片を新鮮なカットを残してはに対して強く助言としてソリューションに亜鉛イオンが溶出します。開発者向けソリューションの準備中、クエン酸バッファーが正しい pH (4.0) この反応は pH の小さい変化に非常に敏感なことを確認する重要です。同様に、ヒドロキノン溶液を加熱は、それは 60 の ° C の下の温度を維持するために不可欠であるが、さらに加熱としてソリューションを酸化し、汚れを抑制します。同様に、ゼラチンのスライド マウントのセクションを簡単に水没が非固有セクションの表面に銀の沈着を防ぐため重要です。ただし、セクションはない 10 以上のゼラチン溶液に残っているべきこれとして s の原因に縮まる不均一な組織染色につながるようになります。開発者ソリューション中のセクションの定期的な目視検査を残して以来のセクション長すぎる overstaining につながることができます勧めします。この汚れはかなりセクションは周囲の温度が暖かいともっとゆっくり温度が涼しいときより迅速に開発する傾向があるので温度に敏感であります。最後に、ゼラチンやスライドから残留銀預金の除去を容易にするために暖かい水ですすぎ段階スライド ラックにスライドを軽く振るする場合があります。しかし、スリップするセクションを引き起こすことができますぬるま湯でスライドを洗浄中のセクションの余分で、不注意な攪拌はスライドをオフ、避けるべきであります。また、定量的な比較を行うため濃度測定のため使用は適切なコントロールが重要です。1 つは潜在的内部統制として軽く、染色または非汚染地域を使用可能性があります。当社の素材開発全体を通して異なる視覚皮質野の光学密度値を正規化するのにとコントロールとして、白質を使用します。我々 は、白質の値が匹敵するさまざまな年齢層の間で、大人17である見つけます。したがって、ことを考えると白質値は年齢の関数として変化しません、白質はデンシトメトリー分析の有効なコントロールとして機能します。

この方法の主な利点は、分布が使えるので、他の組織化学的マーカーのような脳の領域を区別するために、シンプルで信頼性の高い組織化学的染色であることです。しかし、この組織化学的方法の使用は (それらが亜鉛に欠けている) 特定の細胞集団を研究適さない場合がありますまたはシナプス亜鉛として非常に若い動物レベルがマウス体性感覚とネコ視覚野5 の開発に示すように、出生時低 ,20。このプロトコルの別の利点は、神経解剖学的トレーサー注入実験と組み合わせて使えます。私たちの研究室で通常視覚野における複数の領域間の接続パターンの発達的変化を研究する少年のフェレットの一次視覚野に双方向神経トレーサーを注入します。したがって、別の実験研究動物が悪用される場合動物がもっぱら亜鉛化学の使用されない必要があります。この方法の主な利点は、他の種や他の頭脳領域での使用に適応することができます。フェレットの脳組織を使用してこのメソッドを示しましたが、齧歯動物、猫、サルの脳組織を勉強するときに手順のいくつかの微妙な違いが可能性があります。他は正常に染色成人サル視覚野8、開発および大人猫視覚野5ラット体性感覚野9の開発の違いを説明するためにこの亜鉛の組織化学的手法を使用しました。,20、成体マウス体性感覚野6,21, および成人パルマ ワラビー視覚野7

ここで、我々 は高品質亜鉛染色を一貫して達成するために制御する必要がありますプロトコルおよびアンダー スコアの重要なパラメーターの基本的な手順を概説します。1 つは他の感覚や運動野のシナプスの亜鉛レベルまたは他のモデル動物における皮質下構造の変化を評価する必要があります。その濃度の定量的な情報を解析は、このメソッドは (17以前示されている)、次の時間と異なる脳領域間のシナプスの亜鉛レベルのおそらく明らか別の発達プロファイルの皮質の開発のために有利にすることができます。重要な考慮事項は、発達の質問と勉強する動物の対応する年齢です。シナプス亜鉛化学はフェレットで明確に識別できる視覚皮質を明らかにし、皮質の組織と機能のさらなる研究に有用なガイドとして役立つかもしれない。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作業は、研究資源 (2G12RR03060 26A1); 国立センターからの補助金によって支えられました。少数の健康および健康格差 (8G12MD007603-27) 国立衛生研究所から国立研究所プロフェッショナル スタッフ議会市立大学ニューヨーク (PSC ニューヨーク市立大学);教員の研究グラント (ドイツ連邦共和国 II) アメリカ大学シャルジャ.Vidyasagar Sriramoju は、これらのメソッドにご紹介を感謝いたします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

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References

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