Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol beschrijft een methode voor gelijktijdige beeldvorming van thalamocortical axon vertakking en de synapse formatie in organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri. Individuele thalamocortical axonen en hun presynaptische terminals worden gevisualiseerd door een eencellige electroporation techniek met DsRed en synaptophysin van GFP-gelabeld.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Axon vertakking en de synapse formatie zijn cruciale processen voor de vaststelling van nauwkeurige neuronale circuits. Tijdens de ontwikkeling vormen de sensorische thalamocortical (TC) axonen takken en synapsen in bepaalde lagen van de hersenschors. Ondanks de voor de hand liggende ruimtelijke correlatie tussen axon vertakking en de synapse formatie, is de causale relatie tussen hen slecht begrepen. Om aan te pakken dit probleem, ontwikkelde we onlangs een methode om gelijktijdige beeldvorming van vertakking en de synapse formatie van individuele TC axonen in organotypic cocultures.

Dit protocol beschrijft een methode die uit een combinatie van een organotypic coculture en electroporation bestaat. Organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri vergemakkelijking van genetische manipulatie en waarneming van axonale processen, behoud van de karakteristieke structuren zoals laminaire configuratie. Twee verschillende plasmiden codering DsRed en EGFP-gelabeld synaptophysin (SYP-EGFP) waren samen transfected in een klein aantal thalamus neuronen door een electroporation techniek. Deze methode konden we visualiseren van individuele axonale morphologies van TC neuronen en hun presynaptische sites tegelijk. De methode ook ingeschakeld op lange termijn waarneming waaruit bleek het oorzakelijk verband tussen de axon vertakking en de synapse formatie.

Introduction

De projectie van de thalamocortical (TC) in de hersenen van zoogdieren is een geschikt systeem om axon begeleiding en gericht op mechanismen te onderzoeken. Tijdens de ontwikkeling groeien sensorische axonen van de TC in de corticale plaat, en de takken van de vorm en de synapsen bij voorkeur in laag IV van de primaire sensorische gebieden in de hersenschors1,2. Zelfs na de oprichting van fundamentele verbindingen, zijn axonale arbors en synaptische terminals verbouwd afhankelijk van milieuveranderingen3,4. Hoe de TC axon morfologie wordt dynamisch gewijzigd is echter slecht begrepen. Een van de belangrijkste redenen is het ontbreken van een adequate techniek te observeren van structurele veranderingen op het niveau van een enkele cel. Hoewel recente ontwikkelingen in microscopie, zoals twee-foton microscopie, hebben directe observatie van levende corticale neuronen in vivois toegestaan, zijn er nog steeds technische beperkingen voor het vastleggen van de algemene TC trajecten5, 6. Daarom, in vitro methoden voor live beeldvorming van TC axonen zou bieden krachtige hulpmiddelen voor structurele analyses van axon vertakking en de synapse formatie.

Onze fractie voor het eerst vastgesteld een statische segment cultuur methode met permeabel membraan7. Met deze methode een rat corticale segment was cocultured met een zintuiglijke thalamus blok en lamina-specifieke TC verbindingen werden gerecapituleerd in deze7,, organotypic cocultures8. Sparse labelen met een fluorescente proteïne verder konden we observeren TC axon groei en tak vorming9,10,11. Onlangs hebben we een nieuwe methode voor gelijktijdige beeldvorming van vertakking en synapse formatie van individuele TC axonen in de organotypic cocultures12. Om te visualiseren TC axonen en presynaptische sites tegelijk, waren DsRed en EGFP-gelabeld synaptophysin (SYP-EGFP) samen transfected in een klein aantal thalamus neuronen door electroporation van de organotypic coculture. De huidige methode morfologische analyse van TC axonen vergemakkelijkt en zorgt voor lange termijn waarneming, die kan worden gebruikt om het oorzakelijk verband tussen de axon vertakking en de synapse formatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren die zijn vastgelegd door de commissies van het dierenwelzijn van Universiteit van Osaka en de neurowetenschappen Society van Japan.

1. Organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri

Opmerking: Voor de gedetailleerde procedure, verwijzen naar de oorspronkelijke publicaties7,8,13. Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Sprague-Dawley (SD) ratten worden gebruikt voor neuronale culturen.

  1. Preparaten van reagentia
    Opmerking: Volumes van de volgende reagentia zijn voor een rat hersenen.
    1. Voorbereiden 10 x gemodificeerde N2 Supplement 13: insuline (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hydrocortison (200 nM), Natriumseleniet (300 nM), transferrine (1 mg/mL), als putrescine (1 mM), glucose (60 mg/mL)
    2. Serum-bevattende kweekmedium voorbereiden (10 mL): 85% DMEM/F12, 10% 10 x bewerkt N2 supplement, 5% foetale runderserum (FBS)
    3. Serumvrij cultuurmedium voorbereiden (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% 10 x bewerkt N2 supplement
    4. Bereid rat staart collageen oplossing (0,5 mL). Kortom, neem tedere vezels uit de staart van een rat onder steriele omstandigheden en na een nacht bebroeden in azijnzuur-oplossing. Na het centrifugeren, verzamelen het supernatant (een paar mg/mL) en opslaan in een koelkast-13.
  2. Bereiding van gerechten van de cultuur
    1. Plaats een membraan invoegen in een 35 mm petrischaal.
    2. 40-50 μl van rat staart collageen oplossing toevoegen aan het membraan, en verspreiden de collageen oplossing rond het centrum.
    3. Lucht drogen het membraan volledig in een schone bankje.
    4. Zet 1,5-2 mL serum-bevattende gestolde voedingsbodem in de schotel, zodat het membraan doorweekt met het medium is.
    5. Zet de schotel van cultuur in een incubator (37 ° C, bevochtigde lucht van 95% en 5% CO2) voordat plating.
  3. Voorbereiding van corticale segmenten
    1. Steriliseren alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol gedurende 10 minuten of langer.
    2. Ontleden van de hele hersenen snel uit een postnatale dag (P) 2 rat onder ijskoud verdoving (ondergedompeld in ijs-chips voor een paar minuten).
    3. Plaats de hersenen in een 100 mm petrischaal met 100 mL koude Hanks evenwichtige zoutoplossing.
    4. Verwijder de pia zaak van de hersenen met een fijne Tang, en corticale segmenten (300-400 μm dikte) uit de visuele en Somatosensorische cortex met microchirurgische schaar geknipt (voor detail, Zie Figuur 1).
      Opmerking: De dikte van de corticale segmenten is ruwweg geschat door de omvang van rasters onder een verrekijker Microscoop.
      Opmerking: Anderzijds kunnen de corticale segmenten worden gemaakt met een vibratome onder steriele omstandigheden.
    5. Breng een paar corticale segmenten op het membraan invoegen met een disposable plastic pipet.
    6. Aanpassen van de posities van de segmenten in de buurt van het centrum van het donormateriaal cultuur met een brand-gepolijst Pasteur Pipet (voor meer informatie, Zie8,13) en verwijder overtollige medium van het inzetstuk.
      Opmerking: Het niveau van het medium iets onder de oppervlakte van de segmenten aanpassen zodat de plakjes een toereikend aanbod van zowel de gas- en middellange kunnen ontvangen. Dit is essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen.
    7. Gedurende de segmenten in het kweekmedium serum-bevattende bij 37 ° C in een omgeving van bevochtigde 95% lucht en 5% CO2, en cultuur alleen al een dag voordat een thalamus blok is genomen en naast het geplaatst.
  4. Voorbereiding van de thalamus blokken
    1. Steriliseren alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol gedurende 10 minuten of langer.
    2. Anesthetize een zwangere rat (embryonale dag 15) door intraperitoneale injectie van pentobarbital (50 mg/kg) met verdoving.
    3. Ontleden van elk embryo uit de baarmoeder horens, en plaats de embryo's in een petrischaal met 100 mL koude Hanks evenwichtige zoutoplossing van 100 mm.
    4. Onder een binoculaire loep, verwijderen de hersenen uit elk embryo en snijd thalamus blokken waarin vooral het ventrobasal complex en laterale geniculate nucleus (ongeveer 0.5 mm x 3)7 gebruik van microchirurgische schaar (Zie Figuur 1).
  5. Cultuur en onderhouden van organotypic cocultures
    1. Met behulp van een pipet van Pasteur, plaats de thalamus blok naast de ventriculaire oppervlak van de corticale segment die in het membraanfilter heeft gebracht.
    2. Het handhaven van de cocultures in het serum-bevattende kweekmedium bij 37 ° C in een klimaat van bevochtigde lucht van 95% en 5% CO2.
    3. Wisselen van helft van het medium met de serumvrij cultuurmedium na twee dagen in cultuur. Daarna wisselen het medium elke 2-3 dagen.
      Opmerking: Het niveau van het medium moet worden gecontroleerd na de middellange exchange, want het is belangrijk voor de overleving van de cel.

2. Electroporation

Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.

Opmerking: Uitvoeren electroporation één dag na de voorbereiding van de thalamus blokken om te voorkomen dat de onthechting van de blokken.

  1. Plasmiden
    1. Maak een mengsel van plasmiden, als volgt: pCAGGS-DsRed 2 μg/l; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      Opmerking: Zuiveren van de beide plasmiden met behulp van een endotoxine-vrije Maxiprep kit en los op in Hanks evenwichtige zoutoplossing.
  2. Electroporation apparatuur installatie
    De elektrische instrumenten zoals een stimulator en een isolator moeten worden aangesloten, zoals weergegeven in Figuur 2.
    1. Sluit de stimulator aan de tweefase isolator.
    2. Verbind een elektrode (een zilveren 0.2 mm draaddiameter) met de negatieve aansluitklem van de isolator.
    3. Sluit een elektrode (een zilveren draad 1 mm doorsnede) in serie met een weerstand van 100 Ω en de positieve aansluitklem van de isolator.
    4. De versterker verbinden met de oscilloscoop om te controleren of de elektrische stromen worden doorgegeven via de weerstand door het meten van de spanning met de versterker.
  3. Voorbereiding van glas pipetten
    NB: Twee soorten glas pipetten worden gebruikt voor het uitwerpen van de plasmide-oplossing en toepassing van elektrische pulsen.
    1. De pipetten van glas haarvaten met een trekker van de elektrode te maken.
    2. Breken de tip voor de pipet uitwerpen (de tip diameter moet 20-50 μm).
    3. Slijpen en polijsten van het uiteinde van de pipet elektrode met schuurpapier gevolgd door brand-polijsten (de binnendiameter moet 50-200 μm).
      Opmerking: De tip van de elektrode moet vlak en glad, als het rechtstreeks het weefsel raakt.
  4. Procedure van electroporation
    1. De ejectie en elektrode pipetten verbinden met de manipulatoren.
    2. Steek een zilver draad (0.2 mm doorsnede) in de pipet elektrode.
    3. De ejectie pipet hechten aan een injectiespuit 1 mL met een plastic buis.
    4. Oppakken > 5 μL van plasmide oplossing in de pipet uitwerpen door spuit afzuigen.
    5. Zet de coculture op het podium electroporation, en de 1 mm diameter elektrode invoegen het kweekmedium.
    6. Plaats de pipet uitwerpen op de thalamus explant.
    7. Duw de spuit handmatig na de tip het oppervlak van de thalamus blok raakt.
      Opmerking: Over 0,5 μL van de plasmide wordt oplossing meestal gebruikt per één blok van de thalamus.
    8. Plaats de pipet elektrode op de thalamus blok onmiddellijk na intrekking van de pipet uitwerpen.
    9. Leveren elektrische pulsen (50-400 μA, 3 tot en met 5 treinen van 200 vierkante pulsen van 1 ms duur bij 200 Hz). Toezicht op de amplitude en het aantal treinen op de oscilloscoop.
      Opmerking: De amplitude van elektrische stromen, is afhankelijk van de binnendiameter van een elektrode Pipetteer13.
    10. Intrekken van de elektrode pipet en terugkeren van de schotel naar de incubator.
  5. Microscopische waarneming
    1. Zet de schotel cultuur op een microscopische fase van een rechtop confocal microscoop uitgerust met twee filter sets voor EGFP (excitatie, 488 nm, emissie, 515 nm) en DsRed (excitatie, 514 nm, emissie, 565 nm).
    2. Neem beelden van 10-25 optische secties op 1-7 µm-stap maten met een 20 X lang-werkende afstand objectief. Selecteer individueel te onderscheiden gelabelde axonen die zowel DsRed als SYP-EGFP uitdrukken.
      Opmerking: De geconstateerde oppervlakte bedraagt ongeveer 0.7 x 0,7 mm (1024 x 1024 pixels, oftewel correspondeert, 0.68 μm/pixel).
    3. Elke 24 uur per dag voor dagelijkse imaging beelden vastleggen. Vul binnen 10 minuten bij kamertemperatuur en de culturen terug te keren naar de incubator. Voor korte-interval tijd vervallen imaging, houden de cultuur in de kamer van een cultuur, die onderhoudt dat de omgeving van bevochtigde 95% lucht en 5% CO2 bij 37 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het experiment beschreven hier is gericht op het onthullen van de relatie tussen TC axon vertakking en de synapse formatie. Om te visualiseren gelijktijdig axonale trajecten en locaties van exocytose sites, één of een paar thalamus cellen in organotypic cocultures transfected waren met twee plasmiden codering SYP-EGFP en DsRed met behulp van electroporation. Tijdens de tweede week in cultuur, zijn individueel te onderscheiden TC axonen duidelijk gemarkeerd door DsRed (Figuur 3). Alleen de axonen die DsRed en SYP-EGFP tentoongesteld werden geselecteerd voor observatie. Gelabelde TC axonen de corticale segment binnengevallen en takken gevormd voornamelijk in de bovenste lagen, die aangeeft dat de thalamus axonen in het organotypic formulier takken met laminaire specificiteit die lijkt op die gevonden in vivo7, cocultures 8,10,14,15,16,17. Op hetzelfde moment, kon punctate samenvoegingen van SYP-EGFP (SYP-EGFP puncta) worden waargenomen langs DsRed-geëtiketteerden TC axonen (Figuur 3D-3F). Aangezien deze SYP-EGFP puncta waren meestal colocalized met immunopositive signalen voor VGLUT2, oftewel een presynaptische marker van de thalamus cellen, en voor PSD95, die een algemene postsynaptisch marker is, is het waarschijnlijk dat SYP-EGFP puncta meestal vertegenwoordigen exocytose sites op TC axonen12.

Time-lapse beeldvorming van TC axonen verder bleek dat axon vertakking en de synapse formatie van thalamus neuronen waren continue en dynamische toevoeging en eliminatie (Figuur 4)12. Bovendien bleken de meeste takken voortkomen uit SYP-EGFP puncta, die aangeeft dat de presynaptische sites leiden tak vorming (voor meer informatie, Zie12 tot).

Figure 1
Figuur 1 . De procedure voor de voorbereiding van een cocultures van de organotypic van de thalamus en cortex cerebri. (A) het bovenaanzicht van een neonatale rat hersenen. De eerste snede wordt evenwijdig aan de middellijn (1) gemaakt. Dan 300 - 500-μm-dikke coronale secties worden gesneden van de primaire visuele en Somatosensorische cortex (2). Tot slot, maken een parasagittal gesneden te verkrijgen van de corticale segmenten (3). (B) een schematische weergave van een coculture van de organotypic van de thalamus en cortex cerebri. Corticale segmenten van postnatale dag 2 rat en thalamus "blocks" van embryonale dag 15 zijn cocultured op het membraanfilter. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Een schematisch diagram van elektrische instrumenten voor electroporation. De stimulator, de isolator en de elektrode pipet zijn in serie geschakeld. Om te leveren negatief-geladen DNA, is de elektrode-pipet aangesloten op de negatieve aansluitklem van de isolator. De elektrische stromen voor electroporation, kunnen worden gecontroleerd met de oscilloscoop. TH: thalamus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Thalamocortical in een coculture na 2 weken in cultuur axonen. (A--F) Coexpression van SYP-EGFP met DsRed in een thalamocortical (TC) axon. DsRed plus SYP-EGFP plasmiden werden binnengebracht gekweekte thalamus cellen op 1 dag in vitro (DIV) met behulp van electroporation. (A) een coculture van de organotypic van de thalamus en corticale segmenten na 12 DIV. (B) A DsRed-geëtiketteerden thalamus cel doorloopt een axon in de corticale slice en vormen van takken in de bovenste lagen. (C) een vergroot beeld van de boxed Gewest in (A). (D-F) tonen de DsRed-geëtiketteerden TC axon (D) en SYP-EGFP puncta (E) in de vakken regio van (C). Discrete accumulatie van SYP-EGFP werd waargenomen langs een enkele TC axon. Th: thalamus. Schaal bars: (B) 1 mm, (C) 100 µm, en (F) 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Time-lapse beeldvorming van een axon van de thalamocortical uiten SYP-EGFP en DsRed in een organotypic-coculture. DsRed plus SYP-EGFP plasmiden werden binnengebracht gekweekte thalamus cellen op 1 DIV electroporation gebruiken. Dit axon was dagelijks beeld over 4 dagen (11 DIV naar 14 DIV). Schaal bar: 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het huidige protocol is ook een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de ontwikkelingsaspecten van groeiende axonen anders dan van de TC projectie11. Bijvoorbeeld, kunt een combinatie van corticale segment cultuur en de techniek electroporation visualiseren van individuele axonale morfologie van corticale neuronen en lange termijn waarneming9,18.

Met behulp van het huidige protocol, kunnen de rol van interessante genen in axon vertakking en de synapse formatie ook door co expressie van fluorescente proteïnen en de genen van belang worden geanalyseerd. Meestal zijn meer dan 90% van de fluorescerende eiwit waarin cellen mede transfected met een tweede plasmide wanneer de molaire verhouding van de plasmide-oplossingen wordt aangepast tot en met 1:218,19. Echter, de optimale verhouding kan afwijken als co transfectie werkzaamheid en expressie niveau onder vectoren zijn gevarieerd.

Hoewel het huidige protocol efficiënt voor time-lapse experimenten is, zijn er enkele technische problemen. Voor dagelijkse imaging, was elke dag een coculture in een microscopische werkgebied geplaatst. Hoewel axonale ontwikkeling niet lijkt te serieus worden beïnvloed door dagelijkse imaging10, moet elke waarneming worden afgerond binnen 10 min om te minimaliseren van verdamping van cultuur oplossing en veranderingen in de pH van het kweekmedium. Anderzijds zou het beter zijn om de temperatuur, de vochtigheid en de pH van de culturen van de microscopische etappe12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken ook Gabriel Hand voor de kritische lezing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries
192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries
16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335, (1), 123-148 (1993).
  2. Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4, (4), 276-289 (2003).
  3. Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75, (2), 230-249 (2012).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (8), 272 (2005).
  5. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10, (9), 647-658 (2009).
  6. Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
  7. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245, (4914), 192-194 (1989).
  8. Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9, (2), 217-228 (1992).
  9. Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25, (1), 1-9 (2005).
  10. Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27, (19), 5215-5223 (2007).
  11. Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50, (6), 475-477 (2008).
  12. Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76, (3), 323-336 (2016).
  13. Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. 159-168 (2015).
  14. Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351, (6326), 475-477 (1991).
  15. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12, (8), 3054-3070 (1992).
  16. Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20, (24), 9145-9151 (2000).
  17. Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42, (1), 56-68 (2000).
  18. Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28, (37), 9117-9121 (2008).
  19. Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (16), 7562-7567 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics