Visualisering af Thalamocortical Axon forgrening og Synapse dannelse i Organotypic Cocultures

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver en metode til samtidige billeddannelse af thalamocortical axon forgrening og synapse dannelse i organotypic cocultures af thalamus og hjernebarken. Enkelte thalamocortical axoner og deres præsynaptiske terminaler er visualiseret ved en enkelt celle elektroporation teknik med DsRed og normal god landbrugspraksis-mærket synaptophysin.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Axon forgrening og synapse dannelse er afgørende processer til at fastsætte præcise neuronal kredsløb. Under udvikling danner sensoriske thalamocortical (TC) axoner grene og synapser i særlige lag af hjernebarken. Trods åbenlyse rumlige korrelationen mellem axon forgrening og synapse dannelse, er årsagssammenhængen mellem dem dårligt forstået. For at løse dette problem, udviklet vi for nylig en metode til samtidige billeddannelse af forgrening og synapse dannelsen af individuelle TC axoner i organotypic cocultures.

Denne protokol beskriver en metode, som består af en kombination af en organotypic coculture og elektroporation. Organotypic cocultures af thalamus og hjernebarken lette genmanipulation og observation af cytoskeletale processer, bevare karakteristiske strukturer såsom laminar konfiguration. To særskilte plasmider kodning DsRed og EGFP-mærket synaptophysin (SYP-EGFP) var Co transfected ind i et lille antal thalamic neuroner ved en elektroporation teknik. Denne metode tillod os at visualisere individuelle cytoskeletale morfologier TC neuroner og deres præsynaptiske sites samtidigt. Metoden også aktiveret langsigtet observation, som afslørede årsagssammenhængen mellem axon forgrening og synapse dannelse.

Introduction

Thalamocortical (TC) projektion i pattedyr hjernen er et egnet system til at undersøge axon vejledning og målretning mekanismer. Under udvikling vokse sensoriske TC axoner i kortikale plade, og form grene og synapser fortrinsvis i lag IV af de primære sensoriske områder i hjernebarken1,2. Selv efter oprettelsen af grundlæggende forbindelser, er cytoskeletale Dorne og synaptiske terminalerne ombygget afhængigt af miljømæssige ændringer3,4. Men hvordan TC axon morfologi ændres dynamisk er dårligt forstået. En af hovedårsagerne er manglen på en passende teknik til at observere strukturelle ændringer på en enkelt celle niveau. Selv om den seneste udvikling i mikroskopi, såsom to-foton mikroskopi, har tilladt direkte observation af levende kortikale neuroner i vivo, er der stadig tekniske begrænsninger til at indfange den samlede TC baner5, 6. derfor, in vitro- metoder til live imaging af TC axoner ville give kraftfulde værktøjer for strukturelle analyser af axon forgrening og synapse dannelse.

Vores gruppe for første gang fastsat en statisk skive kultur metode med permeabel membran7. Brug denne metode, en rotte kortikale skive var cocultured med en sensoriske thalamic blok, og lamina-specifikke TC forbindelser blev sammenfattet i denne organotypic cocultures7,8. Sparsomme mærkning med en fluorescerende proteiner yderligere tillod os at observere TC axon vækst og gren dannelse9,10,11. For nylig, har vi udviklet en roman metode for samtidige billeddannelse af filialer og synapse dannelsen af individuelle TC axoner i organotypic cocultures12. For at visualisere TC axoner og præsynaptiske sites samtidigt, var DsRed og EGFP-mærket synaptophysin (SYP-EGFP) Co transfected ind i et lille antal thalamic neuroner ved elektroporation af organotypic coculture. Den nuværende metode letter morfologisk analyse af TC axoner og tillader langsigtet observation, som kan bruges til at vise årsagssammenhængen mellem axon forgrening og synapse dannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført ifølge de retningslinier af dyrevelfærd udvalg af Osaka University og Japan neurovidenskab samfund.

1. Organotypic cocultures af thalamus og hjernebarken

Bemærk: For en detaljeret procedure, henvises til den originale publikationer7,8,13. Alle procedurer bør udføres under sterile forhold. Sprague-Dawley (SD) rotter bruges til neuronal kulturer.

  1. Forberedelse af reagenser
    Bemærk: Mængder af følgende reagenser er på en rotte hjernen.
    1. Forbered 10 x modificerede N2 Supplement 13: insulin (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hydrocortison (200 nM), natrium selenite (300 nM), transferrin (1 mg/mL), putrescine (1 mM), glukose (60 mg/mL)
    2. Forbered serum-holdige næringssubstratet (10 mL): 85% DMEM/F12, 10% 10 x ændret N2 supplement, 5% føtal bovint serum (FBS)
    3. Forbered serumfrit næringssubstratet (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% 10 x ændret N2 supplement
    4. Forberede rotte hale kollagen løsning (0,5 mL). Kort sagt, tage bud fibre fra en rotte hale under sterile forhold og der inkuberes i eddikesyreopløsning natten over. Efter centrifugering, indsamle supernatanten (et par mg/mL) og gemme i et køleskab13.
  2. Forberedelse af kultur retter
    1. Placere en membran indsætte i en 35 mm petriskål.
    2. Tilføje 40-50 μL af rotte hale kollagen løsning til membranen, og sprede kollagen løsning omkring midten.
    3. Luft tørre membran helt i en ren bænk.
    4. Lægge 1,5-2 mL af næringssubstratet serum-holdige i skålen, så membranen er gennemblødt med mediet.
    5. Placere kultur fadet i en inkubator (37 ° C, befugtet 95% luft og 5% CO2) før plating.
  3. Forberedelse af kortikale skiver
    1. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter med 70% ethanol i 10 minutter eller længere.
    2. Dissekere hele hjernen hurtigt fra en postnatal dag (P) 2 rotte under iskold anæstesi (nedsænket i ice-chips i et par minutter).
    3. Sted hjerne i en 100 mm petriskål indeholdende 100 mL koldt Hanks afbalanceret saltopløsning.
    4. Fjern pia sagen fra hjernen med fine pincet, og skære kortikale skiver (300-400 μm tykkelse) fra den visuelle og somatosensoriske cortex med microsurgical saks (for detaljer, se figur 1).
      Bemærk: Tykkelsen af kortikale skiver er groft anslået omfanget af gitre under en kikkert mikroskop.
      Bemærk: Alternativt, kortikal skiver kan gøres med en vibratome under sterile forhold.
    5. Overføre et par kortikale skiver på membran Indsæt med en engangs plast pipette.
    6. Justere positioner af skiver i nærheden af midten af kultur-Indsæt med en brand-poleret Pasteur pipette (for detaljer, se8,13) og fjerne overskydende medium fra indsatsen.
      Bemærk: Justere niveauet af medium lidt under overfladen af skiver, så skiverne kan modtage en tilstrækkelig forsyning af både gas og medium. Dette er vigtigt for cellernes levedygtighed.
    7. Vedligeholde skiver dyrkningsmedium serum-holdige ved 37 ° C i et miljø af befugtet 95% luft og 5% CO2og kultur alene for én dag før en thalamic blok er taget og placeres ved siden af.
  4. Forberedelse af thalamic blokke
    1. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter med 70% ethanol i 10 minutter eller længere.
    2. Bedøver en gravid rotte (embryonale dag 15) ved intraperitoneal injektion med pentobarbital (50 mg/kg) indeholdende anæstesi.
    3. Dissekere hver embryo fra de uterine horn, og placere embryonerne i en 100 mm petriskål indeholdende 100 mL koldt Hanks afbalanceret saltopløsning.
    4. Under en kikkert mikroskop, fjerne hjernen fra hvert foster og skære thalamic blokke, som hovedsagelig indeholder ventrobasal komplekse og laterale geniculate kerne (ca 0,5 mm x 3)7 ved hjælp af microsurgical saks (Se figur 1).
  5. Kultur og vedligeholde organotypic cocultures
    1. Ved hjælp af Pasteurs pipette, placere thalamic blokken ved siden af den ventrikulære overflade af kortikale skive, som er blevet placeret på membranfiltret.
    2. Opretholde cocultures i dyrkningsmediet serum-holdige ved 37 ° C i et miljø af befugtet 95% luft og 5% CO2.
    3. Udveksle halvdelen af medium med næringssubstratet serumfrit efter to dage i kultur. Derefter udveksle medium hver 2-3 dage.
      Bemærk: Niveauet af mediet skal kontrolleres efter den medium udveksling, da det er vigtigt for celle overlevelse.

2. elektroporation

Alle procedurer bør udføres under sterile forhold.

Bemærk: Udføre elektroporation én dag efter tilberedning af de thalamic blokke til at forhindre detachment af blokkene.

  1. Plasmider
    1. Gøre en blanding af plasmider som følger: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      Bemærk: Rense de begge plasmider ved hjælp af en endotoxin-fri Maxiprep kit og opløses i Hanks' afbalanceret saltopløsning.
  2. Elektroporation udstyr setup
    De elektriske instrumenter som en stimulator og en isolator skal tilsluttes, som vist i figur 2.
    1. Tilslut stimulatoren til bifasisk isolator.
    2. Tilslut en elektrode (en sølv wire 0,2 mm diameter) til den negative terminal af isolator.
    3. Tilslut en elektrode (en sølv wire 1 mm i diameter) i serien til en 100 Ω modstand og den positive terminal på isolator.
    4. Tilslut forstærkeren til oscilloskop til at overvåge, om elektriske strømme er gået på tværs af modstanden ved at måle spændingen med forstærkeren.
  3. Forberedelse af glas pipetter
    Bemærk: To slags glas pipetter bruges for udslyngning af plasmid løsning og anvendelse af elektriske impulser.
    1. Gøre pipetter fra glas kapillærer med en elektrode puller.
    2. Bryde spidsen for udslyngning pipette (tip diameter skal være 20-50 μm).
    3. Slibe og polere spidsen af elektrode pipette med sandpapir efterfulgt af brand-polering (den indre diameter skal være 50-200 μm).
      Bemærk: Elektrode tip skal være flad og glat, som det direkte berører væv.
  4. Proceduren for elektroporation
    1. Tilsluttes manipulatorer udslyngning og elektrode pipetter.
    2. Indsæt en sølv wire (0.2 mm i diameter) i elektrode pipette.
    3. Tillægge en 1 mL sprøjte med et plastikrør udslyngning pipette.
    4. Tage > 5 μl plasmid løsning i udslyngning pipette af sprøjten suge.
    5. Sætte coculture på elektroporation scenen, og Indsæt 1 mm diameter elektrode i dyrkningsmediet.
    6. Sted udslyngning pipette på de thalamic eksplantat.
    7. Skubbe sprøjten manuelt efter spidsen rører overfladen af thalamic blokken.
      Bemærk: Om 0,5 μl af plasmidet bruges løsning normalt pr. én thalamic blok.
    8. Placer elektrode pipette på thalamic blok straks efter retraktion af udslyngning pipette.
    9. Levere elektriske impulser (50-400 μA, 3 til 5 tog med 200 kvadrat pulser af 1 ms varighed ved 200 Hz). Overvåge amplitude og antallet af tog på oscilloskopet.
      Bemærk: Amplituden af elektriske strømme afhænger af den indvendige diameter af en elektrode pipette13.
    10. Trække elektrode pipette og returnere skålen til rugemaskine.
  5. Mikroskopiske observation
    1. Sætte kultur parabol på en mikroskopisk scenen af en opretstående Konfokal mikroskop udstyret med to filter sæt til EGFP (excitation, 488 nm; emission, 515 nm) og DsRed (excitation, 514 nm; emission, 565 nm).
    2. Tage billeder af 10-25 optisk sektioner på 1-7 µm-trin størrelser med en 20 X long-arbejde afstand mål linse. Vælg enkeltvis kan skelnes mærket axoner, der giver udtryk for både DsRed og SYP-EGFP.
      Bemærk: Den observerede område er ca 0,7 x 0,7 mm (svarende til 1024 x 1024 pixels, dvs, 0,68 μm/pixel).
    3. Capture billeder hver 24 h for daglige billeddannelse. Komplet i 10 min ved stuetemperatur og returnere kulturer til rugemaskine. For kort-interval tid bortfalder imaging, holde kulturen i en kultur kammer, som bevarer miljøet af fugtet 95% luft og 5% CO2 ved 37 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forsøget er beskrevet her har til formål at afsløre forholdet mellem TC axon forgrening og synapse dannelse. Du kan samtidig visualisere cytoskeletale baner og placeringer af præsynaptiske websteder, enkelt eller et par thalamic celler i organotypic cocultures var transfekteret med to plasmider kodning SYP-EGFP og DsRed ved hjælp af elektroporation. Under den anden uge i kultur, var individuelt skelnes TC axoner tydeligt mærket af DsRed (figur 3). Kun de axoner, der udstillede DsRed og SYP-EGFP blev udvalgt til observation. Mærket TC axoner invaderede den kortikale skive og dannet grene primært i de øvre lag, der angiver, at thalamic axoner i organotypic cocultures form grene med laminar specificitet ligner, findes i vivo7, 8,10,14,15,16,17. På samme tid, kunne punktformet sammenlægninger af SYP-EGFP (SYP-EGFP puncta) iagttages langs DsRed-mærket TC axoner (figur 3D-3F). Da disse SYP-EGFP puncta var for det meste colocalized med immunopositive signaler for VGLUT2, som er en præsynaptiske markør thalamic celler, og PSD95, som er en generel postsynaptiske markør, er det sandsynligt, at SYP-EGFP puncta for det meste repræsenterer præsynaptiske websteder på TC axoner12.

Time-lapse billeddannelse af TC axoner yderligere viste at axon forgrening og synapse dannelsen af thalamic neuroner var kontinuerlig og dynamisk med addition og elimination (figur 4)12. Desuden fandtes de fleste grene for at emerge fra SYP-EGFP puncta, der angiver, at præsynaptiske websteder udløse gren dannelse (for detaljer, se12).

Figure 1
Figur 1 . Proceduren for udarbejdelse af en organotypic cocultures af thalamus og hjernebarken. (A) den øverste visning af en neonatal rotte hjerne. Den første skæring er lavet parallelt med midterlinjen (1). Derefter, 300 - 500 μm tykt koronale sektioner er skåret fra den primære visuelle og somatosensoriske cortex (2). Endelig skal en parasagittal skåret for at opnå de kortikale skiver (3). (B) en skematisk fremstilling af en organotypic coculture af thalamus og hjernebarken. Kortikale skiver fra postnatal dag 2 rotte og thalamic blokke fra embryonale dag 15 er cocultured på membranfiltret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Et skematisk diagram over elektriske instrumenter for elektroporation. Stimulatoren, isolator og elektrode pipette er forbundet i serie. For at levere negativt ladede DNA, er elektrode pipette forbundet til den negative terminal af isolator. De elektriske strømme for elektroporation kan overvåges med oscilloskopet. TH: thalamus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Thalamocortical axoner i en coculture efter 2 uger i kultur. (En-F) Coexpression af SYP-EGFP med DsRed i en thalamocortical (TC) axon. DsRed plus SYP-EGFP plasmider indført kulturperler thalamic celler på 1 dag i vitro (DIV) ved hjælp af elektroporation. (A) en organotypic coculture af thalamic og kortikale skiver efter 12 DIV. (B) en DsRed-mærket thalamic celle udvider en axon i det kortikale udsnit og danner grene i øverste lag. (C) et forstørret billede af boxed regionen i (A). (D-F) viser DsRed-mærket TC axon (D) og SYP-EGFP puncta (E) i regionen boxed i (C). Diskrete ophobning af SYP-EGFP blev observeret langs en enkelt TC axon. Th: thalamus. Skalere barer: (B) 1 mm, (C) 100 µm, og (F) 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Time-lapse imaging af en thalamocortical axon udtrykker SYP-EGFP og DsRed i en organotypic coculture. DsRed plus SYP-EGFP plasmider blev indført i kulturperler thalamic celler på 1 DIV ved hjælp af elektroporation. Denne axon var afbildet dagligt over 4 dage (11 DIV til 14 DIV). Skalalinjen: 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nuværende protokol er også et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingsmæssige aspekter af voksende axoner end TC projektion11. For eksempel, en kombination af kortikale skive kultur og elektroporation teknik giver mulighed for visualisering individuelle cytoskeletale morfologi af kortikale neuroner og langsigtet observation9,18.

Ved hjælp af den nuværende protokol, kan roller af interessante gener i axon forgrening og synapse dannelse også analyseres af co udtryk af fluorescerende proteiner og interesse gener. Typisk er over 90% af fluorescerende proteiner udtrykker celler Co transfekteret med en anden plasmid kindtand forholdet mellem plasmid løsninger er indstillet til 1:218,19. Men det optimale forhold kan være forskellige som co Transfektion effektivitet og udtryk niveau er varierede blandt vektorer.

Selv om den nuværende protokol er effektive for time-lapse eksperimenter, er der nogle tekniske problemer. Til daglig imaging, blev en coculture placeret på en mikroskopisk scenen hver dag. Selvom cytoskeletale udvikling ikke syntes at blive påvirket alvorligt af daglige imaging10, bør hver observation være afsluttet inden for 10 min at minimere fordampning af kultur løsning og ændringer i pH af næringssubstratet. Alternativt, ville det være bedre at opretholde temperatur, fugtighed og pH af kulturer på de mikroskopiske etape12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker også Gabriel hånd for kritisk læsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries
192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries
16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335, (1), 123-148 (1993).
  2. Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4, (4), 276-289 (2003).
  3. Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75, (2), 230-249 (2012).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (8), 272 (2005).
  5. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10, (9), 647-658 (2009).
  6. Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
  7. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245, (4914), 192-194 (1989).
  8. Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9, (2), 217-228 (1992).
  9. Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25, (1), 1-9 (2005).
  10. Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27, (19), 5215-5223 (2007).
  11. Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50, (6), 475-477 (2008).
  12. Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76, (3), 323-336 (2016).
  13. Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. 159-168 (2015).
  14. Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351, (6326), 475-477 (1991).
  15. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12, (8), 3054-3070 (1992).
  16. Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20, (24), 9145-9151 (2000).
  17. Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42, (1), 56-68 (2000).
  18. Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28, (37), 9117-9121 (2008).
  19. Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (16), 7562-7567 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics