Anvendelse af Aorta-gonade-mesonephros eksplantat kultur System i udviklingsmæssige bloddannelsen

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver brug af kulturperler Aorta-gonade-Mesonephros udtryk analyser, kolonidannende enheder i kultur og milt og langsigtede rekonstitution for at bestemme virkningen af lovgivningsmæssige faktorer og signalering veje på hæmatopoietisk stilk celle udvikling. Dette er blevet bevist som en effektiv ordning for at studere hæmatopoietisk stamcelle biologi og funktion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lv, J., Liu, F. Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (129), e56557, doi:10.3791/56557 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Begrænsning af ved hjælp af musen embryoner for bloddannelsen undersøgelser er tilføjet besværet i operationer, som er i vid udstrækning på grund af intrauterin udviklingen af fosteret. Selv om genetiske data fra knockout (KO) mus er overbevisende, er det ikke realistisk at generere KO mus til alle gener efter behov. Derudover udfører i vivo rescue eksperimenter til at konsolidere resultaterne af KO mus er ikke nem. For at overvinde disse begrænsninger, blev Aorta-gonade-Mesonephros (AGM) eksplantat kultur udviklet som et passende system til at studere hæmatopoietisk stamcelle (HSC) udvikling. Især for redning eksperimenter, kan det bruges til at genoprette den nedsat bloddannelsen i KO mus. Ved at tilføje de relevante kemikalier i mediet, nedsat signalering kan genaktiveres eller op-regulerede veje kan blive hæmmet. Med brugen af denne metode, mange eksperimenter kan udføres for at identificere de kritiske regulatorer af HSC udvikling, herunder HSC relaterede genekspression på mRNA og protein niveauer, koloni dannelse evne og rekonstitution kapacitet. Denne serie af eksperimenter ville være nyttigt at definere de underliggende mekanismer, der er afgørende for HSC udvikling i pattedyr.

Introduction

Hæmatopoietisk stamceller (HSCs) er væv-specifikke voksne stamceller, som besidder multilineage potentiale, herunder erythroid, myeloid, og lymfoide celler samt evnen til at selv forny. Nylige undersøgelser har vist, at de tidligste HSCs opstod fra en specialiseret endotel befolkning, kendt som hemogenic endotelet (han), gennem i endothelial hæmatopoietisk overgangen (EHT) på den ventrale væg af dorsal aorta1,2 ,3,4. Når dannet i aorta-gonade-mesonephros (AGM) region fra embryonale (E) 10.5 til E12.5 i mus embryo, vil HSCs migrere ind i føtal leveren for ekspansion og endelig kolonisere knoglemarven til at opretholde voksen bloddannelsen i hele en persons liv 5 , 6. selv om det har været studeret i mange år, de underliggende mekanismer af HSC fremkomsten og udviklingen fortsat utilstrækkeligt forstået.

I modsætning til in vitro- befrugtning og udvikling af zebrafisk embryoner gør intrauterin udvikling af musen embryoner studiet af endelige bloddannelsen under embryogenese meget mere besværligt. Selv om genetiske eksperimenter ved hjælp af knockout (KO) mus er almindeligvis udnyttet, begrænser manglen på visse KO mus også deres brug i feltet hæmatopoietisk forskning. Desuden, udføres i vivo rescue eksperimenter ikke nemt i KO mus. Siden 1996, er AGM eksplantat kultur blevet udviklet for hæmatopoietisk undersøgelser af pionerer i felt7. Med hjælp fra denne kultur system, er blevet identificeret ventrale væv af AGM-regionen for at fremme HSC aktivitet, mens dorsale væv udøve en modsat effekt8,9. AGM eksplantat kultur-systemet er også blevet anvendt til at bestemme rollerne af Serotonin, Mpl, SCF, BMP og pindsvin signalering i HSC udvikling10,11,12,13, 14. vigtigere, det er også en populær metode til at redde hæmatopoietisk defekter i mutant embryoner13,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle de procedurer, herunder animalske emner er blevet godkendt af Udvalget for etiske gennemgang i Institute of Zoology, kinesiske Academy of Sciences, Beijing, Kina.

1. materiale forberedelse

  1. Sterilize 0,65 µm filtre med ultraviolette stråler produceret under ultraviolet ray lampe på den rene bænk til 4 h og vend filtrene efter 2 h mark.
    Bemærk: Når du arbejder med UV-lys, bære passende beskyttelse.
  2. Sterilisere rustfrit stål masker med autoklave sterilizer ved 121 ° C i 30 mins.
    Bemærk: En vis højde af rustfrit stål mesh er nødvendige for at understøtte filtre på grænsefladen luft-væske og dette kan realiseres med wiren på armeringsnet ( fig. 1 A).
  3. Fortyndes fluoxetin til en slutkoncentration på 10 µM i M5300 langsigtede kultur medium og bland jævnt.
    Bemærk: For en six-godt plade, 2 mL M5300 langsigtede næringssubstratet er passende til hver brønd. Hydrocortison på 10 -6 M kan fortyndes selektivt til mellemlang.
  4. Overføre medium suppleret med fluoxetin på 10 µM i seks-godt plader eller retter og sætte steriliseret rustfrit stål masker i medium.
  5. Vaske de 0,65 µm filtre med kogende vand to gange i 3 minutter hver gang i glasskål celle kultur for sterilisation. Efter hver vask, sætte filtrene i phosphat bufferet saltvand (PBS) for 2 minutter og sted våde filtre på rustfrit stål masker stående på grænsefladen luft-væske som vist i figur 1 A [skematisk i byens].
    Bemærk: Kogende vand kan være genereret med autoklave sterilizer at opnå aseptik og udstyr bør tages ud af autoklave sterilizer i tide til at undgå et fald i temperaturen.

2. AGM Explant kultur

  1. forsigtigt adskille AGM regioner fra embryoner på E10.5 eller E11 med pincet.
    1. Strip livmoderfremfald fra gravide mus med dissekere saksen og adskille embryoner fra livmoderfremfald.
    2. Aftørre blommesækken, navlestrengen og indvolde fra selve embryo.
    3. Forsigtigt fjerne dorsal nerve væv og omkringliggende muskuløs væv.
    4. Cut off væv med pincet i stedet for forreste og bageste lemmer og adskille regionen AGM fra selve embryo. tal 1 B-C viser skematisk fremstilling og morfologi af dissekerede AGM.
  2. Explant de dissekerede generalforsamlinger separat på filtre på luft-flydende interface ( figur 1 A) og kultur i 5% CO 2 ved 37 ° C i 2-3 dage.
    Bemærk: Ikke placere dissekeret generalforsamlingen på det armeringsnet ledning og sørg for, at filtrene er på grænsefladen luft-væske under kultur. Udover generalforsamlingen, blommesækken og føtal lever kan også blive kulturperler med dette system 7.

3. Udtrykket analyser

  1. mRNA niveau
    1. indsamle de kulturperler generalforsamlinger i 1 mL PBS og centrifugeres ved 4 ° C, 310 x g for 6 min.
    2. Efter at fjerne supernatanten, total RNA er udvundet fra de indsamlede generalforsamlinger med en monofasiske løsning af phenol, ifølge producenten ' s instruktioner.
    3. Total RNA (2 µg) er derefter omvendt transskriberet ved hjælp af M-MLV reverse transkriptase for at opnå cDNA som skabelon. De kvantitative real-time PCR assays udføres med SYBR Green og Gapdh bruges som intern kontrol.
  2. Protein niveau
    1. indsamle kulturperler generalforsamlingen som beskrevet ovenfor i trin 3.1.1.
    2. Forberede protein fra kulturperler generalforsamlingen med celle lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl og 0,5% NP-40) indeholdende protease inhibitor og brug for western blotting ægprodukters protein niveau som tidligere beskrevet 13.

4. Kolonidannende enheder i kultur (CFU-C) analysen

  1. efter dyrkning i 2-3 dage, indsamle AGM regioner i 1 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og der centrifugeres ved 4 ° C, 310 x g for 6 minutter og adskille med 200 µL collagenase (0,1% i PBS) ved 37 ° C.
    Bemærk: Den nødvendige tid til collagenase at generere enkelt celle-suspensioner er ca. 20 min. Ryster de rør, der indeholder AGM kan hver 5 minutter fremskynde fordøjelsesprocessen. 200 µL 0,1% collagenase bruges for hver generalforsamling og 200 µL 10% serum er at stoppe reaktionen.
  2. Kultur enkelt celle-suspensioner i M3434 medium i ultra-lav 24-godt monteringsbeslag.
    Bemærk: For at undgå kontaminering, Penicillin-Streptomycin løsning kan selektivt føjes til mediet. Fordi M3434 medium er tyktflydende, en 1,0 cc sprøjte uden nål bruges til at blande celler og medium.
  3. Efter 7 - 10 dage dyrkning på 37 ° C i 5% CO 2-tal for hver type af kolonier herunder Burst danner enhed--erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monocyt (CFU-GM) og CFU-granulocyt, erytrocyt, makrofager, megakaryocyte (CFU-CLAUSS) er fremtrædende baseret på morfologi og scorede med en inverteret mikroskop ( figur 2 C).

5. In Vivo Transplantation Assay

  1. kolonidannende enheder-milt (CFU-S) assay
    1. efter 2 - 3 dage af eksplantat dyrkning, indsamle generalforsamlinger og forberede enkelt celle-suspensioner af inkubere med 200 µL collagenase (0,1% i PBS) til 20 min.
    2. Udføre dødelige bestråling (9 Gy af røntgenstråler) i 8 til 10 - uger gamle mandlige C57BL/6 mus 4-5 timer før celle indsprøjtning.
    3. Sætte den bestrålede mus i en Tilbageholderen at begrænse sin aktivitet.
    4. Tør halen ved hjælp af en vatpind dyppet i 75% alkohol for at fremme vasodilatation af venen.
    5. Indsprøjtes 0,5 embryo tilsvarende (ee) eller 1 ee enkelt celle-suspensioner af AGM intravenøst i halen vene af bestrålede mus med en 1,0 cc sprøjte.
      Bemærk: Celler er suspenderet med PBS og 0,5 mL PBS pr. modtager er en passende mængde. En nål 25 gauge eller 26 gauge størrelse anvendes til injektion med en 1,0 cc sprøjte. Ingen luft kan føres ind i sprøjten. Tryk på injektionsstedet med en antiseptisk vatpind til at stoppe blødninger.
    6. Elleve dage post transplantation, indsamle og ordne milt af de modtagende mus i Bouin ' s løsning (15 mL 1,22% picrinsyre syre mættet vandig opløsning, 2 mL 40% methanol og 1 mL iseddike) for 1-2 dage og vask med 80% alkohol i en anden 1-2 dage. Tælle de synlige kolonier i milten makroskopisk og bestemme antallet af kolonier pr. ee.
      ​ Bemærk: Bouin ' s fiksativ, slid passende beskyttelse.
  2. Langfristede transplantation assay
    1. efter 2-3 dage explant dyrkning, indsamle generalforsamlinger og forberede enkelt celle-suspensioner af inkubere med 200 µL collagenase (0,1% i PBS) i 20 min.
    2. Udføre dødelige bestråling (9 Gy af X-ray) i 8 til 10 - uger gamle mandlige C57BL/6 mus 4-5 timer før celle indsprøjtning.
    3. Sætte den bestrålede mus i en Tilbageholderen at begrænse sin aktivitet.
    4. Tør halen ved hjælp af en vatpind dyppet i 75% alkohol for at fremme vasodilatation af venen.
    5. < lJeg > injicere 0,5 embryo tilsvarende (ee) eller 1 ee enkelt celle-suspensioner af AGM intravenøst i halen blodåre en bestrålet mus med en 1,0 cc sprøjte. AGM er injiceres i en dosis på 1 ee pr. modtager med 2 × 10 5 knoglemarv celler (CD45.1 baggrund).
      Bemærk: Ingen luft kan føres ind i sprøjten. Tryk på injektionsstedet med en antiseptisk vatpind til at stoppe blødninger.
    6. Fire måneder efter transplantation, indsamle knoglemarven af modtageren og bruge det til rekonstitution analysen af FACS. Kun modtagere med ≥ 10% donor-stammer kimærisme anses at udstille vellykket rekonstitution.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En nylig publikation rapporteret endotel celle-afledte serotonin fremmer overlevelse af HSCs ved at hæmme den pro-apoptotiske pathway i generalforsamling13. For at bekræfte serotonin fremme påvirkning HSC udvikling, var fluoxetin inkluderet. Som en selektiv serotonin re-uptake hæmmer (SSRI), har fluoxetin vist sig for at hæmme serotonin re absorption i perifere væv16,17,18. Ved hjælp af generalforsamlingen explant kultur system, påvirkning af fluoxetin HSC udvikling blev undersøgt ved at følge proceduren beskrevet ovenfor. Udtrykket analyserne viste øget udtryk for Runx1, der er defineret som en central genet for HSC udvikling19, i fluoxetin-behandlede generalforsamlinger på mRNA og protein niveauer, henholdsvis (fig. 2A og 2B). Fluoxetin kan også øge koloni dannelse evne til HSCs i den ordinære generalforsamling, herunder BFU-E, CFU-GM og CFU-CLAUSS (figur 2C og figur 2D). Desuden, viste i vivo transplantation resultater, at HSCs i den ordinære generalforsamling, behandlet med fluoxetin kan øge antallet af milten kolonier i bestrålede voksen modtagere (figur 2E).

Figure 1
Figur 1 . Skematisk fremstilling af AGM struktur og eksplantat kultur system. 
(A) flowdiagram for at bruge AGM eksplantat kultur systemto undersøge kemikaliers indvirkning på HSCs udvikling. Kort, generalforsamlinger er dissekeret fra embryoner og kulturperler på filtre på grænsefladen air-liquid med kemikalier fortyndet i M5300 langsigtede næringssubstratet. 2 - 3 dage senere, de kulturperler generalforsamlinger opsamles og bruges til at undersøge udtrykket hæmatopoietisk relaterede gener, koloni dannelse evne og genindsættelse kapacitet. AGM, aorta-gonade-mesonephros; CFU-C, kolonidannende enheder i kultur; CFU-S, kolonidannende enheder-milt. (B) AGM struktur er vist i flowdiagrammet. En, dorsal aorta; Mig, udkom; G, gonade; Møller, mesonephros. (C) morfologi af generalforsamlingen. Generalforsamlingen er adskilt fra den caudale halvdel af embryonale kroppen med de omkringliggende mesenchymale celler på E10.5. Skalere barer = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Anvendelse af generalforsamlingen explant kultur systemet til at opfange virkning af fluoxetin på udvikling af HSC. (A) mRNA niveau af Runx1 i generalforsamlinger behandlet med fluoxetin på 10 µM blev opdaget af kvantitative real-time PCR. Student's t -test: **, P < 0,01. Resultaterne præsenteres som gennemsnit ± SEM. (B) Western blotting analyse yderligere bekræftet, øget udtryk for Runx1 på protein niveau i de årlige generalforsamling behandlet med fluoxetin. (C) de repræsentative billeder viser morfologi af BFU-E, CFU-GM og CFU-CLAUSS. Skala barer = 100 µm. (D) CFU-C analyse viste, at fluoxetin behandling kan øge antallet af hver type af kolonien. Et embryon tilsvarende (ee) blev brugt. Student's t -test: *, P < 0,05; **, P < 0.01.The resultaterne præsenteres som mean ± SEM. (E) CFU-S assay med generalforsamlinger behandlet med fluoxetin viste, at fluoxetin kan øge antallet af kolonier i milten af bestrålede voksen modtagere. Skalere barer = 1,5 mm. 1 ee blev brugt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er velkendt, at modne HSCs i knoglemarven kan genbefolke blod system af bestrålede modtagere. I modsætning til disse funktionelle HSCs er de nye HSCs i den ordinære generalforsamling af musen embryoner umodne. Direkte transplantation resultater viste, at type jeg (VE-cad+ CD45- CD41+) og type II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs besidder ingen rekonstitution evne20. At drage fordel af generalforsamlingen eksplantat kultur system, de spirende HSCs i regionen AGM kan rekonstruere modtagerne i transplantation assay4,20. Desuden, på grund af intrauterin udvikling af musen embryo, i vivo forsøg at redde de nedsat bloddannelsen i KO mus er besværligt at udføre. AGM eksplantat kultur er et alternativt system, som er velegnet til redning eksperimenter, blot ved at tilføje kemikalier (vækstfaktorer og cytokiner) til medium13,15. Ud over den ordinære generalforsamling, kan blommesækken og føtal lever også blive kulturperler med dette system7.

I begyndelsen af dette eksperiment er den strenge Sterilisation af filtre og rustfrit stål masker ganske vigtigt at undgå forurening. Endnu vigtigere, er den kritiske trin i kulturen at gøre dissekeret generalforsamlingen kulturperler på filtre på grænsefladen luft-væske. For meget medium vil forårsage AGM at være kultiveret i væsken og det kan være ødelagte, for lidt medium vil goere generalforsamlingen tør. Under dyrkning, opretholdelse af den rette luftfugtighed celle rugemaskine er også vigtigt at forhindre fordampning af mediet.

Yderligere forbedring af denne explant kultur system for at virkelig efterligne udviklingen af HSCs i vivo, sammen med de seneste fremskridt i organoid kultur teknikker21, høj grad vil udvide sin ansøgning i bloddannelsen undersøgelser, fra HSC selvfornyelse, multi lineage differentiering, og HSC-niche interaktion til sygdom modellering og drug discovery.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen modstridende økonomiske interesser.

Acknowledgements

Vi takker Suwei Gao for hjælp i figur forberedelse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81530004, 31425016) og ministeriet for videnskab og teknologi i Kina (2016YFA0100500). J.L. udført eksperimenter og udarbejdet manuskript; F.L. redigeret håndskriftet. Begge forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
durapore 0.65 µm filters Millipore R5BA63787 AGM explant culture
M5300 long-term culture medium Stem Cell Technologies 5300 AGM explant culture
Trizol  Tiangen 5829 RNA extration
M-MLV reverse transcriptase Promega 90694 reverse transcription
SYBR Green Qiagen A6002 quantatitive real-time PCR
protease inhibitor Roche 55622 Protein extration
collagenase Sigma C2674 digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium Stem Cell Technologies 3434 CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates Costar 3473 CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd Long-term transplantation
phosphate buffered saline Life Technologines 8115284 AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution HyClone SV30010 AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7 eBioscience 25-0454-80 Long-term transplantation
anti-CD45-FITC eBioscience 11-0451-81 Long-term transplantation
UV lamp Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD 039-14402 power: 30W
stainless steel mesh AS ONE SHANGHAI Corporation 2-9817-10  aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone Sigma H0396 selectively diluted into M5300 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  2. Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
  3. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  4. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
  5. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
  6. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  7. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
  8. Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
  9. Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
  10. Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
  11. Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
  12. Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
  13. Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
  14. Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
  15. Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
  16. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
  17. Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
  18. Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
  19. Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
  20. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
  21. Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics