En i Vivo Duo-farge metode for Imaging vaskulær Dynamics etter Contusive ryggmargsskade

Neuroscience
 

Summary

Introduserer vi en i vivo imaging metode å bruke to forskjellige fluorescerende farger bare spore dynamisk spinal vaskulær endringer etter en contusive ryggmargsskade i voksen Sprague-Dawley rotter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chen, C., Zhang, Y. P., Sun, Y., Xiong, W., Shields, L. B., Shields, C. B., Jin, X., Xu, X. M. An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (130), e56565, doi:10.3791/56565 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ryggmargsskade (SCI) forårsaker betydelig vaskulære forstyrrelser på stedet for skade. Vaskulær patologi skjer umiddelbart etter SCI og fortsetter gjennom den akutte skade fasen. Faktisk synes endotelceller å være først til å dø etter en contusive SCI. Tidlig vaskulær eventene, inkludert økt permeabilitet av blod-ryggmargen barrieren (BSCB), indusere vasogenic ødem og bidra til skadelig sekundære skade hendelser forårsaket av komplekse skade mekanismer. Målretting vaskulær avbrudd, derfor kan være en viktig strategi å redusere sekundære skade cascades som bidrar til histologiske og funksjonelle impairments etter SCI. Tidligere studier ble hovedsakelig utført på postmortem prøver og klarte ikke å fange de dynamiske endringene av vaskulære nettverket. I denne studien har vi utviklet en i vivo duo-farge to-fotonet bildebehandling metode for å overvåke akutt vaskulær dynamiske endringer etter contusive SCI. Denne tilnærmingen kan oppdage blodstrøm, fartøy diameter og andre vaskulær patologi på ulike områder av samme rotte før og etter skade. Total, denne metoden gir et utmerket sted for å undersøke vaskulær dynamics.

Introduction

Traumatisk ryggmargsskade (SCI) er en vanlig skade som fører til svekkelse av funksjonen motor, sensoriske og autonome. Ifølge den National ryggmarg skade statistiske Center (NSCISC) i 2016, omtrent 282,000 personer ble berørt mens 69% av dem var hovedsakelig på grunn av trafikkulykker eller faller1. Disse pasientene krever ofte intensiv pleie; Imidlertid er ingen effektiv behandling tilgjengelig. Derfor behov nye effektive strategier mot SCI inntrengende.

SCI vanligvis blir delt inn i to faser: primære skader og andre skader. Primære skaden består av fysiske fornærmelse forårsaker hemoragisk nekrose på stedet av virkningen2, etterfulgt av en rekke andre skader hendelser, som betennelse, celle apoptose og demyelinisering av gjenværende axons, som stadig fører til utvidelse av morfologiske og funksjonelle underskudd3,4,5,6. Blødning er første synlige tegn på skader, som indikerer en umiddelbar vaskulære forstyrrelser i akutt fase av SCI7,8. En neuroprotective strategi å redusere tidlig vaskulære skader kan forbedre pasienter utvinning, men dette krever en bedre forståelse av patofysiologiske mekanismen av tidlig etter skade vaskulær hendelser.

Til tross for tidligere studier bruker ulike metoder for å studere ryggmargen blodkar, fortsatt betydelige begrensninger. De fleste delte ulempen studerer bare postmortem datautvalg, for eksempel hydrogen klaring9, autoradiography10, microangiogram8, vaskulære korrosjon kaster11og immunohistochemistry12 ,13. Selv Laser Doppler Flowmetry gir noninvasive sanntids overvåking ryggmargen blodet flyt14, er det ikke skille mellom vaskulære systemer og oppdage vaskulær morfologiske endringer. Dynamisk kontrast forbedret MRI (DCE-MRI) er også noninvasive, men det genererer bilder med lav oppløsning og krever en dyr infrastruktur15.

Selv om i vivo imaging bruker 2-fotonet laser skanning mikroskopi (2 P-LSM) er utviklet for å studere vasodynamics i cortex16,17,18, et begrenset antall studier demonstrert vaskulære endringene følge en SCI. Tang et al. har vist endringer i blodstrømmen ytterst på webområdet lesjon i et hemisection modellen19, men imaging etter en contusive skader er mer utfordrende av to grunner. Først ville en tradisjonell optisk glassvindu over skade området ikke opprettholde den mekaniske påkjenninger og fortsatt fungere for bildebehandling. Andre, lekkasje av tracer i parenchyma grunn blødning skaper problemer med etter skade imaging.

Her presenterer vi en roman duo-farge bildebehandling metode, som lar imaging de samme enkeltskip på pre- og etter skade tidspunkt. I tillegg gir det en timelig-romlige profil av vaskulær dynamiske endringer etter en contusive SCI. Det har også potensialet for bildebehandling på flere tidspunkt etter skade. Denne protokollen kan brukes direkte til transgene dyr å studere nevrovaskulære interaksjon.

Protocol

Alle kirurgiske og dyr håndteringsprosedyrer ble utført som godkjent under veiledning for omsorg og bruk av forsøksdyr (National Research Council) og retningslinjene i Indiana universitet skolen av medisin institusjonelle Animal Care og bruk Komité.

1. kirurgisk forberedelse

  1. Sterilisere alle kirurgiske verktøy inkludert stabilisere ryggraden. Rengjør tabellen kirurgiske og alle området med 70% etanol. For utarbeidelsen av den ikke-overlevelse kirurgiske prosedyren, plasserer du en ren kirurgisk pad på en 37 ° C varmeputen.
  2. Bruk seks uker gamle Sprague Dawley (SD)-rotte for denne studien. Veier og bedøve rotte med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (87.7 mg/kg) og xylazine (12.3 mg/kg) blanding. Bekreft skikkelig etappe bedøvelse når dyret slutter å svare på en tå knipe stimulans. Subcutaneously injisere 0.01 til 0.05 mg/kg buprenorfin og 5mg/kg Carprofen før kirurgi.
  3. Barbere rotta inne 2 områder: regionen cervical ryggraden på baksiden og nakken regionen på bryst side. Vattpinne hudområder med betadine kirurgisk scrub og 70% alkohol wipes. Bruk øye ointment å hindre tørre øyne under operasjonen. Plassere dyret i supine posisjon på ren kirurgisk puten.

2. eksterne vena jugularis Catheterization

  1. Finn eksterne vena jugularis ved å finne puls-punkt nær til kragebeinet, og kutt med en liten våren saks å lage en loddrett snitt på stedet, som er kryss-punktet 3 anatomiske punkter: caudal ramus av høyre kjeven, større tuber av humerus und manubrium (figur 1A). Isolere fartøyet våren saks og fine tang. Knytte den klubbeformede enden med 1 sterilt kirurgisk Sutur linjen (figur 1 c)20.
  2. Forberede en 1-mL sprøyte fylt med saltvann og forbundet med en spesialisert kateter laget av en 21-gauge nål (figur 1B). Lag et lite innsnitt med en mikro saks på fartøyet, og skyv kateter på fartøyet.
    1. Sikre nålen ved å binde både proksimale og distale slutten (figur 1 c). Den spesialiserte kateter er laget av en 21-gauge nål. Grind spissen flat og sveise med en 2 mm tips fra en annen 21-gauge nål. Dette kan hindre kateter slipping utenfor.
      Merk: En liten mengde blod strømmer inn nålen viser at nålen har skrevet en blodåre vellykket.

3. ryggraden stabilisering og C5-C7 Laminectomy

  1. Plassere dyret i en utsatt posisjon. Kuttet huden langs midtlinjen med nei 15 skalpell blad på ønsket spinal nivå. Dissekere muscle lagene fra de 5th til 7th cervical ryggsøylen (C5-C7) bilateralt å avsløre den laterale fasetter (figur 2A)21.
    Merk: Finn andre thorax vertebra (T2) ved å finne topp mellom scapulae. Telle oppover fra T2 vertebra finne C7 vertebra21,22,23,24.
  2. Stabilisere ryggraden av rotte bruker en modifisert stabiliserende apparater. Lage en rift på begge sider av lateral ryggvirvel benet. Skyv rustfritt stål armene under de utsatte transverse prosess fasetter og stram skruene for å sikre stabilitet (figur 2B).
  3. Fjern forsiktig C5-C7 laminae (laminectomy, figur 2C).
  4. Sett en liten bit av saltholdig-gjennomvåt gelfoam over den utsatte dura mater å holde det fuktig (figur 2D).

4. installasjon av to-fotonet (2P) Imaging vindu

  1. Ting små biter av gelfoam inn i gapet mellom muskler og ryggvirvel bein, også ting en tynn linje med gelfoam mellom ryggmargen og ryggvirvel bein, deretter bruke vev selvklebende lim for å forsegle området muskel-bein. Vent på 5 minutter for komplett tørrhet (figur 2E).
    Merk: Dette trinnet forhindrer effektivt fremtidige blødning i vinduet og leakiness av nedsenking løsninger.
  2. Forberede 4% agar med ddH2O i mikrobølgeovn. Når agar er fullstendig oppløst, vente før den returnerer til en touchable temperatur. Fyll en 1 mL steril sprøyte med agar løsning og rør det på kanten av vinduet for å bygge en mur (figur 2E). Løsningen stivner raskt og forblir fleksibel linse eller mål å bevege seg fritt.
  3. Når det er klart til avbilding, Fjern gelfoam og sted nedsenking væsken i vinduet for 2P imaging (figur 2F). Overføre stabilisert dyr inne i 2-fotonet mikroskop mørke kammeret og plassere vinduet 2P imaging direkte under linsen. Lavere linsen nøye i vinduet tenkelig.

5. injeksjon av første fluorescerende fargestoff og planlagt bildebehandling

  1. Forberede 0,5 mL Rhodamine B isothiocyanate-dekstran (4 mg/mL gjennomsnittlig molekylvekt ~ 70kDa) i saltvann. Fyll en 1 mL steril sprøyte med løsningen og koble sprøyten til den tidligere installerte kateter.
    Merk: Forbereder fluorescerende fargestoff løsningen før bruk anbefales.
  2. Injisere den første fargestoffet av nedslående sprøyten veldig sakte (figur 3B). Bruk først i okularet for å identifisere området av interesse. Bruke et charge koplede enhet (CCD) kamera for å erverve en lys-feltet bilde av overflaten blodkar mønstre på forstørring som landemerke. Bytte til laser skanningsmodus åpne 2P tenkelig programvare for innsamling av både bilder og linje-scan data.
  3. Velg riktig 2P laser eksitasjon bølgelengde, makt og fluorescerende kanal (rød kanal for første fargestoff) som samsvarer med fluorophores i fotografert vev, og utfør deretter i vivo imaging (figur 3E). Holde dyr på en varmeputen under hele prosessen.

6. C7 Contusive skade bruker LISA enhet

  1. Utføre en C7 midtlinjen contusion skade bruker en Louisville skade systemet apparater (LISA) enhet ifølge en tidligere etablert protokoll25,26.
    1. I korthet, plassere dyret på LISA scenen etter kalibrering.
Etter å velge en null-punktet innstilling og justere vev forskyvning (0.800 mm i dette tilfellet), klikker du "Kjør eksperiment" av programvaren til utløse nedslaget utgivelsen og opprette skaden.
  • Etter skaden, plassere en liten bit av saltholdig-gjennomvåt gelfoam over den utsatte dura mater å holde det fuktig.
  • Gjenta trinn 4.3 og re-utføre i vivo bildebehandling på det samme området som er synlig med den tidligere injisert rød fargen (Figur 3 c & F).
  • Overføre dyr baksiden til tabellen kirurgiske og holde dyr bedøvet med passende anestesi følger protokollen IACUC-IUSM.
  • 7. injeksjon av andre fluorescerende fargestoff og etter skade Imaging

    1. Forberede 0,5 mL av Fluorescein isothiocyanate-dekstran (4 mg/mL, gjennomsnittlig molekylvekt ~ 70 kDa) i saltvann samme som 5.1. Fyll løsningen i en 1 mL steril sprøyte og kontakt med den tidligere installerte kateter.
    2. Overføre stabilisert dyr baksiden inne i 2P mikroskop mørke kammeret og re-image det samme området med den røde kanalen for første fargestoff og den grønne kanalen for andre fargestoff (tall 3D & G).
    3. På slutten av imaging, løslate rotta fra spinal stabilisering enheten og rengjør agar veggen.

    8. dyr offer

    1. Etter bildebehandling, ofre rotta følger de transcardial perfusjon protokoll27. Samle ryggmargen prøvene og løse dem i 4% PFA.

    9. frakoblede dataanalyse: Kvantifisering av fartøyet diameter

    1. Overføre bildefilene en arbeidsstasjon for off-line analyse.
    2. Åpne ImageJ velger "fil" og velg tidligere lagret rådata og åpne filen tilknyttede enkeltbilde (figur 4B).
    3. Kalibrere bildet ved å velge "Analysere" etterfulgt av "Angi skala" (figur 4C). Verdien i "Avstanden i piksler" beregnes ved hjelp av formelen som vises i figur 4A. Kalibrering av 2-fotonet optisk objektivet bestemmer standardverdien i ligningen. Verdien av "opticalZoom" finnes i Excel Extensible Markup Languagefile (XML-fil) knyttet til enkeltbilde filen (figur 4B).
    4. Tegne en linje som er vinkelrett på den lange aksen av fartøyet (Figur 4 d1 & E1) og velg "Analysere" etterfulgt av "Tiltak". Måling av fartøyet diameter vises i resultatvinduet (Figur 4 d2 & E2). Gjenta 3 ganger over skipet å erverve gjennomsnittsverdien.

    10. frakoblede dataanalyse: Kvantifisering av rødt blod celle (RBC) hastighet

    1. Overføre linje-scan filer til arbeidsstasjonen for analyse.
    2. Start ImageJ programvare og velg "fil" og velg tidligere lagret rådata og åpne alle tilknyttede linje-scan filer med filtypen navnet ".ome".
    3. Åpne "Bilde" og velg "Stabler" etterfulgt av"stable". Konvertere alle OME filer til en enkelt bilde stabel TIFF-fil.
    4. Begynne å Matlab programvare og klikk "Åpne", velg "LSPIV_parallel.m" filen. Merk: Matlab kode for LS-PIV kan dataoverførte https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
    5. Velg følgende bestillinger: "Kjøre" > "Endre mappe" > "arterien". Velg bilde TIFF stakkfilen generert i 10.3.
    6. Skriv "Y" og trykk Enter.
    7. Plasser en markør på venstre og høyre side av bildet henholdsvis, og programmet begynner å behandle dataene.
    8. På slutten av programmet, skriver du inn 2 verdier for å beregne den siste lese: "pixel_meter konverteringsverdi", og "søketiden konverteringsverdi". Begge kan finnes i XML-filen tilknyttet linje-scan data. Den siste verdien uttrykkes som middelverdi og standardavvik av hastighet i enheter av millimeter per sekund (mm/s).

    Representative Results

    Metoden er kjøpedyktig dataskjerm i vivo dynamisk spinal vaskulære endringene i enkeltskip pre- og post-traumatisk SCI. Først er et kateter installert via eksterne vena jugularis å gi tilgang for påfølgende fluorescerende fargestoff injeksjoner (figur 1A-C, Figur 3). I det andre trinnet brukes en spesialisert apparater å stabilisere den utsatte C5-C7 (figur 1 d-F, figur 2A-B). Dette stabilisering trinnet kan eliminere puste gjenstander og gir jevn bildebehandling. Etter laminectomy (figur 2C) er det neste trinnet installasjon av 2 P imaging vinduet over C5-C7 (figur 2D-F). Minimere eksterne tissue blødning rundt spinal tenkelig vinduet er avgjørende for vellykket vaskulær bildebehandling. Følgende trinn er å injisere rhodamine-dekstran fluorescerende farge (rød) via den nevnte kateter landemerke og kart vaskulære nettverket som grunnlinjen (figur 3A-B, E). Etter C7 midtlinjen contusive skader med moderat alvorlighetsgrad, FITC-dekstran (grønn) er introdusert på ønsket etter skade tid poeng (figur 3A & D). Skjønnheten av metoden duo-farge er at man kan fortsatt oppdage Vaskulær struktur med andre fargestoff når første fargestoff har allerede lekkasje i parenchyma på grunn av skade (Figur 3 g).

    Under tenkelig samling anbefales det å holde dyr på en varmeputen å opprettholde kroppstemperatur kjernen etter anestesi induksjon.

    Bruke våre duo-farge-metoden kan på hastigheten for diameter og røde blodlegemer (RBC hastighet) av enkeltskip måles og beregnet. Diameter, kan man bruke ImageJ måle fartøyet i største diameter for 3 gjentakelser etter kalibrering (Figur 4). For hastighet måles linje-skanne bilder med Matlab program (MATLAB R2013a) til å beregne RBC hastighet (figur 5)18. Basert på morfologi, blod flyten hastighet og fartøy diameter, fartøyene kan klassifiseres i 2 kategorier: arterien og venen (se tabell 1).

    Figure 1
    Figur 1 . Vena jugularis catheterization og ryggraden stabilisering.
    (A)
    en skjematisk tegning for å finne eksterne vena jugularis. (B) den spesialiserte kateter laget av en 21-gauge nål. Spissen var bakken flat og sveiset med en 2 millimeter tips fra en annen 21-gauge nål. (C) en skjematisk diagram av catheterization. Den klubbeformede enden er samskrevet først, etterfulgt av proksimale kateter stabilisering, med festing nålen sammen med fartøyet (fartøyet hemorroider, blå pilspisser). (D) et bilde av den endrede ryggraden stabilisatoren. En C5-C7 vinduet før laminectomy (E) og etter laminectomy og contusive SCI (F) vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2 . Skjematisk diagram for optisk vindu installasjon trinnvis.
    (A)
    trinn 1: utsette vertebra av skjæring hud og muskel langs midtlinjen. (B) trinn 2: ryggraden stabilisering. (C) trinn 3: laminectomy. (D) trinn 4: opprettholde fuktigheten i ryggmargen ved å plassere et stykke saltholdig-gjennomvåt gelfoam. (E) trinn 5: tette hullene med sterilt gelfoam og vetbond. Etter tørking, er en lag av agar bygd på kanten av vinduet. (F) trinn 6: når det er klart til avbilding, fjerner gelfoam og sted nedsenking væsken inni 2 P imaging vindu. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3 . Den i vivo duo-farge metoden prosedyren trinnvise.
    Hele prosedyren består av 5 trinn (A). Etter trinn 1 og trinn 2, et par dekstran tracers med en størrelse på omtrent 70 KDa er injisert i rekkefølge å merke er ryggmargen blodkar før (B og C) og etter contusive SCI (D). (E)-(G) representant 2P bilder vise ryggmargen blodkar i trinn 3 til trinn 5. Hvite pilene til første-bølge rød farge lekker (F og G), turkis pilspisser vise andre-bølge grønt fargebad lekkasje (G). Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4 . Oppkjøp og kvantifisering av spinal fartøyet diameter.
    Følgende forberedelser, enkelt bildefiler er ervervet under 2 P mikroskopi, sammen med XML-filer av kalibrert verdier (B). (A) ligningen viser beregning av "piksler per mikron" basert på optisk zoom verdier. Etter kalibrering i ImageJ (C), måles fartøyet diameter på 3 poeng over langsgående aksen før (D1) og etter (E1) skade. (D2) og (E2) viser måleverdiene. (F) kvantifisering av fartøyet diameter på grunnlinjen og 30 min etter skade. Skala bar = 50 µm. Data vises som betyr ± SD, *** p < 0.0001, tosidige parvise t-test.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5 . Oppkjøp og måling av spinal fartøyet hastighet.
    Linje-scan bildefiler er ervervet under 2 P mikroskopi beregne enkelt fartøyet hastigheter. (A) et eksempel på en valgt fartøyet og metode for å vurdere blodkar RBC hastighet. (B) et arteriell eksempel linje-scan bilde og tilsvarende tomt-filen for beregning av hastighet, samt et eksempel på en blodåre (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Arterie Blodåre
    Morfologi Rett, glatt og tykk fartøyet veggen Grener, ujevnheter
    Blod flyten hastighet Rask Sakte men varierer
    Diameter 30-80 µm 100-250 µm

    Tabell 1: Vilkår for å identifisere fartøytyper

    Discussion

    En utfordring for vaskulær studier etter SCI er de tekniske begrensningene for tradisjonelle teknikker er i stor grad begrenset til Vaskulær struktur endringer i postmortem prøver. Denne romanen i vivo imaging metoden beskrevet ovenfor kan du dynamisk måling av blodstrøm og relaterte parametere (hastighet og fartøy diameter) med 2 P-LSM i live rotter. Det kan også gjentatte eksamen i de samme filsettene fartøy på ulike tidspunkt etter contusive SCI. Forrige 2-fotonet mikroskopi Bildeteknikker kunne ikke fange post-traumatisk vaskulære strukturer på grunn av lekkasje av en enkelt tracer. Vår duo-farge design kan dynamisk vaskulær bildebehandling for traumatisk modeller. I tillegg gir fleksibiliteten til denne metoden en mulighet til å generere en timelig-romlige profil av akutt vaskulære endringene følger SCI.

    Det er flere avgjørende skritt i våre i vivo duo-farge bildebehandling metode. Først er det grunnleggende å sikre fysisk stabilitet i ryggmargen før tidsinnstilt bildebehandling, spesielt redusere puste bevegelse gjenstand. Vi har utformet form av spinal klemmer å øke høyden på spinal vertebra litt under stabilisering. Dermed bevegelsen av ryggmargen samkjøre å puste dyret kan være sterkt redusert (figur 1 d-F, 2B). Det anbefales å sjekke stabiliteten av ryggmargen før begynnelsen av hver tenkelig økt. Hvis ryggmargen ikke oppnå stabilitet, skal justeringen gjøres til justering og tetthet av spinal cord klemmer. Andre, eksterne tissue (bein, muskler lag og hud) blødning i vinduet bildebehandling kan risikere forurensning av visningen. For en glatte tenkelig økt, bør gelfoam og vev selvklebende lim brukes til omkringliggende vev for effektiv forebygging. Tredje har fluorescerende fargestoffer vi velger samme størrelse som albumin (66 kDa), som er det viktigste molekylvekt blodplasma proteinet. Under homøostatisk forhold beholdes fargestoffer hovedsakelig innsiden av fartøyet lignende albumin28. Etter skaden, fargestoffer gikk gjennom forstyrret endothelial strukturen og lekkasje i parenchyma, forårsaker en betydelig økt fluorescerende intensitet i det eksterne området av blodkar (figur 3F-G). I tillegg finnes det to grunner Hvorfor vi velger eksterne vena jugularis catheterization. Først kan det gi en konsekvent tilgjengelig rute for levering til enhver tid av eksperimentet. Andre, kan det brukes som en rute for behandling injeksjon.

    Selv om vår i vivo duo-farge metoden er kjøpedyktig skaffe en ny arena for traumatisk vaskulær tenkelig studier, må noen ting om denne teknikken adresseres. Foreløpig denne teknikken brukes til å vurdere vaskulære endringene på 2 tidspunkt (planlagt og 1 etter skade punkt), men det er mulig å bytte til flere tidspunkt hvis flere fluorescerende fargestoffer og kanaler er tilgjengelig. Men det er flere studier med implantert glassvindu for kronisk intravital bildebehandling, kan ingen av dem inneholder informasjon om planlagte på samme fartøyet etter traumatisk skade19,29,30, 31,32. I motsetning til disse studiene er våre vinduet en nei-glass vindu. Dette er praktisk for før og etter skade bildebehandling, men det kan være utfordrende for å reetablere vinduet for langsiktig observasjon. Vår fremtidige forskning arbeider med tekniske forbedring for kronisk bildebehandling. Vaskulære system består av flere fartøytyper (arterien, vene og kapillær) og hver er forskjellige i aspekter av morfologi og funksjon. Differensiering mellom fartøytyper under bildebehandling kan hjelpe for å tease ut et klart mønster av vaskulære endringene. Protokollen ovenfor avhenger av observatøren identifisere fartøyene basert på morfologi og hastighet; men kan en arterie-spesifikke fargestoff enkelt legges til å gi en mer definitiv klassifisering mellom fartøyet typer33.

    Denne teknikken er ikke bare begrenset til vurderinger på contusive og andre traumatiske modeller, som knuse skader og stråling skade, men også på studier med fokus på forstyrrelser i BSCB, så vel som vaskulær permeabilitet endringer. Foruten SCI, kan det brukes å studere vaskulære endringene etter andre nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og multippel sklerose (MS). Videre kan det overføres til en transgene dyremodell å studere dynamisk nevrovaskulære samhandlingen. Som en kraftig screening verktøyet, kan fremtidige studier benytte tenkelig teknikken beskrevet her for å vurdere effekten av behandlingen for ryggmargsskade.

    Avslutningsvis er i vivo duo-farge metoden et pålitelig, sanntid, i vivo tilnærming verktøy for vurdering dynamisk vaskulære endringene, som er ideelt for karakteristikk av timelige-romlige vaskulær profil og screening for behandlinger til redusere sekundære skader etter SCI.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet var støttes delvis av NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, fortjener omtale Award I01 BX002356 fra US Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana ryggmarg og hjerne skader Research Foundation ( ISCBIRF) Indiana State Department of Health (019919) og Mari Hulman George begavelse midler.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132 Skin sterilization
    Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Patterson Veterinary  07-881-9413, 07-890-5745 Anesthetic agent
    Buprenorphine(0.03 mg/mL)  Patterson Veterinary  07-891-9756 Pain relief agent
    Carprofen Patterson Veterinary 07-844-7425 Non-steroidal anti-inflammatory drug
    Dukal Gauze Sponges  Fisher Scientific 22-415-490 Skin sterilization
    Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450 Skin sterilization
    Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261  Prevent drying eyes 
    Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific  1006015
    Rhodamine B isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich R9379 Average mol wt 70kDa
    Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich 46945 Average mol wt 70kDa
    Instrument Sterilizer Fine Science Tools 18000-50 for sterilizing surgery tool
    Spine stabilizer set Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Vetbond 3M Animal Care Products 1469SB Tissue adhesive Glue
    Gelfoam Henry Schein 9083300 Stop bleeding
    Noyes Spring Scissors F.S.T 15013-12
    Fine Forceps- Dumont #5 F.S.T 11254-20
    Rongeur Fine Science Tools 16021-14 laminectomy
    Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
    Scalpel Fine Science Tools 10003-12  skin cut
    Scalpel Blade #15 Royal-Tek BS2982 skin cut
    micro angled scissors World Precision Instruments 500260 Can be from any vendor
    3-0 vicryl sutures Ethicon J393H Can be from any vendor
    Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" LOOK 786 Can be from any vendor
    1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200.V0 Can be from any vendor
    21 gauge needle BD 305165 Can be from any vendor
    Agar Sigma-Aldrich A1296 Can be from any vendor
    Two-photon Laser Scanning Microscope Bruker Fluorescence Microscopy
    LISA device Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
    HCImage Live Hamamatsu Corporation Imaging software
    PrairieView Prairie Technologies/Bruker Two-photon imaging software
    ImageJ Image analysis software
    Matlab statistics toolbox The MathWorks, Inc. https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle Image analysis software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. (2016).
    2. Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24, (5), 254-264 (2001).
    3. Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17, (10), 915-925 (2000).
    4. Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59, (4), 606-619 (2006).
    5. Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11, (1), 23-27 (2016).
    6. Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11, (10), 1678-1684 (2016).
    7. Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164, (3), 837-843 (1987).
    8. Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86, (3), 483-492 (1997).
    9. Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2, (3), 197-200 (1974).
    10. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49, (6), 844-853 (1978).
    11. Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32, (2), 260-268 (1993).
    12. Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103, (1), 34-40 (1989).
    13. Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24, (3), 492-507 (2007).
    14. Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27, (4), 403-408 (2005).
    15. Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22, (3), 332-341 (2009).
    16. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (20), 8473-8478 (2011).
    17. Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4, (2), e22 (2006).
    18. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7, (6), e38590 (2012).
    19. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
    20. Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10, (2), 84-94 (2002).
    21. Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
    22. Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220, (1), 9-22 (2009).
    23. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
    24. Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
    25. Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25, (10), 1227-1240 (2008).
    26. Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
    27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
    28. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
    29. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
    30. Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
    31. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
    32. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, (1), 1-7 (2008).
    33. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9, (3), 273-276 (2012).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics