En In Vivo Duo-farve metode for Imaging vaskulære Dynamics efter Contusive rygmarvsskade

Neuroscience
 

Summary

Vi indføre en i vivo billeddannelse metode ved hjælp af to forskellige fluorescerende farvestoffer til at spore dynamisk spinal vaskulære ændringer efter en contusive rygmarvsskade i voksen Sprague-Dawley rotter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chen, C., Zhang, Y. P., Sun, Y., Xiong, W., Shields, L. B., Shields, C. B., Jin, X., Xu, X. M. An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (130), e56565, doi:10.3791/56565 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rygmarvsskade (SCI) medfører betydelige vaskulære afbrydelse på stedet for skade. Vaskulære patologi opstår umiddelbart efter SCI og fortsætter gennem hele den akutte skade fase. Faktisk synes endotelceller at være først til at dø efter en contusive SCI. De tidlige vaskulære begivenheder, herunder øget gennemtrængelighed af blod-rygmarven barriere (BSCB), fremkalde vasogenic ødem og bidrage til skadelige sekundære skade begivenheder forårsaget af komplekse skade mekanismer. Rettet mod den vaskulære forstyrrelser, derfor kunne være en nøglestrategi til at reducere sekundære skade cascades, der bidrager til histologiske og funktionelle handicap efter SCI. Tidligere undersøgelser var for det meste udført på postmortem prøver og var ude af stand til at fange de dynamiske ændringer af det vaskulære netværk. I denne undersøgelse, har vi udviklet en i vivo duo-farve to-foton billedmetoden til at overvåge akut vaskulære dynamiske ændringer efter contusive SCI. Denne tilgang giver mulighed for påvisning af blodgennemstrømningen, fartøj diameter og andre Vaskulære sygdomme på forskellige websteder af samme rotten før og efter skaden. Samlet set giver denne metode et fremragende sted for at undersøge vaskulære dynamics.

Introduction

Traumatisk rygmarvsskade (SCI) er en fælles skade fører til forringelse af motoriske, sensoriske og autonom funktion. Ifølge den nationale rygmarv skade statistiske Center (NSCISC) i 2016, ca. 282,000 personer blev ramt, mens 69% af dem var hovedsagelig som følge af trafikulykker eller falder1. Disse patienter kræve ofte intensiv pleje; men ingen effektiv behandling er tilgængelig i øjeblikket. Derfor er nye effektive strategier mod SCI tvingende nødvendigt.

SCI er primært opdelt i to faser: primær skade og sekundære skade. Den primære skade omfatter den fysiske fornærmelse forårsager blødende nekrose i stedet for virkning2, efterfulgt af en række sekundære skade begivenheder, såsom betændelse, celle apoptose og demyelinering af resterende axoner, der gradvis fører til udvidelse af morfologiske og funktionelt underskud3,4,5,6. Blødning er det første synlige tegn på skade, der angiver en umiddelbar vaskulære forstyrrelser i den akutte fase af SCI7,8. En neuroprotektive strategi med henblik på at reducere de tidlige vaskulære skader kunne forbedre patienternes opsving, men det kræver en bedre forståelse af den patofysiologiske mekanisme for tidlig efter skade vaskulære begivenheder.

Trods tidligere undersøgelser ved hjælp af forskellige metoder til at studere rygmarven Vaskulaturen, fortsat er væsentlige begrænsninger. Den mest delte ulempe er at undersøge kun postmortem prøver, for eksempel, brint regnskabsafslutning9, Autoradiografi10, microangiogram8, vaskulære korrosion kaster11og Immunhistokemi12 ,13. Selv om Laser Doppler Flowmetry giver noninvasive real-time overvågning af rygmarven blod flow14, er det ude af stand til at skelne mellem vaskulære systems og opdage vaskulære morfologiske ændringer. Dynamisk kontrast-forstærket MRI (DCE-MRI) er også noninvasive, men det skaber billeder i lav opløsning og kræver en dyre infrastruktur15.

Selv om i vivo billeddannelse ved hjælp af 2-foton laser scanning mikroskopi (2 P-LSM) er blevet udviklet for at studere vasodynamics i cortex16,17,18, et begrænset antal undersøgelser har demonstreret vaskulære ændringer efter en SCI. Tang et al. har vist ændringer i blodgennemstrømningen i udkanten af webstedet læsion i en hemisection model19, men imaging efter en contusive skade er mere udfordrende af to grunde. Først, en traditionel optisk glasrude over skaden site ville ikke fastholde den mekanisk påvirkning og forblive funktionelle for billeddannelse. Andet, udsivning af tracer i parenkym grund blødning skaber vanskeligheder med efter skade billeddannelse.

Her præsenterer vi en roman duo-farve billedbehandling metode, der tillader imaging de samme individuelle fartøjer på før og efter skade tid point. Desuden giver det en tidsmæssig-rumlige profil af vaskulære dynamiske ændringer efter en contusive SCI. Det har også potentiale for billedbehandling på flere post overtiden point. Denne protokol kan anvendes direkte på transgene dyr at studere neurovaskulære interaktion.

Protocol

Alle kirurgiske og animalske håndteringsprocedurerne blev udført som godkendt i henhold til vejledningen for pasning og anvendelse af forsøgsdyr (National Research Council) og retningslinjerne fra Indiana University skole af medicin institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget.

1. kirurgisk forberedelse

  1. Sterilisere alle kirurgiske værktøjer herunder ryggen stabilisator. Ren tabellen kirurgiske og det omkringliggende område med 70% ethanol. Forberedelse af den kirurgiske procedure, ikke-overlevelse, Læg en ren kirurgisk pad på toppen a 37 ° C varme pad.
  2. Bruge seks uger gamle Sprague Dawley (SD) rotte for denne undersøgelse. Vejer og bedøver rotte med en intraperitoneal injektion af ketamin (87,7 mg/kg) og xylazin (12,3 mg/kg) blanding. Bekræfte korrekt fase af anæstesi, når dyret ophører med at reagere på en tå knivspids stimulus. Subkutant injicere 0,01-0,05 mg/kg buprenorphin og 5mg/kg Carprofen forud for operationen.
  3. Barbere rotte i 2 områder: regionen halshvirvelsøjlen på bagsiden og halsregionen bryst side. Svaber hudområder med betadine kirurgisk krat og 70% alkohol klude. Anvende øjet salve for at forhindre tørre øjne under kirurgi. Placere dyret i en liggende stilling på den rene kirurgisk pad.

2. eksterne halsfedt kateterisation

  1. Find den eksterne halsfedt ved at finde puls point i nærheden af kravebenet, og skar med en lille foråret saks til at lave et lodret snit på stedet, som er cross-punkt 3 anatomiske punkter: caudale ramus af rigtige underkæbe, større tuberkelbakterier af humerus og manubrium (figur 1A). Isolere fartøjet ved hjælp af foråret saks og fine pincet. Binde den distale ende med 1 sterile kirurgisk sutur linje (figur 1 c)20.
  2. Forberede en 1 mL sprøjte fyldt med saltvand og forbundet med en specialiseret kateter fremstillet af en 21-gauge kanyle (figur 1B). Gør et lille snit ved hjælp af et par micro saks på fartøjet og skub kateteret ind i fartøjet.
    1. Sikre nålen ved at binde begge den proksimale og distale ende (figur 1 c). Specialiserede kateteret er lavet af en 21-gauge kanyle. Slibe den flad spids og svejse med en 2-mm stykke tip afskåret fra en anden 21-gauge kanyle. Dette kan forhindre, at kateteret glide udenfor.
      Bemærk: En lille mængde blod flyder ind i nålen angiver, at nålen er trådt et blodkar med succes.

3. ryg stabilisering og C5-C7 laminektomi

  1. Placere dyret i en udsat position. Skære i huden langs midterlinjen med No. 15 skalpel klinge på de ønskede spinal niveauer. Dissekere muskel lag fra de 5th til 7th halshvirvel (C5-C7) bilateralt at eksponere de laterale facetter (figur 2A)21.
    Bemærk: Find den anden thorax ryghvirvel (T2) ved at finde spike mellem scapulae. Tælle opad fra T2 ryghvirvel at finde C7 ryghvirvel21,22,23,24.
  2. Stabilisere rygsøjlen af rotte ved hjælp af en modificeret stabiliserende apparater. Gøre en slids på begge sider af den laterale vertebrale knogle. Skub rustfrit stål arme under udsatte tværgående proces facetter og spænd skruerne for at sikre stabilitet (figur 2B).
  3. Fjern forsigtigt C5-C7 bladplader (laminektomi, figur 2 c).
  4. Læg et lille stykke af saltvand-dyppet gelfoam på toppen af den udsatte dura mater at holde det fugtet (figur 2D).

4. installation af to-foton (2P) Imaging vindue

  1. Ting små stykker af gelfoam ind i hullet mellem musklerne og vertebrale knogler, også ting en tynd streg af gelfoam mellem rygmarven og vertebrale knogler, derefter bruge væv selvklæbende lim til at forsegle området omkring muskel-bone. Vent 5 min. til fuldstændig tørhed (figur 2E).
    Bemærk: Dette trin forhindrer effektivt, at fremtidige blødning i vinduet og leakiness af fordybelse løsninger.
  2. Forbered 4% agar med ddH2O i en mikrobølgeovn. Efter agaren er fuldstændig opløst, vente, indtil det vender tilbage til en touchable temperatur. Fyld en 1 mL steril sprøjte med agar løsning og rør det op på kanten af vinduet for at bygge en mur (figur 2E). Løsningen størkner hurtigt og forbliver fleksible linse eller mål at bevæge sig frit.
  3. Når du er klar til billedbehandling, fjerne gelfoam og sted fordybelse væske inde i vinduet for 2P imaging (figur 2F). Overføre stabiliseret dyret inde i 2-foton mikroskop mørkt kammer og placere vinduet 2P imaging direkte under linsen. Lavere linsen omhyggeligt i vinduet billeddannelse.

5. indsprøjtning af første fluorescerende farvestof og Baseline Imaging

  1. Forberede 0,5 mL af rhodaminfilteret B isothiocyanat-Dextran (4 mg/mL gennemsnitlig molekylevægt ~ 70kDa) i saltvand. Fyld en 1 mL steril sprøjte med løsningen og tilslutte sprøjten til den tidligere installerede kateter.
    Bemærk: Forberede den fluorescerende farvestof løsning før brug anbefales.
  2. Injicere den første farvestof af deprimerende sprøjten meget langsomt (figur 3B). Brug først okular til at identificere området af interesse. Bruge en afgift koblede enhed (CCD) kamera for at erhverve en lysfelt billede af overflade blodkar mønstre ved lavere forstørrelse som et landmark billede. Skifte til laser scanning mode og derefter åbne den 2P imaging software til indsamling af både billeder og line-scan data.
  3. Vælg korrekt 2P laser excitation bølgelængde, magt og fluorescerende kanal (røde kanal for første farvestof) til at matche med fluorophores anvendes i den afbildede væv, og derefter udføre i vivo billeddannelse (figur 3). Holde dyret på en varmepude under hele processen.

6. C7 Contusive skade ved hjælp af LISA enhed

  1. Udføre en C7 midterlinjen kontusion skade ved hjælp af en Louisville skade System apparater (LISA) enhed ifølge en tidligere etableret protokol25,26.
    1. Kort sagt, placere dyret på LISA scenen efter kalibrering.
Efter at vælge en nul-punkt indstilling og justere væv deplacement (0.800 mm i dette tilfælde), klik på knappen "Køre eksperiment" software til at udløse Slaglegemet frigivelse og skabe skaden.
  • Efter skaden, sted endnu et lille stykke af saltvand-dyppet gelfoam på toppen af udsatte dura mater at holde det fugtet.
  • Gentag trin 4.3 og igen udføre i vivo billeddannelse på samme område synlige med den tidligere injiceres røde farvestof (figur 3 c & F).
  • Overføre de dyr tilbage til tabellen kirurgisk og holde dyret sederet med passende anæstesi efter IACUC-IUSM-protokollen.
  • 7. tilførsel af andet fluorescerende farvestof og efter skade Imaging

    1. Forberede 0,5 mL af Fluorescein isothiocyanat-dextran (4 mg/mL, gennemsnitlig molekylvægt ~ 70 kDa) i saltvand samme som 5.1. Fylde løsning i en 1 mL steril sprøjte og oprette forbindelse med den tidligere installerede kateter.
    2. Overføre stabiliseret animalske ryggen inde 2P mikroskop mørkt kammer og re-billed den samme område med den røde kanal for den første farvestof og den grønne kanal til den anden farvestof (tal 3D & G).
    3. For enden af imaging frigive rotte fra enhedens spinal stabilisering og rengør agar væg.

    8. animalske offer

    1. Efter imaging, ofre rotten efter transcardial perfusion protokollen27. Indsamle rygmarven prøver og lave dem i 4% PFA.

    9. offline dataanalyse: Kvantificering af fartøjet diametre

    1. Overføre billedfiler til en arbejdsstation til off-line analyse.
    2. Åbne ImageJ og vælge "file" og derefter vælge tidligere gemte rådata og tilknyttede enkelt billede åbnes (figur 4B).
    3. Kalibrere billedet ved at vælge "Analyser" efterfulgt af "Indstille skala" (figur 4 c). Den værdi, der er placeret i "Afstanden i pixel" beregnes ud fra ligningen vises i figur 4A. Kalibrering af 2-foton optisk linse bestemmer standardværdien i ligningen. Værdien af "opticalZoom" findes i Excel Extensible Markup Languagefile (XML-filen) forbundet med en enkelt billedfil (figur 4B).
    4. Tegn en linje vinkelret på længdeaksen af fartøjet (figur 4D1 & E1) og vælg "Analyze" efterfulgt af "Foranstaltning". Måling af fartøjet diameter der vises i resultatvinduet (figur 4D2 & E2). Gentag 3 gange på tværs af fartøjet til at erhverve den gennemsnitlige værdi.

    10. offline dataanalyse: Kvantificering af rød blod celle (RBC) hastighed

    1. Overføre filerne linje-scan til arbejdsstation til analyse.
    2. Start ImageJ software og vælge "file" og derefter vælge tidligere gemte rådata og åbne alle tilknyttede linje-scan filer med filtypenavnet navn ".ome".
    3. Åbn "Image" og vælg "Stakke" efterfulgt af "billeder at stable". Konvertere alle OME filer i en enkelt stak TIFF-billedfil.
    4. Starter Matlab software og klik på "Åbn", Vælg "LSPIV_parallel.m" fil. Bemærk: Matlab kode for LS-PIV kan downloades på https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
    5. Vælg det følgende: "Kør" > "Skift mappe" > "arterie". Vælg billede stak TIFF-fil genereret i 10.3.
    6. Skriv "Y" og tryk på Enter.
    7. Placerer markøren i venstre og højre side af billedet hhv, og programmet begynder at behandle dataene.
    8. I slutningen af programmet, indtaste 2 værdier for at beregne den endelige Læs: "pixel_meter Konverteringsværdi", og "scan-tid Konverteringsværdi". Begge kan findes i filen XML-tilknyttet linje-scan data. Den endelige værdi er udtrykt som middelværdi og standardafvigelse af hastighed i andele i millimeter pr. sekund (mm/s).

    Representative Results

    Metoden er i stand til at overvåge i vivo dynamisk spinal vaskulære ændringer i individuelle fartøjer præ- og post-traumatisk SCI. Først, et kateter er installeret via den eksterne halsfedt adgang til efterfølgende fluorescerende farvestof injektioner (figur 1A-C, figur 3). I andet trin bruges en specialiseret apparater til at stabilisere den udsatte C5-C7 (fig. 1 d-F, figur 2A-B). Denne stabilisering trin kan fjerne vejrtrækning artefakter og give stabil billeddannelse. Efter laminektomi (figur 2 c) er det næste trin installationen af 2 P imaging vindue over C5-C7 (figur 2D-F). Minimering af perifere væv blødning omkring vinduet spinal billedbehandling er afgørende for vellykket vaskulære imaging. De følgende trin er at injicere rodamin-dextran fluorescerende farvestof (rød) via de førnævnte kateter til landmark og kort den vaskulære netværk som baseline (figur 3A-B, E). Efter C7 midterlinjen contusive skade med moderat sværhedsgrad, FITC-dextran (grøn) er indført på ønskede efter skade tid point (figur 3A & D). Skønheden i metoden duo-farve er, at man kan stadig finde det vaskulære struktur ved hjælp af den anden farve, når den første farvestof er allerede lækket i parenkym på grund af skade (figur 3 g).

    Under imaging-session er det tilrådeligt at holde dyret på en varmepude til at opretholde kroppens kernetemperatur efter anæstesi induktion.

    Metoden vores duo-farve, kan diameter og røde blodlegemer hastighed (RBC hastighed) af enkelte fartøjer måles og beregnes. For diameter, kan man bruge ImageJ til at måle skibet på dets største diameter for 3 gentagelser efter kalibrering (figur 4). For hastighed måles linje-scanne billeder ved hjælp af Matlab program (MATLAB R2013a) til at beregne RBC hastighed (figur 5)18. Baseret på morfologi, blood flow hastighed og fartøj diameter, fartøjerne kan inddeles i 2 kategorier: arterie og vene (se tabel 1).

    Figure 1
    Figur 1 . Halsfedt kateterisation og ryg stabilisering.
    (A)
    en skematisk tegning for at lokalisere den eksterne halsfedt. (B) specialiserede kateteret fremstillet af en 21-gauge kanyle. Spidsen var jorden flad og svejsede med et stykke af 2 millimeter tip afskåret fra en anden 21-gauge kanyle. (C) et skematisk diagram over kateterisation. Den distale ende er forbundet først, efterfulgt af proksimale kateter stabilisering, slutter med fastgørelse nålen sammen med skibet (skib ligatur, blå pilespidser). (D) et billede af den modificerede ryggen stabilisator. En C5-C7 vindue før laminektomi (E) og efter laminektomi og contusive SCI (F) vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2 . Skematisk diagram over fiberoptiske vindue installation trin for trin.
    (A)
    trin 1: udsætte ryghvirvel ved skæring hud og muskel langs midterlinjen. (B) trin 2: ryg stabilisering. (C) trin 3: laminectomy. (D) trin 4: fastholde fugt af rygmarven ved at placere et stykke af saltvand-gennemblødt gelfoam. (E) Step 5: forsegle hullerne med sterile gelfoam og vetbond. Efter tørring, er et lag af agar mur bygget på kanten af vinduet. (F) trin 6: når du er klar til billedbehandling, fjerne gelfoam og sted fordybelse væske inde 2 P imaging vindue. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3 . Den i vivo duo-farve metode procedure trinvise.
    Hele proceduren består af 5 trin (A). Efter trin 1 og trin 2, et par af dextran røbestoffer med en størrelse på ca 70 KDa er indsprøjtet i rækkefølge for at mærke rygmarven Vaskulaturen før ()B og C) og efter contusive SCI (D). (E)-(G) repræsentative 2P billeder vise rygmarven Vaskulaturen på trin 3-trin 5. Hvid pilene peger på første-wave røde farvestof utæt områder (F og G), turkis pilespidser vise anden-bølge grønne farvestof lækage (G). Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4 . Erhvervelse og kvantificering af spinal fartøj diametre.
    Efter tilberedningen, enkelt billedfiler er erhvervet under 2 P mikroskopi, sammen med XML-filer af kalibrerede værdier (B). (A) ligningen viser beregningen af "pixel pr. micron" baseret på optisk zoom værdier. Efter kalibrering i ImageJ (C), fartøj diametre måles til 3 point på tværs af den langsgående akse før (D1) og efter (E1) skade. (D2) og (E2) viser de målte værdier. (F) kvantificering af fartøjet diametre på baseline og 30 min efter skade. Skalalinjen = 50 µm. Data er vist som betyder ± SD, *** p < 0.0001, to-sidede parret t-test.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5 . Erhvervelse og kvantificering af spinal fartøjets hastighed.
    Line-scan billedfiler er erhvervet under 2 P mikroskopi til at beregne enkelt fartøj hastigheder. (A) et eksempel på en valgt fartøj og metode til at vurdere blodkar RBC hastighed. (B) en arteriel eksempel på linje-scan billede og tilsvarende områdefil for beregning af hastighed, samt et eksempel på en vene (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Arterie Vene
    Morfologi Lige, glat, tyk karvæggen Grene, ru kanter
    Blood Flow hastighed Hurtig Langsom men varierer
    Diameter 30-80 µm 100-250 µm

    Tabel 1: Kriterier for at identificere fartøjet typer

    Discussion

    En udfordring for vaskulære studier efter SCI er de tekniske begrænsninger for traditionelle teknikker er stort set begrænset til vaskulære struktur ændringer i postmortem prøver. Denne roman i vivo billeddannelse ovenfor beskrevne metode giver mulighed for dynamisk måling af blodgennemstrømningen og relaterede parametre (hastighed og fartøj diameter) ved hjælp af 2 P-LSM i levende rotter. Det giver også mulighed for gentagne undersøgelse i de samme sæt af fartøjer på forskellige tidspunkter efter contusive SCI. Tidligere 2-foton mikroskopi Billeddannende teknikker har kunnet fange efter traumer vaskulære strukturer som følge af udsivning af en enkelt tracer. Vores duo-farve design giver mulighed for dynamisk vaskulære imaging for traumatisk modeller. Derudover giver fleksibilitet ved denne metode mulighed for at generere en temporal-rumlige profil af akut vaskulære ændringer efter SCI.

    Der er flere kritiske trin i vores i vivo duo-farve billedbehandling metode. For det første er det afgørende at sikre den fysiske stabilitet af rygmarven før time-lapse imaging, især at reducere vejrtrækning motion artefakt. Vi har udviklet form af spinal klemmer til at øge højden af spinal ryghvirvel lidt under stabilisering. Således bevægelighed af rygmarven korrelerede vejrtrækning dyret kan være stærkt reduceret (fig. 1 d-F, 2B). Det anbefales at kontrollere stabiliteten af rygmarven før begyndelsen på hver tænkelig session. Rygmarven ikke opnå stabilitet, skal justeringen foretages til justering og tæthed af rygmarven klemmer. Andet, perifere væv (knogle, muskel lag og hud) blødning i vinduet imaging risikerer forurening af visningen. For en glat imaging session, bør gelfoam og væv klæbende lim anvendes til det omkringliggende væv for effektiv forebyggelse. Tredje, de fluorescerende farvestoffer vi vælger har samme størrelse som albumin (66 kDa), som er den vigtigste høj molekylvægt blodplasma protein. Homeostatiske betingelser, blev farvestoffer i vid udstrækning bevaret inde i fartøjet lignende som albumin28. Efter skaden, farvestofferne passeret forstyrret endotel struktur og rende ind i parenkym, forårsager en betydelig øget fluorescerende intensitet i det perifere område af Vaskulaturen (figur 3F-G). Derudover er der to grunde til, hvorfor vi vælger eksterne halsfedt kateterisation. Først, kan det give en konsekvent adgang rute levering på ethvert tidspunkt af eksperimentet. For det andet kan det bruges som en rute til fremtidige behandling injektion.

    Selv om vores i vivo duo-farve metode er købedygtig levere en roman mødested for traumatisk vaskulære imaging studier, skal nogle forbehold vedrørende denne teknik behandles. I øjeblikket, denne teknik er designet til at vurdere vaskulære ændringer ved 2 tiden point (baseline og 1 efter skade tidspunkt), men det er muligt at skifte til flere tidspunkter hvis yderligere fluorescerende farvestoffer og-kanaler. Selv om der er flere undersøgelser med indopereret glasvindue for kronisk intravital imaging, kan ingen af dem giver baseline oplysninger på et og samme skib efter traumatisk skade19,29,30, 31,32. I modsætning til disse studier er vores vindue en no-glas vindue. Det er bekvemt for præ- og post skade billedbehandling, men det kan være udfordrende for genetablering af vinduet for langsigtet observation. Vores fremtidige forskning arbejder på den tekniske forbedring for kronisk billeddannelse. Det vaskulære system er sammensat af flere fartøj typer (arterie, vene og kapillær) og hver er forskellige aspekter af morfologi og funktion. Differentiering mellem fartøjet typer under imaging kunne bidrage til at drille et klart mønster af vaskulære ændringer. Den ovennævnte protokol afhænger observatør at identificere de fartøjer, der er baseret på morfologi og hastighed; dog kan en arterie-specifikke farvestoffet tilføjes nemt for at give en mere definitiv klassificering mellem fartøjet typer33.

    Denne teknik er ikke kun begrænset til vurderinger af contusive og andre traumatiske modeller, såsom crush skade og stråling skade, men også på undersøgelser fokuserer på forstyrrelse af BSCB, såvel som vaskulær permeabilitet ændringer. Udover SCI, kunne det bruges til at studere de vaskulære ændringer efter andre neurodegenerative sygdomme som Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og multipel sklerose (MS). Det kunne desuden være overføres til en transgene dyr model til at studere den dynamiske neurovaskulære interaktion. Som en kraftfuld screeningsværktøj, kunne fremtidige undersøgelser udnytte den Billeddannende teknik beskrevet her til at vurdere effektiviteten af behandling for rygmarvsskade.

    Konklusion, er i vivo duo-farve metode en pålidelig, real-time, i vivo tilgang værktøj til vurdering af dynamiske vaskulære ændringer, som er ideel til karakterisering af tidsmæssige-rumlige vaskulære profil og screening for behandlinger til reducere sekundære skader efter SCI.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at oplyse.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet i en del af NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Merit anmeldelse Award I01 BX002356 fra US Department of veterananliggender, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana rygmarv og hjerne skade Research Foundation ( ISCBIRF) af Indiana State Department of Health (019919), og Mari Hulman George Endowment midler.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132 Skin sterilization
    Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Patterson Veterinary  07-881-9413, 07-890-5745 Anesthetic agent
    Buprenorphine(0.03 mg/mL)  Patterson Veterinary  07-891-9756 Pain relief agent
    Carprofen Patterson Veterinary 07-844-7425 Non-steroidal anti-inflammatory drug
    Dukal Gauze Sponges  Fisher Scientific 22-415-490 Skin sterilization
    Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450 Skin sterilization
    Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261  Prevent drying eyes 
    Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific  1006015
    Rhodamine B isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich R9379 Average mol wt 70kDa
    Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich 46945 Average mol wt 70kDa
    Instrument Sterilizer Fine Science Tools 18000-50 for sterilizing surgery tool
    Spine stabilizer set Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Vetbond 3M Animal Care Products 1469SB Tissue adhesive Glue
    Gelfoam Henry Schein 9083300 Stop bleeding
    Noyes Spring Scissors F.S.T 15013-12
    Fine Forceps- Dumont #5 F.S.T 11254-20
    Rongeur Fine Science Tools 16021-14 laminectomy
    Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
    Scalpel Fine Science Tools 10003-12  skin cut
    Scalpel Blade #15 Royal-Tek BS2982 skin cut
    micro angled scissors World Precision Instruments 500260 Can be from any vendor
    3-0 vicryl sutures Ethicon J393H Can be from any vendor
    Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" LOOK 786 Can be from any vendor
    1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200.V0 Can be from any vendor
    21 gauge needle BD 305165 Can be from any vendor
    Agar Sigma-Aldrich A1296 Can be from any vendor
    Two-photon Laser Scanning Microscope Bruker Fluorescence Microscopy
    LISA device Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
    HCImage Live Hamamatsu Corporation Imaging software
    PrairieView Prairie Technologies/Bruker Two-photon imaging software
    ImageJ Image analysis software
    Matlab statistics toolbox The MathWorks, Inc. https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle Image analysis software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. (2016).
    2. Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24, (5), 254-264 (2001).
    3. Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17, (10), 915-925 (2000).
    4. Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59, (4), 606-619 (2006).
    5. Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11, (1), 23-27 (2016).
    6. Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11, (10), 1678-1684 (2016).
    7. Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164, (3), 837-843 (1987).
    8. Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86, (3), 483-492 (1997).
    9. Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2, (3), 197-200 (1974).
    10. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49, (6), 844-853 (1978).
    11. Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32, (2), 260-268 (1993).
    12. Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103, (1), 34-40 (1989).
    13. Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24, (3), 492-507 (2007).
    14. Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27, (4), 403-408 (2005).
    15. Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22, (3), 332-341 (2009).
    16. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (20), 8473-8478 (2011).
    17. Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4, (2), e22 (2006).
    18. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7, (6), e38590 (2012).
    19. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
    20. Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10, (2), 84-94 (2002).
    21. Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
    22. Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220, (1), 9-22 (2009).
    23. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
    24. Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
    25. Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25, (10), 1227-1240 (2008).
    26. Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
    27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
    28. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
    29. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
    30. Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
    31. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
    32. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, (1), 1-7 (2008).
    33. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9, (3), 273-276 (2012).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics