Vivo में एक डुओ-रंग विधि इमेजिंग संवहनी गतिशीलता के लिए निंनलिखित Contusive रीढ़ की हड्डी में चोट

Neuroscience
 

Summary

हम एक vivo इमेजिंग विधि में एक contusive वयस्क Sprague-Dawley चूहों में रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद गतिशील रीढ़ की हड्डी में परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए दो अलग फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग परिचय ।

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Chen, C., Zhang, Y. P., Sun, Y., Xiong, W., Shields, L. B., Shields, C. B., Jin, X., Xu, X. M. An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (130), e56565, doi:10.3791/56565 (2017).

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Abstract

रीढ़ की हड्डी की चोट (विज्ञान) चोट के स्थल पर महत्वपूर्ण संवहनी व्यवधान का कारण बनता है । संवहनी विकृति विज्ञान के तुरंत बाद होता है और तीव्र चोट चरण भर में जारी है । वास्तव में, endothelial कोशिकाओं को एक contusive विज्ञान के बाद मरने के लिए पहली बार दिखाई देते हैं । जल्दी संवहनी घटनाओं, रक्त की वृद्धि हुई पारगम्यता सहित रीढ़ की हड्डी में बाधा (BSCB), vasogenic शोफ प्रेरित और जटिल चोट तंत्र की वजह से हानिकारक माध्यमिक चोट घटनाओं के लिए योगदान. संवहनी विघटन लक्ष्यीकरण, इसलिए, एक प्रमुख रणनीति माध्यमिक चोट झरने कि विज्ञान के बाद ऊतकीय और कार्यात्मक विकलांगता में योगदान को कम करने के लिए हो सकता है । पिछले अध्ययनों ज्यादातर गुजाइश नमूनों पर प्रदर्शन किया गया और संवहनी नेटवर्क के गतिशील परिवर्तन पर कब्जा करने में असमर्थ थे । इस अध्ययन में, हम contusive विज्ञान के बाद तीव्र संवहनी गतिशील परिवर्तन की निगरानी करने के लिए एक वीवो डुओ-कलर दो-फोटॉन इमेजिंग विधि में विकसित किया है । यह दृष्टिकोण एक ही चूहे के पूर्व और बाद चोट के विभिंन स्थलों पर रक्त के प्रवाह, पोत व्यास, और अंय संवहनी विकृतियों का पता लगाने की अनुमति देता है । कुल मिलाकर, इस विधि संवहनी गतिशीलता की जांच के लिए एक उत्कृष्ट स्थल प्रदान करता है ।

Introduction

दर्दनाक रीढ़ की हड्डी की चोट (विज्ञान) एक आम चोट मोटर, संवेदी, और स्वायत्त समारोह की हानि के लिए अग्रणी है । राष्ट्रीय रीढ़ की हड्डी में चोट सांख्यिकीय केंद्र (NSCISC) के अनुसार २०१६ में, लगभग २८२,००० व्यक्ति प्रभावित हुए थे जबकि उनमें से ६९% मुख्य रूप से यातायात दुर्घटनाओं की वजह से थे या गिर1. इन रोगियों को अक्सर गहन देखभाल की आवश्यकता होती है; हालांकि, कोई प्रभावी उपचार वर्तमान में उपलब्ध नहीं है । इसलिए, विज्ञान के प्रति नई प्रभावी रणनीतियों की तत्काल आवश्यकता है ।

प्राथमिक चोट और माध्यमिक चोट: विज्ञान मुख्य रूप से दो चरणों में विभाजित है । प्राथमिक चोट शारीरिक प्रभाव के स्थल पर रक्तस्रावी परिगलन के कारण अपमान शामिल है2, इस तरह की सूजन के रूप में माध्यमिक चोट की घटनाओं, की एक श्रृंखला के बाद, सेल apoptosis, और शेष axons के ग्रासलेल्या, कि उत्तरोत्तर नेतृत्व रूपात्मक और कार्यात्मक घाटे के विस्तार के लिए3,4,5,6। नकसीर चोट का पहला दृश्य संकेत है, विज्ञान7,8के तीव्र चरण में एक तत्काल संवहनी व्यवधान का संकेत है । एक न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रारंभिक संवहनी क्षति को कम करने के उद्देश्य से रणनीति रोगियों की वसूली में सुधार कर सकता है, लेकिन यह जल्दी बाद चोट संवहनी घटनाओं के pathophysiological तंत्र की एक बेहतर समझ की आवश्यकता है ।

पिछले विभिंन तरीकों का उपयोग करने के लिए रीढ़ की हड्डी vasculature अध्ययन, महत्वपूर्ण सीमाएं रह अध्ययन के बावजूद । सबसे साझा नुकसान केवल गुजाइश नमूनों का अध्ययन कर रहा है, उदाहरण के लिए, हाइड्रोजन क्लीयरेंस9, autoradiography10, microangiogram8, संवहनी जंग castes11, और immunohistochemistry12 ,13. हालांकि लेजर डॉपलर Flowmetry रीढ़ की हड्डी रक्त प्रवाह14के आक्रामक वास्तविक समय की निगरानी प्रदान करता है, यह संवहनी प्रणालियों के बीच अंतर करने में असमर्थ है और संवहनी रूपात्मक परिवर्तन का पता लगाने । गतिशील इसके विपरीत-बढ़ाया एमआरआई (DCE-एमआरआई) भी गैर इनवेसिव है, लेकिन यह कम संकल्प छवियों को उत्पन्न करता है और एक महंगी बुनियादी सुविधाओं की आवश्यकता है15.

हालांकि vivo इमेजिंग में 2-फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (2P-LSM) का उपयोग कर vasodynamics के प्रांतस्था में अध्ययन के लिए विकसित किया गया है16,17,18, एक सीमित संख्या में अध्ययन है एक विज्ञान. टंग एट अल निंनलिखित संवहनी परिवर्तन का प्रदर्शन किया है एक hemisection मॉडल में घाव साइट के किनारे पर रक्त के प्रवाह में परिवर्तन दिखाया गया है19, लेकिन एक contusive चोट के बाद इमेजिंग दो कारणों के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण है । सबसे पहले, एक पारंपरिक शीशे की चोट साइट पर ऑप्टिकल खिड़की यांत्रिक प्रभाव को बनाए रखने और इमेजिंग के लिए कार्यात्मक नहीं होगा । दूसरा, रक्तस्राव के कारण पैरेन्काइमा में अनुरेखक के रिसाव के बाद चोट इमेजिंग के साथ कठिनाई पैदा करता है.

यहां हम एक उपंयास डुओ-रंग इमेजिंग विधि है, जो पूर्व में एक ही व्यक्ति वाहिकाओं इमेजिंग और बाद चोट समय अंक की अनुमति देता है उपस्थित । इसके अलावा, यह एक contusive विज्ञान के बाद एक लौकिक-संवहनी गतिशील परिवर्तन के स्थानिक प्रोफ़ाइल प्रदान करता है । यह भी कई पद चोट समय अंक में इमेजिंग के लिए क्षमता है । इस प्रोटोकॉल सीधे ट्रांसजेनिक पशुओं के लिए लागू किया जा सकता है neurovascular बातचीत का अध्ययन ।

Protocol

सभी शल्य चिकित्सा और पशु हैंडलिंग प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के तहत अनुमोदित के रूप में प्रदर्शन किया गया (राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद) और इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के दिशानिर्देश संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति.

1. सर्जिकल तैयारी

  1. रीढ़ स्थिरता सहित सभी सर्जिकल उपकरण निष्फल । सर्जिकल मेज और ७०% इथेनॉल के साथ सभी आसपास के क्षेत्र को साफ । गैर जीवन रक्षा शल्य प्रक्रिया की तैयारी के लिए, एक ३७ डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड के शीर्ष पर एक साफ सर्जिकल पैड जगह है ।
  2. इस अध्ययन के लिए छह सप्ताह पुराने Sprague Dawley (एसडी) चूहे का प्रयोग करें । वजन और anesthetize के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहे ketamine (८७.७ मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (१२.३ मिलीग्राम/ संज्ञाहरण के उचित चरण की पुष्टि करें जब जानवर एक पैर की अंगुली चुटकी उत्तेजना का जवाब रहता है । शल्य चिकित्सा से पहले 0.01-0.05 मिलीग्राम/किलो Buprenorphine और 5दिन/
  3. 2 क्षेत्रों में चूहे दाढ़ी: पीठ पर ग्रीवा रीढ़ क्षेत्र और स्तन की ओर गर्दन क्षेत्र । साफ betadine सर्जिकल सफ़ाई और ७०% अल्कोहल पोंछे के साथ त्वचा क्षेत्रों । सर्जरी के दौरान सूखी आंख को रोकने के लिए आंख मरहम लागू करें । साफ सर्जिकल पैड पर एक लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस ।

2. बाहरी Jugular नस कैथीटेराइजेशन

  1. हंसली के पास नाड़ी बिंदु खोजने के द्वारा बाहरी jugular नस का पता लगाने, और छोटे वसंत कैंची की एक जोड़ी के साथ कटौती के मौके पर एक ऊर्ध्वाधर चीरा, जो 3 संरचनात्मक अंक के पार बिंदु है बनाने के लिए: caudal रेमस ऑफ राइट mandible, ग्रेटर tubercle ऑफ humerus और manubrium (चित्र 1a) । वसंत कैंची और ठीक संदंश का उपयोग पोत को अलग । 1 बाँझ सर्जिकल टांका लाइन (चित्रा 1C)20के साथ बाहर का अंत टाई ।
  2. एक 1-मिलीलीटर खारा से भरा सिरिंज तैयार करें और एक 21 गेज सुई (आंकड़ा 1b) से बना एक विशेष कैथेटर के साथ जुड़ा हुआ है । एक छोटे पोत पर माइक्रो कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर चीरा और पोत में कैथेटर स्लाइड ।
    1. दोनों समीपस्थ और बाहर के छोर (चित्रा 1C) बांधने से सुई सुरक्षित । विशेष कैथेटर एक 21 गेज सुई से बनाया गया है । पीस टिप फ्लैट और एक 2 मिमी टुकड़ा टिप के साथ वेल्ड एक और 21 से काट-गेज सुई । इस कैथेटर बाहर फिसल से रोका जा सकता है ।
      नोट: सुई में खून बहने की एक छोटी राशि इंगित करता है कि सुई एक रक्त वाहिका सफलतापूर्वक प्रवेश किया है ।

3. रीढ़ स्थिरीकरण और C5-C7 Laminectomy

  1. पशु को प्रवण स्थिति में रखें । वांछित रीढ़ की हड्डी के स्तर पर एक नंबर 15 स्केलपेल ब्लेड के साथ midline के साथ त्वचा में कटौती । टुकड़े 5th से 7गु ग्रीवा कशेरुकाओं (C5-C7) द्विपक्षीय रूप से पार्श्व पहलुओं (चित्रा 2a)21को बेनकाब करने के लिए मांसपेशियों की परतों को दूर करता है ।
    नोट: scapulae के बीच स्पाइक ढूंढकर दूसरा वक्ष ग्रीवा (टी 2) लगाएं । टी 2 ग्रीवा से ऊपर की ओर गिनती C7 ग्रीवा21,22,23,24को खोजने के लिए ।
  2. एक संशोधित स्थिर तंत्र का उपयोग कर चूहे की रीढ़ को स्थिर । पार्श्व कशेरुका हड्डी के दोनों किनारों पर एक भट्ठा बनाओ । उजागर अनुप्रस्थ प्रक्रिया पहलुओं के नीचे स्टेनलेस स्टील के हथियार स्लाइड और सुरक्षित स्थिरता (चित्रा बी) के लिए शिकंजा कस.
  3. C5-C7 laminae (laminectomy, चित्र 2c) को सावधानीपूर्वक निकालें ।
  4. उजागर बाडी मेटर के शीर्ष पर खारा-लथपथ gelfoam का एक छोटा सा टुकड़ा रखें यह moisturized (चित्रा 2d) ।

4. दो-फोटॉन (2P) इमेजिंग विंडो की स्थापना

  1. सामान मांसपेशियों और कशेरुका हड्डियों के बीच की खाई में gelfoam के छोटे टुकड़े, यह भी सामान रीढ़ की हड्डी और कशेरुका हड्डियों के बीच gelfoam की एक पतली रेखा है, तो ऊतक चिपकने वाला गोंद का उपयोग आसपास के मांसपेशी हड्डी क्षेत्र सील । पूर्ण सूखापन के लिए 5 मिनट रुको (चित्रा 2E) ।
    नोट: इस कदम को प्रभावी ढंग से भविष्य रक्तस्राव खिड़की और विसर्जन समाधान के leakiness में रोकता है ।
  2. एक माइक्रोवेव में ddH2O के साथ 4% आगर तैयार करें । के बाद आगर पूरी तरह से भंग हो गया है, जब तक यह एक स्पर्श तापमान के लिए रिटर्न रुको । एक 1-मिलीलीटर बाँझ सिरिंज समाधान के साथ भरें और यह पाइप खिड़की के किनारे पर एक दीवार (चित्रा 2E) का निर्माण करने के लिए । समाधान जल्दी जम जाता है और लेंस या उद्देश्य के लिए स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति लचीला रहता है ।
  3. जब इमेजिंग के लिए तैयार है, gelfoam और जगह विसर्जन द्रव 2P इमेजिंग (चित्रा 2F) के लिए खिड़की के अंदर निकालें । 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप डार्क चैंबर के अंदर स्थिर पशु स्थानांतरण और लेंस के तहत सीधे 2P इमेजिंग खिड़की जगह है । लेंस इमेजिंग विंडो में ध्यान से कम ।

5. पहले फ्लोरोसेंट डाई और आधारभूत इमेजिंग के इंजेक्शन

  1. खारा में ०.५ मिलीलीटर Rhodamine बी isothiocyanate-Dextran (4 मिलीग्राम/एमएल औसत आणविक वजन ~ 70kDa) तैयार करें । समाधान के साथ एक 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज भरें और पहले से स्थापित कैथेटर के लिए सिरिंज कनेक्ट.
    नोट: उपयोग करने से पहले फ्लोरोसेंट डाई समाधान की तैयारी की सिफारिश की है.
  2. सिरिंज बहुत धीरे (चित्र बी) निराशाजनक द्वारा पहले डाई इंजेक्षन । सबसे पहले, ऐपिस का उपयोग करने के लिए ब्याज के क्षेत्र की पहचान । एक मील का पत्थर छवि के रूप में कम आवर्धन पर सतह रक्त वाहिका पैटर्न के एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि प्राप्त करने के लिए एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा का प्रयोग करें । लेजर स्कैनिंग मोड में स्विच करें और फिर छवियों और लाइन-स्कैन डेटा एकत्र करने के लिए 2P इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें ।
  3. का चयन करें उचित 2P लेजर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, बिजली, और फ्लोरोसेंट चैनल (पहले डाई के लिए लाल चैनल) imaged ऊतक में इस्तेमाल किया fluorophores के साथ मैच, और फिर vivo इमेजिंग (चित्रा 3E) में प्रदर्शन. पूरी प्रक्रिया के दौरान एक हीटिंग पैड पर जानवर रखो ।

6. C7 Contusive चोट लिसा डिवाइस का उपयोग

  1. एक पहले से स्थापित प्रोटोकॉल25,26के अनुसार एक Louisville चोट सिस्टम उपकरण (लिसा) डिवाइस का उपयोग कर एक C7 midline चोट चोट करते हैं ।
    1. संक्षेप में, अंशांकन के बाद लिसा मंच पर पशु जगह है ।
एक शूंय बिंदु की स्थापना का चयन और ऊतक विस्थापन (इस मामले में ०.८०० mm) का समायोजन करने के बाद, प्रभाव रिलीज ट्रिगर और चोट बनाने के लिए सॉफ्टवेयर के "भागो प्रयोग" बटन पर क्लिक करें ।
  • चोट के बाद, खारा के एक और छोटे टुकड़े-उजागर बाडी मेटर के शीर्ष पर लथपथ gelfoam प्लेस यह moisturized रखने के लिए ।
  • दोहराएँ ४.३ चरण और पहले इंजेक्ट किए गए लाल डाई (चित्र 3 सी & #38; F) के साथ दृश्यमान समान क्षेत्र पर vivo इमेजिंग में पुन: निष्पादित करें ।
  • शल्य तालिका के लिए वापस पशु स्थानांतरण और IACUC-IUSM प्रोटोकॉल के बाद उचित संज्ञाहरण के साथ बेहोश जानवर रखने के लिए ।
  • 7. दूसरा फ्लोरोसेंट डाई और बाद चोट इमेजिंग के इंजेक्शन

    1. Fluorescein isothiocyanate-dextran (4 मिलीग्राम/एमएल, औसत आणविक वजन ~ ७० केडीए) में ५.१ के रूप में एक ही खारा में ०.५ मिलीलीटर तैयार करें । एक 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज में समाधान भरें और पहले से स्थापित कैथेटर के साथ कनेक्ट ।
    2. 2P माइक्रोस्कोप डार्क चैंबर के अंदर स्थिर पशु वापस स्थानांतरण और पहले डाई के लिए लाल चैनल और दूसरा डाई के लिए ग्रीन चैनल के साथ फिर से छवि एक ही क्षेत्र (आंकड़े 3 डी & #38; G).
    3. इमेजिंग के अंत में स्पाइनल स्थिरीकरण यंत्र से चूहे को छोड़ें और आगर की दीवार को साफ करें ।

    8. पशु बलि

    1. इमेजिंग के बाद, transcardial छिड़काव प्रोटोकॉल27के बाद चूहे को कुर्बान करें । रीढ़ की हड्डी के नमूनों को इकट्ठा करें और उन्हें 4% पीएफए में ठीक करें ।

    9. ऑफ़लाइन डेटा विश्लेषण: पोत व्यास के ठहराव

    1. छवि फ़ाइलों को बंद लाइन विश्लेषण के लिए किसी कार्यस्थान पर स्थानांतरित करें ।
    2. ImageJ खोलें और "फ़ाइल" का चयन करें और फिर पहले से सहेजा गया raw डेटा चुनें और संबद्ध एकल छवि फ़ाइल (आरेख 4B) खोलें ।
    3. "सेट स्केल" (चित्र 4c) के बाद "विश्लेषण" चुनकर छवि जांचें । "पिक्सेल में दूरी" में रखा गया मान चित्र 4aमें प्रदर्शित समीकरण का उपयोग कर परिकलित किया जाता है । 2-फोटॉन ऑप्टिकल लेंस के अंशांकन समीकरण में डिफ़ॉल्ट मान निर्धारित करता है । "opticalZoom" का मान Excel एक्सटेंसिबल मार्कअप Languagefile (XML फ़ाइल) के साथ संबद्ध एकल छवि फ़ाइल (चित्र 4B) में पाया जाता है ।
    4. पोत की लंबी धुरी के लिए सीधा एक लाइन ड्रा (चित्रा 4d1 & #38; ई1) और का चयन करें "विश्लेषण" के बाद "उपाय" । पोत व्यास की माप परिणाम विंडो में प्रदर्शित किया जाता है (चित्रा 4d2 & #38; ई2) । दोहराएं औसत मूल्य प्राप्त करने के लिए पोत भर में 3 बार ।

    10. ऑफलाइन डेटा विश्लेषण: लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) वेग के ठहराव

    1. विश्लेषण के लिए कार्यस्थान के लिए लाइन-स्कैन फ़ाइलें स्थानांतरित करें ।
    2. ImageJ सॉफ्टवेयर शुरू और "फ़ाइल" का चयन करें और फिर पहले से बचाया रॉ डेटा चुनें और एक्सटेंशन नाम ". ome" के साथ सभी संबंधित लाइन-स्कैन फ़ाइलों को खोलने ।
    3. खोलें "छवि" और "स्टैक करने के लिए छवियाँ" द्वारा पीछा "ढेर" का चयन करें । सभी OME फ़ाइलों को एक एकल छवि स्टैक TIFF फ़ाइल में कनवर्ट करें ।
    4. शुरू Matlab सॉफ्टवेयर और क्लिक करें "खोलो", का चयन करें "LSPIV_parallel. m" कोड फ़ाइल । नोट: LS-PIV के लिए Matlab कोड https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 पर डाउनलोड किया जा सकता है
    5. निंनलिखित आदेशों का चयन करें: "Run" & #62; "फोल्डर बदलें" & #62; "धमनी" । १०.३में जेनरेट की गई छवि स्टैक TIFF फ़ाइल चुनें ।
    6. "Y" टाइप करें और enter दबाएँ ।
    7. छवि के बाईं और दाईं ओर एक कर्सर को क्रमशः रखें, और प्रोग्राम डेटा को संसाधित करने के लिए प्रारंभ होता है ।
    8. प्रोग्राम के अंत में, अंतिम पढ़ने की गणना करने के लिए 2 मान दर्ज करें: "pixel_meter रूपांतरण मान", और "स्कैन-टाइम रूपांतरण मान". दोनों को लाइन-स्कैन डेटा से संबंधित XML फ़ाइल में पाया जा सकता है । अंतिम मान मिलीमीटर प्रति सेकंड (mm/s) की इकाइयों में माध्य और वेग के मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है ।

    Representative Results

    विधि अलग जहाजों में vivo गतिशील रीढ़ की हड्डी में परिवर्तन पूर्व और बाद दर्दनाक विज्ञान में निगरानी करने में सक्षम है । सबसे पहले, एक कैथेटर बाह्य jugular नस के माध्यम से स्थापित करने के बाद फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्शन (चित्र 1a-सी, चित्रा 3) के लिए पहुंच प्रदान करते हैं । दूसरे चरण में, एक विशेष उपकरण उजागर C5-C7 (चित्रा 1 डी-एफ, चित्रा 2a-बी) को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस स्थिरीकरण कदम श्वास कलाकृतियों को खत्म करने और स्थिर इमेजिंग प्रदान कर सकते हैं । निंन laminectomy (चित्र 2c), अगला चरण C5-C7 (चित्र 2d-F) पर 2P इमेजिंग विंडो की स्थापना है । रीढ़ की हड्डी इमेजिंग खिड़की के आसपास खून बह रहा परिधीय ऊतक को कम करने सफल संवहनी इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है । निंनलिखित कदम है rhodamine-dextran फ्लोरोसेंट डाई (aforementioned कैथेटर के माध्यम से लाल) मील का पत्थर को सुई और आधारभूत के रूप में संवहनी नेटवर्क नक्शा (चित्र 3-बी, ) । मध्यम गंभीरता के साथ C7 midline contusive चोट के बाद, FITC-dextran (हरा) वांछित पद पर पेश किया है-चोट के समय अंक (चित्रा 3 ए & #38; डी). डुओ-रंग विधि की खूबसूरती है कि एक अभी भी संवहनी दूसरी डाई का उपयोग कर जब पहली डाई पहले से ही चोट के कारण पैरेन्काइमा में लीक कर दिया है संरचना का पता लगा सकते है (चित्रा 3 जी) ।

    इमेजिंग सत्र के दौरान, यह एक हीटिंग पैड पर पशुओं को संज्ञाहरण प्रेरण के बाद शरीर के मुख्य तापमान बनाए रखने के लिए रखना उचित है ।

    हमारे डुओ-रंग विधि का उपयोग करना, व्यास और लाल रक्त कोशिका वेग (व्यक्तिगत जहाजों के आरबीसी वेग) मापा और गणना की जा सकती है । व्यास के लिए, एक अंशांकन के बाद 3 दोहराता के लिए अपने सबसे बड़े व्यास पर पोत को मापने के लिए ImageJ का उपयोग कर सकते हैं (चित्रा 4). वेग के लिए, लाइन स्कैन छवियों आरबीसी वेग (चित्रा 5)18की गणना करने के लिए Matlab कार्यक्रम (Matlab R2013a) का उपयोग कर मापा जाता है. आकृति विज्ञान, रक्त प्रवाह वेग, और पोत व्यास के आधार पर, जहाजों 2 श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: धमनी और नस (1 तालिका देखें) ।

    Figure 1
    चित्र 1 . Jugular नस कैथीटेराइजेशन तथा रीढ़ स्थिरीकरण ।
    (क)
    बाहरी jugular नस का पता लगाने के लिए एक योजनाबद्ध ड्राइंग. (ख) विशेष कैथेटर एक 21 गेज सुई से बनाया है । टिप फ्लैट जमीन थी और 2 मिलीमीटर टिप के एक टुकड़े के साथ वेल्डेड एक और 21 से काट-गेज सुई । (ग) कैथीटेराइजेशन का एक योजनाबद्ध आरेख. बाहर अंत ligated पहले, समीपस्थ कैथेटर स्थिरीकरण द्वारा पीछा किया जाता है, पोत (पोत बंधाव, ब्लू ऐरोहेड) के साथ सुई बन्धन के साथ समाप्त । (घ) संशोधित रीढ़ स्थिरता की एक छवि । एक C5-C7 खिड़की से पहले laminectomy (ई) और बाद laminectomy और contusive विज्ञान (F) प्रदर्शित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2 . ऑप्टिक विंडो स्थापना कदम दर कदम के योजनाबद्ध आरेख ।
    (क)
    चरण 1: त्वचा और midline साथ मांसपेशी काटने के द्वारा ग्रीवा बेनकाब । (B) चरण 2: रीढ़ स्थिरीकरण । (C) चरण 3: laminectomy । (घ) चरण 4: खारा-भीगे gelfoam का एक टुकड़ा रखकर रीढ़ की हड्डी की नमी को बनाए रखें । (ङ) चरण 5: बाँझ gelfoam और vetbond के साथ अंतराल सील. सूखने के बाद आगर वाल की एक लेयर खिड़की के किनारे पर बनाई गई है । (F) चरण 6: जब इमेजिंग के लिए तैयार हो, तो gelfoam को निकालें और 2P इमेजिंग विंडो के अंदर विसर्जन द्रव लगाएं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3 . vivo डुओ-रंग विधि प्रक्रिया चरण-दर-चरण ।
    पूरी प्रक्रिया में 5 चरण (A)होते हैं । चरण 1 और चरण 2 के बाद, लगभग ७० केडीए के आकार के साथ dextran अनुरेखकों की एक जोड़ी (बी और सी) से पहले स्पाइनल कॉर्ड vasculature लेबल करने के लिए अनुक्रम में इंजेक्ट कर रहे हैं और उसके बाद contusive विज्ञान (D). (E)-(G) प्रतिनिधि 2P छवियां चरण 5 के माध्यम से चरण 3 पर स्पाइनल कॉर्ड vasculature प्रदर्शित करते हैं । सफेद तीर पहली लहर लाल डाई लीक क्षेत्रों (एफ और जी), फ़िरोज़ा ऐरोहेड प्रदर्शन दूसरी लहर हरी डाई रिसाव (जी)को इंगित करते हैं । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 4
    चित्र 4 . अधिग्रहण और रीढ़ की हड्डी पोत व्यास के ठहराव ।
    तैयारी के बाद, एकल छवि फ़ाइलें 2P माइक्रोस्कोपी के तहत प्राप्त कर रहे हैं, नपेed मूल्यों की एक्सएमएल फाइलों के साथ (ख). (क) समीकरण "माइक्रोन प्रति पिक्सेल" ऑप्टिकल ज़ूम मूल्यों के आधार पर गणना प्रदर्शित करता है । ImageJ में अंशांकन के बाद (C), पोत व्यास अनुदैर्ध्य अक्ष भर में 3 बिंदुओं पर (D1) से पहले मापा जाता है और (ई1) चोट के बाद । (D2) और (E2) मापा मानों को प्रदर्शित करें । (च) बेसलाइन पर पोत व्यास का ठहराव और ३० मिनट पश्चात चोट. स्केल पट्टी = ५० µm. Data को मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया गया है, * * * p & #60; ०.०००१, दो पूंछ वाला मीन्स टी टेस् ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्र 5 . अधिग्रहण और रीढ़ की हड्डी पोत वेग के ठहराव ।
    लाइन स्कैन छवि फ़ाइलें 2P माइक्रोस्कोपी के तहत प्राप्त कर रहे है एकल पोत वेग की गणना । (क) एक चयनित पोत और विधि का एक उदाहरण के लिए रक्त वाहिका आरबीसी वेग का आकलन । (ख) रेखा के एक धमनी उदाहरण छवि स्कैन और वेग की गणना के लिए इसी भूखंड फ़ाइल, साथ ही साथ एक नस का एक उदाहरण (ग)कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    धमनी नस
    विज्ञान सीधी, चिकनी, मोटी पोत दीवार शाखाओं, किसी न किसी किनारों
    रक्त प्रवाह वेग तेज धीमा लेकिन बदलता रहता है
    व्यास 30-80 µm 100-250 µm

    तालिका 1: पोत प्रकारों की पहचान के लिए मानदंड

    Discussion

    संवहनी अध्ययन के लिए एक चुनौती विज्ञान के बाद तकनीकी सीमा है क्योंकि पारंपरिक तकनीक काफी हद तक गुजाइश नमूनों में संवहनी संरचना परिवर्तन करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं । ऊपर वर्णित vivo इमेजिंग विधि में यह उपन्यास रक्त प्रवाह और संबंधित मापदंडों (वेग और पोत व्यास) के लाइव चूहों में 2P-LSM का उपयोग करते हुए गतिशील मापन करता है. यह भी contusive विज्ञान के बाद अलग समय अंक पर जहाजों के एक ही सेट में दोहराया परीक्षा की अनुमति देता है । पिछले 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग तकनीक के बाद एक एकल अनुरेखक के रिसाव के कारण आघात संवहनी संरचनाओं पर कब्जा करने में असमर्थ थे. हमारी जोड़ी रंग डिजाइन दर्दनाक मॉडल के लिए गतिशील संवहनी इमेजिंग सक्षम बनाता है । इसके अलावा, इस विधि का लचीलापन एक के लिए एक लौकिक-तीव्र संवहनी परिवर्तन विज्ञान के बाद स्थानिक प्रोफ़ाइल उत्पंन अवसर प्रदान करता है ।

    वहां हमारे में कई महत्वपूर्ण कदम है vivo डुओ-रंग इमेजिंग विधि में । सबसे पहले, यह रीढ़ की हड्डी के शारीरिक स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए समय से पहले चूक इमेजिंग, विशेष रूप से श्वास गति विरूपण साक्ष्य को कम करने के लिए मौलिक है । हम स्पाइनल ग्रीवा की ऊंचाई स्थिरीकरण के दौरान थोड़ा बढ़ाने के लिए रीढ़ की हड्डी clamps के आकार डिजाइन किए हैं । इस प्रकार रीढ़ की हड्डी में सांस लेने वाले जानवर को correlating की आवाजाही बहुत कम किया जा सकता है (आंकड़ा 1 डी-एफ, b) । यह रीढ़ की हड्डी की स्थिरता की जांच करने के लिए प्रत्येक इमेजिंग सत्र की शुरुआत से पहले की सिफारिश की है । यदि रीढ़ की हड्डी में स्थिरता प्राप्त करने में विफल रहता है, समायोजन संरेखण और रीढ़ की हड्डी clamps की जकड़न के लिए किया जाना चाहिए । दूसरा, परिधीय ऊतक (हड्डी, मांसपेशी परत, और त्वचा) इमेजिंग विंडो में खून बह रहा जोखिम को देखने के संक्रमण सकता है । एक चिकनी इमेजिंग सत्र के लिए, gelfoam और ऊतक चिपकने वाला गोंद प्रभावी रोकथाम के लिए आसपास के ऊतकों के लिए लागू किया जाना चाहिए । तीसरा, फ्लोरोसेंट रंजक हम चुन एल्ब्युमिन (६६ केडीए), जो मुख्य उच्च आणविक वजन रक्त प्लाज्मा प्रोटीन है के रूप में एक समान आकार है । समस्थिति शर्तों के तहत, रंजक काफी हद तक एल्ब्युमिन28के रूप में समान पोत के अंदर रखा गया था । चोट के बाद, रंजक बाधित endothelial संरचना के माध्यम से पारित कर दिया और पैरेन्काइमा में लीक, vasculature के परिधीय क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई फ्लोरोसेंट तीव्रता के कारण (चित्रा 3F-जी). इसके अलावा, वहां दो कारणों क्यों हम बाहरी jugular नस कैथीटेराइजेशन का चयन कर रहे हैं । सबसे पहले, यह प्रयोग के किसी भी समय प्रसव के एक लगातार सुलभ मार्ग प्रदान कर सकते हैं । दूसरा, यह भविष्य उपचार इंजेक्शन के लिए एक मार्ग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

    हालांकि हमारे vivo में डुओ-रंग विधि दर्दनाक संवहनी इमेजिंग अध्ययन के लिए एक उपंयास स्थल प्रदान करने में सक्षम है, कुछ इस तकनीक के बारे में निरंतर संबोधित किया जाना चाहिए । वर्तमान में, इस तकनीक को 2 समय अंक (आधार रेखा और 1 के बाद चोट समय बिंदु) में संवहनी परिवर्तन का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन यह कई समय अंक के लिए स्विच करने के लिए संभव है अगर अतिरिक्त फ्लोरोसेंट रंजक और चैनल उपलब्ध हैं । हालांकि कई पुराने intravital इमेजिंग के लिए प्रत्यारोपित कांच खिड़की का उपयोग कर अध्ययन कर रहे हैं, उनमें से कोई भी दर्दनाक चोट के बाद एक ही पोत पर आधारभूत जानकारी प्रदान कर सकते हैं19,29,30, 31,३२. इन अध्ययनों के विपरीत, हमारी खिड़की एक नहीं शीशे की खिड़की है । यह पूर्व के लिए सुविधाजनक है और बाद चोट इमेजिंग, लेकिन यह फिर से लंबी अवधि के अवलोकन के लिए खिड़की की स्थापना के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । हमारे भविष्य के अनुसंधान क्रोनिक इमेजिंग के लिए तकनीकी सुधार पर काम कर रहा है । संवहनी प्रणाली कई पोत प्रकार (धमनी, नस, और केशिका) से बना है और प्रत्येक आकृति विज्ञान और समारोह के पहलुओं में अलग है । इमेजिंग के दौरान पोत प्रकार के बीच भेदभाव के लिए बाहर संवहनी परिवर्तन का एक स्पष्ट पैटर्न चिढ़ा मदद कर सकता है । ऊपर प्रोटोकॉल आकृति विज्ञान और वेग के आधार पर जहाजों की पहचान पर्यवेक्षक पर निर्भर करता है; हालांकि, एक धमनी विशेष डाई आसानी से पोत प्रकार३३के बीच एक अधिक निश्चित वर्गीकरण देने के लिए जोड़ा जा सकता है ।

    इस तकनीक केवल contusive और अंय दर्दनाक मॉडल पर आकलन करने के लिए सीमित नहीं है, ऐसे क्रश चोट और विकिरण चोट के रूप में, लेकिन यह भी BSCB के विघटन पर ध्यान केंद्रित अध्ययन पर, साथ ही संवहनी पारगम्यता परिवर्तन. विज्ञान के अलावा, यह इस तरह के पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस) और एकाधिक स्केलेरोसिस (एमएस) के रूप में अंय neurodegenerative रोगों के बाद संवहनी परिवर्तन का अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, यह एक ट्रांसजेनिक पशु मॉडल को transferrable के लिए गतिशील neurovascular बातचीत का अध्ययन किया जा सकता है । एक शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में, भविष्य के अध्ययन इमेजिंग तकनीक यहां वर्णित रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए उपयोग कर सकते हैं ।

    अंत में, vivo में डुओ-रंग विधि एक विश्वसनीय, वास्तविक समय, गतिशील संवहनी परिवर्तन का आकलन है, जो लौकिक-स्थानिक संवहनी प्रोफ़ाइल और उपचार के लिए स्क्रीनिंग के लक्षण वर्णन के लिए आदर्श है के लिए vivo दृष्टिकोण उपकरण में है विज्ञान के बाद माध्यमिक नुकसान कम करें ।

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    यह काम NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, योग्यता समीक्षा पुरस्कार I01 BX002356 के दिग्गजों मामलों के अमेरिकी विभाग, क्रेग एच नेलसन फाउंडेशन २९६७४९, इंडियाना रीढ़ की हड्डी और ब्रेन इंजरी रिसर्च फाउंडेशन से भाग में समर्थित किया गया था ( इंडियाना राज्य स्वास्थ्य विभाग के ISCBIRF) (०१९९१९), और मारी Hulman जॉर्ज बंदोबस्ती कोष ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132 Skin sterilization
    Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Patterson Veterinary  07-881-9413, 07-890-5745 Anesthetic agent
    Buprenorphine(0.03 mg/mL)  Patterson Veterinary  07-891-9756 Pain relief agent
    Carprofen Patterson Veterinary 07-844-7425 Non-steroidal anti-inflammatory drug
    Dukal Gauze Sponges  Fisher Scientific 22-415-490 Skin sterilization
    Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450 Skin sterilization
    Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261  Prevent drying eyes 
    Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific  1006015
    Rhodamine B isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich R9379 Average mol wt 70kDa
    Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich 46945 Average mol wt 70kDa
    Instrument Sterilizer Fine Science Tools 18000-50 for sterilizing surgery tool
    Spine stabilizer set Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Vetbond 3M Animal Care Products 1469SB Tissue adhesive Glue
    Gelfoam Henry Schein 9083300 Stop bleeding
    Noyes Spring Scissors F.S.T 15013-12
    Fine Forceps- Dumont #5 F.S.T 11254-20
    Rongeur Fine Science Tools 16021-14 laminectomy
    Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
    Scalpel Fine Science Tools 10003-12  skin cut
    Scalpel Blade #15 Royal-Tek BS2982 skin cut
    micro angled scissors World Precision Instruments 500260 Can be from any vendor
    3-0 vicryl sutures Ethicon J393H Can be from any vendor
    Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" LOOK 786 Can be from any vendor
    1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200.V0 Can be from any vendor
    21 gauge needle BD 305165 Can be from any vendor
    Agar Sigma-Aldrich A1296 Can be from any vendor
    Two-photon Laser Scanning Microscope Bruker Fluorescence Microscopy
    LISA device Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
    HCImage Live Hamamatsu Corporation Imaging software
    PrairieView Prairie Technologies/Bruker Two-photon imaging software
    ImageJ Image analysis software
    Matlab statistics toolbox The MathWorks, Inc. https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle Image analysis software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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