Стандартный метод стерилизации высок объём Arabidopsis семян

* These authors contributed equally
Biology
 

Summary

Целью данного исследования было определить последствия отбеливателя и хлора газовой стерилизации на прорастание семян генотипов диапазон Arabidopsis, выращенных на стерильную СМИ. Оптимизированный стерилизации протоколы были разработаны для предотвращения роста микробных загрязнителей обеспечивая выживание удовлетворительного семян.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lindsey III, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. J. Vis. Exp. (128), e56587, doi:10.3791/56587 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Резуховидка Таля Саженцы (арабидопсиса) часто нужно выращивать на стерильную СМИ. Это требует предварительного семян стерилизации для предотвращения роста микробиологических загрязнений на поверхности семян. В настоящее время Arabidopsis семена стерилизуются, с использованием двух различных стерилизации методов в условиях, которые отличаются между лабораториями и не были стандартизированы, часто приводит только частично эффективной стерилизации или чрезмерного семян смертности. Большинство из этих методов, также не легко масштабируемая большое количество линий семян различных генотипов. Технологии для высокой пропускной способности анализа Arabidopsis продолжают размножаться, стандартизированные методы стерилизации большого количества семян различных генотипов становятся существенно важное значение для проведения этих видов экспериментов. Ответ количество линий Arabidopsis на двух разных стерилизации методов оценивалась, основанные на всхожесть семян и уровня загрязнения семян с микробы и другие патогены. Лечение включает разные концентрации стерилизации агентов и время воздействия, объединены, чтобы определить оптимальные условия для выращивания арабидопсиса семян стерилизации. Оптимизированный протоколы были разработаны для двух разных стерилизации методы: bleach (жидкой фазы) и хлора (Cl2) газ (пара фаза), оба приводит к высокой семенной всхожесть цены и минимальный микробной контаминации. Полезность этих протоколов была проиллюстрирована тестирование дикого типа и мутантов семена с диапазоном всхожесть потенциалов. Наши результаты показывают, что семена можно эффективно стерилизовать с помощью либо метода без чрезмерного семян смертности, несмотря на пагубные последствия стерилизации были замечены на семена с ниже, чем потенциал для оптимального прорастания. Кроме того была разработана уравнение для включения исследователей применить условия стерилизации газом стандартизированных хлора в герметичные контейнеры различных размеров. Протоколы, описанные здесь позволяют простой, эффективной и недорогой семян стерилизации для большого числа линий арабидопсиса.

Introduction

Резуховидка Таля (Арабидопсиса) является основной модельный организм для фундаментальных и прикладных исследований в завод биологии1,2,3. Хотя стандартные условия для выращивания арабидопсиса роста были хорошо установленных4, эффект стерилизации семян на жизнеспособности семян не были протестированы тщательно. Твердые СМИ в пластин или коробки обычно используется для облегчения роста Arabidopsis саженцев для многих экспериментальных приложений, таких как идентификация гомозиготных смертоносных мутантов в разделению населения, наблюдения за стрелять и корень фенотипы в начале этапы, изоляции патогеном бесплатно ткани, сбор большого количества Рассада ткани, выбор трансформантов или лекарственно-растений и оценки всхожести1,2,3,4 . Семена собирают из растений, выращенных в парник или рост палата иногда заражены с микроорганизмами и пыли. Рост Arabidopsis саженцев на различных типах стерильных СМИ требует предварительного семян стерилизации для удаления микробного загрязнения, такие как грибки и бактерии, присутствующие на поверхности семян. Использование режима стерилизации эффективной семян имеет решающее значение для баланса высокой всхожести, минимальное загрязнение и роста энергичные растений.

Два наиболее распространенных методов, используемых для стерилизации семян Arabidopsis основаны на коммерческие дезинфицирующие средства (жидкой фазы) и хлора (пара фаза). Различные процедуры использовались для обоих жидкой фазы стерилизации1,4,5,6,,78,9 , 10 и паровой фазы стерилизации Arabidopsis семена8,10,11,12,13,14,15 ,16. Однако хотя эти процедуры были эффективным в выполнении стерилизации семян используемых генотипов, подробный анализ влияния различных стерилизации лечения на семена различных генотипов не сообщалось. Таким образом для определения условий, в которых эффективной стерилизации сочетается с высоким всхожесть требуется оптимизация этих процедур стерилизации.

Арабидопсис биологических центр ресурсов (ABRC) имеет уникальную) проверить жизнеспособность семян целого ряда различных генотипов в коллекции и b) воспользуйтесь процедур контроля качества, применения внутри страны и в ответ на отзывы пользователей о прорастания семян. Эксперименты, представленные здесь заключаются для определения влияния различных методов стерилизации на прорастание семян диапазон Arabidopsis генотипов. Оптимизированный стерилизацию, которые приводят к высокой семенной всхожесть ставок при сохранении минимальный возбудителя загрязнения представлены для отбеливателя и хлора газовой стерилизации.

Protocol

1. Подготовка 1 x фотосинтетическую и Скуг (МС) средний

  1. g добавить 4,31 MS базальной смесь соли, 10 г сахарозы и 0,5 г 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic кислоты (MES) в стакан, содержащие 0,8 Л дистиллированной воды и перемешайте, чтобы растворить. Проверка и регулировка рН до 5,7, используя 1 M гидроксид калия (KOH). Добавьте дистиллированной воды, чтобы сделать 1 л
  2. Делят СМИ на две бутылки 1 Л, 500 мл. Добавьте 5 g агар в каждой бутылке. Держите крышку сыпучих.
  3. Автоклав для 20 минут при температуре 121 ° C, 15 psi с магнитной перемешать бар в бутылке.
  4. После автоклавирования, поместите бутылки на плите переполох на низкой скорости и позволить MS среднего остыть до 45-50 ° C (до тех пор, пока бутылки могут быть проведены с голыми руками).
  5. Начиная с этого шага, выполните все шаги в стерильных условиях в Ламинарный шкаф. Добавьте 500 мкл Gamborg ' s витамин решение каждой бутылки и перемешать MS среднего равномерно распределить раствор витамина.
  6. Налить достаточно СМИ в плиты для покрытия примерно половины глубины пластину.
  7. Позволяют пластины остыть при комнатной температуре около 1 h разрешить агар затвердеть.
    Примечание: Если плиты не должны использоваться сразу же, оберните их в пластик и хранить при 4 ° C (температура холодильник). Покрыты пластины, коробки или трубы с затвердевшей агар могут храниться в течение нескольких недель при температуре 4 ° C в герметичном контейнере.

2. Стерилизация Arabidopsis семян с хлоркой

  1. подготовить MS пластины в соответствии со статьей 1 протокола. Автоклав 100 мл дистиллированной воды, в то же время как MS Media. Использовать это позже как промывочной воды и помочь приостановить семена для помощи в обшивке.
    Примечание: При желании, 0,8% агар смесь (w/v) (например, phytagar) также может быть газобетона в этом шаге. Агар смесь может быть заменен на дистиллированной воды во время покрытия (шаг 2.5.3.). Дополнительных вязкости смеси агар облегчает пространство семена на пластины или завод в строках при необходимости.
  2. Подготовка 50% (v/v) отбеливателем решения, которые будут использоваться для стерилизации семян. Для разбавленных отбеливатель, добавьте 100 мл отбеливателя 100 мл дистиллированной воды. 50 мкл анимации 20 моющего средства в раствор отбеливателя.
    Примечание: Подготовленные отбеливатель решение может храниться до месяца, пока он открыт только в стерильных условиях.
  3. Аликвота 100 семян в 1,5 мл трубку microcentrifuge.
  4. Стерилизовать семена, используя раствор отбеливателя 50%.
    1. В Ламинарный шкаф, добавить 500 мкл раствора 50% отбеливатель пробки microcentrifuge, содержащих семена. Нажмите в нижней части трубки приостановить семена в растворе отбеливателя.
      Примечание: в качестве альтернативы, ротатор или платформы шейкер может использоваться держать семена приостановлено.
  5. Смыть раствор отбеливателя из трубки.
    1. После 10 минут, удалить раствор отбеливателя из с помощью пипетки или Аспиратор с кончика пипетки на конце трубки microcentrifuge.
    2. Добавить 500 мкл стерильной дистиллированной воды в трубе. Закройте трубку и инвертировать смешивать. Разрешить семена поселиться в нижней части трубки. После того как семена поселились в нижней части трубки тщательно удалите раствор отбеливателя, закупорить. Повторите эту процедуру промывки процесс 6 раз.
    3. Добавить 1 мл газобетона дистиллированной воды в трубе приостановить семена.
  6. Пластины стерилизованные семена на пластины MS.
    1. В Ламинарный шкаф, метки в нижней части пластины MS с названием запасов и текущую дату.
    2. Залить семена из пробки microcentrifuge на пластину для MS. Распространение семян вокруг пластину MS, стерильный, однократного использования пересевать цикла или кончик стерильной пипеткой.
      Примечание: Если Семена посеяны в строках, пипетки с наконечником 200 мкл может использоваться для индивидуально поместите семена в желаемой позиции. Чтобы улучшить поток семян, в конце кончика пипетки могут быть урезаны на 3-5 мм с помощью ножниц. Любые неуместные семена или кластеры семян затем может быть перемещено или разделены с использованием стерильных одноразовых пересевать цикла.
    3. Место пластину MS на задней части из Ламинарный шкаф с наполовину закрытой крышкой. Избыток воды испаряются из пластины MS.
    4. Место крышку на пластины MS. Печать, пластину MS, завернув пластины с микропористая Хирургическое ленты (см. Таблицу материалы).

3. Стерилизация Arabidopsis семян с хлора

  1. подготовить MS пластины в соответствии со статьей 1 протокола. Автоклав 100 мл дистиллированной воды, в то же время как MS СМИ; Это будет использоваться позднее для помочь приостановить семена для помощи в обшивке.
    Примечание: При желании, 0,8% агар смесь (w/v) (например, phytagar) также может быть газобетона в этом шаге. Агар смесь может быть заменен на дистиллированной воды во время покрытия (шаг 3.6.2.). Дополнительных вязкости смеси агар облегчает пространство семена на пластины или завод в строках при необходимости.
  2. Перед началом стерилизации, расчета сумм отбеливатель и соляной кислоты (HCl), необходимых для производства газообразного хлора.
    1. Рассчитать количество HCl, необходимых для производства 6,1% Cl 2, необходимых для стерилизации.
    2. Используйте следующую формулу:
      Equation 1
      с 7000 мл как объем контейнера стерилизации и 6.1% Cl 2; объем HCl рассчитывается как 3 мл.
      Примечание: Запрограммированы для выполнения вычислений для различных объемов контейнерных и % Cl 2 таблицы приводится Справочная таблица 1.
  3. Аликвота 100 семян в пробки microcentrifuge 0,5 мл. Закройте крышки для каждого флакона, флаконов в пластиковые стойки и отложите.
    Примечание: Семена могут храниться в течение длительного времени в этот момент, до тех пор, как они хранятся в надлежащих условиях. Условия хранения можно найти в разделе 3.3.2 протокола 4 Риверо и коллег. также может использоваться формат пластины 96-луночных.
  4. Подготовить материалы, необходимые для выполнения стерилизации газ хлор.
    1. Получить от мест их хранения отбеливатель и HCl.
    2. Вырезать полосы больших парафина фильм (см. Таблицу материалов) для использования на шаге 3.5.3. печать контейнер стерилизации.
    3. Место пластиковый контейнер с крышкой, в котором стерилизация будет проходить внутри зонта. Откройте шапки на все флаконы семена и поместите всю семенную стойки внутри пластикового контейнера.
  5. Выполняют хлора газовой стерилизации при комнатной температуре.
    Предупреждение: Работа с отбеливателем и кислоты отдельно. Не оставляйте либо бутылка контаминированных для снижения риска разливов. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) включая перчатки и халате. Если отбеливатель или кислоты брызгает на перчатки, измените перчатки до обработки других материалов. Всегда удалите перчатки в зонта в случае загрязнения отбеливатель или кислоты.
    1. Место 250 мл стакан внутри контейнера и добавить 100 мл отбеливателя.
      Примечание: Реакции между HCl и отбеливатель требует по крайней мере 22 томов избыток отбеливателя. Реакция будет потреблять HCl и отбеливателя, выпустив Cl 2 газ с хлорид натрия (NaCl) и воды как побочные продукты. Использование большой избыток bleach позволяет потребление дополнительных HCl dУринг вентиляционного периода, который уменьшает количество бикарбоната натрия (NaHCO 3) необходимо нейтрализовать решение для утилизации.
      Предупреждение: Стакан должно быть по крайней мере дважды объем жидкий отбеливатель + HCl. Это предотвращает экранирование стакан во время следующего шага, брызги, которые могут повредить семена, отбеливатель одежду или записать открытые участки кожи.
    2. Добавить 3 мл HCl в стакан, содержащие отбеливатель.
      Предупреждение: Первоначальная реакция будет производить пузыри, особенно при концентрации газа, чем 6,1%. Длинными рукавами лаборатории пальто необходимых для этого шага.
    3. Закройте контейнер стерилизации и запечатать его с парафином фильм немедленно.
    4. Контролировать контейнер стерилизации во время стерилизации для обеспечения накопления газов; накопление газа хлора должны быть видны как слабый Желтая дымка внутри контейнера.
      Внимание: Периодически проверяйте стерилизацию контейнера для обеспечения что давление внутри не сбросил крышку или парафиновые фильм. Если крышка стала необратимой или парафин фильм соскользнул, закройте крышку и тщательно заверните контейнер с дополнительным слоем парафина фильма.
    5. После 1 h стерилизации период, откройте контейнер, удаления парафина фильм и открыв крышку на одном углу. Разрешить контейнеру излить за 3 ч до завершения реакции и устранения хлор газ.
    6. Закройте крышки все microcentrifuge трубы в стойку семян.
      Примечание: Стерилизованные семена могут храниться до времени покрытие до тех пор, как они хранятся в сухом состоянии.
    7. Удаления семян стойку и поместить его в Ламинарный шкаф.
    8. Нейтрализации хлора газа реакция
      1. Добавить 1,5 g порошка 3 NaHCO медленно в стакан, содержащие отбеливатель/HCl решение и перемешать с стеклянный стержень распустить NaHCO 3 в раствор. Продолжить добавление NaHCO 3, до тех пор, пока пузырьки газа двуокиси углерода (CO 2) перестали образуя.
        Предупреждение: Добавьте медленно предотвратить брызги. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и лаборатории пальто.
      2. Тест рН раствора с помощью РН полоски или pH метр. Добавить дополнительные NaHCO 3 при необходимости до pH раствора нейтральной (рН 7,0). На этом этапе решение могут быть удалены из зонта и утилизировать согласно все применимые удаления руководящие принципы.
        Предупреждение: Если какой-либо запах заметил во время удаления, то решение должно немедленно возвращено зонта.
  6. Пластины стерилизованные семена на пластины MS.
    1. В Ламинарный шкаф, метки в нижней части пластины MS с названием запасов и текущую дату.
    2. Добавить 500 мкл стерилизованные дистиллированной воды для каждой пробки microcentrifuge приостановить семена. Залейте семена на пластину MS и распространять семена равномерно вокруг пластину с помощью стерильный, однократного использования пересевать цикла или кончик стерильной пипеткой.
    3. Место пластину MS на задней части из Ламинарный шкаф с наполовину закрытой крышкой. Избыток воды испаряются из пластины MS.
    4. Место крышку на пластины MS. Печать пластину MS, завернув пластины с микропористые бумаги хирургическая лента.

4. Рост Arabidopsis на пластины MS

  1. место пластины с крышкой на вершине за три дня на 4 ° c и относительной влажности.
    Примечание: Этот процесс называется стратификации и служит для синхронизации всхожесть семян индивидуальных.
  2. Передачи пластины роста среду.
    1. Поддержания температуры при 23 ° C и интенсивности света на 120-150 мкмоль/м 2 с светом 16 h / 8 h темные фотопериода. Поместите пластины плоские в среду расти с крышкой на верхней так корни растут в среду.
  3. Рассаду на тарелках расти на 8 дней пусть.
    Примечание: 8 дней вегетационного периода позволяет поздно прорастания семян к прорастанию. Пластины может быть забит раньше, чем через 8 дней, если все семена проросшие.
  4. Оценка ставок всхожесть.
    1. Запись количество семян, проросшие и что не прорастали. Рассчитать путем деления числа семян, которые проросшие всхожесть на общее количество семян на пластину.
      Примечание: Прорастание подсчитывается, когда корешок прогнозирует вне seed Пальто и видны две семядоли.
    2. Также рассчитывать количество семян, пострадавших от плесени для определения эффективности условий стерилизации.

Representative Results

Арабидопсис семена, собранных из открытых поле, Теплице или рост палата иногда заражены различные микроорганизмы, как грибов и бактерий в1,4. Таким образом прорастания семян на стерильную СМИ может быть особенно сложным из-за загрязнения плит, особенно когда снабжения семенами ограничен. Оптимизированный протокол для отбеливателя и хлора газовой стерилизации, результаты которого представлены ниже, свести к минимуму эту проблему и сохраняет жизнеспособность семян, необходимых для высокопроизводительных приложений.

Эффекты отбеливатель стерилизации на прорастание семян Arabidopsis Col-0

Bleach является наиболее часто используемым агент для стерилизации семян в многочисленных видов растений. Оптимальная концентрация стерилизации агента и время экспозиции варьируется от видов. Ряд протоколов были заняты с помощью отбеливателя для стерилизации Arabidopsis семена1,4,5,6,,78,9 , 10. четыре различных концентраций отбеливатель с пяти различных выдержка, периоды были проверены, и результаты представлены в Рисунок 1. Процедуры были применены в Колумбии одичал тип (Col-0) семена. Эффект концентрация отбеливателя на прорастание семян Col-0 варьируется в зависимости от времени стерилизации как свидетельствует значительное взаимодействие между отбеливатель концентрации и времени стерилизации (рис. 1, P < 0,001, ANOVA-дисперсионный анализ).

В экспериментах с стерилизации раз между 5 и 10 мин лечения с всех отбеливателя концентрацией привели к столь же высокую всхожесть семян Col-0 (рис. 1). Также высокую всхожесть темпы наблюдались для бытовой отбеливатель концентрации 40% и 50% для всех раз стерилизации. Лечение с 80% и 100% отбеливатель для периодов длиннее 10 минут привел к значительному уменьшение всхожесть, по сравнению с короче замачивания раз (P < 0,01, ANOVA). Кроме того, для 80% и 100% отбеливание лечение 20 мин, прорастание был значительно сократилось по сравнению с соответствующей 40% и 50% отбеливание лечение (P < 0,001, ANOVA).

Семена отображаются различные уровни отбеливания и съежившегося при использовании высокой отбеливатель концентрации за 15 минут или дольше. В дополнение к относительно высоким (до 32%) семян смертности, проросшие семена, стерилизовать в этих условиях, часто показали рост дефектов, отражение в провал семядоли и гипокотиля разворачиваться и удлиненное, что приводит к развития ареста. Большинство методов лечения (14 из 20) были полностью плесень бесплатно, что приводит к общей плесень уровне среднем 0,21% ± 0,003 (Таблица 1).

Лечения с 50% отбеливателя и выдержки времени 10 мин был выбран как лучший режим стерилизации потому, что он в сочетании с хорошим торможение роста поверхности патогена высокой всхожести. Эта процедура была выбрана для тестирования эффект стерилизации отбеливателя на различных мутантных линий, как описано ниже.

Эффекты хлора газовой стерилизации на прорастание семян Col-0

Для оптимизации условий стерилизации газ хлор, три различные концентрации хлора были использованы для стерилизации Col-0 семена для двух периодов времени (Таблица 2). Концентрация газа было рассчитано на объем концентрированной HCl и объем контейнера стерилизации, используя следующее уравнение:

Equation 2

Эта формула была получена с помощью закона идеального газа предполагая 12,3 М HCl, температуре 23 ° C и нормальном атмосферном давлении 101,3 кПа.

Было показано, что эффект концентрации газа хлора на прорастание семян Col-0 зависит от времени стерилизации как указано существенного взаимодействия между временем и концентрации факторов (рис. 2A, P < 0,01, ANOVA) . Концентрация газа хлора не оказало существенного влияния на прорастание семян Col-0, подвергаются стерилизации 1 ч. С этого времени стерилизации, все концентрации хлора аналогичным образом способствует высокий уровень прорастания, выше 85% (P > 0,05, ANOVA). С другой стороны, 3 h Лонг стерилизации привело к значительным снижением всхожесть наибольшей концентрации хлора, по сравнению с двумя более низких концентраций газа (P < 0,05, ANOVA). Эти результаты показывают, что лечение Arabidopsis семян с какой-либо из проверенных хлора концентрации газа за 1 ч или концентрации газа ниже 16,5% за 3 ч, одинаково эффективны в деле сохранения жизнеспособности семян, поскольку прорастание ставки всегда были более более 82%. Однако стерилизации семян для 3 h с 16,5% газа пагубно для прорастания семян.

Количество плесени был также зависит от концентрации газа и времени экспозиции. Рост плесени был эффективно препятствует с относительно высокой концентрации 6,1% и 16,5% хлора для 1 h длительного лечения и все концентрации газа для 3 h (Рисунок 2Б).

На основе этих результатов, лечение с концентрацией газа 6,1% за 1 ч (Таблица 2) была выбрана в качестве лучших паровой фазы стерилизации условие для проверки эффекта газовой стерилизации на различных мутантных линий, так как он в сочетании высокой всхожести ставка ( 85%) с очень низким уровнем загрязнения плесень (0,02%).

Эффекты отбеливателя и хлора газовой стерилизации на семена с различными всхожесть потенциальных

Статистический анализ показал, что ответ всхожесть методов стерилизации зависит от прорастания потенциал линии (рис. 3A, P < 0,01, ANOVA). Отбеливатель ни хлора газовой стерилизации уменьшена всхожесть семян с высокой всхожести потенциальных (группы 4 и 5). Ни лечения оказали воздействие на уже низкий всхожесть группы с низким всхожестьпотенциал (Группа 1). В отличие от хлора газовой стерилизации привело к значительному сокращению примерно 12-18% (P < 0,01, ANOVA) в всхожесть семян с промежуточным всхожесть потенциалом (группы 2 и 3). Отбеливатель стерилизации также снизилась всхожесть на 13% группы 2, но он не уменьшить всхожесть 3 группы. Хотя без существенных различий в всхожесть отбеливателя и хлор газ лечения в любой группе прорастания (рис. 3A, P > 0.442, ANOVA), семена, стерилизации с помощью отбеливателя имели несколько выше всхожесть, чем газ стерилизации семян во всех группах прорастания.

Стерилизации лечения значительно изменила (P < 0,001, ANOVA) процентов семян, пострадавших от плесени (рис. 3B). Обе хлор газ и отбеливатель стерилизации привело к менее плесени (P < 0,05, ANOVA) по сравнению с не стерилизации. Нет никакой разницы в уровне плесень, обнаружен между газом и отбеливатель стерилизации в любой группе (рис. 3Б, P > 0,4, ANOVA).

Figure 1
Рисунок 1: эффекты отбеливателя концентрацией и стерилизации времени на прорастание семян Arabidopsis Col-0. Значения являются средства ± SD, полученные из 5 независимых репликаций эксперимента. * Указывает на существенные различия по сравнению с 5 мин, замачивания продолжительность для диапазона концентраций отбеливатель (P < 0,01, ANOVA). #показывает значительные различия по 80% и 100% отбеливатель концентрации по сравнению с 40% и 50% на 20 мин период времени (P < 0,01, ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: эффекты хлора газа время концентрации и стерилизации на семена Arabidopsis Col-0. (A) всхожесть и (B) плесень уровне. Планки погрешностей представляют собой средства ± SD, полученные от 5 биологических и 5 технических репликаций эксперимента. Средства, которые не разделяют письмо значительно отличаются (P < 0,05, ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: эффекты отбеливателя и хлора газовой стерилизации на семена с различными всхожесть потенциальные. (A) всхожесть и (B) плесень уровне. 100 линий Солка T-ДНК были разделены на пять групп в соответствии их всхожесть потенциал определяется как всхожесть в отсутствие любого агента стерилизации. Группы, основанные на всхожесть были следующим образом: Группа 1 (0-20%), Группа 2 (21-50%), Группа 3 (51-70%), Группа 4 (71-90%) и Группа 5 (91-100%). Линии были выбраны случайным образом и их всхожесть потенциал не зависит от генотипа. Значения являются средства ± SD, полученные от трех независимых репликаций эксперимента. Буквы («a», «ab», «c» и т.д.) выше каждое значение указывают статистические группировки категории средств. Средства, которые не разделяют письмо значительно отличаются (P < 0,05, ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Время стерилизации (мин) Концентрация отбеливателя (%)
40 50 80 100
5 0.00% 0.00% 0.00% 2.13%
8 0.00% 0.00% 0.00% 0.00%
10 0.00% 0,50% 0.00% 0,36%
15 0.00% 0.00% 0.00% 0,68%
20 0,19% 0,28% 0.00% 0.00%

Таблица 1: Плесень уровне Блич стерилизации семян Col-0.

Блич HCl Время % Хлора (мол Cl2/mol всего газа)
(мл) (мл) (h)
25 1 1 2.1
25 1 3 2.1
100 3 1 6.1
100 3 3 6.1
200 9 1 16,5
200 9 3 16,5

Таблица 2: Хлора (Cl2) газовой стерилизации лечения на Columbia одичал тип семян с помощью контейнера 7 Л.

Справочная таблица 1: Запрограммированы для выполнения вычислений для различных объемов контейнерных и % Cl2таблицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Когда выращивания арабидопсиса семена на стерильную СМИ, должны применяться некоторые формы стерилизации. Bleach и хлора газовой стерилизации лечения привести аналогичные всхожесть темпы и формы торможение роста. Ни один из методов стерилизации вызывает значительное снижение в всхожесть семян с высокой всхожести потенциал; Однако отбеливатель стерилизации рекомендуется для линий с более низким потенциалом прорастания (20-70%), из-за малого, хотя и незначительное, улучшение всхожесть по сравнению с газовой стерилизации (Рисунок 3А).

Стерилизационные Arabidopsis семена с отбеливателем концентрации от 40-100% для до 10 мин обеспечивает удовлетворительный всхожесть проценты и эффективные формы подавления. Хотя концентрации отбеливатель, менее чем в 40% обеспечивают адекватные стерилизации для большинства много семян, используя 40% концентрации или выше гарантии эффективной стерилизации даже сильно загрязненные семян лотов. Это важно не превышать 10 мин стерилизации при использовании отбеливателя концентрации равных или выше 80% чтобы избежать высокой семенной смертности и дефекты в развитии рассады.

Лечение Arabidopsis семена с концентрации газа хлора 6,1% или 16,5% для 1 h результаты ставок высокой всхожести и адекватные формы ликвидации. Низкая хлора концентрация газа (2,1%) могут успешно использоваться, увеличивая продолжительность стерилизации до 3 ч.

Когда несколько строк нужно стерилизовать, рекомендуется жидкий стерилизации в растворе хлорки 50% за 10 мин. Для большего числа линий газовой стерилизации с концентрацией газа 6,1% за 1 ч это лучший вариант, так как многие линии можно стерилизовать быстро и легко с менее манипуляции.

Наши результаты обеспечивают стандартизированные условия для стерилизации большое количество семян различных генотипов и семена с нижней всхожесть потенциал. Единственным ограничением этих методов стерилизации является, что они не могут применяться к семена с прорастания цены менее чем 20% из-за обширных семян смертности. Альтернативные методы, такие как sonication17, повысить всхожесть в отсутствие стерилизации может быть полезно в тех случаях.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить за помощь в подготовке экспериментальных материалов Гаури Датта. Мы признательны также Bettina Wittler и Джеймс Манн для критического обзора рукописи. Эта работа была поддержана NSF грантов DBI-1049341 и MCB-1143813.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.65 mL Microcentrifuge tubes GeneMate C-3260-5 Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
1.7 mL Microcentrifuge tube GeneMate C-3262-1 Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
7 L plastic container Sistema 1016265438 Container in which gas sterilization is performed
Concentrated HCl Sigma-Aldrich 320331 Chemical used in the process of creating chlorine gas
Disposable sterile inoculating loop Fisher Scientific 22-363-603 Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates
Gamborg’s vitamin solution Sigma-Aldrich G1019 Vitamin solution used in the process of making MS media
Household bleach Clorox Regular-Bleach Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933 Chemical used in the process of making MS media
Micropore surgical tape 3M 1530-1 Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS) Sigma-Aldrich M5524 Chemical used in the process of making MS media
Parafilm M Bemis Company #PM996 Parraffin film used to seal sterilization container
Petri dish 100 X 15 mm  Fisher Scientific FB0875713 Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
pH indicator strips Whatman 2613991 Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution
Phytoagar Fisher Scientific 50-255-212 Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Chemical used in the process of making MS media
Tween 20 Fisher BioReagents BP337-100 Chemical used in the process of liquid sterilization
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org CS70000 (Col-0) Arabidopsis wild-type seeds 
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_037606C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_041402C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_059101C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_063470C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_072048C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_072240C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_081989C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_084124C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_085049C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_089717C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_107354C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_110111C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_111322C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_113109C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_114702C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_114872C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_115657C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_116803C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_039445C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_039782C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_043037C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_045828C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_048556C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_049514C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_049725C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_080816C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_081176C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_081770C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_082262C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_082289C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_082702C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_083630C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_084635C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_085337C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_085656C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_093049C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_103332C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_105336C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_105704C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_106388C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_109575C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_110580C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_110617C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_111424C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_111584C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_112097C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_113339C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_115837C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_019535C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_026478C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_046565C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_049258C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_049339C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_056307C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_081292C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_081597C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_083488C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_110573C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_112793C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_113658C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_113904C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_114673C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_114709C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_115455C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_013186C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_018261C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_062509C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_080639C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_088586C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_096651C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_106900C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_110131C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_111051C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_111245C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_113223C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_121391C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_125097C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_201905C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_210001C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_000662C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_029335C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_047760C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_071275C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_080530C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_103881C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_110864C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_120294C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_124390C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_132808C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_137036C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_139519C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_140643C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_142288C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_143304C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_147597C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_209076C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_081081C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1
Arabidopsis thaliana seeds ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org SALK_107487C Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).
  2. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61, (6), 909-921 (2010).
  3. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408, (6814), 796-815 (2000).
  4. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).
  5. Yamada, K., et al. Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome. Science. 302, (5646), 842-846 (2003).
  6. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes. Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).
  7. Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins. PLoS One. 8, (9), e73291 (2013).
  8. Podar, D. Plant growth and cultivation. Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).
  9. Xu, W., et al. An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 3, 1273 (2013).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (1998).
  11. Cederholm, H. M., Benfey, P. N. Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development. New Phytol. 207, (3), 683-691 (2015).
  12. Ye, G. N., et al. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation. Plant J. 19, (3), 249-257 (1999).
  13. Kuromori, T., et al. A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis. Plant J. 37, (6), 897-905 (2004).
  14. Fiers, M., et al. The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway. Plant Cell. 17, (9), 2542-2553 (2005).
  15. Stepanova, A. N., Alonso, J. M. PCR-based screening for insertional mutants. Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).
  16. O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome. Nat Protoc. 2, (11), 2910-2917 (2007).
  17. López-Ribera, I., Vicient, C. M. Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds. Plant Methods. 13, (31), (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics