ניתוח התקשורת בין ומונוציטים ו תאים סרטניים בשד ראשי במטריצה חוץ-תאית לחלץ (ECME)-מבוסס מערכת תלת מימדי

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה תלת מימדי התרבות לנתח המורפולוגיה של ראשי תאים סרטניים בשד, כמו גם כדי לחקור את יחסי הגומלין ישירים ועקיפים ומונוציטים לבין התוצאות כגון קולגן השפלה, גיוס תאים חיסוניים, תא הפלישה, קידום של דלקת הקשורים לסרטן.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מוטבע על מטריצה חוץ-תאית (ECM), תאים אפיתל רגיל ואמצעים בצורה אינטימית לתקשר עם תאים hematopoietic ו- hematopoietic, ובכך מאוד המשפיעים על התוצאה הומאוסטזיס ומחלות הרקמות. סרטן השד, הקשורים מקרופאגים (תאמי) משחק תפקיד קריטי התקדמות המחלה, גרורות, הישנות; לכן, הבנת המנגנונים של מונוציט chemoattraction כדי microenvironment את הגידול ואת האינטראקציות שלהם עם תאים סרטניים חשוב לשלוט במחלה. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של מערכת תלת מימדי (3D) תרבות משותפת של תאים סרטניים (BrC) בשד האנושי ומונוציטים אנושי. BrC התאים המיוצרים הבזליים רמות גבוהות של הפעלת מוסדר, T-cell נורמלי הביע והוא מופרש (RANTES), מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1), ופקטור המושבה-מגרה גרנולוציט-מקרופאג (G-CSF), בעוד תרבות משותפת עם ומונוציטים, בטא אינטרלויקין (IL)-1 ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1β) ו- IL-8 היו מועשר יחד עם מטריקס metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2 ו- MMP-10. Microenvironment משתית את הגידול קידם התנגדות anoikis MCF-10A מבנים דמויי acini 3D, chemoattraction של monocytes ופלישה של תאים BrC אגרסיבי. הפרוטוקולים המובאת כאן חלופה נוספת במחיר נוח ללמוד תקשורת אינטרה-הגידול, הן דוגמה הפוטנציאל הגדול המספקים במבחנה תא 3D מערכות לחקור תכונות ספציפיות של הגידול הביולוגיה הקשורים הגידול התוקפנות.

Introduction

הגידול ביולוגיה היא הרבה יותר מסובכים ממה שסברו קודם לכן. הרכבה ראיות מראה כי תאים סרטניים הם יותר מאשר גרידא בתפזורת של תאים מתרבים לא מבוקרת; במקום זאת, נראה תאים אמצעים שונים כדי לבצע פונקציות שונות הצגת הארגון גבוהה וההיררכיה בתוך הגידול1. תאים סרטניים נמצאים גם תקשורת אינטימית עם תאים שאינם טרנספורמציה: מקרופאגים, fibroblasts, לימפוציטים, adipocytes, תאי אנדותל, בין שאר התאים כולם שקועים חלבונים לגרדום, פוליסכרידים המהווים את ECM. אינטראקציות ישיר ועקיף רבים נוצרים בין תאים טרנספורמציה והפך הלא ועם ה-ECM, אשר משפיעה על המחלה תסריט2,3. בחוזקה. במקרה הספציפי של BrC, זה חשוב במיוחד לנתח את התקשורת של תאים BrC עם תאמי, בהתחשב בעובדה כי תאמי נמצאו לשחק תפקיד קריטי באבולוציה של הגידול, הגדלת הסיכון של גרורות, של הישנות המחלה4 ,5.

כדי לנתח אינטראקציות אינטרה-tumoral ותוצאות אפשריות שלהם, גישות חדשות 3D במבחנה פותחו בהתבסס על השימוש של תמציות ECM המספקים microenvironment הרבה יותר מורכב, יותר קרוב למציאות של הגידול ביולוגיה, לעומת תרביות תאים חד שכבתי קונבנציונלי שבו התאים גדלים קשור פלסטיק. פיטרסון, Bissell6 מסופקים הדגם הראשון של nonmalignant, ממאירים בתאי אפיתל החלב תרבותי על קרום המרתף laminin עשיר והיו הראשונים לתאר את המבנים 3D organotypic כי להפלות אדם nonmalignant תאים אפיתל בשד מהקבצים המקבילים ממאיר. עשור לאחר מכן, המודל שפותח על ידי Debnath, Muthuswamy, וסיפק Brugge-7,-8,-9 כלי חשוב להבהיר המסלולים ביולוגי נחשף במהלך שינוי ממאיר של הבלוטות acini, כזה כמו היווצרות acini גדולים עקב התפשטות בלתי מבוקרת, delocalization של חלבונים צומת חזק כמו עדות קיטוב תא לקוי וירידה acini לומן בשל התנגדות תא anoikis, סוג של מוות תאים מתוכנת המתרחשת ב anchorage תלוית תאים כאשר הם להתנתק מהתכונה ECM שמסביב. הדגמים של Sameni, Jedeszko, סלואן התמקדו פעילות הפרוטאוליטי הדמיה על ידי תאים, אשר קשורה קשר הדוק invasiveness, עוד תכונה קריטית של גידול ממאיר10,11,12. מודלים אלה מסתמכים על מטריצות חלבון מעורבב עם חלבונים שונים מתרצה-קרינה פלואורסצנטית מצעים (DQ-ג'לטין, DQ-קולגן, DQ-קולגן הרביעי), באותות פלואורסצנט אשר מעידים על השפלה הפרוטאוליטי של קולגן. דגמי תלת-ממד משמשים גם ללמוד מאפייני תא גזע של שניהם טרנספורמציה ו תאים סרטניים, אשר תא אגרגטים, הנקרא גם spheroids, יכול להיות בתרבית ההשעיה או בחלבונים ECM כמו חוקר על מנגנונים תאית התמיינות, א-סימטרי חלוקת התא, הדבקות לתא ו תא תנועתיות13,14. הפלישה מבחני לאפשר בדיקה של התוקפנות מהותי של הגידול וזיהוי של מולקולות זה לשמש chemoattractants במהלך תהליך פולשני ה-15. באופן כללי, תלת-ממד מודלים מייצגים של גיוון סבירים במבחנה תרבית תאים המשקפים באופן הדוק יותר רקמה נורמלית ולא oncogenic מורפוגנזה.

עיצבנו מערכת תרבות משותפת תא 3D המבוססת על מודלים הנ ל7,10,11, באמצעות שני האדם מסחרי BrC שורות תאים של פוטנציאל תוקפני ידוע (סוגי luminal, טריפל-שלילי), ראשי תאים explanted מחולים BrC. לראשונה פיתחנו מודל איפה כוחניות (MCF-7) או תאים (מד א-MB-231) BrC אגרסיבי היו בתרבית במשותף עם U937 ומונוציטים ב תמצית מטריצה חוץ-תאית (ECME)-מערכת תלת-ממד שמותר באינטראקציה ישירה תאים תאים מבוססת. תרבויות שיתוף אלה שימשו כדי לקבוע כיצד התקשורת בין שושלות תא שני אלה השפיעו על שעתוק של קבוצת גנים הקשורים לסרטן התנהגות תוקפנית. עלייה משמעותית של cyclooxygenase-2 (COX-2) תעתיק נצפתה כי בד בבד עם ייצור מוגבר של אחד המוצרים שלה, פרוסטגלנדין E2 (PGE2), ממצא זה הדגיש את תפקידה של דלקת התקדמות סרטן. שעתוק מוגברת של MMP נצפתה גם זה בקורלציה עם proteolysis קולגן רבתי כאשר תאים מד א-MB-231 אגרסיבי היו תרבותי משותף עם U937 ומונוציטים בתרבויות המכילות קולגן DQ הרביעי. ראוי לציין, תרבויות המשנה שלנו לא תמכו ההנחה כי מנגנוני אינטראקציה עם תא-תא יש צורך קולגן השפלה. זה די הציע כי התקשורת בין שושלות תא שני היה מתווך על ידי מולקולות המופרש. יתר על כן, supernatants שנקטפו מבחני תרבות שיתוף אלה הכילו גורמים מסיסים מאורגן acini הבלוטות הנוצרת על-ידי שאינם הפך MCF-10A תאים13. נמצא כי אגרסיבי, תאים BrC הראשי מופרש רמות גבוהות של מונוציט chemotactic מולקולות MCP-1, GM-CSF ולאחר RANTES. לפיכך, אנו המתוארים תרבות 3D שבו תאים הופרדו תא מוסיף תרבות כדי למנוע תא-תא אינטראקציות. תרבויות אלה שימשו כדי לטפל התקשורת עקיף בין תאים BrC ומונוציטים. אלה מבחני, כוחניות ותוקפנית מסחרי BrC שורות תאים, התאים BrC הראשי של שלושה סוגים שונים של האדם ומונוציטים: U937 מסחרי ותאי THP-1, ומונוציטים הראשי (PMs) מבודד מהדם ההיקפי של תורמים בריא (כל ומונוציטים שימשו במצב שלא הופעל) שימשו. ריכוז מוגבר של ציטוקינים דלקתיים IL-1β ו- IL-8 נצפו כדי להעשיר בתרבות משותף. בדומה לכך, נמצא כי MMP-1, MMP-2 ו- MMP-10 היו גם גדל ב BrC תאים-מונוציט תרבויות המשנה, ובכך חיזוק הממצאים הקודמים14. כתב יד זה, זרימת עבודה-מדוקדק של ראשי בידוד תאים BrC ובדיקה בתרבויות 3D מוצגת יחד עם נציג תוצאות. עבודה זו מהווה דוגמה טובה של הפוטנציאל הגדול המספקים במבחנה תא 3D מערכות לחקור היבטים ספציפיים של הגידול הביולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגימות מחולים BrC התקבלו מהבנק רקמות של Unidad de Investigación en Virología y גרועה, החולים הקניות de México פדריקו גומז. מחקר זה אושרה על ידי מדעי, אתיות, biosecurity לסקור לוחות של גומז פדריקו החולים הקניות de México: Comité דה Investigación, Comité de Ética en Investigación, Comité דה Bioseguridad. כל המטופלים פרוספקטיבי נרשמו, הודיעו על מהות המחקר: אלו המוכנים להשתתף חתמה על הסכמה בכתב לפני דוגמה אוסף וטופלו על פי הנחיות אתית הטוב הקלינית של המוסד. הזהות של המשתתפים היה תשוחררנה לתקופת המחקר. הממתינים הנכללים אובחנו עם קרצינומה ductal פולשני, היסטולוגית כיתה 2, קליני שלב II, עם אין טיפול neoadjuvant הקודם לפני כריתה של רקמה. המטופלים היו בגילאי כולן נקבות בממוצע 56.8 בת (טווח 42 75)14.

1. תרביות תאים תלת-ממד

  1. זרע 0.1 x 106 MCF-10A תאים או תאים BrC הראשי ב 25 ס מ2 מבחנות תרבות DMEM/F12 תרבות בינונית בתוספת 5% סוס סרום, פניצילין U/mL 100, 100 µg/mL סטרפטומיצין, טוקסין הכולרה 100 ננוגרם למ"ל, 0.5 µg/mL הידרוקורטיזון, 10 µg/mL אינסולין, 20 ng/mL של גורם גדילה עוריות (EGF). זרע 0.1 x 106 תאים BrC מסחרי, MCF-7 תאים ותאים מד א-MB-231 75 ס מ2 תרבות מבחנות עם DMEM/F12 תרבות בינוני בתוספת 10% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 100 µg/mL סטרפטומיצין. דגירה-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
  2. לאחר 48 שעות, יש לשטוף את טפט תא עם 10 מ"ל של עקר 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). Trypsinize את טפט תא עם 3 מ ל תמיסת 0.05% טריפסין ו 0.48 מ"מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) למשך 5-10 דקות ב 37 º C. להוסיף 200 µL של הסרום המתאים כדי לעצור את trypsinization ו- mL 7 בינוני בלי תוספי מזון. Resuspend התאים על ידי pipetting והסרה של aliquot של µL 10 לספור תאים בתוך תא נויבאואר.
  3. כל היטב במערכת שקופית הקאמרית 8-ובכן, להפיץ את בסיס 40 µL של ECME טהור, ואחריו דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  4. כל טוב, במקום התאים 800 resuspended ב 400 µL של DMEM/F12 (ללא פנול אדום) בתוספת כמו שלב 1.1 אבל עם השינויים הבאים: עבור ראשי BrC תאים ותאים MCF-10A, להוסיף 4 ננוגרם למ"ל של EGF ו- 2% ECME; MCF-7, מד א-MB-231, להוסיף רק 2% ECME.
  5. דגירה תרבויות-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה. להחליף את תרבות המדיה כל 48 שעות.
  6. רשומה מורפולוגי משתנה של תאים בכל 24 שעות ביממה במשך 15 ימים עם מיקרוסקופ אופטי. כדי לנתח את המורפולוגיה של ראשי BrC תאים, MCF-10A ותאים מד א-MB-231 הן עזר שורות תאים עבור דוגמאות של היווצרות acinar מסודרות המתוסבכים מבנים דמויי סרטן אגרסיבי, בהתאמה.
  7. להשיג כמה תמונות של תאים מיקרוסקופיית שדה בהיר-100 X ו- 200 X הגדלה והשווה מורפולוגיה תאים עם הפניה MCF-10A, מד א-MB-231 שורות תאים (איור 1).

2. לקבל את תאי סרטן ראשוני של רקמת הגידול

הערה: כדי להשיג גידול בתאי אפיתל להשתמש ברקמה מן resected הראשית גידולים מחולים BrC עם אין טיפול neoadjuvant הקודם; להימנע אזורי נמק ולעבוד עם מינימום של 0.5 ס מ3 של רקמת הגידול.

  1. לשטוף את רקמת הגידול עם PBS x 1 סטרילי, מכנית disaggregate זה עם איזמל לחלקים 1-2 מ מ.
  2. לעכל את רקמות בקבוקון זכוכית סטריליים mL 20 עם מכסה עבור 2 h בטמפרטורת החדר (RT) עם 2 מ"ל של הפתרון בצע: לערבב 1 מ"ג/מ"ל collagenase סוג אני, hyaluronidase U/mL 100 DMEM/F12 בינוני המכיל 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 , עם ערבוב מתמיד.
  3. לסנן ההשעיה הנוצרת באמצעות סטיריליים פיסות בד טול לחסל את חתיכות גדולות של רקמות מעוכל. לאחר מכן לסנן התליה תא דרך קרום מיקרומטר-נקבובית 100 מעוקר.
  4. גלולה התאים ב- g 430 x עבור 5 דקות ב RT ולשטוף אותם פעמיים עם PBS x 1 סטרילי. התרבות התאים הראשי בינוני DMEM/F12 בתוספת 5% הסוס סרום, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100, 100 ננוגרם למ"ל כולרה הרעלן, 0.5 µg/mL הידרוקורטיזון, אינסולין µg/mL 10 ו 20 ng/mL של EGF. להחליף את המדיום כל ה 48 שמור על תרבויות-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
  5. ודא מבודד התאים לתאי האפיתל עם פרוטוקול תקני immunocytochemistry14. בדיקת סמני אפיתל שלושה: פאנל של cytokeratins (PanCK), mucin-1 (Muc-1), ותא אפיתל אדהזיה מולקולה (EpCAM).

3. בידוד PM תאים מדם היקפי

  1. תמצית כ 40 מ"ל של דם היקפיים בריאה מתנדבים, לדלל את הדם ביחס 1:3 עם PBS סטרילי ללא אנדוטוקסין 1 x ונושא זה פרידה הדרגתי צפיפות.
  2. במקום צינור חרוטי, 2 מ של מדיום diatrizoate polysucrose ו נתרן עם צפיפות של 1.077 g/mL. לאט ובזהירות כיסוי 8 מ של דם מדולל. צנטריפוגה למשך 30 דקות, 765 g x RT. בשימוש מהירות האצה-ההאטה האיטית לצנטריפוגה.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, ארבע שכבות ייווצר מלמטה למעלה: בגדר כדוריות דם אדומות, השכבה הדרגתיות צפיפות בינונית, את שכבת תאי תאי (זה מופיע כעיגול לבן בסדר), השכבה פלזמה.
  3. בזהירות לאחזר את שכבת תאים תאי מעבר הצבע עם פיפטה פסטר סטרילי ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 1 x PBS, בכל פעם ואחריו צנטריפוגה איטי (430, 275 ו- 191 x g) למשך 10 דקות ב- RT.
  4. להשתמש בפרוטוקולים שלילית הבחירה כדי למנוע הפעלה של תאים. דוגמה פרוטוקול כזה הוא הדברים הבאים:
    1. לשטוף את התאים תאי פעם אחת עם פתרון כביסה buffered (0.5% שור אלבומין, 2 מ מ EDTA ב- PBS 1 x). לספור את התאים בתוך תא נויבאואר ולהתאים להם את צפיפות של עונה 1 פרק 10-7 תאים/30 µL של פתרון במאגר.
    2. עבור כל התאים7 עונה 1 פרק 10, להוסיף 10 µL של ה-FcR חסימת ריאגנט ו- µL 10 קוקטייל ביוטין-נוגדן מונוציט המכיל נגד CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123, A Glycophorin (כולל קיטים מסחריים).
    3. לערבב את התאים, תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 º C. להוסיף על µL 30 נוספים של הפתרון כביסה באגירה מלאה פלוס 20 µL של גרגרי אנטי ביוטין (כלול בערכה); לערבב תאים, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
    4. שטיפת התאים פעם עם פתרון במאגר, צנטריפוגה-g 430 x עבור 5 דקות ב RT, resuspend ב 1.5 מיליליטר buffered פתרון הפרדה מגנטית.
    5. לטעון התליה תא על עמודה הפרדה מגנטית שטופים מראש ולהוסיף 7 מ של פתרון במאגר. לאסוף את השבר מועשרת מונוציט צינור חרוטי 15-mL, לספור את התאים, אם לא תרבותי מיד, הקפאת ומונוציטים על צפיפות של 2 x 106 תאים/1 מ ל DMEM/F12 בינוני בתוספת 50% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד ב −80 מעלות צלזיוס.
      הערה: הימנעו משימוש ומונוציטים לאחר יותר מ 2 חודשים לקפוא, הכדאיות שלהם יכול להיות בסכנה.
  5. לשמור על תרבויות של PMs DMEM/F12 בינוני בתוספת 6% FBS פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg 100/mL, ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
  6. לבצע כל ערכה של ניסויים ניצול PMs מתורמים שונים לפחות שני באופן עצמאי, כמו צירוף חיבורים ומונוציטים מתורמים שונים יכולים לגרום מונוציט הפעלה.

4. יצירת 3D תרבויות שיתוף

  1. תרבויות המשנה 3D עם אינטראקציה עקיפה
    הערה:
    לבצע מבחני אלה ב- 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות צלחות באמצעות פוליקרבונט תא תרבות מוסיף עם ממברנות של 0.4 גודל הנקבוביות מיקרומטר. ב הזה assay, הן supernatants והן תאים ניתן יהיה לאחזר בסוף הניסוי.
    1. לטפח 2 x 106 ומונוציטים U937 ו- THP-1 ב- 10 מ"ל של מדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS, 1% אנטיביוטיקה/antimycotic, ולטפח PMs טריים שהושלם DMEM/F12 בינוני (כפי שצוין בתחילת שלב 3.5), ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
    2. צלחת ומונוציטים5 4 x 10 1 מ"ל/טוב של המדיום המתאים שלהם (בתוספת 2% ECME ו- 2% FBS ומונוציטים U937 ו- THP-1, או 2% ECME ו 6% FBS עבור תסמונת קדם וסתית).
    3. במקום מוסף כל היטב ולהוסיף 0.9 מ של 4 x 105 BrC תא השעיה בתוך המדיום המתאים (בתוספת עם 2% ECME ו- 2% FBS עבור שורות תאים מסחרי או 5% סוס סרום עבור תאים BrC הראשי). להחליף מחצית מדיה סה כ כל 48 שעות.
    4. דגירה-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה במשך 5 ימים ולשחזר את supernatants. לאחזר תאים על-ידי trypsinization אם לאחר מכן ניתוח זה מבוצע.
    5. כוללים את הפקדים של תרביות תאים בודדים עם התקשורת בהתאמה.
  2. תרבויות המשנה 3D עם אינטראקציה ישירה
    1. תווית BrC התאים, ומונוציטים עם צבעי פלורסנט שונים לפני תרבית תאים כדי לאפשר מיון עצמאית של כל שושלת היוחסין של תאי אחרי תרבות לניתוח של הביטוי mRNA וחלבון. השתמש זמינים מסחרית נגזרות קומרין ו rhodamine לעבור בחופשיות דרך קרום התא של תאים חיים. פרוטוקול כללי עבור תיוג הוא הדברים הבאים:
      1. להכין של טפט של תאים BrC עניין (2 × 106 תאים בבקבוקון תרבות2 25 ס מ), להחליף את המדיום סטנדרטי מספיק הפתרון עובד ומחוממת מראש של הפלורסנט (1:2, 000 של הפלורסנט במדיום בסיס רגיל ללא כל תוספת). דגירה 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה. האחות הפתרון לצבוע ולשטוף בעדינות עם מספיק 1 x PBS. האחות של PBS ולהוסיף המדיום סטנדרטי.
      2. Trypsinize את טפט תא עם 2 מיליליטר תמיסת EDTA טריפסין ו 0.48 מ"מ 0.05% למשך 5-10 דקות ב 37 º C. הוסף µL 200 FBS להפסיק trypsinization של 7 מ של המדיום כתב בלי תוספי מזון. Resuspend התאים על ידי pipetting. . בסדר aliquot של µL 10 לספור תאים בתוך תא נויבאואר ממשיכים עם פרוטוקול תרבות משותפת לאחר ספירת תאים.
      3. גלולה התאים ב- g x 430 עבור 5 דקות ב RT (לבצע פעולה זו הראשונה מאז ומונוציטים לגדול ההשעיה). למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend תאים עם 3 מ"ל של הפתרון עובד ומחוממת מראש של הפלורסנט (1:2, 000 של הפלורסנט במדיום הבסיס הסטנדרטי ללא תוספי תזונה). תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
      4. גלולה התאים שוב, למחוק את הפתרון עובד צבע, resuspend בעדינות עם 5-7 מ ל 1 x PBS. גלולה פעם נוספת, למחוק את PBS ו resuspend תאים ב- 5-7 מ ל בינונית רגילה. . בסדר aliquot של µL 10 תא השעיה לספור תאים בתוך תא נויבאואר ממשיכים עם פרוטוקול תרבות משותפת לאחר ספירת תאים.
    2. הגדר את תרבות משותפת כדלקמן:: התפשטה מספיק ECME בתחתית הבאר כדי ליצור שכבת אפילו כל היטב של מערכת שקופית 4-ובכן קאמרית. צלחת µL 20 של השעיה תא בודד המכיל 5 × 105 שכותרתו BrC תאים לכל טוב.
    3. לאחר 15-20 דקות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, מוסיף השעיה של 2.5 10x5 שכותרתו ומונוציטים 80 µL assay בינוני (בתוספת 60% ECME).
    4. לאפשר ECME לגבש למשך 15-20 דקות ב 37 º C.
    5. להוסיף 1 מ"ל של שילוב 1:1 של תאים BrC מונוציט תרבות המדיה.
    6. דגירה תרבויות המשנה ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה עבור 24 שעות, 48 שעות או 5 ימים כדי לעקוב אחר שינויים בנקודות זמן שונות.
    7. לבזות ECM חלבונים להתאושש התאים התרבויות. מחוק לגמרי, למחוק את המדיום, להוסיף 0.5 מ"ל של PBS 1 x עם 0.1% טריפסין, 0.25% EDTA, תקופת דגירה של h 3-37 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה, להוסיף 0.5 מ של PBS 1 x עם 10% FBS כדי לנטרל את טריפסין, ואת resuspend את התאים על ידי pipetting נמרצות כדי לקבל השעיה תא בודד.
    8. גלולה תאים ב- g 765 x עבור 5 דקות ב RT למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את התאים ב 5 מ של PBS 1 x עם 10% FBS. חזור על שלב זה פעם אחת.
    9. נושא התליה תא תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) עם הכלי המתאים. ודא האוכלוסיות הסופי לפחות 95% טהור).
    10. לאחר מיון, לשטוף את התאים עם x 1 סטרילי PBS, גלולה (430 גרם x עבור 5 דקות ב RT), resuspend ב x 1 סטרילי PBS. התאים יכולים להיות מעובדים על-פי תקנונים ספציפיים RNA בידוד או חלבונים.
    11. חזור על כל assay שלוש פעמים, כולל תרבויות תלת-ממד של כל שושלת היוחסין של תא בודד כפקדים.
  3. האינטראקציה הישירה של תרבויות שיתוף תלת-ממד כדי להעריך קולגן השפלה
    1. ליצור תרביות תאים תלת-ממד שיתוף כפי שמתואר בשלב 4.2, בצעד הנוסף של הוספת µg/mL 32.5 סוג הקולגן הרביעי עם fluorescein isothiocyanate כדי ECME תוויות. הריכוז הסופי של קולגן הרביעי ב ECME הוא 0.5%. לגדול תרבויות coverslip 35 מ מ ב- צלחות פטרי.
    2. מורחים שכבה של 40 µL של ECME בתחתית הפטרי. לאפשר ECME לגבש ב 37 º C.
    3. להוסיף 2.5 x 10 תאים BrC5 10 µL של המדיום ולאפשר תאים להתמסד.
    4. הוסף השעיה של 1.25 x 105 U937 ומונוציטים 40 µL assay בינוני (בתוספת 60% DQ-קולגן הרביעי הנקרא-ECME).
    5. לאפשר ECME לגבש למשך 15-20 דקות ב 37 º C.
    6. להוסיף 2 מ של שילוב 1:1 של תאים BrC מונוציט תרבות המדיה.
    7. דגירה התרבויות שותף במשך 5 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה. להחליף את תרבות המדיה כל 48 שעות.
    8. לנתח את פליטת קרינה פלואורסצנטית במיקרוסקופ קונפוקלי סריקה ולמדוד את הצפיפות האופטית משולב (iod תבקש) לכל 50 מיקרומטר2 של תרבות. להשוות IODs תרבויות בודדות ותרבות בזמן אפס (איור 2).

5. ניתוח של Supernatants תלת-ממד משותף תרבויות עם אינטראקציה עקיפה

  1. לאחר 5 ימים של תרבות משותפת, לשחזר את supernatants העליון והן התאים נמוך של התרבויות שיתוף תלת-ממד, ומתוך הפקדים תרבות 3D בודדים. מערבבים היטב כל תגובת שיקוע על-ידי pipetting. Aliquot, חנות תגובת שיקוע על −20 ° C עד לשימוש (חודש אחד).
    הערה: לשמור supernatants −80 ° C אם האחסון יהיה יותר חודש אחד.
  2. לנתח את supernatants עם ריבוב assay פלטפורמות, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) או מבוסס-חרוז immunoassays בעקבות בפרוצדורות מומלצות של היצרן.
    הערה: Supernatants יכול להיות גם נותחו על ידי תספיג או מרוכזת דרך מסננים ספציפיים נקבובית להשיג גודל מועשר שברים חלבון כדי לבצע zymography ניתוח16,17. לחלופין, להשתמש supernatants את המדיה ממוזגים לניסויים אחרים, כפי שמתואר להלן. מדיה ממוזגים מתקבלת בדרך כלל מתרבות 5 ימים (איור 3).

6. אפיון ההשפעות של Supernatants מתאי BrC העיקרי על היווצרות Acini ומבנה Acini

  1. כל היטב של שקופית 8-ובכן הקאמרית מערכת להפיץ את בסיס µL 40 של ECME ולתת לו לחזק למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. זרע 800 MCF-10A תאים/טוב ב µL 400 שהושלם בינוני תרבות DMEM/F12, כפי שמתואר בשלב 1.2.
  3. הוסף µL 400 של מדיה ממוזגים או בינוני תרבות DMEM/F12 שהושלם עם 20 ng/mL של האדם רקומביננטי IL-1β.
  4. המקום השקופית קאמרית לתוך צלחת פטרי זכוכית המכילה 35 מ מ פטרי מלא 2 מ של PBS ליצירת סביבת לחות.
  5. החלף את המדיה/תגובת שיקוע כל 48 שעות.
  6. להקליט acini הבלוטות היווצרות כל 24 שעות למשך 14 ימים עם מיקרוסקופ אופטי.
  7. אחרי 14 יום של תרבות כתם acini עם 100 µL של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)-ריכוז של 100 nM ב- 1 x PBS להתבונן גרעין התא. תקופת דגירה של 25 דקות ב RT תוך בחישה מתמדת. לשטוף שלוש פעמים עם PBS x 1 במשך 5 דקות, בכל פעם תוך ערבוב מתמיד-הר RT. ההכנות עם מדיום הרכבה ספציפיים עבור צביעת פלורסנט. חותם עם לק שקוף ולתחזק מוגן מפני אור ב 4 º C.
  8. לנתח את acini עם מיקרוסקופ קונפוקלי לקיחת תמונות של ערימות ואלכסוני בעומקים שונים של acini (איור 4A, B, C).
  9. דמיינו החלבונים שונים ב- acini עם פרוטוקולים מכתימים נאותה. למשל, E-קדהרין היה מוכתם להעריך אדהזיה מתא אל תא, התא קוטביות, ו/או לומן היווצרות18 (איור 4D).

7. העברת מבחני

הערה: לבצע העברת מבחני של U937, תסמונת קדם וסתית THP-1, וטריים ב- 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות צלחות באמצעות פוליקרבונט תא מוסיף תרבות עם ממברנות של 8 גודל הנקבוביות מיקרומטר. בעבר הוכח כי נוגדנים GM-CSF, MCP-1 ו- RANTES נמצאו מופרש בריכוזים גבוהים תרבויות 3D בודדים של הקווים תא BrC אגרסיבי. הוצע כי ציטוקינים אלה היו קריטיים למשיכת ומונוציטים לאתר של הגידול העיקרי; זה נבחנה במבחני ההעברה באמצעות של ציטוקינים כמו chemoattractants.

  1. תרבות U937, תסמונת קדם וסתית THP-1, או טריים כפי שמתואר בשלב 4.1.1.
  2. לשטוף פעם כל הוספה עם 200 µL של RPMI 1640 ללא סרה מימה הקרום.
  3. למלא אותו µL 50 של ECME קר, למקם את הכיסויים צלחת 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות, ולאפשר את ECME פולימריזציה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  4. להוסיף 180 µL של RPMI בלי FBS בתא העליון של הצלחת. להוסיף בתא התחתון ללא מבעבע 800 µL של RPMI בתוספת או 100 ננוגרם למ"ל של GM-CSF, MCP-1, או RANTES כמו chemoattractant. השתמש בינונית ללא ציטוקינים כפקד שלילי. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 ° C כדי ליצור מעבר הדרגתי כימוקין.
  5. המקום 1.5 x 105 של כל סוג מונוציט בשפופרת סטרילי, לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של 1 x PBS צנטריפוגה ב g 430 x עבור 5 דקות ב- RT. Resuspend ומונוציטים ב 20 µL של RPMI בלי FBS, מקם אותם בתוך השרוול , ואני מאוד בזהירות homogenize התליה תא (הנפח הסופי של התא העליון הוא 200 µL).
  6. לאפשר את נדידת תאים כדי התקדמות במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
    הערה: כפי ומונוציטים שאינו חסיד, תאים נודדים יהיה בדרך כלל בתקשורת של תא נמוך יותר.
  7. הסר את המכסים, לאחזר את המדיה, ולספור תאים בחלק 2, 4, 6 ו- 24 שעות ביממה באמצעות תא נויבאואר או cytometer של זרימה; לחלופין, במיוחד אם אין תאים נמצאים בתקשורת, לרכוש תמונות של החלק התחתון של התוספות באמצעות מצלמה דיגיטלית. ספירת רשע משדות אקראי 3 (בהגדלה X 100) משמשת לניתוח (איור 5).

8. הפלישה מבחני

הערה: ביצוע מבחני חדירה של תאי BrC צלחות 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות באמצעות פוליקרבונט תא תרבות מוסיף עם ממברנות של 8 גודל הנקבוביות מיקרומטר. במחקרים המקורי שלנו, IL-8 היה אחד ציטוקינים מועשר ב- supernatants של BrC תא/מונוציט תלת-ממד משותף התרבויות. אם ציטוקין השתתפו בפלישה של הקווים תא BrC נבחנה.

  1. הרחב BrC בתאים 75 ס מ2 מבחנות. MCF-7, T47D, HS578T, מד א-MB-231 כפי שמתואר בשלב 1.2 (אך ללא ECME) ותאים BrC העיקרי כפי שמתואר בשלב 2.4.
  2. לשטוף לאחר תרבית תאים הממברנה כל פוליקרבונט 8 מיקרומטר-נקבובית הכנס עם 200 µL בינוני ללא סרה (אופן השימוש תלוי שורת התאים נבדקו) מימה הקרום.
  3. למלא את תותב עם 50 µL של ECME קר (1:4 דילול ECME:cold בינוני ללא FBS), מניחים את הכיסויים צלחת 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות, ולאפשר את ECME פולימריזציה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר ECME יש polymerized, להוסיף 180 µL של המדיה המתאימים לתא ללא FBS. הוסף מדיה µL 800 ללא FBS דרך חרכי תותב. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 ° C ליצירת מעבר צבע של IL-8.
    הערה: הימנע מיצירת בועות בתקשורת. מדיה המשמשת ללא FBS אבל בתוספת 100 ננוגרם למ"ל של IL-8 chemoattractant או מדיה טהור ללא FBS, כפקדי שלילי.
  5. לקבל סך של 6 x 105 תאים בכל שורה תא כדלקמן:
    1. התעלם supernatants, לשטוף פעם עם 10 מ"ל של PBS 1 x ולהוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין/0.48 מ"מ EDTA למשך 2 דקות ב 37 ° C כדי לנתק את התאים. להוסיף 4 מיליליטר בינוני שהושלם להפסיק את התגובה טריפסין, resuspend נמרצות על ידי pipetting.
  6. . בסדר µL 10 aliquot של התליה תא לספור את התאים בתוך תא נויבאואר לקחת אמצעי אחסון של השעיה התא המכיל 6 x 105 תאים. צנטריפוגה-g x 430 עבור 5 דקות ב RT, למחוק את תגובת שיקוע, ולשטוף תאים 1 מ"ל של PBS 1 x. חזור על רינס פעם נוספת.
  7. Resuspend תאי µL 20 של המדיה המתאימים ללא FBS ומקום בתוך השרוול המכיל 180 µL של המדיה המתאימים ללא FBS. בזהירות homogenize התליה תא על-ידי pipetting.
  8. לאפשר את הפלישה תא כדי התקדמות במשך 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
  9. לאחר 48 שעות, הסר את תותב, למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את תותב פעם מאוד בזהירות עם 200 µL ל- 1 x PBS. עם המוליך שקצהו כותנה להסיר את עודף של PBS.
    הערה: התאים פולשנית בדרך כלל מחוברים לצד השני של הקדמי כפי במקרה זה איפה תאים חסיד.
  10. לתקן את התאים על ידי הצבת את תותב בטוב של צלחת 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות המכיל 1 מ"ל/טוב של 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות ב- RT. לאחר מכן. כך, יש לשטוף את הכיסויים פעם אחת עם 1 x PBS.
  11. מכתים את התאים על ידי הצבת את תותב בבאר של צלחת 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות המכיל 1 מ"ל/טוב ל- 1 x PBS בויולט קריסטל 0.2% במשך 45 דקות ב RT. בקפידה, עם הסר שקצהו כותנה המוליך כל ECME מהחלק העליון של קרום , אשר מכילה תאים לא להעביר, יש לשטוף היטב עם מים מזוקקים כדי למנוע ביטול קבוע תאים פולשני.
  12. לספור את התאים הפולשים על ידי התבוננות בצד התחתון של הקדמי תחת המיקרוסקופ הפוכה. ספירת רשע משדות אקראי 3 (בהגדלה X 100) משמש. במקרים פלשו כמו אשכולות בהם קשה לספור בנפרד התאים, לרכוש תמונות מ- 3 שדות אקראיים (בהגדלה X 100) באמצעות מצלמה דיגיטלית. לנתח את התמונות עם תוכנה לניתוח תמונות ולהשתמש של IOD לכמת תא הפלישה (איור 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח מורפולוגי של תאים BrC בתרבויות 3D:

המורפולוגיה של גדל בתרבויות 3D ב צפיפויות נמוך וגבוה התאים BrC העיקרי היה למד במשך 5 ימים. במהלך 48 ה הראשונה תאים לדבוק ECME, לשמור על צפיפות נמוכה. בנקודת זמן זו, זה בבירור ניתן להערכה כי תאים להציג צורת פלך דמוי מוארך, חלקם עם שניים או יותר זמן cytoplasmic תחזיות, מבלי להראות לכאורה תא תא אנשי קשר. לאחר 5 ימים של התרבות תאים התרבו תוך שמירה על מורפולוגיה הראשונית שלהם. יתר על כן, הם הקימו מבנה דמוי רשתות ללא ארגון מבנה ספציפי ומופיעות לערימות למעלה ללא סימן דיכוי. השוואה עם תאים שאינם הפך MCF-10A בוצע, אשר יוצרים מבנים כדוריים הדומה acini הבלוטות. תאים אלה להציג מורפולוגיה אופיינית של מבנים מעוגלים היטב מופרד ומאורגן בגדלים הומוגנית (מתוך כ-50 מיקרומטר). להפך, ראשי תאים BrC לשתף עם הרבה דמיון קרוב עם BrC אגרסיבי תאים מד א-MB-231 (איור 1).

ניתוח של אינטראקציות ישיר-לתא והשפלה קולגן:

עיצבנו דגם תלת-ממד תרבות משותפת כדי להעריך את הדברים הבאים: תא מורפולוגיה, קולגן השפלה, נדידת תאים, האם ישנו האינטראקציה הישירה בין תאים BrC ומונוציטים בתרבות משותף. לאחר 5 ימים, הן תאים BrC MCF-7 ומד א-MB-231 מסחרי טופס אגרגטים לא מאורגן בתרבויות תלת-ממד, עם זאת, הם נבדלים המורפולוגיה שלהם. תאים אגרסיבי מד א-MB-231 טופס אגרגטים עם צורות מוארך עם כמה תאים נוטה להפריד בין השאר, בעוד כוחניות MCF-7 תאים יוצרים אגרגטים תאים לשמור על צורות מעוגלות ואיפה שהם נראים יותר בצפיפות הדחוס (איור 2 A, B). DQ קולגן הרביעי סופחה להמחיש הפרוטאוליטי השפלה (ירוק), עם שתי תרבויות BrC המציגות פעילות פלורסנט. להעריך באופן כמותי פעילות הפרוטאוליטי, נמדדה קרינה פלואורסצנטית ירוק כמו IOD משדות2 6 50 מיקרומטר. נעשתה השוואה בין תרבויות 3D בודדים של מד א-MB-231 תאים ותרבויות משותף עם U937 ומונוציטים. נצפתה עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית של proteolysis בתרבות שיתוף (איור 2C). כמו כן, ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של טורי מנוגדים ערימות כל 10 מיקרומטר של מד א-MB-231 וביצע U937 ומונוציטים תרבות משותפת היה (איור 2D). ניתוח זה חשף כי U937 ומונוציטים להעביר לקראת אגרסיבי תאים מד א-MB-231 עם כמה ומונוציטים להגיע השכבה של תאים BrC. עם זאת, זה היה ברור כי אתרי האינטראקציה הישירה תא-תא היו לא בהכרח בד בבד עם תחומי הפעילות הפרוטאוליטי גבוה יותר: במקום, אזורי השפלה קולגן בצורה אחידה במקומות שונים בתרבות, שמוביל היסק זה קולגן השפלה הייתה התוצאה של תקשורת עקיפה מתווכת על ידי גורמים המופרש. לכן, דגם התלת-ממד תרבות משותפת השתנה למקם את התאים בתאים שונים מופרדים באמצעות קרום נקבובי כדי לאפשר תקשורת בהתבסס על גורמים המופרש ולהימנע תא תיוג ומיון אחרי תרבות.

ניתוח של IL-1β ב Supernatants מתרבויות 3D:

עבודה עם התרבויות 3D אינטראקציה עקיפה, supernatants של הפרט BrC העיקרי תרבויות ובין תרבויות המשנה שלהם 5 ימים עם PM נבצרו. Supernatants האלה היו נענשים ניתוח בו זמנית של ציטוקינים 18 ו 5 MMPs באמצעות ערכות מסחריות ומכשיר שתוכננה במיוחד עבור ניתוח זה. של analytes כל נבדק, נצפו רמות גבוהות באופן משמעותי של IL-1β ו- IL-8 בתרבויות העיקרי BrC תא-מונוציט משותף, שני ציטוקינים דלקתיים מכריע זה נקשרו בעבר עם התקדמות ממאיר15, 18 , 19 , 20 (איור 3; תוצאות IL-1β). דוגמה זו היא סוג אחר של ניתוח כי תרבויות 3D מאפשר לחקות את רשת התקשורת שמעצבת את microenvironment הגידול.

אפיון Supernatants ומבנה Acini:

על בסיס מערכת ניסויית 3D שפותחה על ידי Debnath, Muthuswamy ו Brugge7, שבו הוקמו MCF-10A כמודל של המנגנונים הקשורים oncogenesis, הערכה האם הגורמים המופרש מתא BrC ראשי supernatants השפיע על היווצרות של MCF-10A 3D acini דמויי המבנים, דומה לפעילות נצפתה לאחר התמרה חושית של7,oncogenes ויראלי וסלולריות21 בוצע. תאים MCF-10A היו מעובדים עם שני supernatants שונים של שתי שורות תאים העיקרי BrC להתבונן היווצרות לומן (כאמצעי של עמידות anoikis). יום 14, spheroids הוערכו על ידי חתכים ואלכסוני מיקרוסקופיה קונפוקלית-0, 25, 50, 75 ועומק 100%, בשני המקרים, נמצא anoikis evaded את התאים MCF-10A (נמדד על ידי ספירת מספר התאים (luminal) המרכזי ב- acini (איור 4 B, C)). לפיכך, MCF-10A תא acini שנוצרו עם התקשורת ממוזגים מתאי BrC, חוסר לומן חלול בנוי היטב, בניגוד MCF-10A כי הם בוגרים בינונית רגילה שלו תרבות (כפי שמתואר בשלב 1.2) (איור 4א). במערכת תלת-ממד תרבות משותפת, IL-1β היה מופרש מאוד; לכן, התאים MCF-10A היו גם מעובדים עם האדם רקומביננטי IL-1β18. איור 4 D מראה מיקרוסקופיה קונפוקלית ואלכסוני לחתוך בעומק 50% של acini בנוכחות IL-1β (לוחות התחתון), מגלה כי ציטוקין גם מקנה עמידות anoikis. לפיכך, גורמים מסיסים מופרש על ידי תאי BrC הראשית, כגון IL-1β, לקדם את ההישרדות של הלא-הפך MCF-10A תאים לאבד אינטראקציות ECM, מאפיין של סרטן פולשני.

3D תרבויות משותף לקדם לתגובה דלקתית המשויך העברה של Monocytes ופלישה של תאים סרטניים:

אנחנו הפגינו בעבר כי ראשי תאים BrC בתרבות 3D מפרישים הבזליים רמות גבוהות של נוגדנים הפרו דלקתיים ידוע למשוך ומונוציטים14. לפיכך, ניתחנו את הנדידה הקיבולות של monocytes, בתגובה נוגדנים נמצאו מועשר בתקשורת ממוזגים של התאים BrC. הקיבולת הנדידה של monocytes מסחרי U937, THP-1 ו- PMs טריים הוערך בתגובה שלושה נוגדנים שונים: GM-CSF, MCP-1 ו- RANTES. ומונוציטים U937 ו- THP-1 היו מסוגלים נודדות בתגובה GM-CSF MCP-1, עם U937 כמו היענות ביותר, בעוד שני ומונוציטים היה null בתגובה RANTES. חשוב, תסמונת קדם וסתית הראה פעילות נודדות הבזליים גבוהה וגם התגובה הקטלניים ביותר MCP-1 (איור 5). IL-8 הועשר גם לאחר התרבות שיתוף תלת-ממד של תאים BrC העיקרי ומונוציטים. לפיכך, ניתחנו אם IL-8 משנה את היכולת של הפלישה של שורות תאים BrC ראשי ומסחרי. מסחרי אגרסיבי BrC תא הקווים (HS578T ומד א-MB-231) פלשו בתגובה IL-8, ואילו כוחניות (MCF-7, T47D) לא לפלוש. באופן מפתיע, תאים BrC העיקרי היו פולשניים יותר מאשר שורות תאים BrC אגרסיבי מסחרי בתגובה IL-8 (איור 6א, לוחות נכון). במקרים מסוימים, תאים לפלוש כמו אשכולות, ולכן ניתוח IOD היה הכרחי (איור 6B).

Figure 1
איור 1 : להחליפן בתמונות של תאים BrC בתרבויות 3D. משמאל לימין: השליטה הלא-טרנספורמציה תאים MCF-10A ויוצרים acini הבלוטות אופיינית, עם מעוגל מורפולוגיה, אנשי קשר תא מופרדים היטב, ומאורגן מבנים בגדלים הומוגנית (כ 50 מיקרומטר על ההגדלה הממוצע, אופטי של 200 X). מראות האמצעי העיקרי תאים BrC תרבותי בצפיפות נמוכה (2 ימים), צפיפות גבוהה (5 ימים). התאים לדבוק ECME, לשמור על צפיפות נמוכה בנקודות זמן מוקדם. זה ברור כי תאים להציג צורת פלך דמוי מוארך, חלקם עם שניים או יותר זמן cytoplasmic תחזיות, ועם אין הידבקות תאים תאים לכאורה. מצד שני, בעל צפיפות התאים בנקודות מאוחר יותר הקים מבנים דמוי רשתות ללא ארגון מבנה ספציפי. תאים אלה הופיעו לערימות למעלה מציג ללא סימן דיכוי. פקד של תאים מד א-MB-231 מסחרי לאחר 5 ימים בתרבות 3D מוצג; תאים אלה-BrC אגרסיבי לשתף עם הרבה דמיון קרוב עם BrC העיקרי תרבויות (הגדלה אופטית של 100 X). סולם בר מייצג 50 מיקרומטר. 800 התאים היו נזרע בתחילת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ניתוח של השפלה ECM. תאים MCF-7 Non-אגרסיבי מוכתם fluorochrome צהוב (A) ותאים מד א-MB-231 אגרסיבי מוכתם fluorochrome אדום (B) מעובדים במשך 5 ימים בתנאי תלת-ממד; 0.5% של קולגן התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק הרביעי סופחה להמחיש ECM השפלה. ב A ו- B, התמונות השמאלי העליון מייצג את רמות הקולגן השפלה, הלוחות נכון העליון מייצג את התמונות אופטי, בפינה השמאלית התחתונה לייצג את התאים BrC ולהציג הלוחות נכון התחתון המיזוג של פלורסנט, אופטי תמונות. עבור A ו- B, מוצגים הגדלה אופטית של 200 X ובר בהיקף של 100 מיקרומטר. (ג) נציג תמונות של proteolysis ECM (ירוק) בתרבות תלת-ממד של תאים בודדים של מד א-MB-231 שליטה, לעומת ה-ECM proteolysis של תרבות משותפת תלת-ממד של מד א-MB-231 עם U937 ומונוציטים. סולם העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. IOD (צפיפות אופטית משולבת) של שדות2 6 50 מיקרומטר כל תנאי נמדדה. הממוצע ושגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM) מ quantifications מוצגים; שתי כוכביות מייצגים הבדל משמעותי סטטיסטית עם p < 0.01 (מבחן מאן-ויטני). (ד) האינטראקציה הישירה של מד א-MB-231 תאים (אפור בגוון המוני) עם U937 מוכתמים fluorescently ומונוציטים (כתום); קרינה פלואורסצנטית ירוק מקביל proteolysis. פרוסות טורי נוצרו כל 10 מיקרומטר מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית לכתובת לוקליזציה של אינטראקציות ישיר בין שתי שורות תאים. הגדלה אופטית של 200 X; סולם העמודות מייצגות 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: IL-1β ריכוז גדל בתרבויות שיתוף 3D. תוצאה נציג אחד של IL-1β רמות (pg/mL) supernatants מתאי שמונה (PC1-8) ראשי BrC, תרבותי בנפרד ב- 3D (תלת ממדי), והשוו שלהם תרבויות המשנה 3D עם PM (CC). פקד PM בתרבות 3D בודדים נכללה להשוואה (PM). התוצאות היו מופק ניתוח multiplexing גדול יותר, איפה ציטוקינים מספר במקביל אותרו כל דגימה באמצעות טכניקה המבוססת על immunodetection זמין כמו ערכת מסחרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : גורמים המופרש מתאי BrC העיקרי זירוז התנגדות anoikis בתאים MCF-10A שאינו משתנה. תאים MCF-10A גדלו בתנאים 3D עם תקן תרבות המדיה (עמודה A וחלוניות העליון של D), שבה זה יכול להיות שנצפו acini להציג טיפוסי חלול לומן (מודגש עם ריבוע אדום עומק 25-75%); כאשר תאים MCF-10A היו מבוגר עם שתי supernatants שונות של שתי תרבויות BrC הראשי (בעמודות B ו- C), לומן אינם חלול אבל מלאה עם תאים שמשמעו התנגדות anoikis. באופן דומה, כאשר תאים MCF-10A היו תרבותי בתנאים 3D הוספת האנושי רקומביננטי IL-1β (20 ng/mL), אין לומן חלול ניתן להערכה על עומק 50% מיקרוסקופיה קונפוקלית חלקים acini (התחתון פאנלים של D). הקריקטורה ממש סגלגל מייצג את הסעיפים מיקרוסקופיה קונפוקלית שבוצעו בעומק 0, 25, 50, 75 ו- 100% של acini. תמונות להראות גרעינים צבעונית עם דאפי (כחול), E-קדהרין בירוק. הגדלה אופטית של 200 X, גודל העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : יכולת הנדידה של ומונוציטים. להחליפן בתמונות של הקיבולת הנדידה של U937, THP-1 ו- PM בתגובה GM-CSF, MCP-1 ו- RANTES. פקדים ללא כימוקין הינם כלולים (העמודה הראשונה משמאל לימין). המספרים מתחת הדימויים מציינים את מספר התאים נודדים כל תנאי; U937 ומונוציטים THP-1 היו מגיבים בעיקר GM-CSF ו- MCP-1, בעוד PM הראתה קיבולת גבוהה נודדות כשלעצמה, היו התאים היענות ביותר MCP-1. הגדלה אופטית של 100 X; סרגלי קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : אגרסיבי ותאי BrC העיקרי לפלוש בתגובה IL-8- א הפלישה מבחני עם שני כוחניות (MCF-7 ו- T47D), שני אגרסיבי ביותר (HS578T מד א-MB-231) BrC שורות תאים ותרבות אחד ראשי BrC בתגובה IL-8 משמש chemoattractant. העליון פאנלים מקבילים פקדים ללא כימוקין מציג פלישה אין, נמוך יותר מראות בתגובה IL-8, עם תאים BrC אגרסיבי ביותר ותאים BrC ראשוני הפולשים דרך הקרום של התרבות התא הקדמי. B. דוגמה של תאים לפלוש אשכולות; במקרים אלה, מדידה של הפלישה מתבצעת באמצעות תוכנית ניתוח התמונה כדי לקבוע הפלישה במונחים של IOD (צפיפות אופטית משולבת) לכל אזור. המספרים מתחת התמונות מייצגים את מספר התאים הפולשים בכל מצב. הגדלה אופטית של 100 X; סולם העמודות מייצגות 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תאים אפיתל לגדול קונפורמציה מרחבית תלת-ממד, האינטראקציה שלהם עם החלבונים ECM מכריע בשביל לרקמות הומאוסטזיס. מחקרים סרטן רבים התבססו על התאים גדלו ב monolayers (2D), למרות שהם כבר קריטי להבנת היבטים רבים של היווצרות הגידול והתקדמות, monolayers לא מסכם את הדברים המאפיינים שמטילה על תאים, ECM עבור מופע: הגבלת ההפצה, אדהזיה תלויית התא הישרדות, הפסגה-basolateral קוטביות, ECM שיפוץ, תאית התמיינות, וכו ' חשוב, לא רק האינטראקציה בין תאים סרטניים ECM חיוניים ההתקדמות של סרטן, אך הקים התקשורת בין גידול תאים שאינם סרטניים, כגון תאים חיסוניים. הפרוטוקולים שסופק כאן להקל על ההבנה של אינטראקציות בין תאים חיסוניים תאים סרטניים בתוך הסביבה שסופקו על-ידי ECM, התגובה דלקתית קידום על ידי אינטראקציות אלה, וכיצד ליצור מצב דלקתי זה לולאה חיובי וטיפוח chemoattraction של monocytes ופלישה יותר של תאים סרטניים.

יתרון גדול של שימוש ECME הוא שהיא מספקת לפיגום הביולוגי מתאים לביצוע מגוון רחב של נסיוני תלת-ממד מודלים22. מועשר ECM חלבונים כגון laminin קולגן הרביעי, entactin, הפאראן גופרתי פרוטאוגליקן, גורמי גדילה, אשר אין ויוו להיות אינטראקציה עם תאים אפיתל. החיסרון הוא כי זה בא lysates של מאתר סרקומות, הריכוז של הרכיבים שלהם משתנה בין מגרשים שונים. אז, יש לעיתים קרובות צורך לאפיין כמה מגרשים כדי לקבל נתונים הומוגנית. במעבדה, נבדק כל לוט חדש בשתי דרכים: 1) על-ידי הערכת היווצרות acini הנכון של תאים MCF-10A, ו- 2) על-ידי הערכת את invasiveness של BrC תא קווים של קיבולת פולשנית ומבוססת. אפשרות נוספת היא לעבוד עם מוצרים אחרים, פיגומים, כגון הידרוג, אשר לפיגום פפטידים סינתטיים nanofiber. הנוקשות של התרבות 3D יכול להיות נשלט על ידי התאמת את הריכוז של הידרוג23,24. חשוב, מערכת זו היתה אפשרות להחיל את האינטראקציה בין כל סוג של תא אמצעים hematopoietic או תאים שאינם hematopoietic. יתכן גם ניתן לתכנן מערכות מורכבות יותר באמצעות יותר משני שושלות תאים שונים. אחד היתרונות החשובים דגמי תלת-ממד הוא כי הם יאפשרו מחקר של מורפולוגיה תאים, תא ארגון מעוצבת על ידי אינטראקציות ECM, אשר שונו במהלך טרנספורמציה oncogenic. כמו כן, אחד יכולים ללמוד oncogenic תכונות כגון הפרוטאוליטי השפלה, והאם תאים בתחילה מניחים בשכבות שונות של האות תרבות זו לזו כדי לקדם אינטראקציה ותקשורת ישירה. יתר על כן, ניתן לסמן שושלות תאים שונים עם fluorochromes אחר כך הם יכולים להיות מבודדים לאחר הניסוי שאלות ספציפיות על כל סוג תא בודד, שימוש, לדוגמה RNA ו/או חלבון ביטוי ניתוח13. כאן, IL-1β הפרשת למדיום תרבויות שיתוף תאים/PM BrC הראשי מוצג, תמיכה תפקיד מרכזי אפשרי של ציטוקין בתקשורת עקיף בין תאים סרטניים ומונוציטים שמפעיל התקדמות ממאיר.

נסיוני חיוני אחר במעבדה הוא הניתוח של היווצרות acini בתרבויות תלת-ממד של תאים MCF-10A שאינו משתנה. Assay הזה שימש כדי לבדוק את פעילות אונקוגן ויראלי וסלולריות, כדי לבדוק כיצד microenvironment הגידול משפיע על תכונה הקשורה סרטן אגרסיבי. למשל, במהלך להתפתחות תקינה של acini, luminal תאים המרכזית לאבד קשר עם החלבונים קרום הבסיס (שסופק על-ידי ECME) מפעילה מנגנונים של מוות של תאים, המכונה anoikis. זה היה ציין כי הן supernatants ראשי BrC תאים או רקומביננטי IL-1β לקדם את עמידות תאי MCF-10A anoikis. בגלל ריכוז גבוה של IL-1β הוא קידם בעת אינטראקציה עם תא-מונוציט BrC, התבוננות זו תומכת כי stroma הגידול הוא מרכיב אינטגרלי של התקדמות הגידול בשלבים אגרסיבי ביותר.

הפרוטוקולים העברה והפלישה המתוארים כאן מהווים שימושי מבחני משלימים 3D שבו אנו יכולים לתמוך את היכולת של תאים כדי להעביר או לפלוש בתגובה לגירויים שמקורם stroma הגידול. זה הוצג נוגדנים (MCP-1 ו- GM-CSF) נמצאו ריכוזים גבוהים בתרבויות תלת-ממד של תאים BrC הראשי יכול לקדם את ההעברה של U937, THP-1, ו- PMs, התומכות את היכולת של תאי הגידול אגרסיבי כדי לקדם microenvironment פרו דלקתיים. יתר על כן, IL-8 זה נמצא גם ריכוז מוגבר ב- supernatants מתרבויות שיתוף של תאים BrC/ומונוציטים, קידם הפלישה מוגברת של תאים מסחרי BrC אגרסיבי (HS578T ומד א-MB-231) והן תאים BrC העיקרי.

בנוגע למצב של תאים, חשוב לעבוד עם תאים BrC הראשי לפני שהם מגיעים עשרה קטעים לנצל את שיא ההתפשטות שלהם ולהימנע פוטנציאליים שלאחר בידוד גנטי epigenetic שינויים הנובעים במבחנה תרבות. עוד היבט מהותי בעת עבודה עם ראשי תאים הוא לאשר את הזהות שלהם לאחר בידוד. השתמשנו פאנל של סמנים ביולוגיים כדי לקבוע את זהותם השושלת אפיתל, הכולל PanCK, Muc-1, EpCAM (שצוין בשלב 2.5). באופן דומה, עדיף להשתמש PMs טריים, אשר נבדק כל אצווה שמבטיח כי הם בשלב זהה של בידול. כל אצווה חדשה בשימוש הציג את פנוטיפ CD34neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68מינוס CD16שלילי, המתאים שלא הופעל ומונוציטים לא בוגרת. חשוב, אנחנו לא מערבבים ומונוציטים מתורמים שונים, כמו לערבב התוצאה מונוציט הפעלה. במקום זאת, בדקנו באופן עצמאי BrC משותפת תרבויות באמצעות ומונוציטים מתורמים שונים לפחות שני.

מערכות התרבות 3D עדיין יש מגבלה יכולה להיות מעוצבת בצורה אמינה רק כמה אלמנטים של הגידול הביולוגיה. אלטרנטיבה חדשה זו דגמי תלת-ממד מורכבים יותר של organoids, אשר מבוססים על הרחבה, התמיינות של תאי גזע במבחנה. Organoids גם לפתח מאורגן מאוד מבנים אפיתל. דוגמאות כוללות את הקיבה 25,26, הכבד 27ו כליות organoids28. לעומת זאת, נותרים תא צורב מודלים עבור כל איבר אנושי להיות מושגת; יתר על כן, הם דורשים תנאי הניסוי מורכבים ויקרים הרבה יותר.

לסיכום, כאן נתאר בפירוט את זרימת עבודה של מבחני: החל מבידוד של תאים סרטניים מחולים BrC, בדיקת יכולת דלקתיות שלהם במודל המבוסס על ECME תרבות תלת-ממד, בדיקות איך הזה microenvironment דלקתיות משמשת אותם לגייס דלקתיות תאים נוספים, כגון ומונוציטים, סוף סוף לניתוח התקשורת בין שני סוגים של תאים ומפתח איך תקשורת נוסף של microenvironment דלקתיות המקדם סדר שלבי סרטן אגרסיבי יותר. בנוסף, אנו מתארים מורפולוגיה של פנוטיפ של תאים BrC העיקרי. בעתיד מחקרים, יהיה מעניין לבדוק תאים דלקתיים אחרים או אפילו לבדוק את התקשורת בין התאים BrC בתאים מרובים לעיתים קרובות שנמצאו stroma הגידול. תרבויות 3D מרובה תאים אלה תספק תמונה גדולה יותר מה קורה מבחינה ביולוגית ויוו במהלך התקדמות סרטן. השוואות בין נתונים במבחנה ואת התוצאה הקלינית החולה יהיה לזהות מנגנונים פוטנציאל השפעה גבוהה יותר על סרטן תוקפנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם כל ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי CONACyT FONSEC הסוכן המיוחד/איאמאסאס/ISSSTE פרויקט מס 233061 כדי Ezequiel מ פואנטס-Pananá ועל ידי Fondo Apoyo דה לה Investigación, בית החולים הקניות de México פדריקו גומז (פרויקט מספר לו-2014-053). נה אספינוזה-Sánchez הוא דוקטורנט מן פרוגרמה de Doctorado en Biomédicas עצמה, למד נאסיונאל Autónoma de México (UNAM) ואחווה שהתקבלו 231663 מ- CONACYT. נה E-S, גם להכיר את התמיכה הכספית שסופקו על-ידי המכון המקסיקני של ביטוח לאומי (איאמאסאס).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95, (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8, (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18, (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3, (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2, (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11, (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65, (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16, (1), 118-126 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics