Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chen, J., Shao, N., Hu, J., Li, R., Zhu, Y., Zhang, D., Guo, S., Hui, J., Liu, P., Yang, L., Tao, S. C. Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array. J. Vis. Exp. (129), e56597, doi:10.3791/56597 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Çoklu hedef, kısa süre ve kaynak uygun yöntemlerden birden çok nükleik asitler tek bir test kolay tespiti için acilen ihtiyaç vardır hastalık tanı, mikrobiyal izleme, genetiği değiştirilmiş organizma (GDO) algılama, ve adli analiz. Sakin (Capillary Array tabanlı Loop-aracılı izotermal amplifikasyon Multiplex nükleik asitler görsel algılanması için) olarak adlandırılan platformu daha önce anlatmıştık. Burada, geliştirilmiş imalat ve bu platform için performans işlemleri açıklanmaktadır. Burada, Nükleik asitlerin multiplex görsel algılama için kılcal dizi tarafından monte küçük, kullanıma hazır bir kaset geçerli. Kılcal damar kılcal damarlar içinde izotermal amplifikasyon (lamba) döngü-aracılı astar setleri sabitleme önce bir hidrofobik ve hidrofilik kalıp içine önceden tedavi dizidir. Sonra derleme yükleme bağdaştırıcısının lamba tepki karışımı yüklü ve tek bir pipetting adım kapiller zorla nedeniyle her kılcal damar içine izole. LAMBA reaksiyonlar kılcal paralel gerçekleştirilir. Sonuçları görsel olarak el UV el feneri ile aydınlatma tarafından okunur. Bu platformu kullanarak, sık sık yüksek özgüllük ve duyarlılık ile öğeleri ve GDO örnekleri genlerinde görünmüyor 8 izleme göstermektedir. Özetle, burada açıklanan platformu birden çok nükleik asitler algılama kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Biz alanlarında yüksek üretilen iş nükleik asit analizi gerekli olduğu yerde geçerli olacağına inanıyoruz.

Introduction

Aynı anda birden fazla nükleik asitler tespiti için düşük maliyetli, hızlı ve kullanımı kolay sistemleri Klinik teşhis1,2,3, GDO algılama4gibi alanlarda geniş bir alanda acilen ihtiyaç vardır, 5,6,7,8,9, analiziniz10,11ve özellikle nokta-in-bakım testleri (POCTs), nerede izleme mikrobiyal kaynaklar genellikle sınırlı12,13,14vardır.

Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), gerçek zamanlı PCR ve çoklu PCR, türev yöntemleri de dahil olmak üzere bu alanlardaki algılama için en yaygın olarak uygulanan bir tekniktir. Ancak, bu yöntemler genellikle sadece bir hedef bir test15 dakika içinde algılamak ve elektrik ve sofistike profesyonel ekipman gerektirir.

Nükleik asitler algılamak için başka bir gelecek vaat eden ilk tarif eden 200016izotermal amplifikasyon (lamba), döngü-aracılı teknolojisidir. LAMBA yüksek verim DNA algılama yöntemi vardır. Teorik olarak, tek bir sabit sıcaklık, (Yani, 60-65 ° C arasında) gerçekleştirilen bir saat içerisinde amplicons 109 kopya 1 kopya yükseltmek. Başarılı amplifikasyon çözünmez yan ürünü pirofosfat büyük miktarda üretmek ve bulanıklık17doğrudan çıplak gözle tarafından gözlenen, bir değişiklik neden. Renk değişikliği, metal iyonları veya floresan boyalar Calcein18, nükleik asit boya19ve hidroksil naftol mavi20gibi eklenmesi tarafından da görülebilir. Yüksek hassasiyet avantajları ve işlem kolaylığı nedeniyle, lamba nükleik asit algılama içinde yaygın olarak uygulanmaktadır.

Şu anda, başlıca iki stratejiler multiplex lamba deneyleri için vardır. Biri birden çok lamba alarak birden fazla lamba deneyleri gerçekleştirmeye astar ayarlar içinde bir tüp21,22,23. Ancak, çokluğu ve amplifikasyon verimliliği iç parazit ve farklı astar kümeleri arasında rekabet tarafından sınırlı. Ayrıca, farklı lamba ürünleri aynı tepki olarak tanımlamak zor olabilir. Başka bir strateji üzerinde fiziksel yalıtım dayanmaktadır. Farklı astar kümeleri bireysel küçültülmüş bölmeleri izole ve birden çok lamba reaksiyonlar sonra aynı anda gerçekleştirilen24,25. Genellikle mikrosıvısal çip üzerinde temel alır, bu yaklaşımların yüksek üretilen iş lamba reaksiyonlar için olası bir çözüm sunar. Ancak, cips üretimi ve multiplex öncesi kaplama astar kümeleri karmaşıktır maliyetleri artırmak ve tekrarlanabilirlik azaltmak.

Son zamanlarda, bazı çalışmalar mikrosıvısal çip karmaşık imalatı bypass ve düşük maliyetli algılama26,27elde ettik kılcal performanslı lamba tepkileri anlatmıştık. Örnekleri ve reaksiyon Kimyasalları (farklı astar kümeleri dahil olmak üzere) olmalı ayrı ayrı hazırlanan ve farklı teslim çünkü ancak, yüksek üretilen iş analizi açısından, bu kılcal PCR şerit tüpler, minyatür sürümleri için benzer reaksiyon biriminde bulunan kılcal damarlar. Paralel ve çok katmanlı analiz elde etmek için örnekleri ya da reaktifler paralel yükleme için ek donanımları, örneğin bir çok kanallı şırınga pompa, gereklidir.

Nükleik asitler multiplex algılanması için geçerli yöntemleri ile ilişkili sınırlamalarını aşmak için kılcal bir dizi görsel lamba teknoloji birleştiren bir minyatür platformu geliştirdi. Bu platform çoklu hedef, kompakt, düşük maliyetli ve kolay28çalışmasına boyutu. Burada, kapiller dizi imal ve lamba reaksiyonlar dizideki gerçekleştirmek nasıl ayrıntıları açıklamak. Burada açıklanan protokol genetiği değiştirilmiş organizma (GDO) algılama bir model olarak kullanarak standart. Önemlisi, bu iletişim kuralı diğer nükleik asit hedefler yüksek üretilen iş tespiti de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Bu protokol istenen mikro kanallar ve yükleme adaptörü için şekil taşıyan paslanmaz çelik kalıp önceden yaptığınızı varsayar (3D dosyaları ek dosyalar 1 sağlanan ve 2. ). Bu iletişim kuralı da bitki DNA izolasyon zaten yapılmıştır varsayar.

1. kılcal dizi tabanlı kullanıma hazır kaset imalatı

  1. paslanmaz çelik kalıp temizlik.
    1. Potansiyel kirletici kaldırmak için paslanmaz çelik kalıp deterjan, etanol, deiyonize su ile yıkama. Kalıp tarafından azot kuru.
  2. Kılcal temiz
    1. aşınma emniyet gözlük, laboratuvar düzgün ve kimyasal koruyucu eldivenler.
    2. Yer kılcal içine bir ölçek. Organik madde kaldırmak 5 min için 30 mL aseton ile kılcal temiz ve kılcal deiyonize su ile yıkama.
      Dikkat: Başa bir duman başlıklı aseton.
    3. H 2 O 2 10 mL kabı dökün ve 4 H 2 O 2 ile içine yavaş böylece aşırı ısınmayı önlemek için sallayarak H 2 30 mL ekleyin. (Piranha çözüm) tamamen kılcal en az 30 dakika süreyle kapsadığından emin olun
      Dikkat: piranha çözüm taşıma sırasında dikkatli olun (H 2 SO 4/h 2 O 2 = 3: 1, v/v) . Piranha çözüm dökülen, çok miktarda su ile hızlı bir şekilde çözüm silsin ve yüzey kağıt havlu ile silin.
      Not: Kılcal temizlik, lamba reaksiyon da başarıya ulaşmak için önemli noktalar biridir. Bu baloncuklar içinde kılcal damarlar kaldırmak için temizleme işlemi sırasında asit silindir sallamak gereklidir ve temiz zaman da gerektiğinde uzatılabilir.
    4. Su büyük miktarda piranha Çözümle silsin. Kılcal etanol ve 5 min için deiyonize su ile yıkayın. Kılcal bir kurutma fırında kuru.
  3. Polydimethylsiloxane (PDMS) dökün
    1. ağırlık PDMS temel ve kür reaktifler oranı 1:1 bir 50 mL tüp ile dışarı. Genellikle, elastomer Ajan kür elastomer 5 g için temel 5 g karıştırın.
    2. İyice için yaklaşık 5 dakika cam çubuk ile karışımı ilave edin. Bir vakum Sırça fanus de-gaz için 30 dk için PDMS ile tüp yerleştirin.
    3. PDMS yavaş yavaş paslanmaz çelik kalıp silindir içine dökün. Kurutma fırın 60 ° c de 3 h için tedavi PDMS izin
      Not: Hava kabarcıkları PDMS dökme önlemek dikkatli olun. Dökme PDMS sonra 5 dk'ya doğal baloncuklar PDMS dışarı için stand izin.
  4. PDMS kalıptan çıkarmak
    1. PDMS kür sonra kalıp kalıp silindir dışarı çekerek çıkarın. Kalıp bir neşter ile kenar kesim tarafından silindir PDMS kaldırmak.
    2. Üç kez etanol ve deiyonize su ile yıkama PDMS
    3. . Kuru PDMS azot ile destek.
  5. Hidrofobik olmak PDMS destek alt yüzeyinin tedavi. PDMS destek bir süper hidrofobik emmek kat 1 s. kuru için bu oda sıcaklığında 10 dk için.
    1. Kılcal PDMS destek içine eklemek temizlenmiş 4 mm kılcal PDMS destek deliklere yerleştirin ve 0,5 mm kapiller PDMS destek üst yüzeyi dışında bırakın. Kılcal uçları aynı düzeyde olduğundan emin olun.
  6. Kılcal dış yüzeyi ve hidrofobik olmak PDMS desteğinin üst yüzeyi tedavisi.
    1. Ekleyin 15 µL süper hidrofobik kat PDMS üst yüzeyinin destek. Unutmayın kaplama (PDMS destek üst yüzeyi ve kılcal maruz parçası dış yüzeyleri de dahil olmak üzere) üst yüzeyi kapiller Kuvvetleri tarafından her yerinde hemen yayılır.
    2. Hava kuru süper hidrofobik değiştirilmiş kapiller dizi.
  7. Astar kapiller diziye tamir
    1. astar çözüm hazırlamak. Ağırlık 0.65 g kitosan dışarı (moleküler formülü: (C 6 H 11 NO 4) n) ve pH 4.5-5.5 ile Asetik asit % 1.3 kitosan konsantrasyon ulaşmak için ayarlayarak 50 mL deiyonize su geçiyoruz. Astar bileşenleri karıştırmak Tablo 1 göre hazırlayın. Bkz. Astar için ek tablo 1
    2. astar önceden tasarlanmış bir sıraya göre kılcal dizinin bir karşılık gelen kılcal doldurmak için bir dizi karışımı ekleyin 1.6 µL.
      Not: Negatif denetimler olarak kalan iki boş kılcal kuruldu.
    3. Standart düz dipli 96-şey plaka şeffaf bir kuyu dizide çapa ve en az 2 h. için 60 ° C'de dizi kuru
< td > 1.0/1.0
lamba astar sabitleme mix bileşenler (başlangıç konsantrasyonu) birim (μL)
GKD 2 O 17,0
Chitosan (% 1.3) 1.0
FIP/BIP astar (20 mikron) 2.0/2.0
LoopF/LoopB astar (20 mikron)
F3/B3 astar (20 mikron) 0.5/0,5
Toplam hacim 25.0

Tablo 1: lamba bileşenleri reaktifler sabitleme astar. Mix sabitleme lamba astar bileşenleri tablonun sol sütununda listelenir ve her bileşen hacmi sağ sütunda listelenir.

  1. araya kaset aşağıdaki gibi. Bir yükleme adaptörü bağlantılı dizi koydu. Adaptör çanak sadece tüm on kılcal damarlar (bkz: şekil 1) maruz kalan bölümlerini kapsar emin olun.

Figure 1
Resim 1: kaset imalat ve montaj. (bir) paslanmaz kalıp ve PDMS destekler. Kalıp 3 bölümden oluşur: silindir, Barajı kurulu ve ayağı plaka. (b) PDMS şematik destek imalat ve montaj kapiller kaset. Tüm süreç 5 adım içerir: 1. dökme, PDMS 2. kalıp kaldırma, 3. kılcal ekleme ve yüzey kaplama, 4. Astar sabitleme ve 5. Kaset demirleme. 1. PDMS kalıp silindir içine dökün; 2. kalıp PDMS kaldırmak için itme Barajı kurulu dışarı destek; 3. kat PDMS aşağı yüzeyine desteklemek ve kılcal PDMS yerleştirin destek, son olarak PDMS destek üst yüzey kat ve kılcal maruz. Kalın mavi çizgi süper hidrofobik kat gösterir; 4. Astar bireysel kılcal ayarla yük; 5. tek bir 96-şey plaka kapiller dizide çapa ve adaptör üzerine yükleme bir örnek yükleyin. Ayrıntıları protokol adımları 1.1-1.9 anlatmıştık. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. lamba performans reaksiyon kapiller dizideki

  1. hazırla tepki mix
    1. başı olarak T mümkün 2 lamba tepki karışımı hazırlayın.
    2. Calcein ekledikten sonra
    3. Ekle reaktifler karışıma seçtiğiniz sıraya göre Tablo 2 ve girdap tepki karışımı olduğu gibi 5 s. Yavaşça inçDikey 20 kere sonra Bst polimeraz tüp eklenir.
lamba bileşenleri (ilk konsantrasyon) birim (μL)
GKD 2 O 11,6
MgSO 4 (100 mM) 2.0
dNTPs (25 mM) 1.4 < /t d >
Betaine (5 M) 4.0
tampon (10 x) 2.5
Calcein (1,25 mM) 0.5
MnCl 2 (25 mM) 0.5
Bst < /Em > polimeraz (8 U/μL) 1.5
DNA bitki (10 ng/μL) 1.0
Toplam hacim 25.0

Tablo 2: Tepki sistemi kapiller dizi lamba. Kılcal dizi lamba bileşenlerinin tepki sisteminin bileşenleri sol sütununda listelenir ve her bileşen hacmi sağ sütunda listelenir.

  1. reaktifleri yük ve kaset mühür
    1. pipet 20 µL lamba tepki karışımı ile standart 100 µL ipucu. İpucu kilitlemek için yükleme adaptör girişi yerleştirin. Yavaşça tepki karışımı adaptör çanak içine enjekte; reaksiyon karışımı hızlı bir şekilde çanak doldurmak ve kılcal kapiller Kuvvetleri aracılığıyla otomatik olarak yüklemek.
    2. Kilitli ucu adaptörü çıkarın ve iyi tarafından bir PCR uyumlu şeffaf mühürleme film mühür.
      Not: yalnızca kılcal reaksiyon karışımı hidrofilik tabak içinde dokunmadan dolu olabilir. Bu yüzden tüm kılcal üst kısmı aynı yüksekliği (bkz: Şekil 2) olduğundan emin olun.

Figure 2
Şekil 2: örnek yükleme yükleme adaptörü kullanarak diyagram. Resim mavi çözüm örnek olarak istihdam yükleme işlemi gösterir. İpucu giriş yerleştirin ve örnek adaptör yavaş yavaş enjekte ve adaptörü ile kilitli ipucu kaldır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Incubate bir kuluçka 63 ° c için 1 h. kapiller dizide

3. sonuçları okuma ve veri analizi

  1. elde Floresans emisyon görüntülerini.
    1. Görünür ışığın filtre uygulamak için bir küçük el UV LED el feneri üst yüzeyinde bir UV filtre düzeltmek.
    2. UV el feneri ile floresan yayılmasını sağlamak için Disosiye calcein heyecanlandırıyor. Esir alma imge kapiller dizi tepesinden bir dijital fotoğraf makinesi ya da bir akıllı telefon.
    3. Bir resim çekerken kamerayı kılcal yüksek kaliteli olsun, görüntülerini temizlemek mümkün olduğu kadar alan üzerinde yakınlaştırılmış sağlamak.
  2. Sonuçları analiz
    1. tarafından görüntü analiz yazılımı açın ve sonra seçin " görüntü > kalıp > gri tonlama > Evet " ve " görüntü > kalıp > 16 bit > Evet ". Seçin " dosyayı > olarak kaydedin > biçimi > TIFF " görüntünün 16 bit TIFF biçimine dönüştürmek için.
    2. Mikroarray analiz yazılımı floresan yoğunluğu
      1. Aç değerini çıkarın. 16-bit TIFF biçimi görüntü yazılımı arayüzü içine sürükleyin ve dalga boyu seçin " 532 nm " ve bir rengi " yeşil " resmi görüntülemek için.
      2. Kılcal Floresans sinyalini bulmak için Oluştur yeni bir blok. Seçin " araçlar > yeni blok " ve olarak satır ve sütun numarasını girin " 1; 1 " ve " 2; 5 " içinde ' blok ' ve ' özellikleri ' ayrı ayrı arabirimleri.
      3. Sağ tıklatın ve seçin " özellikleri " model ve kapiller Floresans alanına sığacak şekilde çapı ve konumunu ayarlayın. Seçin " analiz " floresan yoğunluğu değeri ayıklamak için.
      4. Select " dosya > ayarları farklı kaydet " blok belgeleri kaydedin ve seçmek için " dosya > olarak sağlamaları " floresan yoğunluğu sağlamaları için. LAMBA başarıyla kılcal damarlar içinde gerçekleştirilen tanımlamak için SNR hesaplamak.
        Not: Sinyalleri kapiller noktalar ve sinyal-gürültü oranı (SNRs) gri değerler ön sinyal ön plan sinyalleri iki negatif ortalama ortalama değerlerine hedeflerinden ortalama değerlerden oranları olarak tanımlanan kayıt tarafından elde edildi denetimleri. Olumlu sinyaller belirlemek için kesim SNR kuruldu > 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntemde, Çapraz bulaşma farklı kılcal damarlar arasında örnek yükleme sırasında önlemek önemlidir. Bu amaçla, hangi bireysel kılcal astar korumak kitosan tanıtıldı. O ya da değil amele olup olmadığını sınamak için "T" ve "U", deseni ile kılcal kaset set ADH1 (Mısır endojen referans gen) astar gösterildiği gibi önceden tamir ettik şekil 3a. Beklendiği gibi yalnızca bulunan kılcal astar gösteren olumlu sinyaller (şekil 3b) ayarlar.

Figure 3
Şekil 3: örnek olarak kapiller sonuç. (bir) kapiller dizi düzeni. Yeşil noktalar ADH-1 astar kümeleri kılcal damarlar içinde önceden giderilen gösterir. (b) floresan lamba sonra iki kapiller dizi fotoğrafları. Yeşil renk olumlu lamba amplifikasyon sundu. Test içinde yinelenen gerçekleştirildi. Başarılı amplifikasyon sadece astar-sabit kılcal damarlar ve boş kılcal damarlar arasında kirlenme olmadan sundu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

~ %75-in ticari GDO olayları kapsayan yedi sık kullanılan transgenik öğeleri seçtik daha fazla GDO izleme olanağı değerlendirmek için (Yani, P-CaMV35S, çubuk, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos ve nptII) (4 rakam, düzen) hangi kılcal numarası 1-7 ve Mısır (ADH1) için bir endojen referans gen karşılık gelir. Bu yöntem, üç GM etkinlikler özgüllük göstermek için (MON863, MON89034 ve 59122) seçilir ve sakin için uygulanır. Sonuçları analiz etmek, Floresans görüntüleri kamera tarafından çekilen ve protokol adımlarda açıklandığı gibi analiz. Beklenen sonuçları tüm testleri (şekil 4) için elde edilmiştir. Örneğin, GM Mısır MON863 için olumlu sinyaller kılcal damarlar için 1, 6, 7 ve 8, P-CaMV35S hedefe karşılık, elde edilmiştir T-nos, nptII ve endojen referans gen ADH1, anılan sıraya göre.

Figure 4
Şekil 4: GDO izleme özgüllüğü. Yani, farklı DNA örnekleri tespiti MON863, MON89034, 59122, mix yukarıdaki üç GM Etkinlikler (GDO mix), Sigara-GM Mısır ve saf su (Hayır şablon kontrol, NTC). 1 - 8: P-CaMV35S bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII ve ADH-1, lamba setleri astar ile ayrı ayrı önceden sabit kılcal damarlar. 9 - 10, iki no-astar denetim. Test içinde yinelenen gerçekleştirilmiş ve biz tüm sonuçları beklentilerle tutarlı bulundu. Ek tablo 2 veri analizi için bkz: Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bir gerçek dünya uygulama bizim yöntem performansını test etmek için iki pratik Mısır örnek sakin tarafından analiz için seçildi. O zaman sonuçları bu gerçek zamanlı PCR ve sonuçları ile karşılaştırıldı tutarlı (şekil 5, ek tablo 2)

Figure 5
Şekil 5: iki Mısır örnek test sonuçlarını. 1 - 8: P-CaMV35S bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, ve ADH-1, lamba astar kümesiyle önceden ayrı ayrı sabit kılcal damarlar. 9 - 10, iki no-astar denetim. Test içinde yinelenen gerçekleştirilmiş ve sonuçları bu gerçek zamanlı PCR ile karşılaştırıldı ve sonuçları tutarlı edildi. Ek tablo 3 için karşılaştırma sonuçları görmek. Veri analizi için bkz ek tablo 2 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 1: lamba liste astar dizileri. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 2: veri analizi lamba dizi deneyler. Yeşil renk kodlu hücreler tablo olumlu sonuç gösterir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 3: gerçek zamanlı PCR raporlama formu sonuç. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, sakin platformu gösterdi hangi lamba teknolojisi ile kılcal bir dizi birleştiren, aynı anda birden çok gen GDO ile ilgili hedef tek bir son derece etkili ve kolay test çalışmasına tespiti sağlar.

Multiplex lamba reaksiyonlar kasete başarıyla uygulamak için üç kritik noktaları fark gerekir. İlk olarak, kılcal üst tarafında ve kapiller dizi hidrofilik ve hidrofobik desen için aynı yükseklikte ulaşmak reaktifler tüm kılcal aynı anda yüklemek için kritik. İlk hepsi emin olmak için PDMS desteğine ekleme yükleme adaptörü tabak yüklü tepki karışımı dokunduktan sonra kılcal bir tabak tarafından uyumlaştırılması gerekmektedir. Ne zaman kılcal dizi süper hidrofobik ceket ile tedavi, kılcal damar iç yüzeyine emmek kat izin vermez. Kılcal dış yüzeyinin sadece kat PDMS desteği, kılcal üst kısımları dış yüzeylere yaymak kaplama sağlayan üst üst yüzeyinde yükleyerek tedavi. Eğer zaman zaman tüm kılcal reaktifleri ile dolu olursa, reaktif doğrudan belirli bir kılcal damar yüklemek ihtiyatlı olabilir.

İkinci olarak, lamba reaktifler hazırlanması ile dikkatli olun. Tüm süreç yavaşça ve hızlı bir şekilde LAMP nispeten düşük reaksiyon sıcaklığını ve Bst polimeraz kırılganlık nedeniyle buz üzerinde yapılmalıdır. Bst polimeraz ekledikten sonra şiddetle tepki tüp lamba karışımı yavaşça yerine vortexing tüp ile sarsmaya tavsiye edilir. Uygunsuz bir işleme tepki neden olabilir. Bu deneyde, ADH1 (Mısır endojen referans gen) pozitif kontrol olarak ayarlanır ve astar olmadan iki kılcal boş denetimler olarak ayarlanır. Yani, lamba karışımı ele doğru olumlu denetim yeşil gösterir ve test gerçekleştirildikten sonra boş denetim değişmeden kalır.

Üçüncü olarak, DNA amplicon ortamında bir eser miktarda ise lamba tepki yüksek verimlilik nedeniyle, yanlış pozitif değerler ya da ertelenmiş bulaşma gerçekleşebilir. Bu nedenle, her zaman öncesi reaksiyon ve sonrası tepki çalışma süreçleri kesinlikle farklı alanlarda ayrılması gerektiğini ve lamba ürünleri olmalı sıkıca mühürlenmiş ve Analizden sonra atılan unutmayın ki. Ayrıca, boş bir kontrol lambası yeterli bir performans gösteren için ayarlamanız gerekir.

Özünde, sakin bir evrensel çoklu hedef nükleik asit algılama iyi esneklik ve genişletilebilirlik ile yöntemidir. Kılcal damarlar içinde gerçekleştirilen lamba reaksiyonlar kolayca diğer tip daire amplifikasyon (RCA)29ve recombinase polimeraz amplifikasyon (RPA)30haddeleme gibi izotermal güçlendirme metodu tarafından yedek olabilir. Patojen algılama27 ve hastalık tanı31gibi diğer algılama alanlara da uygulanabilir.

Astar ayarlar önceden chitosan ile giderilen rağmen zaman test yöntemi sadelik düşüren yapılır bu yöntem geçerli formda lamba karışım hazırlama süreci hala gereklidir. Bu sorunu çözmek için tüm reaktifler kılcal LAMBADA önceden yüklemek ve sonra örnek kaset pipette çalışacaktı. Bizim yöntemi için başka sınırlama nükleik asit ayıklama eksikliği olabilir, ama biz şimdi nükleik asitler, otomatik resim alarak ve gerçek bir "örnek-in ve sonuçları-out elde etmek için verileri analiz çıkarımı birleştiren bir mobile tabanlı makine geliştiriyoruz "yöntemi.

Özetle, sakin platformu multiplex lamba ile kılcal bir dizi entegre ederek geliştirdik. Genel nükleik asit algılama yöntemi olarak sakin de diğer nükleik asit çözümleme uygulamaları geniş bir potansiyel olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu çalışmada kısmen Ulusal doğal Bilim Vakfı, Çin hibe (31370813, 3147670, 31670831 ve 31600672,), ulusal transjenik bitki özel Fonu (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), Program tarafından yeni yüzyıl mükemmel yeteneklerini için finanse edildi Üniversitesi, ulusal anahtar araştırma ve geliştirme projesi (2016YFA0500601) Çin ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (2016M 591667).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat) UltraTech 4001 supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS Dow Corning 8332557
Bst polymerase New England BioLabs M0275L
betain Sigma-Aldrich B0300-1VL
calcein Sigma-Aldrich C0875-5G
MnCl2 Sigma-Aldrich MKBP0495V
MgSO4 New England BioLabs B1003S
dNTPs Shanghai Sangon B804BA0022
chitosan Shanghai Sangon LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software Adobe Systems Inc., CA, USA Image analysis
GenePix Pro 6.1 Molecular Devices, CA, USA microarray analysis software
AutoCAD Adobe Systems Inc. 3D construction software
UV filter (ZWB2) YXSensing supplier : taobao

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
  2. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  3. Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21, (4), 323-331 (2015).
  4. Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83, (5), 1579-1586 (2011).
  5. Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86, (2), 1269-1276 (2014).
  6. Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522, (2), 123-132 (2013).
  7. Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82, (3), 143-151 (2012).
  8. Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35, (1), 10-14 (2013).
  9. Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13, (2), 319-339 (2015).
  10. Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82, (16), 6991-6999 (2010).
  11. Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137, (23), 5510-5519 (2012).
  12. Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29, (5), 240-250 (2011).
  13. Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16, (8), 1062-1069 (2010).
  14. Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33, (5), 464-469 (2015).
  15. Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11, (21), 3609-3618 (2011).
  16. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (12), (2000).
  17. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289, (1), 150-154 (2001).
  18. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3, (5), 877-882 (2008).
  19. Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41, (6), 2616-2622 (2003).
  20. Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46, (3), 167-172 (2009).
  21. Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71, (3), 281-287 (2007).
  22. Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84, (8), 3758-3763 (2012).
  23. Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148, (2), 75-79 (2011).
  24. Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83, (3), 690-695 (2011).
  25. Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12, (8), 1454-1462 (2012).
  26. Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85, (9), 4698-4704 (2013).
  27. Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86, (14), 7057-7062 (2014).
  28. Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17, (3), 521-529 (2017).
  29. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. (1998).
  30. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4, (7), 1115-1121 (2006).
  31. Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21, (4), 323-331 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics