पता लगाने और संयोजक प्रोटोटाइप फोम वायरस Integrase के शोधन के दौरान Nuclease संदूषण को हटाने

Immunology and Infection

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Summary

संयोजक प्रोटोटाइप फोम वायरस integrase प्रोटीन अक्सर शुद्धि के दौरान एक जीवाणु nuclease के साथ दूषित है । यह विधि nuclease संदूषण की पहचान करती है और इसे एंजाइम की अंतिम तैयारी से निकालती है ।

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Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

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Abstract

integrase (में) retrovirus प्रोटोटाइप फोम वायरस (PFV) के प्रोटीन सिंड्रम एकीकरण के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल एंजाइम है । अन्य retroviruses से में की तुलना में, में PFV अधिक घुलनशील है और अधिक प्रयोगात्मक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी. इसके अतिरिक्त, यह नैदानिक प्रासंगिक मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी-1) में अवरोधकों के प्रति संवेदनशील है, सुझाव है कि में PFV के उत्प्रेरक तंत्र एचआईवी के समान है-1 में । catalyzes में वायरल पूरक डीएनए (सीडीएनए) के आबंध कार्यग्रहण को लक्ष्य एक प्रक्रिया में डीएनए कतरा स्थानांतरण कहा जाता है । इस किनारा हस्तांतरण प्रतिक्रिया लक्ष्य डीएनए को निक का परिचय । एकीकरण प्रतिक्रिया उत्पादों के विश्लेषण nucleases की उपस्थिति है कि इसी तरह निक डीएनए द्वारा पाया जा सकता है । एक जीवाणु nuclease में व्यक्त किया गया है सह करने के लिए संयोजक PFV के साथ शुद्ध ई कोलाई (ई. कोलाई) । यहां हम हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी द्वारा दूषित nuclease से PFV को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं । भागों आसानी से एक supercoiled प्लाज्मिड और agarose जेल ट्रो के साथ nuclease संदूषण के लिए जांच कर रहे हैं । PFV में और प्रदूषित nuclease हेपरिन sepharose के लिए वैकल्पिक समानताएं प्रदर्शित nuclease संयोजक की एक PFV मुक्त तैयारी के लिए उपयुक्त में थोक जैव रासायनिक या एकीकरण के एकल अणु विश्लेषण ।

Introduction

जैव रासायनिक और डीएनए के साथ प्रोटीन बातचीत के एकल अणु अध्ययन असाधारण शुद्ध संयोजक प्रोटीन की आवश्यकता है । बैक्टीरिया से दूषित nucleases इन परख के परिणाम अस्पष्ट कर सकते हैं । एक प्रदूषित nuclease की तैयारी में पाया गया है संयोजक प्रोटीन ऑक्सीजन मेहतर protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) और प्रोटोटाइप फोम वायरस (PFV) integrase (में) ई कोलाई (ई. कोलाई) से पृथक1 , 2 , 3.

सिंड्रम एकीकरण परख supercoiled डीएनए के रूपांतरण पर निक या रैखिक उत्पादों के लिए गतिविधि में4के एक उपाय के रूप में भरोसा करते हैं । में सेलुलर संक्रमण के दौरान एक वायरल सीडीएनए के दोनों सिरों को होस्ट क्रोमेटिन5में मिलती है । प्रत्येक अंत में शामिल होने की प्रतिक्रिया कतरा स्थानांतरण करार है । गतिविधि में संयोजक की परख दो डीएनए वायरल सीडीएनए नकल उतारने में शामिल हो सकते है oligomers एक ठोस एकीकरण प्रतिक्रिया में एक लक्ष्य डीएनए के लिए समाप्त होता है4,5,6,7,8। वैकल्पिक रूप से संयोजक एक गैर में केवल एक डीएनए अंत में शामिल हो सकते है शारीरिक रूप से प्रासंगिक आधा साइट एकीकरण प्रतिक्रिया9,10। जब supercoiled प्लाज्मिड डीएनए एकीकरण का लक्ष्य है, संगठित एकीकरण उत्पादों रैखिक डीएनए और आधा साइट एकीकरण उत्पादों रहे है आराम हलकों । ये प्रतिक्रिया उत्पादों agarose जेल ट्रो1के दौरान उनके रिश्तेदार गतिशीलता द्वारा की पहचान कर रहे हैं । यदि संयोजक में एक दूषित nuclease है, वहां नकली आराम हलकों या संभवतः एक रैखिक प्लाज्मिड प्रयोगात्मक परिणाम भ्रमित होगा । वायरल डीएनए oligomers फ्लोरोसेंट के लिए निर्णायक एकीकरण उत्पादों की पहचान करने के लिए, के रूप में nuclease उत्पादों का विरोध लेबल हो सकता है । हालांकि, में बहुत supercoiled डीएनए लक्ष्य एहसान; supercoiled प्लाज्मिड के किसी भी हानि nuclease दूषित द्वारा हलकों या रैखिक डीएनए आराम करने के लिए परिणाम और डेटा की व्याख्या विषम सकता है11। इस प्रकार तैयारियों में सिंड्रम से जीवाणु nucleases को दूर करना अनिवार्य है.

PFV में बैक्टीरियल nuclease1की तुलना में हेपरिन sepharose के लिए एक अलग समानता है । PFV में और nuclease हेपरिन sepharose से एक रैखिक ढाल रेफरेंस से अलग हो सकता है । nuclease २८० एनएम चोटी पर या विश्लेषणात्मक सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) द्वारा एक पराबैंगनी (यूवी) अवशोषक द्वारा आसानी से पता नहीं है । इसके बजाय, nuclease एक nuclease गतिविधि परख एक supercoiled प्लाज्मिड के रूपांतरण को रोजगार से पता चला है हलकों या रैखिक उत्पादों आराम । प्रत्येक अंश म् हेपरिन sepharose क्रोमैटोग्राफी nuclease गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाता है । PFV और nuclease contaminant में मोनो-क्यू आयनों राल के लिए अपनत्व में कोई अंतर नहीं है. मोनो एस कटियन राल के लिए संबध में एक छोटे से अंतर है. हालांकि, मोनो-एस में बैक्टीरियल nuclease और PFV के संकल्प प्रोटीन की कुशल जुदाई की अनुमति नहीं होगी । अंततः, हेपरिन sepharose संबध शुद्धि में PFV से बैक्टीरियल nuclease का सबसे अच्छा जुदाई प्रदान करता है और असीमित लोड मात्रा का लाभ है ।

nuclease गतिविधि को दूषित करने के लिए परीक्षण अंय प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । ब्याज की प्रोटीन की संभावना में PFV से वैकल्पिक संबंध विशेषताओं होगा; ब्याज और nuclease contaminant के प्रोटीन की बाध्यकारी विशेषताओं में अंतर empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । nuclease संदूषण की पहचान के लिए यह पद्धति मोनो-एस कटियन या मोनो-क्यू आयनों एक्सचेंज रेजिन सहित अन्य रेजिन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । समानता और आयन एक्सचेंज रेजिन क्रोमैटोग्राफी के दौरान प्रोटीन की मात्रा पर कोई सीमा के साथ nucleases दूषित से ब्याज की एक संयोजक प्रोटीन को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान कर सकते हैं ।

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Protocol

1. ई. कोलाई में अभिव्यक्ति में PFV प्रेरित

  1. अभिव्यक्ति में PFV की 1 μL जोड़ें प्लाज्मिड (10 एनजी/μL) के लिए 20 μL के ई. कोलाई BL21 (DE3) pLysS (20 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोशिकाओं के μL aliquot है > 2 x 106 CFU/μg प्लाज्मिड) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में । उंगली दोहन या ट्यूब फ़्लिक द्वारा धीरे से मिश्रण । 5 मिनट बर्फ पर मशीन ।
    1. एक ४२ ˚ सी पानी स्नान में बिल्कुल 30 एस के लिए हीट शॉक और फिर तुरंत बर्फ के लिए 2 मिनट के लिए वापस ।
    2. catabolite दमन (समाज) मीडिया के साथ कमरे के तापमान सुपर इष्टतम शोरबा के ८० μL जोड़ें । ३७ ˚ सी पर प्रति मिनट २२५ क्रांतियों (rpm) मिलाते के साथ 1 घंटे के लिए मशीन ।
    3. प्लेट 25 μL पर मिश्रण की १०० मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश युक्त Luria शोरबा (पौंड) की 25 मिलीलीटर (1 L LB आगर: 10 ग्राम bacto-tryptone, 10 ग्राम NaCl, 5 ग्राम खमीर निकालने, 15 ग्राम आगर) और १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन (१०० mg/
    4. एक दूसरी समान प्लेट पर रूपांतरित कोशिकाओं के बचे हुए ७५ μL को प्लेट में । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर नीचे ढक्कन के साथ प्लेटों की मशीन ।
  2. बदल ई. कोलाई की प्लेटों को पुनः प्राप्त करें । एक एकल कॉलोनी का प्रयोग करें लगाना पौंड के 3 मिलीलीटर (1 एल पौंड: bacto के 10 ग्राम-tryptone, NaCl के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 ग्राम) १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन के साथ एक 14 मिलीलीटर दौर में नीचे के पूरक संस्कृति ट्यूब । २२५ rpm मिलाते के साथ ३७ ˚ सी में ~ 8 एच के लिए मशीन ।
    1. एक २५० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी में ५० मिलीलीटर पौंड १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन और ३४ μg/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल (३४ मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान) के साथ पूरक के लिए संस्कृति के 3 मिलीलीटर जोड़ें । २२५ rpm मिलाते के साथ ३७ ° c पर रातोंरात संस्कृति मशीन ।
    2. 1 एल पौंड, १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन, और ३४ μg/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल 4 एल Erlenmeyer कुप्पी में संस्कृति का ५३ एमएल स्थानांतरण । २२५ rpm मिलाते के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
    3. ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने के समय पर संस्कृति । शुरू में, संस्कृति आयुध डिपो६०० हर एच की जांच करें । के रूप में संस्कृति वांछित आयुध डिपो६००तक पहुंचता है, हर 15 मिनट की जांच करने के लिए नहीं तबदील । ०.९ और १.० के बीच एक आयुध डिपो६०० के लिए संस्कृति हो जाना । संस्कृति के तापमान को कम करने के लिए एक बर्फ स्नान और भंवर को कुप्पी स्थानांतरण ।
  3. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए संस्कृति के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण बाद में विश्लेषण के लिए denaturing एसडीएस द्वारा-पृष्ठ विश्लेषण ।
    1. १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक microfuge में 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १४,००० x g पर में कोशिकाओं गोली । supernatant को त्यागें । १५० μL फॉस्फेट में गोली reसस्पेंड pipetting द्वारा खारा (पंजाब) बफर । पंजाबियों के साथ या CaCl2 और MgCl2के बिना या तो हो सकता है ।
    2. 2x एसडीएस-पृष्ठ नमूना बफर के १५० μL जोड़ें (१५० mM Tris-HCl, pH ६.८, १.२% एसडीएस, 30% ग्लिसरॉल, 15% β-mercaptoethanol (βME), ०.००१८% bromophenol ब्लू) और प्लास्टिक या भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । -20 डिग्री सेल्सियस पर 3 min. Store के लिए उबाल लें ।
  4. बैक्टीरियल संस्कृति में जोड़ें: ०.२५ mm isopropyl का अंतिम एकाग्रता-बीटा-डी-thiogalactopyranoside (IPTG, ०.२५ M स्टॉक समाधान) और ५० माइक्रोन ZnCl2 (५० mM स्टॉक सॉल्यूशन) । IPTG T7 प्रवर्तक और ZnCl से जीन में PFV की अभिव्यक्ति लाती है2 में PFV में एक एमिनो टर्मिनल जस्ता फिंगर डोमेन की सही तह के लिए एक पूरक के रूप में जोड़ा जाता है, 25 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को मिलाना के साथ २२५ rpm पर 4 घंटे के लिए तुरंत एक बर्फ स्नान के लिए कुप्पी स्थानांतरण । १.३ में ऊपर के रूप में एक ही प्रोटोकॉल के बाद एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए संस्कृति के 1 मिलीलीटर सहेजें ।
  5. जीवाणु संस्कृति हस्तांतरण करने के लिए उचित आकार केंद्रापसारक बोतलों । उदाहरण के लिए, एक 1 एल संस्कृति चार बाँझ डिस्पोजेबल २५० एमएल शंकु नीचे के बोतलों को हस्तांतरित किया जा सकता है । 4 ˚ सी में 20 मिनट के लिए ३००० x g पर एक प्रशीतित तालिका के ऊपर केंद्रापसारक में बोतलें स्पिन घनघोर द्वारा supernatants त्यागें.
    1. छर्रों के सभी एक 1 एल बैक्टीरियल संस्कृति से 25 मिलीलीटर की कुल मात्रा में reसस्पेंड (बोतल प्रति ६.२५ मिलीलीटर) शीत पंजाबियों (के साथ या बिना CaCl2 और MgCl2) द्वारा pipetting । जीवाणु सस्पेंशन को १ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब से संयोजित और स्थानांतरित करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ३,००० x g पर एक प्रशीतित केंद्रापसारक में स्पिन । supernatant को घनघोर या pipetting से त्यागें.
  6. 10 मिलीलीटर resuspension बफर में बैक्टीरियल गोली reसस्पेंड (५० mm Tris-HCl, पीएच ७.५, ५०० mm NaCl, और ५०० माइक्रोन phenylmethylsulfanoxide (PMSF) को छेड़ो अवरोधक) द्वारा pipetting । स्नैप ५० एमएल ट्यूब जलमग्न करने के लिए पर्याप्त तरल नाइट्रोजन के साथ एक देवर कुप्पी में ट्यूब रखकर गोली फ्रीज । ध्यान से तरल नाइट्रोजन से ट्यूब निकालें और-८० ° c पर स्टोर ।
    नोट: बैक्टीरियल छर्रों-८० डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है । हम दो साल के लिए-८० ° c भंडारण निंनलिखित सक्रिय प्रोटीन का कोई नुकसान नहीं देखा है ।
  7. पूर्व प्रेरण और ८.३ सेमी चौड़ा द्वारा प्रेरण नमूने के बाद विश्लेषण, ७.३ सेमी ऊंची, ०.७५ एमएम मोटी एसडीएस-पेज जैल विथ १.५ mL 6% polyacrylamide स्टैकिंग लेयर (१२५ एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ६.८, 6% acrylamide, ०.१% एसडीएस, ०.१% अमोनियम persulfate, ०.००१% TEMED) और ३.५ एमएल 10% polyacrylamide संपति परत (३७५ एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ८.८, 10% acrylamide, ०.१% एसडीएस, ०.१% अमोनियम persulfate, ०.००१% TEMED)12.
    1. स्टैकिंग जेल डालने के बाद, एक 10 अच्छी तरह से कंघी डालें. जब जेल बहुलक है, पृष्ठ तंत्र को इकट्ठा, और पर्याप्त एसडीएस-पृष्ठ चल बफर जोड़ें (25 mm Tris, १९२ mm glycine, ०.१% एसडीएस) ।
    2. प्रत्येक नमूने के 10 μL और दाग प्रोटीन मानकों के 4 μL लोड करें । जब तक डाई सामने जेल के नीचे पहुंचता है, लगभग ६० मिनट १६.५ V/
    3. जेल प्लेटें जुदा और एक प्लास्टिक टब के लिए जेल हस्तांतरण । Coomassie शानदार नीला धुंधला समाधान जोड़ें (०.१% Coomassie प्रतिभाशाली नीले आर २५०, ४०% मेथनॉल, 10% एसिटिक एसिड) उदारता से जेल कवर और परिवेश के तापमान पर 20 मिनट के लिए दाग ।
    4. डालने और दाग समाधान (४०% मेथनॉल, 10% एसिटिक एसिड) के साथ बदलने से दाग समाधान निकालें बैंड आसानी से दिखाई दे रहे हैं । गिरने और पानी के साथ की जगह से धुंधला समाधान निकालें । PFV में इंडक्शन सैंपल के बाद आसानी से पहचान की जानी चाहिए । एक hexahistidine टैग के साथ में PFV ४७३७४ के एक आणविक वजन है डा.
    5. यदि PFV में दिखाई नहीं देता है, परिवर्तन प्लेटों में से एक से एक अलग कॉलोनी के साथ शुरू प्रेरण दोहराने ।

2. निकेल संबध क्रोमैटोग्राफी

  1. बर्फ पर गल एक जीवाणु गोली ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण समय (लगभग 2-3 ज) ले जाएगा । जब गोली एक सेल गारा करने के लिए गल गया है, एक अतिरिक्त ५०० माइक्रोन PMSF (१०० mM स्टॉक समाधान) जोड़ें ।
  2. बर्फ पर बैक्टीरिया घोल की ५० एमएल ट्यूब रखें । 30 एस के लिए 30% आयाम पर जीवाणु Sonicate (1 एस पर, 1 से बाहर s) 1 एल संस्कृति से व्युत्पंन एक ०.५ इंच व्यास जैव सींग के साथ एक sonicator का उपयोग कर एक ०.१२५ इंच व्यास पतला microtip, 20 kHz की एक आवृत्ति और ४०० डब्ल्यू की अधिकतम शक्ति
  3. एक कोल्ड ultracentrifuge ट्यूब के लिए सेल नमूना स्थानांतरण । का प्रयोग करें पाली कार्बोनेट बोतल विधानसभाओं (25 मिमी व्यास, ८९ mm ऊंचाई) एक प्रकार ६० ती निश्चित कोण रोटर के साथ संगत । एक ही गुरुत्वाकर्षण बल हासिल किया है अगर वैकल्पिक ट्यूबों और रोटर इस्तेमाल किया जा सकता है । 4 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए १२०,००० x g स्पिन । वहां एक स्पष्ट गोली होना चाहिए । supernatant पीले रंग का हो सकता है ।
  4. supernatant को घनघोर या pipetting करके ठंडे ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें । वॉल्यूम नोट करें; यह वॉल्यूम स्नैप जमने से पहले उपयोग किए गए resuspension बफ़र की मात्रा लगभग होना चाहिए । यदि supernatant चिपचिपा है, यह जीवाणु डीएनए जो क्रोमैटोग्राफी कॉलम रोकना सकता द्वारा दूषित हो सकता है । इस मामले में, ultracentrifugation को दोहराने के लिए जीवाणु डीएनए गोली ।
  5. ५०० एमएल बफर ए (५० एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ७.५, ५०० एमएम NaCl, ५०० माइक्रोन PMSF) और ५०० एमएल बफर बी (५० एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ७.५, ५०० एमएम NaCl, ५०० माइक्रोन PMSF, २०० एमएम imidazole) तैयार करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (FPLC) सिस्टम, सभी बफ़र्स और एक ठंडे कमरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना रखें ।
    1. ०.२ माइक्रोन डिस्पोजेबल फिल्टर इकाइयों के साथ एक और बी बाँझ फिल्टर बफ़र्स. FPLC प्रणाली पर निर्भर करता है, एक और पंप एक बफर और बी बफर के साथ बी, क्रमशः पंप धोने । प्रवाह ९०% बफर एक और 10% बफर बी चालकता और यूवी रीडिंग स्थिर जब तक प्रणाली के माध्यम से । अधिकतम प्रवाह दर साधन पर निर्भर करेगा; १.० MPa की अधिकतम दाब सीमा के साथ 5 मिलीलीटर/मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करें ।
  6. एक ११० मिमी लंबे, 5 मिमी व्यास FPLC स्तंभ १.५ मिलीलीटर निकल-चार्ज राल के साथ तैयार (अधिकतम बाध्यकारी क्षमता ५० मिलीग्राम/एमएल, अधिकतम दबाव 1 MPa) । कॉलम शुद्धि से पहले दिन तैयार किया जा सकता है और 4 ˚ सी पर संग्रहीत ।
  7. स्तंभ को FPLC इंस्ट्रूमेंट से कनेक्ट करें । Equilibrate ९०% बफर एक और 10% बफर बी की 20 मिलीलीटर के साथ कॉलम (20 मिमी imidazole) ०.५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर ०.५ MPa की अधिकतम दबाव सीमा के साथ/ साधन २८० एनएम (एक२८०) में चालकता और यूवी अवशोषक के वास्तविक समय डेटा एकत्रित किया जाना चाहिए । चालकता और यूवी रीडिंग स्थिर करना चाहिए । इन रीडिंग स्थिर नहीं है, तो स्तंभ के माध्यम से बफ़र्स प्रवाह करने के लिए जारी रखें जब तक कि वे स्थिर हैं ।
  8. प्रोटीन का नमूना लोड (~ 10 मिलीलीटर प्रति गोली) ०.१५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर स्तंभ के लिए/०.५ MPa की अधिकतम दबाव सीमा के साथ मिनट । प्रवाह दर और स्तंभ दबाव शुद्धि भर में एक ही रहता है । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह ले लीजिए ।
    1. 20 मिलीलीटर ९०% बफर एक और 10% बफर बी के साथ कॉलम धो एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में धो लीजिए । Elute 10% की एक 20 मिलीलीटर रैखिक ढाल के साथ प्रोटीन के लिए १००% बफर बी (20 मिमी से २०० mm imidazole) ।
    2. अंत में, 5 मिलीलीटर १००% बफर बी (२०० mM imidazole) के साथ कॉलम धो लो । ग्रेडिएंट और अंतिम वाश को ०.२७ mL अंशों में लीजिए.
  9. 15 μL का मिश्रण 2x एसडीएस-पृष्ठ नमूना बफर के माध्यम से प्रवाह के 15 μL के साथ, धोने, और एक२८० भागों चोटी । 3 मिनट के लिए नमूने उबाल लें ।
    1. 15 अच्छी तरह से कंघी के साथ छोड़कर चरण १.६ में पहले वर्णित के रूप में २ १०% एसडीएस-पृष्ठ जैल तैयार करें । प्रत्येक नमूने के 10 μL जैल और दाग प्रोटीन मानकों के 4 μL लोड । चलाने के लिए, दाग, और १.६ चरण में वर्णित के रूप में जैल का विश्लेषण ।
    2. भागों है कि दृश्य निरीक्षण के आधार पर में लगभग शुद्ध PFV शामिल दिखाई गठबंधन । माप pipetting द्वारा मात्रा, आमतौर पर 8-10 मिलीलीटर ।
    3. एक spectrophotometer का प्रयोग, संयुक्त भागों के एक२८० को मापने और प्रोटीन में PFV की कुल राशि की गणना; हमारे ठेठ उपज है ~ 10 प्रेरित संस्कृति के एल प्रति मिलीग्राम । hexahistidine टैग के साथ में PFV के विलुप्त गुणांक ५९३६० सेमी-1 एम-1है ।
  10. hexahistidine टैग को हटाने के लिए, के साथ में PFV पूरक 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी, 1 मीटर स्टॉक समाधान) और ०.१ मिमी EDTA, पीएच ८.० (०.५ एम स्टॉक समाधान). 15 μg जोड़ें मानव राइनोवायरस (HRV) 3 सी प्रति मिलीग्राम PFV में 4 ˚ सी रात भर में । क्लीवेज ४७३७४ दा से ४४३९४ दा तक आणविक भार में PFV को कम कर देता है और 10% एसडीएस द्वारा सत्यापित किया जा सकता है-पृष्ठ विश्लेषण ।

३. हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी

  1. तैयार २५० एमएल बफर सी (५० एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ७.५, 10 एमएम डीटीटी, ०.१ एमएम EDTA, ५०० माइक्रोन PMSF) और २५० एमएल बफर डी (५० एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ७.५, 10 एमएम डीटीटी, ०.१ एमएम EDTA, ५०० माइक्रोन PMSF, 1 एम NaCl) ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, FPLC सिस्टम, बफ़र्स, और नमूना 4 ˚ C पर एक ठंडे कमरे में रखा जाता है ।
    1. बाँझ फ़िल्टर बफ़र्स सी और डी ०.२ माइक्रोन डिस्पोजेबल फिल्टर इकाइयों के साथ. FPLC प्रणाली पर निर्भर करता है, एक और पंप बफर सी और बफर डी के साथ बी, क्रमशः पंप धोने । प्रवाह ८०% बफर सी और प्रणाली के माध्यम से 20% बफर डी चालकता और यूवी रीडिंग स्थिर जब तक । अधिकतम प्रवाह दर साधन पर निर्भर करेगा; हम नियमित रूप से १.० MPa की अधिकतम दबाव सीमा के साथ 5 मिलीलीटर/
  2. एक ८० मिमी लंबे, 5 मिमी व्यास FPLC कॉलम हेपरिन sepharose राल की 1 मिलीलीटर के साथ तैयार (अधिकतम बाध्यकारी क्षमता २.० एमएल राल प्रति गोजातीय antithrombin III के मिलीग्राम; अधिकतम दबाव १.४ MPa) । कॉलम शुद्धि से पहले दिन तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । स्तंभ को FPLC इंस्ट्रूमेंट से कनेक्ट करें ।
    1. Equilibrate ८०% बफर सी और 20% बफर डी (२०० मिमी NaCl) के 20 मिलीलीटर के साथ स्तंभ ०.५ मिलीलीटर की एक अधिकतम दबाव सीमा के साथ 1 MPa की दर/ साधन २८० एनएम (एक२८०) में चालकता और यूवी अवशोषक के वास्तविक समय डेटा एकत्रित किया जाना चाहिए । चालकता और यूवी रीडिंग स्थिर करना चाहिए । इन रीडिंग स्थिर नहीं है, तो स्तंभ के माध्यम से बफ़र्स प्रवाह करने के लिए जारी रखें जब तक कि वे स्थिर हैं ।
  3. PFV के NaCl एकाग्रता को कम करने के लिए २०० मिमी के लिए नमूने में १.५ मात्रा बफर सी जोड़कर उदाहरण के लिए, 10 मिलीलीटर PFV में 15 मिलीलीटर बफर सी जोड़ें । हमारी कुल मात्रा आमतौर पर ~ 25 मिलीलीटर है ।
  4. हेपरिन sepharose स्तंभ के लिए नमूना में पतला PFV लोड करने के लिए अधिकतम दबाव सीमा १.० MPa के साथ ०.५ मिलीलीटर/ प्रवाह दर और स्तंभ दबाव शुद्धि भर में एक ही रहता है । एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह ले लीजिए ।
    1. ८०% बफर सी और 20% बफर डी (२०० mM NaCl) के 20 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में धोने का संग्रह । Elute 20% के १००% बफर डी (२०० mM से 1 M NaCl) के लिए 30 मिलीलीटर रैखिक ढाल के साथ कॉलम को
    2. १००% बफर के 5 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो घ. ०.३७ मिलीलीटर अंशों में ग्रेडिएंट और अंतिम वाश एकत्र करें ।
  5. २.९ में वर्णित के रूप में लोड, प्रवाह के माध्यम से, धो, और 8% एसडीएस द्वारा भिंन-पृष्ठ का विश्लेषण । hexahistidine टैग की दरार के बाद PFV में ४४३९४ दा का आणविक भार है और विलुप्त गुणांक ५९३६० सेमी-1 एम-1 hexahistidine टैग के बिना रहता है । एक nuclease परख के पूरा होने तक 4 ˚ सी पर सभी भागों की दुकान ।

4. Nuclease परख

  1. हेपरिन sepharose अंशों कि लगभग शुद्ध PFV में शामिल करने के लिए प्रकट की पहचान करें 3 μL के हेपरिन अंश और ५० एनजी के 3 केबी supercoiled प्लाज्मिड डीएनए में प्रतिक्रिया बफर (10 मिमी HEPES, पीएच ७.५, ११० मिमी NaCl, 5 मिमी MgSO4, 4 माइक्रोन ZnCl2 , 10 मिमी डीटीटी) 15 μL के एक अंतिम मात्रा के साथ । ९० मिनट के लिए ३७ ˚ सी पर मशीन में कोई PFV के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं ।
    1. 1 मिलीग्राम/एमएल proteinase कश्मीर (20 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान) और ०.५% एसडीएस (10% शेयर समाधान) के साथ प्रतिक्रिया बंद करो । 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन नमूने बाद में विश्लेषण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. 1% वजन की मात्रा प्रति १२५ मिलीलीटर जेल तैयार करें (w/v) agarose 1x ताे बफर (४० mm Tris-एसीटेट, 1 mm EDTA) विथ ०.१ µ g/मब ethidium ब्रोमाइड (10 mg/एमएल स्टॉक सॉल्यूशन)13। agarose समाधान पिघला और एक 15 सेमी x 10 सेमी जेल कास्टिंग ट्रे करने के लिए डाल दिया । 5 मिमी चौड़ा, ०.७५ mm मोटी कुओं के साथ एक 15 अच्छी तरह से कंघी डालें । पतले कुओं १.५ mm मोटी कुओं की तुलना में बेहतर बैंड संकल्प उपज । परिवेश के तापमान पर जमना के लिए जेल की अनुमति दें ।
    1. ०.१ µ g/mL ethidium ब्रोमाइड के साथ 1x ताे में जेल विसर्जित कर दिया । जोड़ें ३.५ μL 6x लोड हो रहा है डाई (५०% ग्लिसरॉल, ०.१५% ऑरेंज जी डाई) nuclease परख प्रतिक्रियाओं के लिए । पूरे वॉल्यूम को जेल में लोड करें । लगातार वोल्टेज पर जेल भागो, 10 वोल्ट प्रति सेमी (१०० वी) के लिए परिवेश के तापमान पर 1 ज या जब तक नारंगी जी डाई सामने जेल के अंत तक पहुंचता है ।
  3. तुरंत एक फ्लोरोसेंट स्कैनर ethidium ब्रोमाइड का पता लगाने के लिए सेट के साथ agarose जेल छवि । रैखिक डीएनए 3 केबी पर आकार करने के लिए सही चलाना चाहिए, supercoiled डीएनए तेजी से चलाने चाहिए (~ 2 kb), और आराम चक्र डीएनए धीमी गति से चलाना चाहिए (~ ३.५ kb).
    1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग, supercoiled, रैखिक की पिक्सेल मात्रा की गणना, और प्रत्येक लेन में सर्कल प्लाज्मिड आराम । इन तीन डीएनए रूपों के लिए पिक्सेल की मात्रा की राशि कॉल "कुल डीएनए" मूल्य और रैखिक और आराम हलकों के प्रतिशत की गणना करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं । उदाहरण के लिए, आराम हलकों की पिक्सेल मात्रा उस लेन में कुल डीएनए पिक्सेल मूल्य से विभाजित है, एक प्रतिशत निर्धारित करने के लिए १०० द्वारा इस संख्या गुणा । भागों है कि दूषित nuclease नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में रैखिक और आराम हलकों का एक उच्च प्रतिशत प्रदर्शित होते हैं ।
  4. हेपरिन sepharose भागों है कि दूषित nuclease गतिविधि प्रदर्शित नहीं गठबंधन । Dialyze में 10 मिमी 6-8 केडीए आणविक भार कटऑफ (MWCO) 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस टयूबिंग 1 एल के खिलाफ रातोंरात ५० mm Tris-HCl, pH ७.५, २०० mm NaCl, ५० माइक्रोनZnCl2, 10 mm डीटीटी, 20% ग्लिसरॉल ।
  5. डायलिसिस टयूबिंग से नमूने में nuclease मुक्त PFV ठीक । एक२८० को मापने और अंतिम प्रोटीन एकाग्रता की गणना । Aliquot और तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज । -८० डिग्री सेल्सियस पर aliquots स्टोर ।

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Representative Results

संयोजक PFV में अक्सर एक जीवाणु nuclease1के साथ दूषित है । जैव रासायनिक एकीकरण परख आराम हलकों और रैखिक उत्पादों के लिए supercoiled प्लाज्मिड डीएनए के रूपांतरण के quantitation पर निर्भर करते हैं । एक दूषित nuclease की उपस्थिति इन परख के नकली quantitation के लिए नेतृत्व कर सकता है । एक hexahistidine टैग के साथ में PFV की अभिव्यक्ति ई. कोलाई (चित्रा 1) में प्रेरित है और पहले निकल अपनत्व क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 2) द्वारा शुद्ध । भागों में लगभग शुद्ध PFV के साथ संयुक्त और hexahistidine टैग एक चिढ़ाने से सट जाता है । हमने निर्धारित किया है कि PFV और प्रदूषित nuclease में हेपरिन sepharose क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 3)1के लिए अलग समानताएं है । हेपरिन sepharose क्रोमैटोग्राफी निंनलिखित भागों में PFV आराम हलकों और रैखिक supercoiled, प्लाज्मिड गतिविधि के उत्पादों (चित्रा 4) के लिए परख करने के लिए एक प्लाज्मिड nuclease के साथ मशीन हैं । इस परख nuclease (चित्रा 5) के बिना प्रोटीन भागों की पहचान की अनुमति देता है । इन अंशों को संयुक्त किया जा सकता है, dialyzed, और भविष्य के प्रयोगों के लिए जमे हुए ।

Figure 1
चित्र 1: ई. कोलाई में PFV की प्रेरण । संस्कृतियों से पहले की कोशिकाओं (लेन 2) और बाद (लेन 3) प्रेरण में PFV की उपस्थिति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं, ४७३७४ डा. नमूनों 10% एसडीएस द्वारा अलग-पृष्ठ और Coomassie शानदार नीले रंग के साथ दाग रहे थे । लेन 1, आणविक भार मार्करों (केडीए) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: निकेल संबध क्रोमैटोग्राफी अंश । घुलनशील बैक्टीरियल lysates से अलग हो गए थे निकल अपनत्व क्रोमैटोग्राफी. एक hexahistidine टैग के साथ में PFV २०० mm imidazole के लिए 20 मिमी की एक रैखिक ढाल के साथ eluted था । अंशों 10% एसडीएस द्वारा मूल्यांकन किया गया पृष्ठ और Coomassie शानदार नीले रंग के साथ सना हुआ । PFV में, ४७३७४ दा, कॉलम (लोड) करने के लिए लोड नमूना में आसानी से स्पष्ट है, लेकिन के माध्यम से या धोने के प्रवाह में कम स्पष्ट है । imidazole ग्रेडिएंट में जल्दी elute वाले भिंन ७५ केडीए के पास धीमी गतिशीलता contaminant के साथ-साथ 25 केडीए में या उससे नीचे कुछ तेज़ गतिशीलता संदूषण प्रदर्शित करते हैं । imidazole के उच्च सांद्रता में कोई आसानी से स्पष्ट संदूषण और PFV में अपेक्षाकृत शुद्ध प्रतीत होता है । इस उदाहरण में, #84 के माध्यम से #33 भिंन संयुक्त और आगे शुद्ध थे । आणविक वजन मार्करों (केडीए) प्रत्येक जेल के बाईं ओर हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : हेपरिन sepharose क्रोमैटोग्राफी में PFV 1 . निकल अपनत्व और hexahistidine टैग, PFV में (४४३९४ दा) की छेड़ो हटाने के बाद हेपरिन sepharose द्वारा fractionated था । प्रोटीन २०० mM से 1 M NaCl एक रैखिक ढाल के साथ eluted थे । यहां तक कि #44 के लिए #12 अंश 8% एसडीएस द्वारा मूल्यांकन किया गया पृष्ठ Coomassie नीले रंग के साथ सना हुआ । आणविक वजन मार्करों (केडीए) प्रत्येक जेल के बाईं ओर हैं । nuclease गतिविधि के लिए इन अंशों का परीक्षण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: हेपरिन sepharose अंशों की Nuclease परख 1 . supercoiled प्लाज्मिड डीएनए में प्रत्येक हेपरिन sepharose अंश जोड़ा गया । भिंन संख्याएं आरेख 3में दिखाए गए लोगों से सहसंबंधित होती हैं । निंनलिखित मशीन, nuclease प्रतिक्रियाओं deproteinated थे और ethidium ब्रोमाइड के साथ 1% agarose द्वारा अलग । नकारात्मक नियंत्रण कोई प्रोटीन के साथ प्लाज्मिड डीएनए (केवल लक्ष्य) और ज्ञात में जंगली प्रकार PFV के एक पिछले शुद्धि nuclease (PFV में WT) से मुक्त होना शामिल हैं । nuclease गतिविधि को दूषित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण उत्प्रेरक निष्क्रिय PFV है कि में दूषित nuclease (D128N में PFV) के लिए जाना जाता है की एक पिछली शुद्धि है । डीएनए आकार मार्करों kb में दिखाए जाते हैं । Supercoiled प्लाज्मिड (SC), रैखिक प्लाज्मिड (एल), और आराम हलकों (आर सी) संकेत कर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : nuclease परख के Quantitation 1. Agarose जैल थे स्कैन और पिक्सेल मूल्यों के लिए मात्रा थे supercoiled (SC), रैखिक (L), और आराम सर्कल (आर सी) बैंड प्रत्येक लेन में. भिन्न संख्याएं 3 और 4 के आंकड़े में दर्शाए गए लोगों के लिए सहसंबंधी हैं । रैखिक और आराम हलकों के प्रतिशत पिक्सेल मूल्यों और दिखाया समीकरण का उपयोग कर की गणना की गई । उदाहरण के लिए, भिन्न #12 के बैंड के लिए पिक्सेल मान हैं: ८१७६३६ supercoiled प्लाज्मिड, ५०४६७ रेखीय प्लाज्मिड, और ११२०५२ आराम हलकों. #12 अंश के लिए कुल डीएनए पिक्सेल मान इन मानों, ९८०१५५ का योग है । रैखिक डीएनए का प्रतिशत ५०४६७ प्रतिशत के लिए १०० से गुणा है और कुल डीएनए ५.१% के बराबर मूल्य से विभाजित है । आराम हलकों का प्रतिशत ११२०५२ १०० से गुणा और कुल डीएनए ११.४% के बराबर मूल्य से विभाजित है । रैखिक और आराम चक्र प्रतिशत का योग १६.५% है । कोई प्रोटीन के साथ नकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मिड डीएनए (में, नीचे ग्राफ) इंगित करता है कि प्लाज्मिड की इस तैयारी के रेखीय या आराम हलकों के रूप में कुल डीएनए का ४.४% शामिल थे । एक दूसरे नकारात्मक नियंत्रण (WT) है कि रैखिक या आराम हलकों के रूप में कुल डीएनए का ८.६% प्रदर्शित में जंगली प्रकार PFV के एक पिछले शोधन था । इन दो नियंत्रण गलियों निक या रैखिक अकेले सब्सट्रेट के साथ और में PFV के साथ वर्तमान प्लाज्मिड की पृष्ठभूमि स्तर से संकेत मिलता है । एक सकारात्मक नियंत्रण उत्प्रेरक निष्क्रिय PFV के (D128N) जो रैखिक और आराम हलकों के रूप में कुल डीएनए का 23% था की एक पिछले शोधन है । डीएनए हेपरिन sepharose अंशों को उजागर के माध्यम से #12 #22 के परिणामस्वरूप > रैखिक और आराम हलकों के रूप में डीएनए के 10% । इस उदाहरण में, अंशों को रेखीय और निश्चिंत वृत्तों में < 10% कनवर्ज़न #42 प्रदर्शित करने के लिए #24 । ये अंश संयुक्त और dialyzed थे. Aliquots जमे हुए थे और भविष्य में उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

डीएनए के साथ बातचीत संयोजक प्रोटीन कि डीएनए की मरंमत प्रोटीन के रूप में, एकल अणु माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए ऑक्सीजन मेहतर, या सिंड्रम integrases, जीवाणु nucleases2,3दूषित से मुक्त होना चाहिए । ये संदूषण बल्क जैव रासायनिक या एकल अणु की परख के दौरान परिणामों की व्याख्या को भ्रमित कर सकते हैं ।

हमने पाया है कि एक जीवाणु nuclease अक्सर सह में PFV के साथ शुद्ध । हालांकि, PFV हेपरिन sepharose के लिए एक समानता है कि जीवाणु nuclease contaminant1से आसानी से अलग है प्रदर्शित करता है । nuclease की तैयारी के लिए कुंजी-मुक्त PFV में है nuclease गतिविधि के सावधान quantitation प्रत्येक अंश में हेपरिन sepharose से ग्रेडिएंट रेफरेंस निम्न है. ग्रेडिएंट पर्याप्त रूप से nuclease contaminant से PFV के पृथक्करण की अनुमति देने के लिए उथले होना चाहिए; एक खड़ी ढाल कुशल जुदाई के साथ संगत नहीं होगा । इसके अलावा, प्लाज्मिड डीएनए सब्सट्रेट आराम हलकों के एक कम प्रतिशत के लिए nuclease परख की पृष्ठभूमि को कम करना चाहिए । यदि प्लाज्मिड डीएनए सब्सट्रेट आराम हलकों की एक उच्च पृष्ठभूमि है, प्लाज्मिड डीएनए की एक नई शुद्धि प्रदर्शन किया जाना चाहिए । nuclease गतिविधि परख दूषित nuclease और भागों है कि छोड़ दिया जाना चाहिए की उपस्थिति का पता चलता है ।

कुछ मामलों में, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (SEC) एक दूषित nuclease2को निकालने के लिए एक प्रभावी विधि हो सकता है । पिछले समूहों में PFV की शुद्धि के दौरान एसईसी का इस्तेमाल किया है4। एसईसी एक सीमित लोड मात्रा है और अंतिम प्रोटीन एकाग्रता को कम करने के लिए जाता है । समानता और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के लिए प्रमुख लाभ के लिए एसईसी से एक काफी अधिक मात्रा लोड करने की क्षमता है ।

nuclease गतिविधि के लिए परीक्षण अलग प्रोटीन है कि सह एक जीवाणु nuclease के साथ शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यहां हम की पहचान है कि PFV में और एक दूषित nuclease हेपरिन sepharose क्रोमैटोग्राफी से अलग किया जा सकता है । हम पहले से पता चला है कि PFV में मोनो एस कटियन और मोनो क्यू आयनों एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी इन रेजिन इस प्रोटीन के लिए अनुपयुक्त बनाने के साथ nuclease के लिए एक समान प्रोफ़ाइल है । nuclease के संबंध में वांछित प्रोटीन के संबध विशेषताओं के आधार पर, इस प्रोटोकॉल संबंध या आयन एक्सचेंज रेजिन और ढाल रेफरेंस के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । ब्याज की एक प्रोटीन से nuclease संदूषण के प्रभावी हटाने के लिए महत्वपूर्ण एक राल के लिए संबध में एक अंतर है । प्रत्येक अंश nuclease गतिविधि के लिए परख की जानी चाहिए । इस प्रोटोकॉल के क्रोमैटोग्राफी रेजिन सीधे सभी प्रोटीन है कि सह बैक्टीरियल nucleases के साथ शुद्ध करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है । हालांकि, एक समानता या आयन विनिमय राल का उपयोग करने के लिए ब्याज की एक प्रोटीन और परख nuclease गतिविधि के लिए भागों से nuclease अलग मोटे तौर पर लागू हो सकता है की समग्र अवधारणा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम NIH AI099854 और AI126742 कुंजी को समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

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References

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