كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

هي غالباً ما تكون ملوثة البروتين integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف مع نوكلاس بكتيرية أثناء تنقية. هذا الأسلوب يعرف التلوث نوكلاس وإزالته من التحضير النهائي للانزيم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بروتين إينتيجراسي (في) لفي النموذج الفيروس مزبد (فف) إنزيم نموذج لدراسة إليه التكامل للفيروسات الرجعية. مقارنة من الفيروسات القهقرية الأخرى، في فف القابلة للذوبان أكثر وأكثر قابلية للمعالجة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه حساس لمثبطات في ذات الصلة سريرياً فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يدل على أن الآلية الحفازة في فف مماثلة إلى أن من "تلبيتها،" فيروس نقص المناعة البشرية-1 يحفز التساهمية ضم الحمض النووي التكميلية الفيروسية (كدنا) للهدف ودعا الحمض النووي في عملية نقل حبلا. ويدخل هذا رد فعل نقل حبلا نيكس إلى الهدف الحمض النووي. يمكن مرتبك تحليل إدماج نواتج التفاعل بوجود نوكليسيس أن المثل نك الحمض النووي. لقد ثبت نوكلاس جرثومي لتنقية يشترك مع المؤتلف في فف المعرب عنها في الإشريكيّة القولونية (كولاي). هنا يصف لنا طريقة لعزل في فف من نوكلاس تلويث من الهيبارين التقارب اللوني. ويجري فرز الكسور بسهولة للتلوث نوكلياسي مع بلازميد سوبيركويليد و [اغروس] هلام التفريد. في بفف و nuclease تلويث عرض الانتماءات البديلة سيفاروسي الهيبارين مما يسمح إعداد خالية nuclease المؤتلف بفف في مناسبة لتحليل جزيء البيوكيميائية أو واحد الجزء الأكبر من التكامل.

Introduction

دراسات جزيء البيوكيميائية وواحد من تفاعلات البروتين مع الحمض النووي تتطلب البروتينات المؤتلف استثنائية نقية. تلوث نوكليسيس من البكتيريا يمكن أن تحجب نتائج هذه الاختبارات. تم العثور على نوكلاس تلويث في الأعمال التحضيرية للبروتينات المؤتلف الأكسجين الكاسح بروتوكاتيتشواتي-3 و 4-ديوكسيجيناسي (PCD) ونموذج مزبد الفيروس (فف) إينتيجراسي (في) المعزولة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)1 , 2 , 3.

فحوصات التكامل للفيروس تعتمد على تحويل الحمض النووي سوبيركويليد للمنتجات رصدت أو الخطي كتدبير في النشاط4. خلال العدوى الخلوية ينضم في طرفي كدنا الفيروسية الكروماتين المضيف5. ويطلق على كل نهاية الانضمام إلى رد فعل نقل حبلا. فحوصات المؤتلف في النشاط قد ينضم إلى اثنين الحمض النووي ليغومرات محاكاة كدنا الفيروسية وينتهي إلى هدف الحمض النووي في تكامل منسقة رد فعل4،5،6،،من78. وبدلاً من ذلك قد المؤتلف في الانضمام إلى واحدة فقط من نهاية الحمض النووي في موقع نصف ذات صلة غير فسيولوجيا تكامل رد فعل9،10. عندما سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي هو الهدف من التكامل، التكامل متضافرة منتجات خطيا الحمض النووي ومنتجات التكامل الموقع نصف الدوائر استرخاء. يتم تعريف هذه المنتجات رد فعل بقدرتهم النسبية على الحركة أثناء [اغروس] هلام التفريد1. إذا كان في المؤتلف تلويث نوكلاس، سيكون هناك دوائر استرخاء زائفة أو بلازميد ربما تطبق الخلط بين النتائج التجريبية. قد يكون المسمى ليغومرات الحمض النووي الفيروسي فلوريسسينتلي شكل قاطع تحديد المنتجات التكامل، بدلاً من المنتجات نوكلاس. ومع ذلك، في تفضل كثيرا سوبيركويليد الحمض النووي الأهداف؛ ويمكن أن تحرف أي خسارة في بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو الحمض النووي الخطي بتلويث نوكلاس النتائج وتفسير البيانات11. وبالتالي من الضروري إزالة nucleases البكتيرية من الفيروسات التراجعية في الأعمال التحضيرية.

في فف لها صلة مختلفة عن الهيبارين سيفاروسي مقارنة بال نوكلاس البكتيرية1. قد تكون مفصولة في فف ونوكلاس شطف تدرج خطي من الهيبارين سيفاروسي. عدم الكشف عن نوكلاس سهولة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) 280 نانومتر ذروة أو الصوديوم التحليلية دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). بدلاً من ذلك، يتم الكشف عن نوكلاس بمقايسة نشاط نوكلاس استخدام تحويل بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو المنتجات الخطية. يتم اختبار كل جزء بعد الهيبارين سيفاروسي اللوني لنشاط نوكلاس. في فف والملوث نوكلاس قد لا فرق في تقارب عن راتنج شاردة مونو-Q. هناك فرق صغيرة في تقارب عن الراتنج الموجبة مونو-S. ومع ذلك، لا يسمح القرار مونو-S نوكلاس البكتيرية وفي فف كفاءة فصل البروتينات. وفي نهاية المطاف، الهيبارين سيفاروسي انجذاب تطهير يقدم أفضل فصل نوكلاس البكتيرية من فف في وفي الاستفادة من حجم التحميل غير محدود.

اختبار لتلويث نوكلاس النشاط يمكن تكييفه مع غيرها من البروتينات. بروتين الفائدة من المحتمل أن يكون الخصائص تقارب البديلة مما في فف؛ ويجب تحديد الفرق في ربط خصائص البروتين الفائدة والملوث نوكلاس تجريبيا. قد تكون هذه المنهجية لتحديد التلوث nuclease تتكيف مع الراتنجات الأخرى بما في ذلك الموجبة مونو-S أو راتنجات تبادل شاردة مونو-Q. راتنجات التبادل الأيوني وتقارب قد توفر طريقة موثوقة لعزل بروتين المؤتلف من الفائدة من تلويث nucleases مع أي قيود على حجم البروتين خلال الفصل اللوني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الحث على بفف في التعبير في كولاي

  1. إضافة 1 ميكروليتر من بفف في التعبير بلازميد (10 نانوغرام/ميكروليتر) إلى 20 ميكروليتر من بليس BL21(DE3) كولاي (20 ميكروليتر قاسمة من الخلايا المتوفرة تجارياً قد > 2 × 106 ميكروغرام/زيمبابوي بلازميد) في أنبوب 1.5 مل. المزيج بلطف بالإصبع التنصت أو التحريك الأنبوب. احتضان الجليد في 5 دقائق.
    1. حرارة صدمة للضبط 30 ثانية في ˚C 42 المياه حمام وثم العودة فورا الجليد لمدة 2 دقيقة.
    2. إضافة 80 ميكروليتر من درجة حرارة الغرفة مرق سوبر الأمثل مع وسائل الإعلام القمع (شركة نفط الجنوب) كاتابوليتي. احتضانها ح 1 في 37 ˚C مع 225 الثورات في الدقيقة الواحدة (لفة في الدقيقة) تهتز.
    3. لوحة 25 ميكروليتر من المخلوط على 100 ملم × 15 ملم طبق بتري يحتوي على 25 مل أجار (رطل) مرق لوريا (1 L رطل أجار: 10 جرام بكتو-تريبتوني، 10 جرام كلوريد الصوديوم، خلاصة الخميرة ز 5، 15 ز أجار) و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين (100 مغ/مل حل الأسهم).
    4. لوحة ميكروليتر 75 المتبقية من الخلايا المحولة على صفيحة متطابقة ثانية. احتضان اللوحات مع الأغطية لأسفل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. استرداد اللوحات من تحول كولاي. استخدام مستعمرة واحدة لتطعيم 3 مل رطل (L 1 رطل: استخراج 10 غم من بكتو-تريبتوني، 10 غم من كلوريد الصوديوم، 5 غ خميرة) وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين في أنبوب ثقافة البوليبروبيلين قاع جولة 14 مل. احتضانها ح ~ 8 في ˚C 37 مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
    1. إضافة مل 3 من الثقافة إلى 50 مل تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والكلورامفينيكول 34 ميكروغرام/مل (حل الأسهم 34 ملغ/مل) في 250 مل قارورة Erlenmeyer رطل. احتضان ثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
    2. نقل مل 53 من الثقافة إلى رطل و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول في قارورة Erlenmeyer ل 4 1 لتر. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
    3. قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) للثقافة بشكل دوري. وفي البداية، تحقق ثقافة OD600 كل ح. كما تصل الثقافة التطوير التنظيمي المطلوب600، تحقق من كل 15 دقيقة عدم كسا. تنمو الثقافة ل التطوير التنظيمي600 بين 0.9 و 1.0. نقل قارورة لحمام الثلج ودوامه لتخفيض درجة الحرارة للثقافة.
  3. نقل 1 مل الثقافة إلى أنبوب 1.5 مل لتحليلها في وقت لاحق من يشوه الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل.
    1. بيليه الخلايا في الأنبوب 1.5 مل بالطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في [ميكروفوج] في غ س 14,000 في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في 150 ميكروليتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) قبل بيبيتينج. قد يكون برنامج تلفزيوني أما مع أو بدون كاكل2 ومجكل2.
    2. إضافة ميكروليتر 150 2 × الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت (150 مم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 1.2% الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 30%، 15% β-ميركابتوثانول (βME)، بروموفينول 0.0018% الأزرق) ومزيج دقيق من بيبيت أو دوامة. يغلي لدقيقة 3 مخزن في-20 درجة مئوية.
  4. إضافة إلى ثقافة البكتيرية: تركيز نهائي ل 0.25 مم الأيزوبروبيل-بيتا-د-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج، حل الأسهم 0.25 متر) و 50 ميكرومتر زنكل2 (حل الأسهم 50 مم). إيبتج الحث على التعبير عن الجين فف من المروج T7 وزنكل2 يتم إضافتها كملحق للطي الصحيحة لمجال إصبع الزنك الأمينية الطرفية في تلبيتها، فف إينكوباتي ثقافة عند 25 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة ل 4 h. فورا نقل قارورة لحمام الثلج. حفظ 1 مل ثقافة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل أثر البروتوكول نفسه كما هو مذكور أعلاه في 1-3.
  5. نقل ثقافة البكتيرية لزجاجات حجم مناسب للطرد المركزي. على سبيل المثال، يمكن نقل ثقافة 1 لتر إلى أربعة زجاجات البولي بروبلين مخروطية الشكل السفلي عقيمة المتاح 250 مل. تدور الزجاجات في الطرد مركزي منضدية مبردة في 3000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 ˚C. تجاهل سوبيرناتانتس بصب.
    1. ريسوسبيند كل من الكريات من ثقافة بكتيرية 1 لتر في إجمالي حجم 25 مل (6.25 مل للزجاجة الواحدة) برنامج تلفزيوني الباردة (مع أو بدون كاكل2 ومجكل2) قبل بيبيتينج. الجمع ونقل تعليق البكتيرية إلى أنبوب مخروطي 50 مل واحد. تدور في أجهزة الطرد مركزي مبردة في 3,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية بصب أو بيبيتينج.
  6. ريسوسبيند بيليه البكتيرية في المخزن المؤقت لاستثارة 10 مل (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ومثبطات البروتياز فينيلميثيلسولفانوكسيدي (بمسف) ميكرومترات 500) قبل بيبيتينج. تجميد الأداة بيليه عن طريق وضع الأنبوب في قارورة ديوار مع النيتروجين السائل تكفي لغمر أنبوب 50 مل. بعناية إزالة الأنبوب من النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين الكريات البكتيرية لعدة أشهر في-80 درجة مئوية. ولقد رأينا أي فقدان للبروتين النشط بعد تخزين-80 درجة مئوية لمدة عامين.
  7. تحليل العينات قبل التعريفي والتوجيهي بعد انتهاء من 8.3 سم، 7.3 سم ارتفاع، 0.75 مم سميكة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الهلام مع بولياكريلاميدي 6% 1.5 مل التراص طبقة (125 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 6% الاكريلاميد، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، 0.1% الأمونيوم فوق كبريتات، 0.001% تيميد) و 3.5 مل 10% بولياكريلاميدي حل طبقة (375 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 8، 8، 10% الاكريلاميد، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، 0.1% الأمونيوم فوق كبريتات، 0.001 في المائة تيميد)12.
    1. بعد صب جل التراص، إدراج 10 مشط جيدا. عندما قد بلمرة الهلام، تجميع الجهاز الصفحة، وإضافة كافية الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المخزن المؤقت قيد التشغيل (25 مم تريس، 192 مم جليكاين، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%).
    2. تحميل 10 ميكروليتر من كل عينة وميكروليتر 4 مستويات البروتين بريستاينيد. تشغيل عند 16.5 V/سم حتى يصل إلى الجبهة صبغ الجزء السفلي من الجل، حوالي 60 دقيقة.
    3. تفكيك لوحات جل ونقل الجل إلى حوض بلاستيك. إضافة "أخذ الأزرق الرائعة" تلطيخ الحل (0.1% R-250 الأزرق الرائعة أخذ، الميثانول 40%، حمض الخليك 10 ٪) لتغطية جل سخاء ووصمة عار لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة الحل المصبوغة بصب واستبدال مع ديستين الحل (40% ميثانول وحمض الخليك 10%) حتى تكون الأشرطة العيان. إزالة الحل ديستينينج بصب واستبدالها بالمياه. ينبغي أن تحدد في فف بسهولة في العينة بعد التعريفي. وقد في فف مع علامة هيكساهيستيديني وزن الجزيئي 47374 دا.
    5. إذا لم يكن مرئياً في فف، كرر التعريفي بدءاً من مستعمرة مختلفة من واحدة من لوحات التحويل.

2-النيكل التقارب اللوني

  1. ذوبان الجليد واحد بيليه البكتيرية على الجليد.
    ملاحظة: هذا سوف يستغرق قدرا كبيرا من الوقت (حوالي 2-3 ح). عندما قد إذابة بيليه إلى ملاط خلية، إضافة ميكرومترات 500 إضافية بمسف (حل الأسهم 100 ملم).
  2. إبقاء أنبوب 50 مل من البكتيريا الملاط على الجليد. Sonicate البكتيريا في السعة 30% 30 s (1 s في 1 s إيقاف) كل بيليه المستمدة من الثقافة 1 لتر باستخدام سونيكاتور مع قرن بيو قطرها 0.5 بوصة قطرها 0.125 بوصة مدبب ميكروتيب، وتواتر 20 كيلوهرتز، والحد الأقصى من الطاقة من 400 جورج
  3. نقل العينة الخلية إلى أنبوب أولتراسينتريفوجي باردة. استخدام البولي زجاجة التجميعات (25 مم وارتفاع 89 مم) متوافقة مع دوار زاوية ثابتة "نوع 60 منظمة الشفافية الدولية". قد يتم استخدام أنابيب بديلة والدوارات إذا تحقق نفس القوة الجاذبية. ز خ 120,000 تدور لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. ينبغي أن يكون هناك بيليه واضحة. قد تكون المادة طافية لون أصفر.
  4. نقل المادة طافية بصب أو بيبيتينج إلى أنبوب مخروطي باردة 50 مل. علما بأن حجم؛ ينبغي أن يكون هذا الحجم تقريبا حجم استثارة المخزن المؤقت المستخدمة من قبل الأداة الإضافية التجميد. إذا كانت المادة طافية لزج، قد تكون ملوثة بالحمض النووي البكتيرية التي يمكن أن تسد العمود اللوني. وفي هذه الحالة، كرر تنبيذ فائق بيليه الحمض النووي البكتيري.
  5. إعداد 500 مل المخزن المؤقت (50 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 500 ميكرومتر بمسف) و 500 مل "ب المخزن المؤقت" (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 500 ميكرومتر بمسف، ايميدازول 200 ملم).
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، والحفاظ على النظام اللوني السائل (فبلك) البروتين سريعة وكافة المخازن المؤقتة والعينة في 4 درجات مئوية في غرفة باردة.
    1. المخازن المؤقتة لتصفية العقيمة A و B مع وحدات تصفية المتاح ميكرومترات 0.2. استناداً إلى نظام فبلك، تغسل بمضخة ومضخة ب مع المخزن المؤقت A و B المخزن المؤقت، على التوالي. تدفق 90% بالمخزن المؤقت و 10% "ب المخزن المؤقت" عن طريق النظام حتى استقرار الموصلية وقراءات الأشعة فوق البنفسجية. يتوقف معدل التدفق الأقصى في الصك؛ استخدم معدل تدفق من 5 مل/دقيقة مع حد أقصى ضغط 1.0 الآلام والكروب الذهنية.
  6. إعداد 110 مم طويلة، 5 ملم قطر فبلك عمود مع الراتنج 1.5 مل مشحونة بالنيكل (ملزمة كحد أقصى قدرة 50 ملغ/مل، الحد الأقصى من الضغوط 1 الآلام والكروب الذهنية). وقد أعدت قبل تنقية اليوم العمود والمخزنة في 4 ˚C.
  7. قم بتوصيل العمود الأداة فبلك. حجته العمود مع 20 مل من 90% بالمخزن المؤقت و 10% المخزن المؤقت ب (20 مم ايميدازول) بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع حد أقصى ضغط 0.5 الآلام والكروب الذهنية. ينبغي أن يكون الصك جمع بيانات الوقت الحقيقي من الموصلية وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر (280). وينبغي تحقيق الاستقرار الموصلية وقراءات الأشعة فوق البنفسجية. إذا لم قد استقرت هذه القراءات، تواصل تدفق المخازن المؤقتة من خلال العمود حتى أنها مستقرة.
  8. تحميل العينة البروتين (~ 10 مل كل بيليه) إلى العمود بمعدل تدفق 0.15 مل/دقيقة مع حد أقصى ضغط 0.5 الآلام والكروب الذهنية. لا يزال الضغط الأعمدة ومعدل تدفق نفسه طوال التنقية. جمع من خلال التدفق في أنبوب 50 مل.
    1. أغسل العمود مع 20 مل 90% بالمخزن المؤقت و 10% تجمع المخزن المؤقت ب الغسيل في أنبوب 50 مل. الوت البروتينات مع تدرج خطي 20 مل من 10% إلى 100% المخزن المؤقت ب (20 ملم إلى 200 ملم ايميدازول).
    2. وأخيراً، أغسل العمود مع 5 مل 100% المخزن المؤقت ب (200 ملم ايميدازول). جمع الغسيل التدرج ونهائي في مل 0.27 الكسور.
  9. الجمع بين 15 ميكروليتر 2 x الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت مع 15 ميكروليتر من التدفق من خلال المياه والصرف الصحي، وذروة الكسور280 ألف. يغلي عينات لمدة 3 دقائق.
    1. إعداد اثنين 10 ٪ الهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة كما هو موضح مسبقاً في الخطوة 1.6 إلا مع 15 كومز جيدا. تحميل 10 ميكروليتر من كل عينة للمواد الهلامية وميكروليتر 4 مستويات البروتين بريستينيد. تشغيل، وصمة عار، وتحليل المواد الهلامية كما هو موضح في الخطوة 1، 6.
    2. الجمع بين الكسور التي يبدو أنها تحتوي على قرابة نقية في فف استناداً إلى الفحص البصري. قياس الحجم قبل بيبيتينج، عادة من 8-10 مل.
    3. باستخدام جهاز المطياف الضوئي، قياس أ280 من الكسور مجتمعة وحساب المبلغ الإجمالي للبروتين في فف؛ لدينا عائد نموذجي ~ 10 ملغ للأم الثقافة المستحث. معامل الانقراض في فف مع علامة هيكساهيستيديني هو سم 59360-1 م-1.
  10. لإزالة علامة هيكساهيستيديني، الملحق "في فف" مع ديثيوثريتول 10 ملم (DTT، حل الأسهم 1 متر) و 0.1 ملم يدتا، pH 8.0 (0.5 م حل الأسهم). إضافة 15 ميكروغرام للبشرية رهينوفيروس (HRV) ج 3 حوزتي كل مغ فف تلبيتها، إينكوباتي في 4 ˚C بين عشية وضحاها. يقلل من الوزن الجزيئي "في فف" من 47374 دا على دا 44394 الانقسام ومن الممكن التحقق من تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10%.

3-الهيبارين التقارب اللوني

  1. تحضير 250 مل "ج المخزن المؤقت" (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 10 مم DTT، 0.1 مم يدتا، 500 ميكرومتر بمسف) و 250 مل العازلة د (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 10 مم DTT، 0.1 مم يدتا، 500 ميكرومتر بمسف، 1 م كلوريد الصوديوم).
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، نظام فبلك، ومخازن وعينه يتم الاحتفاظ في غرفة باردة في 4 ˚C.
    1. تصفية العقيمة "ج المخازن المؤقتة" ود مع وحدات تصفية المتاح ميكرومترات 0.2. استناداً إلى نظام فبلك، تغسل A مضخة ومضخة ب مع المخزن المؤقت جيم ودال في المخزن المؤقت، على التوالي. تدفق 80% ج المخزن المؤقت و 20% د المخزن المؤقت عن طريق النظام حتى الموصلية واستقرار قراءات الأشعة فوق البنفسجية. يتوقف معدل التدفق الأقصى في الصك؛ نحن تستخدم بشكل روتيني بمعدل تدفق 5 مل/دقيقة بحد أقصى ضغط 1.0 الآلام والكروب الذهنية.
  2. إعداد 80 مم طويلة، 5 ملم قطر فبلك عمود مع 1 مل من الهيبارين سيفاروسي الراتنج (الحد الأقصى الراتنج الثالث antithrombin كل مل القدرة الملزمة 2.0 ملغ للأبقار؛ والحد الأقصى من الضغوط 1.4 الآلام والكروب الذهنية). قد يكون إعداد اليوم قبل تنقية العمود والمخزنة في 4 درجات مئوية. قم بتوصيل العمود الأداة فبلك.
    1. حجته العمود مع 20 مل من 80% ج المخزن المؤقت و 20% د المخزن المؤقت (200 ملم كلوريد الصوديوم) بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع حد أقصى ضغط 1 الآلام والكروب الذهنية. ينبغي أن يكون الصك جمع بيانات الوقت الحقيقي من الموصلية وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر (280). وينبغي تحقيق الاستقرار الموصلية وقراءات الأشعة فوق البنفسجية. إذا لم قد استقرت هذه القراءات، تواصل تدفق المخازن المؤقتة من خلال العمود حتى أنها مستقرة.
  3. خفض تركيز كلوريد الصوديوم من العينة "في فف" إلى 200 ملم بإضافة 1.5 حجم "المخزن المؤقت جيم" على سبيل المثال، بإضافة 15 مل ج "المخزن المؤقت" إلى 10 مل بفف تلبيتها، عادة ما يكون لدينا الحجم الإجمالي ~ 25 مل.
  4. تحميل العينة في فف المخفف للعمود سيفاروسي الهيبارين معدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع الحد الأقصى من الضغوط تحد من الآلام والكروب الذهنية 1.0. لا يزال الضغط الأعمدة ومعدل تدفق نفسه طوال التنقية. جمع من خلال التدفق في أنبوب 50 مل مخروطية.
    1. أغسل العمود مع 20 مل من 80% C العازلة و 20% د المخزن المؤقت (200 ملم كلوريد الصوديوم)، جمع الغسيل في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الوت العمود مع تدرج خطي 30 مل من 20% إلى 100% د المخزن المؤقت (200 ملم إلى 1 م كلوريد الصوديوم).
    2. أغسل العمود مع 5 مل من 100% D. المخزن المؤقت جمع الغسيل التدرج ونهائي في مل 0.37 الكسور.
  5. تحليل تحميل، والتدفق من خلال، والمياه والصرف الصحي، والكسور بنسبة 8% الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة كما هو موضح في 2-9. في فف عقب انشقاق العلامة هيكساهيستيديني وزن الجزيئي دا 44394 ومعامل الانقراض يظل سم 59360-1 م-1 دون علامة هيكساهيستيديني. تخزين جميع الكسور في 4 ˚C حتى الانتهاء من المقايسة نوكلاس.

4-نوكلاس الإنزيم

  1. تحديد الكسور سيفاروسي الهيبارين التي يبدو أنها تحتوي على النقي تقريبا فف تلبيتها، الجمع بين 3 ميكروليتر من الكسر الهيبارين و 50 نانوغرام 3 كيلو بايت الحمض النووي بلازميد سوبيركويليد في رد فعل المخزن المؤقت (10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.5، 110 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم MgSO4، 4 ميكرومترات زنكل2 ، 10 مم DTT) مع وحدة تخزين نهائي من 15 ميكروليتر. احتضان في ˚C 37 ل 90 دقيقة تضمين عنصر تحكم سلبية مع لا تلبيتها، فف
    1. وقف رد الفعل مع البروتيناز 1 ملغ/مل ك (حل الأسهم 20 ملغ/مل) والحزب الديمقراطي الصربي 0.5% (10 ٪ حل الأسهم). احتضان في 37 درجة مئوية لعينات حاء – 1 قد تكون مخزنة في-20 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.
  2. تحضير هلام 125 مل 1% من وزن الواحدة [اغروس] حجم (w/v) في 1 x TAE المخزن المؤقت (40 مم تريس-خلات، يدتا 1 مم) مع 0.1 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد (10 ملغ/مل حل الأسهم)13. تذوب الحل [اغروس] وصب إلى علبة صب جل 15 سم × 10 سم. إدراج 15 مشط جيدا مع 5 مم على نطاق واسع، 0.75 مم سميكة الآبار. الآبار رقيقة تسفر عن قرار الفرقة أفضل مقارنة بالآبار 1.5 مم سميكة. السماح الهلام يصلب في درجة حرارة الغرفة.
    1. تزج الهلام في 1 x TAE مع 0.1 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد. إضافة 3.5 ميكروليتر من 6 × تحميل صبغ (والغليسيرول 50%، وصبغ "برتقالي ز" 0.15 في المائة) إلى ردود فعل الإنزيم نوكلاس. تحميل وحدة التخزين بأكملها إلى الهلام. تشغيل الهلام في الجهد المستمر، 10 فولت كل سم (100 V) في درجة حرارة الغرفة لح 1 أو حتى الجبهة صبغ "برتقالي ز" يصل إلى نهاية الهلام.
  3. فورا صورة [اغروس] هلام مع ماسح ضوئي فلورسنت للكشف عن اثيديوم بروميد. ينبغي تشغيل خطي الحمض النووي وفيا لحجم في 3 كيلو بايت والحمض النووي سوبيركويليد يجب تشغيل أسرع (~ 2 كيلو بايت) ودائرة استرخاء الحمض النووي يجب تشغيل أبطأ (~3.5 كيلو بايت).
    1. استخدام برنامج تحليل الصور، حساب حجم بكسل بلازميد دائرة سوبيركويليد والخطية، واسترخاء في كل حارة. استدعاء مجموع بكسل قيمة وحدات التخزين لهذه الأشكال الثلاثة من الحمض النووي الحمض النووي "المجموع" واستخدامها لحساب النسبة المئوية للدوائر الخطية واسترخاء. على سبيل المثال، هو حجم بكسل دوائر استرخاء مقسوماً على إجمالي قيمة بكسل الحمض النووي في هذا الممر، وضرب هذا الرقم 100 لتحديد نسبة مئوية. الكسور التي تحتوي على نوكلاس تلويث عرض نسبة مئوية أعلى من الدوائر الخطية ومريحة مقارنة بمراقبة سلبية.
  4. الجمع بين الهيبارين سيفاروسي الكسور التي لا تعرض بتلويث نوكلاس النشاط. دياليزي في 10 ملم 6-8 كاتشين الوزن الجزيئي استقطاع (موكو) الغسيل الكلوي الأنابيب عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها ضد 1 لتر من 50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 200 ملم كلوريد الصوديوم، 50 ميكرومتر زنكل2، 10 مم DTT، والغليسيرول 20%.
  5. استرداد العينة في بفف nuclease خالية من أنابيب الغسيل الكلوي. قياس أ280 وحساب تركيز البروتين النهائي. تجميد قاسمة والمفاجئة في نيتروجين سائل. تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المؤتلف فف في كثير من الأحيان ملوثة نوكلاس بكتيرية1. فحوصات التكامل البيوكيميائية تعتمد على كوانتيتيشن لتحويل سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي للدوائر استرخاء ومنتجات الخطي. يمكن أن يؤدي وجود نوكلاس تلويث إلى كوانتيتيشن زائفة لهذه الاختبارات. التعبير في فف مع علامة هيكساهيستيديني التي يسببها في كولاي (الشكل 1) وتنقيتها أولاً بالنيكل التقارب اللوني (الشكل 2). يتم تجميع الكسور مع نقية تقريبا فف في وهو المشقوق العلامة هيكساهيستيديني التي حوزتي. لقد حددنا أن الانتماءات المختلفة للهيبارين سيفاروسي اللوني (الشكل 3)1"في فف" ونوكلاس تلويث. هي المحتضنة الكسور في فف عقب الهيبارين سيفاروسي اللوني مع بلازميد سوبيركويليد الاعتداء للدوائر استرخاء وبلازميد خطية، نتاج نشاط نوكلاس (الشكل 4). ويسمح هذا الفحص تحديد أجزاء من البروتين دون نوكلاس (الشكل 5). هذه الكسور قد تكون جنبا إلى جنب، دياليزيد، والمجمدة للتجارب المقبلة.

Figure 1
رقم 1: تحريض فف في كولاي . خلايا من الثقافات قبل (لين 2)، وبعد أن يتم تحليل التعريفي (لين 3) لوجود "عينات المنشودة" في بفف، 47374 كانت مفصولة بنسبة 10 في المائة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والملون مع أخذ الزرقاء الرائعة. لين 1، علامات الوزن الجزيئي (كاتشين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: النيكل التقارب اللوني للكسور. تم فصل ليساتيس الجرثومي للذوبان بالنيكل التقارب اللوني. وكان التيد في فف مع علامة هيكساهيستيديني مع تدرج خطي من عيار 20 ملم إلى 200 ملم ايميدازول. وقيمت الكسور بنسبة 10% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والملون مع أخذ الأزرق الرائعة. فف في، 47374 دا، هو بادية للعيان في العينة حملت على العمود (load)، ولكن هو أقل وضوحاً في التدفق من خلال أو أغسل. الكسور التي الوت في بداية التدرج ايميدازول عادة عرض ملوث تنقل أبطأ قرب كاتشين 75، فضلا عن بعض الملوثات تنقل أسرع أو أقل كاتشين 25. يوجد في أعلى تركيزات ايميدازول لا ملوثات بادية للعيان، ويبدو أن في فف نقي نسبيا. في هذا المثال، جنبا إلى جنب الكسور 33 # من خلال #84 وكذلك تنقيته. علامات الوزن الجزيئي (كاتشين) على الجهة اليسرى من كل جيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الهيبارين سيفاروسي اللوني في فف 1 . عقب النيكل تقارب وحوزتي إزالة العلامة هيكساهيستيديني، وكان مجزأ فف في (دا 44394) قبل سيفاروسي الهيبارين. كانت التيد البروتينات مع تدرج خطي من 200 مم إلى 1 م كلوريد الصوديوم. وتم تقييم الكسور حتى #12 إلى #44 بنسبة 8% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ملطخة بأخذ الأزرق. علامات الوزن الجزيئي (كاتشين) على الجهة اليسرى من كل جيل. تم اختبار هذه الكسور لنشاط نوكلاس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
4 الرقم: والرزن نوكلاس الهيبارين سيفاروسي الكسور 1 . تمت إضافة كل جزء سيفاروسي الهيبارين إلى سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي. أرقام جزء ربط تلك هو موضح في الشكل 3. وبعد الحضانة، ردود فعل نوكلاس ديبروتيناتيد ومفصولة 1% [اغروس] مع اثيديوم بروميد. وتشمل عناصر سلبية بلازميد الحمض النووي مع لا بروتين (الهدف فقط) وعلى تنقية سابقة من النوع المتوحش في فف المعروفة لتكون خالية من نوكلاس (فف في وزن). هو عنصر إيجابي لتلويث نوكلاس النشاط على تنقية سابقة في فف حفازة الخاملة التي من المعروف أن تلويث نوكلاس (فف في D128N). وتظهر علامات حجم الحمض النووي في كيلو بايت. يتم الإشارة إلى بلازميد سوبيركويليد (SC) وخطي بلازميد (L)، والدوائر استرخاء (اتفاقية روتردام). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : كوانتيتيشن لفحوصات نوكلاس 1-تم قياس كمية [اغروس] تم تفحص المواد الهلامية وقيم بكسل للخطية (L)، سوبيركويليد (SC) والعصابات دائرة استرخاء (اتفاقية روتردام) في كل حارة. أرقام جزء ربط تلك يبين الشكلان 3 و 4. وحسبت النسب المئوية للدوائر الخطية واسترخاء باستخدام قيم بكسل والمعادلة هو مبين. على سبيل المثال، قيم بكسل عصابات الكسر #12: بلازميد سوبيركويليد 817636، 50467 بلازميد الخطي، ودوائر استرخاء 112052. مجموع قيمة بكسل الحمض النووي للكسر #12 هو مجموع هذه القيم، 980155. النسبة المئوية للحمض النووي الخطي هو 50467 مضروباً في 100 النسبة المئوية ومقسوما على إجمالي قيمة الحمض تساوي 5.1 في المائة. هو النسبة المئوية للدوائر استرخاء 112052 مضروباً في 100 ومقسوما على إجمالي قيمة الحمض تساوي 11.4 في المائة. مجموع النسب المئوية دائرة الخطية وخففت من نسبة 16.5 في المائة. مراقبة سلبية بلازميد الحمض النووي مع لا بروتين (لا في، أسفل الرسم البياني) يشير إلى أن هذا إعداد بلازميد تشمل 4.4 في المائة من إجمالي الحمض النووي كدوائر الخطية أو استرخاء. وكان عنصر تحكم سلبية ثانية على تنقية سابقة من النوع المتوحش فف في (WT) التي عرضها 8.6% من إجمالي الحمض النووي كدوائر الخطية أو استرخاء. هذه الممرات اثنين التحكم تبين مستوى الخلفية بلازميد رصدت أو خطية الحالية مع الركيزة وحدها وتلبيتها، فف هو عنصر تحكم إيجابية على تنقية سابقة في فف حفازة نشطة (D128N) الذي كان 23% من الحمض النووي مجموع الدوائر الخطية واسترخاء. أسفرت عن الحمض النووي تتعرض للكسور سيفاروسي الهيبارين #12 من خلال #22 > 10% من الحمض النووي كالدوائر الخطية واسترخاء. في هذا المثال، الكسور #24 إلى #42 عرض < تحويل 10% للدوائر الخطية واسترخاء. وكانت هذه الكسور جنبا إلى جنب ودياليزيد. مختبرين المجمدة والمخزنة في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المؤتلف البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي، مثل إصلاح الحمض النووي البروتينات، الزبالين الأكسجين لتطبيقات الميكروسكوب جزيء واحد، أو إينتيجراسيس للفيروسات الرجعية، ينبغي أن تكون خالية من تلوث جرثومي نوكليسيس2،3. قد يسبب ارتباكا هذه الملوثات تفسير النتائج خلال فحوصات جزيء البيوكيميائية أو واحد الأكبر.

وقد وجدنا أن نوكلياسي بكتيرية وكثيراً ما شارك ينقي بتلبيتها، بفف ومع ذلك، يعرض في بفف تقارب سيفاروسي الهيبارين بسهولة يمكن تمييزها من التلوث البكتيري نوكلياسي1. هو المفتاح لإعداد نوكلاس خالية في فف كوانتيتيشن حذراً من النشاط نوكلاس في كل جزء بعد شطف التدرج من الهيبارين سيفاروسي. يجب أن يكون التدرج ضحلة بما فيه الكفاية للسماح بالفصل في فف عن الملوث نوكلاس؛ لن متوافقة مع فصل كفاءة الانحدار حاد. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون الركيزة الحمض النووي بلازميد نسبة منخفضة من الدوائر استرخاء للحد من خلفية الإنزيم نوكلاس. إذا كان الركيزة الحمض النووي بلازميد خلفية الدوائر استرخاء عالية، ينبغي أن يجري على تنقية بلازميد الحمض النووي جديد. تحليل النشاط نوكلاس يكشف عن وجود تلويث نوكلاس والكسور التي يجب أن يتم تجاهل.

وفي بعض الحالات، قد يكون حجم الاستبعاد اللوني (SEC) وسيلة فعالة لإزالة نوكلاس تلويث2. واستخدمت المجموعات السابقة ثانية أثناء تنقية فف في4. ثانية حجم تحميل محدود، ويميل إلى خفض تركيز البروتين النهائي. والميزة الرئيسية للتقارب والتبادل الأيوني اللوني هو القدرة على تحميل وحدة تخزين أكبر بكثير مما ثانية

اختبار لنشاط nuclease يمكن تكييفها للبروتينات المختلفة التي تنقية يشترك مع نوكلياسي بكتيرية. هنا علينا أن نحدد تلك "في فف" وقد تكون مفصولة تلويث نوكلاس الهيبارين سيفاروسي اللوني. وقد أظهرنا سابقا أن "في فف" لديه ملف مماثلة نوكلاس مع الأيونات الموجبة مونو-S وشاردة مونو-Q تبادل اللوني صنع هذه الراتنجات غير صالحة لهذا البروتين. اعتماداً على خصائص تقارب من البروتين المطلوب بالنسبة نوكلاس، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع راتنجات تقارب أو التبادل الأيوني وشطف التدرج. مفتاح الإزالة الفعالة للتلوث نوكلاس من وتين فائدة فرق في النسب راتنج. يجب أن تكون جزيئي كل جزء لنشاط نوكلاس. قد لا مباشرة تطبيق راتنجات اللوني من هذا البروتوكول إلى جميع البروتينات التي تنقية يشترك مع نوكليسيس البكتيرية. ومع ذلك، قد يكون المفهوم العام لاستخدام تقارب أو راتنج التبادل الأيوني لفصل في نوكلاس من بروتين الفائدة والكسور المعايرة لنشاط نوكلاس المطبقة على نطاق واسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics