Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Rekombinant prototip köpüklü virüs integrase protein genellikle arıtma sırasında bakteriyel nükleaz ile kirlenmiş. Bu yöntem nükleaz kirlenme belirler ve enzim son hazırlık kaldırır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Retrovirüs prototip köpüklü virüs (PFV) integrase (IN) protein retroviral Tümleştirme mekanizmasının okuyan bir model enzimdir. IN diğer Retrovirüsler, PFV inç daha çözünür ve daha deneysel manipülasyon için mükellef karşılaştırılır. Ayrıca, klinik insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) inç inhibitörleri, PFV inç katalitik mekanizması HIV-1 inç inç viral Tamamlayıcı DNA (cDNA) hedef kovalent katılmadan tromboksan benzer olduğunu ima için duyarlıdır Bir işlemde DNA strand transfer aradı. Bu strand transfer reaksiyon nickler hedef DNA tanıtır. Entegrasyon reaksiyon ürünleri analizini benzer şekilde DNA nick nükleaz varlığı ile şaşırmış. Bakteriyel nükleaz rekombinant PFV inç Escherichia coli içinde (E. coli) ifade ile birlikte arındırmak için gösterilmiştir. Burada PFV inç bulaşıcı nükleaz heparin benzeşme Kromatografi tarafından izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Kesirler kolayca nükleaz kirlenme bir supercoiled Plazmid ve özel Jel Elektroforez için tarandı. PFV inç ve bulaşıcı nükleaz heparin sepharose rekombinant PFV inç nükleaz ücretsiz hazırlanması toplu biyokimyasal veya tek molekül analiz entegrasyon için uygun izin için alternatif benzeşim görüntüler.

Introduction

Protein etkileşimler DNA ile biyokimyasal ve tek molekül çalışmaları son derece saf rekombinant proteinler gerektirir. Enzimler bakterilerden bulaşıcı bu deneyleri sonuçları belirsiz. Bulaşıcı bir nükleaz müstahzarları rekombinant proteinlerin oksijen leş protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) ve Escherichia coli (e.coli)1 ' den izole prototip köpüklü virüs (PFV) integrase (IN) bulundu , 2 , 3.

Retroviral Tümleştirme deneyleri dönüşüm supercoiled DNA çentik ya da doğrusal ürünler için etkinlik4bir ölçüsü olarak güveniyor. Hücresel enfeksiyon sırasında inç bir viral cDNA iki ucu ana bilgisayar Kromatin5' e katıldı. Her iki ucu tepki katılmadan strand transferi olarak adlandırılır. Deneyleri rekombinant IN etkinliği iki DNA reaksiyonlar katılabilir miyim viral cDNA taklit biter bir hedefe DNA'sı uyumlu entegrasyon tepki4,5,6,7,8. Alternatif olarak rekombinant inç bir fizyolojik olarak sigara ilgili yarım sitesini Tümleştirme tepki9,10' tek bir DNA son üye olabilirler. Supercoiled plazmid DNA hedef olduğunda Tümleştirme, uyumlu entegrasyon ürünlerdir DNA doğrusallaştırılmış ve rahat daireler yarım sitesi Tümleştirme ürünlerdir. Bu reaksiyon ürünleri özel Jel Elektroforez1sırasında onların göreceli hareketlilik tarafından tanımlanır. Rekombinant inç bulaşıcı nükleaz varsa, sahte rahat daire veya muhtemelen doğrusallaştırılmış plazmid deneysel sonuçlar kafa karıştırıcı olacak. Viral DNA reaksiyonlar fluorescently kesin nükleaz ürünleri aksine entegrasyon ürünleri tanımlayan olarak etiketlenmiş olabilir. Ancak, içinde büyük ölçüde supercoiled DNA hedefleri iyilik; rahat daireler veya doğrusal DNA bulaşıcı nükleaz tarafından supercoiled plazmid kaybı sonuçları ve veri11yorumlanması çarpık. Böylece bakteriyel nükleaz MÜSTAHZARLARI retroviral kaldırmak için zorunludur.

PFV inç için heparin sepharose bakteriyel nükleaz1' e göre farklı bir ilgi vardır. PFV inç ve nükleaz heparin sepharose üzerinden doğrusal bir degrade elüsyon tarafından ayrılmış. Nükleaz kolayca 280 nm pik ultraviyole (UV) Absorbans veya analitik Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) tarafından algılanmaz. Bunun yerine, nükleaz supercoiled plazmid dönüşüm rahat daire veya doğrusal ürünler için istihdam nükleaz etkinliği tahlil tarafından algılanır. Heparin sepharose Kromatografi takip her kesir nükleaz etkinlik için test edilmiştir. PFV inç ve nükleaz kirletici Mono-Q anyon reçine için ilgi hiçbir fark var. Mono-S katyon reçine için ilgi küçük bir fark vardır. Ancak, Mono-S çözünürlüğe bakteriyel nükleaz ve PFV inç proteinlerin verimli ayrılık izin vermez. Sonuçta, heparin sepharose benzeşme arıtma PFV inç sunar bakteriyel nükleaz en iyi ayrılması ve sınırsız yük hacmi bir avantaja sahiptir.

Nükleaz etkinlik kirletici için test diğer proteinler için adapte olabilir. Faiz protein alternatif benzeşimi özelliklerini PFV inç daha büyük olasılıkla olacak; protein faiz ve nükleaz kirletici özelliklerini bağlama fark ampirik olarak belirlenmelidir. Nükleaz kirlenme tanımlamak için bu yöntem Mono-S katyon veya Mono-Q anyon Satım reçineler de dahil olmak üzere diğer reçineler adapte olabilir. Benzeşme ve iyon değiştirme reçineler enzimler protein birimdeki sınırsız Kromatografi sırasında bulaşıcı üzerinden ilgi rekombinant protein izole etmek için güvenilir bir yöntem sunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PFV neden E. coli ifadede

  1. PFV inç ifade plazmid (10 ng/μL) 1 μL E. coli BL21(DE3) pLysS 20 μL için Ekle (20 μL aliquot piyasada bulunan hücre vardır > 2 x 106 CFU/μg plazmid) 1,5 mL tüp içinde. Hafifçe dokunarak veya tüp flicking finger ile karıştırın. Kuluçkaya on Ice 5 dak.
    1. Isı şok tam olarak 30 42 ˚C s su banyosu ve 2 min için buz hemen dönün.
    2. Süper en uygun oda sıcaklığında suyu catabolite baskı (SOC) medya ile 80 μL ekleyin. 37 ˚C sallayarak dakikada (devir/dakika) 225 devrimler ile 1 h için kuluçkaya.
    3. Bir 100 mm x 15 mm Petri kabına 25 mL Luria suyu (LB) agar içeren tarih karışımı 25 μL plaka (1 L LB agar: 10 g bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g maya ekstresi, 15 g agar) ve 100 μg/mL Ampisilin (100 mg/mL stok çözelti).
    4. İkinci aynı tabakta dönüştürülmüş hücrelerin kalan 75 μL plaka. Gecede 37 ° C'de aşağı kapakları ile plakalar kuluçkaya
  2. Plakaları almak dönüştürülmüş E. coli. 3 mL LB aşılamak için bir koloni kullanın (1 L LB: 10 g bacto-tryptone, 10 gram NaCl, 5 g maya özü) bir 14-mL yuvarlak alt polipropilen kültür tüp 100 μg/mL Ampisilin ile desteklenmiştir. 225 rpm sallayarak ile 37 ˚C ~ 8 h için kuluçkaya.
    1. Kültür 3 mL 50 mL LB 100 μg/mL Ampisilin ve 34 μg/mL kloramfenikol (34 mg/mL stok çözelti) 250 ml Erlenmeyer şişesi ile takıma ekleyin. Gecede 37 ° C'de 225 rpm sallayarak ile Kültür kuluçkaya.
    2. Kültür 53 mL 1 L LB, 100 μg/mL Ampisilin ve 34 μg/mL kloramfenikol içinde 4 L Erlenmeyer flask aktarın. 37 ° C'de 225 rpm sallayarak ile kuluçkaya.
    3. 600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) kültürünün düzenli olarak. Başlangıçta, kültür OD600 her saat kontrol edin. Kültür istenen OD600ulaştığı gibi her 15 dakikada değil sarmak için kontrol edin. Kültür bir OD600 arasında 0,9 ve 1.0 için büyür. Şişeye bir buz banyosu aktarmak ve kültür sıcaklığını azaltmak için girdap.
  3. 1 mL kültür daha sonraki analizler için 1,5 mL tüp SDS-sayfa analizi denaturing tarafından aktarın.
    1. 14.000 x g oda sıcaklığında, microfuge içinde 1 dk aralıklarla tarafından 1.5 mL tüp hücrelerde cips. Süpernatant atmak. Pelet 150 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) pipetting tarafından resuspend. PBS ile veya olmadan CaCl2 ve MgCl2olabilir.
    2. 2 SDS-sayfa örnek arabellek x 150 μL ekleyin (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 1,2 SDS, % 30 gliserol, % 15 β-mercaptoethanol (βME), %0.0018 bromophenol mavi) ve damlalıklı veya girdap tarafından iyice karıştırın. -20 ° C'de 3 dk. deposu için kaynatın
  4. Bakteri kültürü ekleyin: 0,25 mM izopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.25 M hisse senedi çözüm) ve 50 mikron ZnCl2 (50 mM stok çözelti) son bir konsantrasyon. IPTG üzerinden T7 organizatörü PFV inç gen ifadesi indükler ve ZnCl2 PFV inç Incubate 4 h için 225 rpm'de hemen sallayarak ile Kültür 25 ° C'de bir amino terminal çinko parmak etki alanının doğru katlanır için ek olarak eklendi şişeye bir buz banyosu aktarın. 1 mL kültür SDS-sayfa analizi 1.3 içinde yukarıdaki gibi aynı protokol sonrası için sakla.
  5. Bakteri kültürü uygun ölçekli santrifüj şişe aktarın. Örneğin, bir 1 L kültür dört steril tek kullanımlık 250 mL konik alt polipropilen Şişeler için transfer edilebilir. 20 dk 4 ˚C az için 3000 x g de buzdolabında bir masa üstü santrifüj şişelerde spin. Supernatants dökerek atmak.
    1. Tüm 25 mL (6.25 mL şişe başına) soğuk PBS (ile ya da ezelî CaCl2 ve MgCl2) toplam hacmi 1 L bakteriyel kültüründe çökeltilerini pipetting tarafından resuspend. Birleştirmek ve bakteriyel süspansiyonlar bir 50 mL konik tüp için transfer. 3000 x g de soğutmalı santrifüj 4 ° C'de 20 dk içinde spin Süpernatant dökme veya pipetting atın.
  6. Bakteriyel Pelet 10 mL resuspension arabellekte (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl ve 500 mikron phenylmethylsulfanoxide (PMSF) proteaz inhibitörü) pipetting tarafından resuspend. Ek bir Dewar şişesi ile sıvı azot 50 mL tüp daldırın için yeterli tüp yerleştirerek Pelet dondur. Dikkatle sıvı azot tüpü çıkarması ve-80 ° C'de depolayın
    Not: Bakteriyel granül birkaç ay-80 ° C'de depolanmış olabilir -80 ° C depolama iki yıldır takip aktif protein kaybı olmadan gördük.
  7. İndüksiyon öncesi ve sonrası indüksiyon örnekleri 8.3 cm genişliğinde, 7,3 cm yüksek, 0,75 mm kalın SDS-sayfa jelleri katman yığınlama 1,5 mL % 6 polyacrylamide ile analiz (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 6 Akrilamid, % 0,1 SDS, % 0,1 amonyum persülfat, %0,001 TEMED) ve 3,5 mL % 10 Katman çözme polyacrylamide (375 mM Tris-HCl, pH 8.8, % 10 Akrilamid, % 0,1 SDS, % 0,1 amonyum persülfat, % 0.001 TEMED)12.
    1. Yığın jel dökme sonra 10 iyi tarak yerleştirin. Jel polimerli ne zaman sayfa aparatı monte ve yeterli SDS-sayfa çalışan arabellek (25 mM Tris, 192 mM glisin, % 0,1 SDS) ekleyin.
    2. Her örneğinin 10 μL ve prestained protein standartların 4 μL yük. Boya açık alt jel, yaklaşık 60 dk ulaşıncaya kadar 16,5 V/cm çalıştırın.
    3. Jel levha sökmeye ve jel için plastik bir küvet aktarın. Coomassie parlak mavi çözüm (%0.1 Coomassie parlak mavi R-250, % 40 metanol, % 10 Asetik asit) cömertçe jel kapak ve ortam sıcaklığı, 20 dk için leke için boyama ekleyin.
    4. Boyama çözüm dökerek kaldırın ve eski yerine koymak ile çözüm (% 40 metanol, % 10 Asetik asit) destain bantları kolayca görünür hale gelene kadar. Destaining çözüm dökerek kaldırın ve deiyonize su ile değiştirin. PFV inç sonrası indüksiyon örnekte kolaylıkla tanımlanmalıdır. PFV inç hexahistidine etiketi ile 47374 Da bir moleküler ağırlık vardır.
    5. PFV inç görünür değilse, bir dönüşüm plakaların farklı bir koloni ile başlayan indüksiyon yineleyin.

2. nikel benzeşme Kromatografi

  1. Bir bakteriyel Pelet buz çözme.
    Not: Bu önemli zaman (yaklaşık 2-3 h) alacak. Pelet hücre Bulamaç çözdürülen, ek bir 500 mikron PMSF (100 mM stok çözelti) ekleyin.
  2. 50 mL tüp bakteri Bulamaç buz üzerinde tutun. Bakteri için %30 30 genlik adlı solüsyon içeren temizleyicide s (1 s, 1 kapalı s) 1 L kültür 0,125 inç çapında 0,5 inç çapında biyolojik boynuzlu bir sonicator kullanarak elde Pelet başına konik microtip, 20 kHz frekans ve 400 W. maksimum güç
  3. Hücre örnek bir soğuk ultracentrifuge tüp aktarın. Polikarbonat şişe (25 mm çapında, 89 mm yükseklik) bir türü 60 Ti sabit açılı rotor ile uyumlu kullanabileceksiniz. Eğer aynı yerçekimi kuvveti elde alternatif tüpler ve rotorlar kullanılabilir. Spin 120.000 x g 4 ° C'de 60 dk Bariz bir Pelet olmalıdır. Süpernatant sarı bir renk olabilir.
  4. Süpernatant dökme veya soğuk 50 mL konik tüp pipetting aktarın. Not Ses; Bu birim yaklaşık buz gibi ek önce kullanılan resuspension arabellek hacmi olmalıdır. Süpernatant viskoz ise, Kromatografi sütun yapışmasına neden bakteriyel DNA tarafından kirlenmiş. Bu durumda, bakteriyel DNA cips ultrasantrifüj yineleyin.
  5. 500 mL hazırlamak bir (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 mikron PMSF) tampon ve 500 mL arabellek B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 mikron PMSF, 200 mM imidazole).
    Not: Bu protokol için hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistemi, tüm tamponları ve örnek 4 ° C soğuk bir odada tutun.
    1. Steril filtre arabelleği A ve B 0,2 mikron tek kullanımlık filtre cihazları ile. FPLC sistemine bağlı olarak, yıkama pompası A ve pompa B arabellek A ve arabellek B, sırasıyla. Akış Arabellek A % 90 ve % 10 arabellek B iletkenlik ve UV okuma stabilize kadar sistemi aracılığıyla. Maksimum akış hızı araç üzerinde bağlıdır; bir akış hızı 5 mL/dk 1.0 MPa maksimum basınç limit ile kullanın.
  6. 110 mm uzunluğunda, 5 mm çap FPLC sütun 1,5 mL nikel-ücret reçine ile hazırlamak (en fazla bağlama kapasitesi 50 mg/mL, maksimum basınç 1 MPa). Sütun bir gün arıtma önce hazırlanan ve 4 ˚C depolanır.
  7. Sütun FPLC araç olarak bağlayın. Sütun ile tampon A % 90 ve % 10 arabellek B (20 mM imidazole) bir akış hızı 0.5 mL/dk 20 mL 0.5 MPa maksimum basınç sınırı ile equilibrate. Araç iletkenlik ve 280 Absorbans UV gerçek zamanlı veri toplama nm (bir280). İletkenlik ve UV okuma stabilize. Bu ölçümler stabilize değil, akışı arabelleği üzerinden sütun için kararlı oldukları kadar devam.
  8. 0,15 mL/dk Debi maksimum basınç sınırı 0.5 MPa olan adresindeki sütun için protein örnek (~ 10 mL başına pelet) yükleyin. Debisi ve sütun basıncı arıtma boyunca aynı kalır. 50 mL tüp aracılığıyla akış toplamak.
    1. Sütun yıkama 20 mL arabellek A % 90 ve % 10 ile arabellek B. toplamak bir 50 mL tüp yıkama. Proteinler 20 mL doğrusal gradyan, %10 100 arabellek B (20 mM 200 mM imidazole için) ile elute.
    2. Son olarak, sütun 5 mL %100 arabellek B (200 mM imidazole) ile yıkayın. Degrade ve son yıkama toplamak 0,27 mL kesirler.
  9. 2 x SDS-sayfa örnek arabelleği 15 μL 15 μL akışı aracılığıyla, yıkama ve tepe A280 kesirler ile birleştirir. Örnekleri 3 dakika kaynatın.
    1. İki %10 15 iyi tarak adımla 1.6 dışında daha önce açıklandığı gibi SDS-sayfa jelleri hazırlayın. Her örneği için jeller 10 μL ve prestained protein standartların 4 μL yük. Koşmak, leke ve jelleri 1.6 adımda anlatıldığı gibi analiz.
    2. Neredeyse saf PFV inç görsel inceleme üzerine dayalı içerecek şekilde görünür kesirler birleştirin. Pipetting tarafından genellikle 8-10 mL birimin tedbir.
    3. Bir Spektrofotometre kullanarak, birleştirilmiş kesirler A280 ölçmek ve PFV inç protein, toplam miktarı; ~ 10 mg-L indüklenen kültür bizim tipik verimidir. PFV inç yok olma katsayısı hexahistidine etiketiyle 59360 cm-1 M-1olduğunu.
  10. Hexahistidine etiketi kaldırmak için PFV inç ile 10 mM dithiothreitol (DTT, 1 M hisse senedi çözüm) ve 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M stok çözelti) ek. İnsan rhinovirus (HRV) 3 C proteaz mg PFV inç Incubate başına 15 μg gecede 4 ˚C ekleyin. Bölünme PFV inç molekül ağırlığı 47374 Da 44394 Da azaltır ve % 10 SDS-sayfa analizi tarafından doğrulanmadı.

3. heparin benzeşme Kromatografi

  1. 250 mL hazırlamak arabellek C (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 mikron PMSF) ve 250 mL arabellek D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 mikron PMSF, 1 M NaCl).
    Not: Bu protokol için FPLC sistem, tamponlar ve örnek 4 ˚C, soğuk bir odada tutulur.
    1. Steril filtre arabelleği C ve D 0,2 mikron tek kullanımlık filtre cihazları ile. FPLC sistemine bağlı olarak, yıkama pompası A ve pompa B arabellek C ve arabellek D, sırasıyla. Akış Arabellek C % 80 ve % 20 arabellek D iletkenlik ve UV okuma stabilize kadar sistemi aracılığıyla. Maksimum akış hızı araç üzerinde bağlıdır; Biz rutin 1.0 MPa maksimum basınç limit ile bir akış hızı 5 mL/dk kullanın.
  2. Bir 80 mm uzunluğunda, 5 mm çap FPLC sütun 1 mL heparin sepharose reçine (bağlama kapasitesi sığır 2.0 mg mL başına Antitrombin III reçine; maksimum basınç 1.4 MPa maksimum) ile hazırlayın. Sütun bir gün arıtma önce hazırlanan ve 4 ° C'de depolanan Sütun FPLC araç olarak bağlayın.
    1. Maksimum basınç sınırı 1 MPa olan arabellek C % 80 ve % 20 arabellek D (200 mM NaCl) bir akış hızı 0.5 mL/dk 20 mL ile sütun equilibrate. Araç iletkenlik ve 280 Absorbans UV gerçek zamanlı veri toplama nm (bir280). İletkenlik ve UV okuma stabilize. Bu ölçümler stabilize değil, akışı arabelleği üzerinden sütun için kararlı oldukları kadar devam.
  3. PFV inç örnek 200 mm NaCl konsantrasyon 1,5 birimleri arabellek C. ekleyerek azaltmak Örneğin, 10 mL PFV inç için arabellek C 15 mL ekleyin Bizim toplam genellikle ~ 25 mL birimdir.
  4. Yük heparin sepharose sütun, 0.5 mL/dk akış hızı maksimum basınç ile seyreltilmiş PFV inç örneğe 1.0 MPa sınırlayın. Debisi ve sütun basıncı arıtma boyunca aynı kalır. 50 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak.
    1. Yıkama sütun 20 mL % 80'i arabellek C ve arabellek D (200 mM NaCl), % 20 ile 50 mL konik tüp makinaya toplama. Sütun (200 mM 1 M NaCl ile) 30 mL doğrusal gradyan, %20 100 arabellek D ile elute.
    2. Yıkama sütun 5 mL % 100 arabellek d. ile 0.37 mL kesirler degrade ve son makinaya toplamak.
  5. Yük, akış, yıkama ve kesirler 8 oranında analiz SDS-sayfa 2.9 içinde açıklandığı gibi. 44394 Da bir molekül ağırlığı PFV bölünme hexahistidine etiketinin aşağıdaki inç var ve yok olma katsayısı 59360 cm-1 M-1 hexahistidine etiketi olmadan kalır. 4 ˚C, tüm kesirler nükleaz tahlil tamamlanması kadar saklayın.

4. nükleaz tahlil

  1. Neredeyse saf PFV inç birleştirmek 3 μL heparin kesir ve 50 içerecek şekilde görünür heparin sepharose kesirler tanımlamak ng 3 KB supercoiled plazmid DNA tepki tampon (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 mikron ZnCl2 10 mM DTT) 15 μL son hacmi ile. 90 dk. Ekle bir negatif kontrol için 37 ˚C ile hiçbir PFV inç, kuluçkaya
    1. 1 mg/mL İndinavir K ile Reaksiyonu (20 mg/mL stok çözelti) DurdurveÇoğaltma % 0.5 SDS (% 10 hisse senedi çözüm). 1 h. örnekleri daha sonraki analizler için-20 ° C'de depolanmış olabilir için 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. 125 mL jel % 1 kilo başına birim (w/v) özel 1 x TAE tampon (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) 0.1 µg/mL arasında etidyum bromür (10 mg/mL stok çözelti)13ile hazırlayın. Özel çözüm eritin ve bir 15 cm x 10 cm jel döküm tepsiye dökün. 15 iyi tarak 5 mm genişliğinde, 0,75 mm kalın kuyu ile ekleyin. İnce wells 1.5 mm kalınlığında wells için karşılaştırıldığında daha iyi grup çözünürlük verim. Ortam sıcaklığında katılaşmaya jel izin.
    1. 1 jel bırakın 0.1 µg/mL arasında etidyum bromür ile x TAE. Boya (% 50 gliserol, % 0.15 Orange G boya) yükleme x 6 3.5 μL nükleaz tahlil reaksiyonlar için ekleyin. Birimin tümü jel için yükleyin. Jel sabit voltaj, cm (100 V), ortam sıcaklığında 1 h için veya Orange G boya açık jel sonuna ulaşana kadar başına 10 volt çalıştırın.
  3. Hemen özel jel etidyum bromür algılamak için ayarla floresan bir tarayıcı ile resim. Doğrusal DNA 3 kb boyutu sadık çalıştırmalısınız, supercoiled DNA daha hızlı (~ 2 kb) çalıştırmalısınız ve rahat daire DNA yavaş (~3.5 kb) çalıştırmalısınız.
    1. Görüntü analiz yazılımı kullanarak, her şeritte supercoiled, doğrusal ve rahat daire plazmid piksel hacmi hesaplama. Birimler bu üç DNA formu "Toplam DNA" için değer ve doğrusal ve rahat daireler yüzdesini hesaplamak için kullanabilirsiniz piksel toplamı ara. Örneğin, rahat daireler piksel hacmi toplam DNA piksel değeri bu şeritte bölünür, bu numarayı bir yüzde belirlemek için 100 ile çarpmak. Bulaşıcı nükleaz içeren kesirleri doğrusal ve rahat daireler negatif denetimine göre daha yüksek bir yüzdesi görüntüler.
  4. Bulaşıcı nükleaz faaliyet gösterme heparin sepharose kesirler birleştirin. 10 mm 6-8 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) diyaliz boru 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 mikron ZnCl2, 10 mM DTT, % 20 gliserol karşı gecede 4 ° C'de diyaliz.
  5. Nükleaz serbest PFV inç örnek gelen diyaliz boru kurtarmak. A280 ölçmek ve son protein konsantrasyonu hesaplayın. Aliquot ve ek sıvı azot dondur. Aliquots-80 ° C'de depolayın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinant PFV inç genellikle bakteriyel nükleaz1ile kirlenmiş. Biyokimyasal Tümleştirme deneyleri supercoiled plazmid DNA dönüşüm rahat daireler ve doğrusal ürünlerini Nefelometri bağlıdır. Bulaşıcı bir nükleaz varlığı bu deneyleri sahte Nefelometri için neden olabilir. PFV inç ifade hexahistidine etiketi ile E. coli (şekil 1) indüklenen ve ilk saf nikel benzeşme Kromatografi (Şekil 2). Kesirler neredeyse saf PFV inç ile birleştirilir ve hexahistidine etiket bir proteaz tarafından i ciddi. PFV inç ve bulaşıcı nükleaz heparin sepharose Kromatografi (şekil 3)1için farklı benzeşim olduğunu belirlediler. Heparin sepharose Kromatografi takip PFV inç kesirler için rahat daireler tahlil için supercoiled bir Plazmid ve doğrusallaştırılmış plazmid ile ürünler nükleaz faaliyet (şekil 4) inkübe. Bu tahlil protein kesirler nükleaz (şekil 5) olmadan tanımlamasını sağlar. Bu kesirler kombine, diyaliz ve gelecekteki deneyler için dondurulmuş.

Figure 1
Şekil 1: İndüksiyon E. coli olarak içinde PFV . Hücreleri (lane 2) önce kültürlerden ve (lane 3) indüksiyon analiz sonra PFV inç, 47374 da örnekleri varlığı için % 10 oranında ayrı kaldık SDS-sayfa ve Coomassie ile parlak mavi lekeli. 1 yolu, molekül ağırlığı işaretleri (kDa). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Nikel benzeşme Kromatografi kesirler. Çözünür bakteriyel lysates nikel benzeşme Kromatografi tarafından ayrı kaldık. PFV inç hexahistidine etiketi ile 20 mm 200 mM imidazole için doğrusal gradyan ile eluted. Kesirler % 10 oranında değerlendirilmiştir SDS-sayfa ve Coomassie ile parlak mavi lekeli. PFV inç, 47374 Da, sütun (yük) yüklü örnek kolayca açıkça görülür, ancak daha az belirgin akışı veya yıkama. Erken imidazole degradede yaygın olarak elute kesirler 75 kDa yanı sıra bazı daha hızlı hareket eden kirletici yakınındaki bir daha yavaş hareket eden geçen madde veya 25 kDa altında görüntüler. İmidazole daha yüksek konsantrasyonları orada kolayca belirgin hiçbir kirletici ve PFV inç nispeten saf gibi görünüyor. Bu örnekte, kesirler #33 #84 ile kombine ve daha fazla saf. Moleküler ağırlık işaretleri (kDa) her jel sol tarafta vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Heparin sepharose Kromatografi PFV ın 1 . Nikel benzeşme ve proteaz kaldırılması hexahistidine etiketi, heparin sepharose tarafından PFV (44394 Da) içinde şeker. Proteinler 200 mm'den doğrusal gradyan için 1 M NaCl ile eluted. Hatta kesirler #12 #44 8 SDS-sayfa Coomassie ile mavi lekeli oranında değerlendirildi. Moleküler ağırlık işaretleri (kDa) her jel sol tarafta vardır. Bu kesirler nükleaz etkinlik için test edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Nükleaz tahlil heparin sepharose kesirler 1 . Her heparin sepharose kesir supercoiled plazmid DNA eklendi. Kesir sayıları bu şekil 3' te gösterilen aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Kuluçka, nükleaz tepkiler deproteinated vardı ve % 1'özel etidyum bromür ile ayrılmış. Hiç protein (hedef sadece) ve vahşi türü PFV inç (PFV inç WT) nükleaz ücretsiz olarak bilinen önceki bir arınma plazmid DNA negatif denetimler içerir. Nükleaz etkinlik kirletici için olumlu bulaşıcı nükleaz (PFV inç D128N) sahip olduğu bilinmektedir catalytically etkin olmayan PFV inç önceki bir arınma denetimdir. DNA boyutu işaretlerine kb cinsinden gösterilir. Supercoiled plazmid (SC), doğrusal plazmid (L) ve rahat daireler (RC) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Nükleaz deneyleri Nefelometri 1. özel jelleri inceden inceye gözden geçirmek ve piksel değerlerini supercoiled (SC), doğrusal (L) ve her lane bantlarında rahat daire (RC) için sayısal. Kesir sayıları bu rakamlar 3 ve 4 gösterildiği aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Doğrusal ve rahat daireler oranlarda piksel değerlerini ve gösterilen Denklem kullanılarak hesaplanır. Kesir #12 bantları vardır örneğin, piksel değerleri: 817636 supercoiled plazmid, 50467 doğrusal Plazmid ve 112052 rahat daireler. Toplam DNA piksel değeri kesir #12 için bu değerleri, 980155 toplamıdır. Doğrusal DNA yüzde 100 ile çarpılır ve toplam DNA değerine göre % 5.1 eşit bölünmüş 50467 yüzdesidir. 100 ile çarpılmış ve % 11.4 eşit toplam DNA değerine göre bölünmüş 112052 rahat daireler yüzdesidir. Doğrusal ve rahat daire yüzde %16,5 toplamıdır. Hiç protein (inç, alt grafik) ile negatif kontrol plazmid DNA plazmid bu hazırlanması doğrusal veya rahat daireler olarak toplam DNA'ın % 4.4 dahil gösterir. İkinci bir negatif kontrol vahşi türü PFV inç (WT) toplam DNA'ın % 8,6 doğrusal veya rahat daireler olarak görüntülenen önceki bir arınma yapıldı. Bu iki denetim yolları parçalanmış veya doğrusallaştırılmış plazmid substrat yalnız ve PFV inç ile mevcut arka plan düzeyini gösteren Catalytically etkin olmayan PFV toplam DNA'ın % 23 doğrusal ve rahat daireler vardı inç (D128N) önceki bir arınma olumlu bir denetimdir. Heparin sepharose kesirler #12 #22 aracılığıyla maruz DNA sonuçlandı > doğrusal ve rahat daireler olarak DNA'ın % 10. Bu örnekte, görüntülenen kesirler #24-#42 < % 10 dönüşüm için doğrusal ve rahat daireler. Bu kesirler kombine ve diyaliz. Aliquots donmuş ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA onarım proteinler, tek molekül mikroskobu uygulamalar veya retroviral integrases, oksijen gidericiler gibi DNA ile etkileşim rekombinant proteinler bakteriyel nükleaz2,3bulaşıcı özgür olmalıdır. Bu kirleticiler sonuçları yorumlama toplu biyokimyasal veya tek molekül deneyleri sırasında karışabilir.

Biz bir bakteriyel nükleaz sık PFV inç ile birlikte arındırır olduğunu bulduk Ancak, PFV inç bakteriyel nükleaz geçen madde1ile kolayca ayırt edilebilir heparin sepharose bir ilgi gösterir. Degrade elüsyon heparin sepharose takip her kesir faaliyete nükleaz dikkatli Nefelometri nükleaz ücretsiz PFV inç hazırlanması için anahtardır. Geçişin PFV inç ayrılması nükleaz kirletici izin vermek için yeterince sığ olması gerekir; dik bir degrade etkin ayırma ile uyumlu olmayabilir. Ayrıca, plazmid DNA substrat rahat daireler nükleaz tahlil arka plan azaltmak için düşük bir yüzde olması gerekir. Plazmid DNA substrat rahat daireler yüksek bir arka plan varsa, plazmid DNA yeni bir arınma yapılmalıdır. Nükleaz etkinliği tahlil bulaşıcı nükleaz ve atılmalıdır kesirler varlığı ortaya koymaktadır.

Bazı durumlarda, boyutu dışlama Kromatografi (sn) bulaşıcı nükleaz2kaldırılması için etkili bir yöntem olabilir. Önceki gruplar sn PFV inç4saflaştırılması sırasında kullandık. SN sınırlı yük hacme sahip ve en son protein konsantrasyonu azaltmak eğilimindedir. En büyük avantajı benzeşme ve iyon Kromatografi sn daha önemli ölçüde daha büyük bir hacim yük yeteneğidir

Nükleaz etkinlik için test bir bakteriyel nükleaz ile birlikte arındırmak farklı proteinler adapte olabilir. Burada bu PFV inç tanımlamak ve bulaşıcı nükleaz heparin sepharose Kromatografi tarafından ayrılmış. Biz daha önce PFV inç nükleaz Mono-S katyon ve bu reçineler bu protein için uygun olmayan hale Mono-Q anyon Satım Kromatografi ile benzer bir profile sahip olduğunu göstermektedir. Nükleaz ile ilgili olarak istenen protein benzeşimi özelliklerini bağlı olarak, bu iletişim kuralını benzeşme veya iyon değiştirme reçineler ve degrade elüsyon ile kullanılabilir. Etkili nükleaz kontaminasyon kaldırılması için anahtar--dan bir protein ilgi bir reçine için ilgi içinde bir fark vardır. Her kesir nükleaz etkinlik için denetlesinler gerekir. Bu protokol Kromatografi reçineler ile bakteri enzimler işbirliği arındırmak tüm proteinler için doğrudan uygulanmayabilir. Ancak, faiz ve raporlaması kesirler nükleaz etkinliği için bir protein nükleaz ayırmak için bir benzeşme veya iyon değiştirme reçine kullanarak genel kavram genel olarak uygulanabilir olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser NIH AI099854 ve AI126742 için anahtar tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics