Detección y eliminación de nucleasa contaminación durante la purificación de prototipo recombinante Virus Espumoso integrasa

Immunology and Infection

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Summary

Proteína de integrasa prototipo recombinante virus espumoso está a menudo contaminada con una nucleasa bacteriana durante la purificación. Este método identifica la contaminación nucleasa y lo quita de la preparación final de la enzima.

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Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

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Abstract

La proteína integrasa (IN) de los virus espumoso del prototipo de retrovirus (PFV) es una enzima de modelo para estudiar el mecanismo de integración retroviral. Comparado con el IN de otros retrovirus, en PFV es más soluble y más susceptibles a la manipulación experimental. Además, es sensible a los inhibidores IN clínicamente relevantes virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1), sugiriendo que el mecanismo catalítico de PFV es similar a la que del VIH-1 in en cataliza la unión covalente de viral DNA complementaria (cDNA) al destino ADN en un proceso llamado transferencia de cadena. Esta reacción de transferencia de cadena presenta mellas el ADN diana. Análisis de productos de la reacción de integración puede ser confundido por la presencia de nucleasas que igualmente nick ADN. Una nucleasa bacteriana se ha demostrado para purificar conjuntamente con PFV recombinante expresado en Escherichia coli (e. coli). Aquí se describe un método para aislar en PFV de nucleasas contaminantes por cromatografía de afinidad de heparina. Fracciones son fácilmente evaluadas por contaminación de nucleasa con un plásmido superenrollado y electroforesis en gel de agarosa. EN PFV y nucleasas contaminantes muestran afinidades alternativas para heparina sepharose permitiendo una preparación libre de nucleasa de recombinantes en PFV adecuado para análisis bioquímicos o de una sola molécula de a granel de la integración.

Introduction

Estudios bioquímicos y una sola molécula de interacciones de proteínas con ADN requieren proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminando las nucleasas de bacterias puede ocultar los resultados de estos ensayos. Una nucleasa contaminante se ha encontrado en preparaciones de proteínas recombinantes oxígeno carroñero protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) y prototipo virus espumoso (PFV) integrasa (IN) aislados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.

Ensayos de integración retroviral se basan en la conversión de ADN superenrollado productos mellada o lineal como una medida de la actividad4. Durante la infección celular IN se une a los dos extremos de un cDNA viral al host cromatina5. Cada extremo a la reacción se denomina transferencia de cadena. Ensayos del recombinante en actividad puede unirse dos oligomeros DNA mímico el cDNA viral termina con un objetivo de ADN en una reacción de integración concertada de5,4,6,7,8. Alternativamente IN recombinante puede unirse solamente un extremo de ADN en un sitio medio no fisiológico relevante integración reacción9,10. Cuando DNA plasmídico superenrollado es el objetivo de integración, integración concertada son productos lineal ADN y medio productos de integración son círculos relajados. Estos productos de reacción son identificados por su movilidad relativa en gel de agarosa electroforesis1. Si la IN recombinante tiene una nucleasa contaminante, habrá falsos círculos relajados o un plásmido linearizado posiblemente confundir los resultados experimentales. Oligómeros de DNA virales pueden etiquetarse fluorescencia para identificar concluyente productos de integración, en comparación con productos de nucleasa. Sin embargo, en gran medida favorece objetivos de ADN superenrollados; cualquier pérdida del plásmido superenrollado círculos relajados o DNA linear por nucleasas contaminantes podría sesgar resultados e interpretación de datos11. Así es indispensable para quitar las nucleasas bacterianas de retrovirales en los preparativos.

PFV en tiene una afinidad diferente para sepharose heparina en comparación con la de nucleasas bacterianas1. PFV en y la nucleasa pueden estar separados por una elución gradiente lineal de sepharose de heparina. La nucleasa no se detecta fácilmente por una absorbancia (UV) ULTRAVIOLETA en pico nm 280 o por electroforesis en gel de poliacrilamida analítica sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE). En cambio, la nucleasa es detectado por un análisis de la actividad de nucleasa utilizando la conversión de un plásmido superenrollado en círculos relajados o productos lineales. Cada fracción siguiente cromatografía de sepharose de heparina se comprueba actividad nucleasa. PFV en y el contaminante de nucleasa no tienen ninguna diferencia en la afinidad de la resina de anión Mono-Q. Hay una pequeña diferencia en la afinidad de la resina de catión Mono-S. Sin embargo, la resolución Mono-S de nucleasas bacterianas y en PFV no permitiría la separación eficiente de las proteínas. En última instancia, heparina sepharose afinidad purificación ofrece la mejor separación de nucleasas bacterianas de PFV en y tiene la ventaja del volumen de carga ilimitado.

Pruebas de contaminación actividad nucleasa puede adaptarse a otras proteínas. La proteína de interés probablemente tendrá características de afinidad alternativos que PFV en; la diferencia de enlace características de la proteína de interés y el contaminante de nucleasa debe determinarse empíricamente. Esta metodología para identificar la contaminación de la nucleasa puede adaptarse a otras resinas como cationes Mono-S o resinas de intercambio de aniones Mono-Q. Resinas de afinidad e intercambio iónico pueden ofrecer un método confiable para aislar una proteína recombinante de interés contaminen las nucleasas sin límites en el volumen de proteína durante la cromatografía.

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Protocol

1. inducir PFV en expresión de e. coli

  1. Añadir 1 μL del plásmido de expresión en PFV (10 ng/μL) a 20 μL de e. coli BL21(DE3) pLysS (20 alícuota μL de las células disponibles comercialmente tiene > 2 x 106 UFC/μg plásmido) en un tubo de 1,5 mL. Mezclar suavemente con el dedo golpeando o sacudiendo el tubo. Incubar en hielo 5 minutos.
    1. Choque por exactamente 30 de calor s en a 42 ° c baño de agua y se vuelve inmediatamente hielo por 2 min.
    2. Añadir 80 μL de caldo super óptima temperatura ambiente con los medios de comunicación (SOC) de represión catabólica. Incubar durante 1 h a 37 ° c con 225 revoluciones por minuto (rpm) temblor.
    3. Placa de 25 μL de la mezcla en un 100 x 15 mm placa de Petri que contiene 25 mL de agar caldo (LB) de Luria (agar LB de 1 L: 10 g de bacto-triptona, 10 g de NaCl, extracto de levadura 5 g, agar 15 g) y 100 μg/mL ampicilina (100 mg/mL de solución stock).
    4. El restante 75 μL de las células transformadas en una segunda placa idéntica de la placa. Incubar las placas con las tapas hacia abajo durante la noche a 37 ° C.
  2. Recuperar las placas de transformados e. coli. Utilice una sola Colonia para inocular 3 mL de LB (L 1 LB: 10 g de bacto-triptona, 10 g de NaCl, 5 g de levadura extracto) suplementado con ampicilina 100 de μg/mL en un tubo de cultivo de polipropileno de 14 mL de fondo redondo. Incubar durante 8 h a 37 ° c con agitación de 225 rpm.
    1. Añadir 3 mL del cultivo a 50 mL LB suplementado con 100 μg/mL ampicilina y cloranfenicol 34 μg/mL (solución stock de 34 mg/mL) en un erlenmeyer de 250 mL. Incubar el cultivo durante la noche a 37 ° C con agitación de 225 rpm.
    2. Transferir los 53 mL de cultura a L 1 LB ampicilina 100 de μg/mL y 34 cloranfenicol μg/mL en un erlenmeyer de 4 L. Incubar a 37 ° C con agitación de 225 rpm.
    3. Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) de la cultura periódicamente. Inicialmente, verifique la cultura OD600 cada h. Como la cultura alcanza el deseado OD600, compruebe cada 15 min que no cubran. Crecer la cultura a un OD600 entre 0.9 y 1.0. Transferir el matraz en un baño de hielo y agitar para reducir la temperatura de la cultura.
  3. Transferir 1 mL del cultivo a un tubo de 1,5 mL para su posterior análisis por desnaturalización análisis de SDS-PAGE.
    1. Sedimenten las células en el tubo de 1,5 mL por centrifugación durante 1 minutos en una microcentrífuga a 14.000 x g a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 150 μL tampón fosfato salino (PBS) por pipeteo. El PBS puede ser con o sin CaCl2 y MgCl2.
    2. Añadir 150 μL de 2 x de tampón de SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1.2% SDS, 30% glicerol, 15% β-mercaptoetanol (βME), 0.0018% azul de bromofenol) y homogeneizar por pipeta o vórtice. Hervir durante 3 minutos almacenar a-20 ° C.
  4. Añadir a la cultura bacteriana: una concentración final de 0.25 mM isopropílico-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG, solución de 0,25 M) y 50 μM vivencias2 (solución 50 mM). IPTG induce la expresión del gen PFV IN desde el promotor de T7 y vivencias2 se agrega como un suplemento para el plegamiento correcto de un dominio de dedo de zinc terminal amino en PFV IN. Incubate el cultivo a 25 ° C con agitación a 225 rpm por 4 h. inmediatamente transferir el matraz en un baño de hielo. Guardar 1 mL de cultivo para el análisis de SDS-PAGE siguiendo el mismo protocolo que el anterior en 1.3.
  5. Transferir el cultivo bacteriano para botellas de tamaño apropiado de la centrífuga. Por ejemplo, una cultura 1 L puede transferirse a cuatro botellas de polipropileno de fondo cónico desechable estéril de 250 mL. Girar las botellas en una centrífuga de mesa refrigerada a 3000 x g por 20 min a 4 ° c. Deseche el sobrenadante vertiendo.
    1. Vuelva a suspender todos los diabolos de un cultivo bacteriano de 1 L en un volumen total de 25 mL (6,25 mL por frasco) PBS frío (con o sin CaCl2 y MgCl2) mediante pipeteo. Combinar y transferir la suspensión bacteriana a un tubo cónico de 50 mL. Girar en una centrífuga refrigerada a 3.000 x g durante 20 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante vertiendo o pipeteando.
  6. Resuspender el precipitado bacteriano en 10 mL de tampón de resuspensión (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl e inhibidor de la proteasa de la phenylmethylsulfanoxide (PMSF) de 500 μM) mediante pipeteo. Snap freeze el pellet colocando el tubo en un frasco Dewar con nitrógeno líquido suficiente para sumergir el tubo de 50 mL. Cuidadosamente retire el tubo de nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C.
    Nota: Pellet bacteriano se puede almacenar por varios meses a-80 ° C. No hemos visto pérdida de la proteína activa después de almacenaje de-80 ° C durante dos años.
  7. Analizar las muestras antes de la inducción y la inducción por 8,3 cm de ancho, 7,3 cm de alto, 0.75 m m gruesa de SDS-PAGE gel con poliacrilamida de 6% de 1,5 mL apilando capa (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, la acrilamida de 6%, 0.1% SDS, persulfato de amonio 0.1%, 0,001% TEMED) y 3,5 mL 10% poliacrilamida de resolución de capa (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, persulfato de amonio 10% acrilamida, 0.1% SDS, 0,1%, 0,001% TEMED)12.
    1. Después de verter el gel de apilamiento, coloque un peine bien 10. Cuando el gel ha polimerizado, montar el aparato de la página y añadir suficiente buffer correr de SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192 mM, 0.1% SDS).
    2. Coloque 10 μL de cada muestra y 4 μL de estándares prestained proteína. Ejecutar a 16,5 V/cm hasta el frente del tinte llega a la parte inferior del gel, aproximadamente 60 minutos.
    3. Desmonte las placas de gel y transferir el gel a un recipiente de plástico. Añadir Coomassie azul brillante coloración solución (0,1% R-250 azul brillante de Coomassie, 40% metanol, ácido acético al 10%) para cubrir el gel generosamente y la mancha por 20 min a temperatura ambiente.
    4. Eliminar la solución de tinción vertiendo y reemplazar con desteñir solución (40% de metanol, ácido acético al 10%) hasta que las bandas son fácilmente visibles. Eliminar la solución de extracción vertiendo y reemplazar con agua desionizada. PFV en deben ser fácilmente identificado en la muestra después de la inducción. PFV en con una etiqueta de hexahistidine tiene un peso molecular de 47374 Da.
    5. Si no está visible en PFV, repetir la inducción a partir de una colonia diferente de una de las placas de la transformación.

2. cromatografía de afinidad de níquel

  1. Descongelar un pellet bacteriano en el hielo.
    Nota: Esto le llevará un tiempo considerable (aproximadamente 2-3 h). Cuando el diábolo descongelado a una mezcla de células, agregar un adicional de 500 μM PMSF (solución stock de 100 mM).
  2. Mantenga el tubo de 50 mL de bacterias en el hielo de la mezcla. Someter a ultrasonidos las bacterias en 30% amplitud de 30 s (1 s a 1 s off) por pellets derivados de cultura de 1 L, utilizando un sonicador con un cuerno de bio de 0,5 pulgadas de diámetro con un diámetro de 0,125 pulgadas cónico microtip, una frecuencia de 20 kHz y una potencia máxima de 400 w.
  3. Transferir la muestra de células a un tubo de ultracentrífuga frío. Uso de policarbonato botella asambleas (25 mm de diámetro, altura de 89 mm) compatibles con un rotor de ángulo fijo tipo 60 Ti. Rotores y tubos alternativos pueden usarse si se alcanza la misma fuerza de gravitación. Spin x 120.000 g durante 60 min a 4 ° C. Debe haber una pelotilla obvio. El sobrenadante puede tener un color amarillo.
  4. Transferir el sobrenadante vertiendo o pipetear en un tubo cónico de 50 mL frío. Nota el volumen; Este volumen debe ser aproximadamente el volumen de buffer de resuspensión antes del snap de congelación. Si el sobrenadante es viscoso, pueden ser contaminada por ADN bacteriano que pueda obstruir la columna de cromatografía. En este caso, repita la ultracentrifugación para la pelotilla de la DNA bacteriana.
  5. Preparar 500 mL tampón un (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) y 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, imidazol de 200 mM).
    Nota: En este protocolo, mantener el sistema de cromatografía líquida (FPLC) proteína rápida, todos los búferes y la muestra a 4 ° C en una cámara fría.
    1. Filtro estéril búferes A y B, con 0,2 μm filtro desechable. Dependiendo del sistema FPLC, lave la bomba un y bomba B con Buffer A Buffer B y, respectivamente. Del flujo 90% un Buffer y 10% de tampón B a través del sistema hasta que se estabilicen las lecturas de la UV y conductividad. El caudal máximo depende del instrumento; utilizar un flujo de 5 mL/min con un límite de presión máxima de 1,0 MPa.
  6. Preparar una 110 mm largo, 5 mm diámetro FPLC columna con resina de níquel cargado de 1,5 mL (capacidad máxima 50 mg/mL, máxima presión de 1 MPa). La columna puede preparada el día antes de la purificación y almacenada a 4 ° c.
  7. Conecte la columna del instrumento FPLC. Equilibrar la columna con 20 mL de 90% A Buffer y 10% Buffer B (imidazol 20 mM) con un caudal de 0,5 mL/min con un límite máximo de presión de 0,5 MPa. El instrumento debe recoger datos en tiempo real de la conductividad y la absorbancia UV a 280 nm (un280). La conductividad y las lecturas de la UV deben estabilizar. Si estas lecturas no se han estabilizado, continuar buffers de flujo a través de la columna hasta que sean estables.
  8. La muestra de proteínas (~ 10 mL por pellets) de carga a la columna con un caudal de 0,15 mL/min con un límite máximo de presión de 0,5 MPa. La tasa y la columna de presión sigue siendo la misma a través de la purificación. Recoge el flujo a través de un tubo de 50 mL.
    1. Lavar la columna con 20 mL 90% un Buffer y 10% Buffer B. recoger el lavado en un tubo de 50 mL. Eluir las proteínas con un degradado lineal de 20 mL de 10% a 100% B Buffer (20 mM de imidazol de 200 mM).
    2. Por último, lavar la columna con 5 mL 100% Buffer B (imidazol de 200 mM). Recoger el lavado final y degradado en fracciones 0,27 mL.
  9. 15 μL de tampón de muestra 2 x SDS-PAGE se combinan con 15 μL del flujo a través, de lavado y pico A280 fracciones. Hervir las muestras por 3 minutos.
    1. Preparar dos 10% SDS-PAGE gel como se describió anteriormente en el paso 1.6 excepto con peines bien 15. Coloque 10 μL de cada muestra a los geles y 4 μL de estándares prestained proteína. Correr, la mancha y analizar los geles como se describe en el paso 1.6.
    2. Combinar fracciones que parecen contener casi puro en PFV basado en inspección visual. Medir el volumen de pipeteo, por lo general 8-10 mL.
    3. Utilizando un espectrofotómetro, A280 de las fracciones combinadas de medir y calcular la cantidad total de proteína en PFV; nuestro rendimiento típico es ~ 10 mg por L de cultura inducida. El coeficiente de extinción de PFV en con la etiqueta hexahistidine es 59360 cm-1 M-1.
  10. Para quitar la etiqueta de hexahistidine, suplemento PFV en 10 mM Ditiotreitol (DTT, solución stock de 1 M) y 0.1 mM EDTA, pH 8.0 (solución stock de 0,5 M). Añadir 15 μg de la proteasa 3C de rinovirus humanos (HRV) por mg PFV IN. Incubate a 4 ° c durante la noche. Reduce el peso molecular de PFV en de 47374 Da a Da 44394 y puede ser verificado por análisis de SDS-PAGE 10%.

3. cromatografía de afinidad heparina

  1. Preparar 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF) y 250 mL Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    Nota: En el presente Protocolo, el sistema FPLC, buffers y muestra se mantienen en una cámara fría a 4 ° c.
    1. Filtro estéril Buffers C y D con las unidades de filtro desechable de 0,2 μm. Dependiendo del sistema FPLC, lave la bomba un y bomba B con amortiguamiento C y Buffer D, respectivamente. Flujo tampón C el 80% y 20% D Buffer a través del sistema hasta que se estabilicen las lecturas de la UV y conductividad. El caudal máximo depende del instrumento; Utilizamos sistemáticamente un flujo de 5 mL/min con un límite de presión máxima de 1,0 MPa.
  2. Preparar una 80 mm largo, 5 mm diámetro FPLC columna con 1 mL de resina de sepharose de heparina (máxima capacidad 2.0 mg de bovino resina de antitrombina III por mL; máximo presión 1,4 MPa). La columna puede ser preparada el día antes de la purificación y almacenada a 4 ° C. Conecte la columna del instrumento FPLC.
    1. Equilibrar la columna con 20 mL de tampón C el 80% y 20% Buffer D (200 mM NaCl) a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min con un límite de presión máxima de 1 MPa. El instrumento debe recoger datos en tiempo real de la conductividad y la absorbancia UV a 280 nm (un280). La conductividad y las lecturas de la UV deben estabilizar. Si estas lecturas no se han estabilizado, continuar buffers de flujo a través de la columna hasta que sean estables.
  3. Reducir la concentración de NaCl de la muestra en PFV a 200 mM sumando 1,5 volúmenes de tampón C. Por ejemplo, añadir 15 mL de Buffer C 10 mL PFV pulg El volumen total es típicamente ~ 25 mL.
  4. Carga de la muestra diluida del PFV en a la columna sepharose de heparina a velocidad de flujo de 0,5 mL/min y presión máxima límite 1,0 MPa. La tasa y la columna de presión sigue siendo la misma a través de la purificación. Recoge el flujo a través de un tubo cónico de 50 mL.
    1. Lavar la columna con 20 mL de tampón C el 80% y 20% Buffer D 200 mM (NaCl), que recoge el lavado en un tubo cónico de 50 mL. Eluir la columna con un gradiente lineal de 30 mL de 20% a 100% Buffer D (200 mM a 1 M de NaCl).
    2. Lavar la columna con 5 mL de 100% Buffer D. recoja el gradiente y lavado final en fracciones de 0,37 mL.
  5. Análisis de la carga, flujo, lavado y fracciones por 8% SDS-PAGE como se describe en 2.9. PFV en tras la ruptura de la etiqueta de hexahistidine tiene un peso molecular de 44394 Da y el coeficiente de extinción sigue siendo 59360 cm-1 M-1 sin la etiqueta de hexahistidine. Guarde todas las fracciones en 4 ° c hasta la realización de una prueba de la nucleasa.

4. ensayo nucleasa

  1. Identificar fracciones de sepharose de heparina que parecen contener casi puro PFV pulg. combinar 3 μL de la fracción de heparina y 50 ng de 3 kb DNA plasmídico superenrollado en reacción buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM vivencias2 10 mM TDT) con un volumen final de 15 μL. Incubar a 37 ° c durante 90 minutos incluye un control negativo con no IN. PFV
    1. Detener la reacción con proteinasa K de 1 mg/mL (20 mg/mL de solución stock) y 0,5% SDS (solución stock al 10%). Incubar a 37 ° C por 1 h. muestras pueden ser almacenadas a-20 ° C para su posterior análisis.
  2. Preparar un gel de 125 mL de 1% en peso por volumen (p/v) de agarosa en buffer de x TAE 1 (40 mM Tris acetato, EDTA 1 mM) con 0,1 μg/mL etidio bromuro (solución stock de 10 mg/mL)13. La solución de agarosa del derretimiento y vierta en una bandeja de fundición de gel de 15 cm x 10 cm. Inserte un peine bien 15 pozos de espesor 0,75 mm ancho, 5 mm. Delgado pozos rinden mejor resolución de banda en comparación con los pozos de espesor 1,5 mm. Permita que el gel se solidifique a temperatura ambiente.
    1. Sumergir el gel en 1 x TAE con bromuro de etidio de 0.1 μg/mL. Añadir 3,5 μL de 6 x carga del tinte (50% glicerol, colorante de naranja G 0.15%) a las reacciones de prueba de la nucleasa. Carga todo el volumen del gel. Correr el gel a tensión constante, 10 voltios por cm (100 V) a temperatura ambiente durante 1 hora o hasta que el frente de tinte naranja G llega al final del gel.
  3. Inmediatamente la imagen del gel de agarosa con un analizador fluorescente para detectar bromuro de etidio. ADN lineal debe ejecutar tallaje a 3 kb, ADN superenrollado debe correr más rápido (~ 2 kb), y círculo relajado DNA debe ejecutar más lento (~3.5 kb).
    1. Usando software de análisis de imagen, calcular el volumen de píxeles del plásmido superenrollado, lineal y relajado círculo en cada carril. Llame a la suma del píxel volúmenes para estas tres formas de ADN "ADN total" valoran y usan para calcular el porcentaje de círculos lineales y relajados. Por ejemplo, el volumen de píxeles de círculos relajados se divide por el total valor de píxel de ADN en ese carril, multiplique este número por 100 para determinar un porcentaje. Fracciones que contienen contaminante nucleasa muestran un porcentaje más alto de círculos lineales y relajados en comparación con el control negativo.
  4. Combinar fracciones de sepharose de heparina que no muestran actividad de nucleasas contaminantes. Dializarse en 10 mm tubo corte del diálisis de 6-8 kDa peso molecular (MWCO) a 4 ° C durante la noche contra 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM vivencias2, 10 mM DTT, 20% de glicerol.
  5. Recuperar la muestra libre de nucleasa de PFV en tubo de diálisis. Mida A280 y calcular la concentración de la proteína final. Alícuota y complemento la congelación en nitrógeno líquido. Almacenar en alícuotas a-80 ° C.

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Representative Results

Recombinante en PFV está a menudo contaminada con nucleasas bacterianas1. Análisis bioquímico de la integración dependen de la cuantificación de la conversión de ADN de plásmido superenrollado en círculos relajados y productos lineales. La presencia de una nucleasa contaminante podría conducir a falsa cuantificación de estos ensayos. Expresión de PFV en con una etiqueta de hexahistidine es inducida en e. coli (figura 1) y primero se purificó por cromatografía de afinidad níquel (figura 2). Las fracciones con casi puro en PFV se combinan y la etiqueta hexahistidine es dividida por una proteasa. Hemos determinado que en PFV y nucleasas contaminantes tienen diferentes afinidades para heparina sepharose cromatografía (figura 3)1. Fracciones en PFV tras cromatografía de sepharose de heparina se incuban con un plásmido superenrollado a ensayo para círculos relajados y plásmido linearizado, producto de la actividad de nucleasa (figura 4). Este ensayo permite la identificación de fracciones de proteína sin nucleasa (figura 5). Estas fracciones pueden combinar, dializaron y congeladas para futuros experimentos.

Figure 1
Figura 1: Inducción de PFV en e. coli . Las células de las culturas antes (carril 2) y después de la inducción (carril 3) se analizan para detectar la presencia de PFV en, 47374 da. muestras fueron separadas por 10% SDS-PAGE y teñidas con azul brillante de Coomassie. Carril 1, marcadores de peso molecular (kDa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Níquel fracciones de cromatografía de afinidad. Lisados bacterianos solubles fueron separados por cromatografía de afinidad de níquel. PFV en con una etiqueta hexahistidine eluyó con un degradado lineal de 20 mM de imidazol de 200 mM. Fracciones se evaluaron 10% SDS-PAGE y teñidas con azul brillante de Coomassie. PFV en, 47374 Da, es evidente en la muestra que se carga a la columna (carga), pero es menos evidente en el flujo a través o lavado. Fracciones que procederá a la elución en la gradiente de imidazol comúnmente muestran un contaminante de movilidad más lento cerca de 75 kDa, así como algunos contaminantes más rápidos de la movilidad en o por debajo de 25 kDa. A concentraciones más altas de imidazol no contaminantes evidentes ya en PFV parece ser relativamente puro. En este ejemplo, fracciones #33 a #84 fueron combinados y más purificadas. Marcadores de peso molecular (kDa) están a la izquierda de cada gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Cromatografía de sepharose heparina de PFV en 1 . Después del retiro de afinidad y proteasa de níquel de la etiqueta hexahistidine, PFV en (Da 44394) fue fraccionado por heparina sefarosa. Las proteínas fueron eluidas con un degradado lineal desde 200 mM a 1 M de NaCl. Incluso fracciones #12 a #44 se evaluaron 8% SDS-PAGE teñido con Coomassie blue. Marcadores de peso molecular (kDa) están a la izquierda de cada gel. Estas fracciones fueron probadas para la actividad de nucleasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ensayo de la nucleasa de sepharose fracciones de heparina 1 . Cada fracción de sepharose heparina fue añadido al ADN del plásmido superenrollado. Fracción números se correlacionan con los se muestra en la figura 3. Tras la incubación, las reacciones de nucleasa fueron deproteinated y separaron por 1% agarosa con bromuro de etidio. Controles negativos incluyen ADN de plásmido con ninguna proteína (sólo blanco) y una purificación previa de tipo salvaje en PFV conocido libre de nucleasas (PFV en peso). Control positivo para contaminantes actividad nucleasa es una purificación previa de catalítico inactivo en PFV que se sabe que tienen contaminante nucleasa (PFV en D128N). Marcadores del tamaño de ADN aparecen en kb. Plásmido superenrollado (SC), plásmido lineal (L) y círculos relajados (RC) se indican. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Cuantificación de ensayos de nucleasas 1. se examinaron los geles de agarosa y valores de los píxeles se cuantificaron para superenrollado (SC), lineal (L) y bandas de círculo relajado (RC) en cada carril. Fracción números se correlacionan con los se muestra en las figuras 3 y 4. Se calcularon los porcentajes de círculos lineales y relajados utilizando los valores de píxel y la ecuación que se muestra. Por ejemplo, valores de píxel para las bandas de fracción #12 son: 817636 plásmido superenrollado, 50467 plásmido lineal y 112052 círculos relajados. El valor de píxel de ADN total de fracción #12 es la suma de estos valores, 980155. El porcentaje del ADN lineal es 50467 multiplicado por 100 el porcentaje y dividido por el total valor de ADN equivale a 5.1%. El porcentaje de círculos relajados es 112052 multiplicado por 100 y dividido por el total valor de ADN equivale a 11,4%. La suma de los porcentajes del círculo lineal y relajado es 16.5%. ADN del plásmido de control negativo con ninguna proteína (No en, el gráfico de abajo) indica que esta preparación de plásmido incluye 4.4% del ADN total como círculos relajados o lineales. Un segundo control negativo fue una purificación previa de tipo salvaje en PFV (WT) que muestra el 8,6% del ADN total como círculos relajados o lineales. Estos carriles dos indican el nivel de fondo de mellada o lineal del plásmido presente con el sustrato solo y con PFV pulg. Un control positivo es una purificación previa de catalítico inactivo en PFV (D128N) que tenía el 23% del ADN total como círculos lineales y relajados. El ADN expuesto a fracciones de heparina sepharose #12 al #22 resultó en > 10% de la DNA como círculos lineales y relajados. En este ejemplo, fracciones #24 y #42 aparecidos < 10% conversión lineal y relajado de los círculos. Estas fracciones fueron combinadas y se dializaron. Alícuotas fueron congeladas y almacenadas a-80 ° C para su uso futuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Proteínas recombinantes que interactúan con el ADN, tales como proteínas, depuradores de oxígeno para aplicaciones de microscopía sola molécula o integrases retroviral, de reparación del ADN deben estar libres de contaminantes nucleasas bacterianas2,3. Estos contaminantes pueden confundir la interpretación de los resultados durante los ensayos bioquímicos o de una sola molécula a granel.

Hemos encontrado que una nucleasa bacteriana con frecuencia Co purifica con PFV pulg. Sin embargo, PFV en muestra una afinidad por heparina sepharose que es fácilmente distinguible de las nucleasas bacterianas contaminantes1. La clave para preparación de libre de nucleasa PFV es la cuidadosa cuantificación de actividad nucleasa en cada fracción después de elución gradiente de sepharose de heparina. El gradiente debe ser suficientemente bajo para permitir la separación del PFV en el contaminante nucleasa; una fuerte pendiente no sería compatible con una separación eficiente. Además, el sustrato de DNA de plásmido debe tener un bajo porcentaje de círculos relajados para reducir el fondo de la prueba de la nucleasa. Si el sustrato de DNA de plásmido tiene un alto fondo de círculos relajados, debe realizarse una nueva purificación de ADN plásmido. El ensayo de actividad de nucleasa revela la presencia de las fracciones que deben ser desechados y nucleasas contaminantes.

En algunos casos, la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) puede ser un método eficaz para la eliminación de un contaminante de la nucleasa2. Grupos anteriores han utilizado seg durante la purificación de PFV en4. SEC tiene un volumen de carga limitada y tiende a reducir la concentración de la proteína final. La ventaja principal a afinidad y cromatografía de intercambio iónico es la capacidad para cargar un volumen significativamente mayor de segundos

Pruebas de actividad de nucleasa puede adaptarse a diferentes proteínas que purifican conjuntamente con una nucleasa bacteriana. Aquí identificamos que en PFV y una nucleasa contaminante se puede separar por cromatografía de sepharose de heparina. Previamente hemos demostrado que en PFV tiene un perfil similar a la nucleasa con cationes Mono-S y cromatografía de intercambio de aniones Mono Q hacer estas resinas no aptos para esta proteína. Dependiendo de las características de afinidad de la proteína deseada en relación con la nucleasa, este protocolo puede usarse con resinas de afinidad o de intercambio iónico y la elución gradiente. La clave para quitar contaminación de nucleasa de una proteína de interés es una diferencia en la afinidad por una resina. Cada fracción debe ensayarse para actividad de nucleasa. Las resinas de cromatografía de este Protocolo no pueden ser directamente aplicadas en todas las proteínas que purifican conjuntamente con nucleasas bacterianas. Sin embargo, el concepto global de la utilización de una afinidad o resina de intercambio iónico para separar la nucleasa de una proteína de interés y detectar fracciones actividad nucleasa puede aplicarse ampliamente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NIH AI099854 y AI126742 a la clave.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

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References

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