Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

Immunology and Infection

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Summary

Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.

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Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

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Abstract

Das Protein Integrase (IN) des Retrovirus Prototyp schaumig Virus (PFV) ist ein Modell-Enzym für die Untersuchung des Mechanismus der retroviralen Integration. Im Vergleich zu IN aus anderen Retroviren, ist PFV IN besser löslich und besser geeignet, um experimentelle Manipulation. Darüber hinaus ist es empfindlich auf klinisch relevante humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) IN Inhibitoren, darauf hindeutet, dass der katalytische Mechanismus der PFV IN ähnlich ist, dass der HIV-1 Zoll IN katalysiert die kovalente Verbindung von viralen komplementäre DNA (cDNA) zum Ziel DNA in einem Prozess namens Strang Transfer. Dieser Transfer Strangreaktion stellt die Ziel DNA Nicks. Analyse der Reaktion Integrationsprodukte kann durch die Anwesenheit von Nukleasen, die DNA ähnlich nick verwechselt werden. Eine bakterielle Nuklease hat sich gezeigt, zusammen mit rekombinanten PFV IN ausgedrückt in Escherichia coli (E. Coli) zu reinigen. Hier beschreiben wir eine Methode um PFV IN von kontaminierenden Nuklease durch Heparin Affinitätschromatographie isolieren. Brüche werden leicht auf Nuklease Kontamination mit supercoiled Plasmid und Agarose-Gelelektrophorese überprüft. PFV IN und die kontaminierenden Nuklease anzeigen alternative Affinitäten für Heparin-Sepharose ermöglicht eine Nuklease-freie Herstellung von rekombinanten PFV IN für biochemische oder einzelne Molekül Massenanalyse Integration geeignet.

Introduction

Biochemische und einzelne Molekül Studien von Protein-Interaktionen mit DNA erfordern außergewöhnlich reinen rekombinanter Proteine. Kontaminierende Nukleasen von Bakterien kann die Ergebnisse dieser Tests verdecken. Kontaminierende Nuklease befindet sich in Vorbereitung der rekombinante Proteine Sauerstoff Fänger Protocatechuate-3,4-Dioxygenase (PCD) und Prototyp schaumig Virus (PFV) Integrase (IN) von Escherichia coli (E. Coli)1 isoliert , 2 , 3.

Retroviren Integration Tests verlassen sich auf die Umwandlung von supercoiled DNA, geklaut oder lineare Produkte als Maß für die Aktivität4. Im zellulären Infektion tritt IN die beiden Enden der viralen DNA an die Host-Chromatin-5. Jedem Ende Beitritt Reaktion wird als Strang Transfer bezeichnet. Assays von rekombinanten IN Aktivität kann beitreten zwei DNA-Oligomere imitiert die virale cDNA zu einem Ziel DNA in einem abgestimmten Integration Reaktion4,5,6,7,8endet. Alternativ kann rekombinante IN nur einem DNA-Ende nicht physiologisch relevanten halbe Seite Integration Reaktion9,10teilnehmen. Wenn supercoiled Plasmid-DNA das Ziel der ist Integration, abgestimmte Integration sind Produkte linearisiert DNA und eine halbe Seite Integrationsprodukte sind entspannt Kreise. Diese Reaktionsprodukte sind durch ihre relative Mobilität während Agarose-Gel-Elektrophorese1identifiziert. Wenn die rekombinante IN einen kontaminierenden Nuklease verfügt, werden falsche entspannt Kreise oder eine möglicherweise linearisierten Plasmid verwirrend die experimentellen Ergebnisse. Virale DNA-Oligomere können Eindringmittel markiert werden, um schlüssig Integrationsprodukte, im Gegensatz zu Nuklease Produkten identifizieren. Jedoch bevorzugt stark supercoiled DNA Ziele; der Verlust von supercoiled Plasmid entspannt Kreise oder lineare DNA von kontaminierenden Nuklease Labelling Ergebnisse und Interpretation von Daten11. So ist es zwingend notwendig, um bakterielle Nukleasen von Retroviren IN Vorbereitungen zu entfernen.

PFV IN hat eine unterschiedliche Affinität zu Heparin-Sepharose im Vergleich zu den bakteriellen Nuklease-1. PFV IN und der Nuklease können durch einen linearen Farbverlauf Elution von Heparin Sepharose abgetrennt werden. Die Nuklease ist nicht ohne weiteres durch eine ultraviolette (UV)-Extinktion auf 280 nm Höhepunkt oder analytische Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erkannt. Stattdessen wird der Nuklease durch eine Nuklease Aktivität Assay beschäftigt die Umwandlung von supercoiled Plasmid zu entspannt Kreise oder lineare Produkte erkannt. Jede Fraktion nach Heparin-Sepharose-Chromatographie wird für Nuklease Aktivität getestet. PFV IN und der Nuklease Verunreinigung haben keinen Unterschied in der Affinität für Mono-Q Anion Harz. Es gibt einen kleinen Unterschied in Affinität für Mono-S kation Harz. Jedoch würde die Mono-S-Auflösung der bakteriellen Nuklease und PFV IN effiziente Trennung der Proteine nicht zulassen. Letztlich bietet die beste Trennung von bakteriellen Nuklease aus PFV IN Heparin Sepharose Affinitätsreinigung und hat den Vorteil der unbegrenzten Ladevolumen.

Tests für kontaminierende Nuklease Aktivität kann an andere Proteine angepasst werden. Das Protein des Interesses haben wahrscheinlich alternative Affinität Eigenschaften als PFV IN; der Unterschied in der bindenden Eigenschaften des Proteins des Interesses und der Nuklease Verunreinigung muss empirisch ermittelt werden. Diese Methodik zur Ermittlung der Nuklease Kontamination kann an anderen Harzen einschließlich Mono-S kation oder Anion Austausch Harze Mono-Q angepasst werden. Affinität und Ionenaustausch Harze können eine zuverlässige Methode um eine rekombinante Protein des Interesses von kontaminierenden Nukleasen ohne Grenzen auf dem Datenträger des Proteins während der Chromatographie isolieren anbieten.

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Protocol

(1) induzieren PFV im Ausdruck in E. Coli

  1. 20 μL der E. Coli BL21(DE3) pLysS 1 μL des PFV IN Expressionsplasmid (10 ng/μl) hinzufügen (20 μl aliquoten von kommerziell verfügbaren Zellen hat > 2 x 106 KBE/µg Plasmid) in einer 1,5 mL Tube. Mit dem Finger tippen oder streichen das Rohr mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie 5 min auf Eis.
    1. Hitze-Schock für genau 30 s in einem 42 ° c Wasserbad und dann sofort um zu Eis für 2 min zurück.
    2. Fügen Sie 80 μl Raumtemperatur super optimale Brühe mit Catabolite Repression (SOC) Medien. Inkubation für 1 h bei 37 ° c mit 225 Umdrehungen pro Minute (u/min) schütteln.
    3. Platte 25 μL der Mischung auf einer 100 x 15 mm Petrischale mit 25 mL Brühe (LB) Agar Luria (1 L LB-Agar: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 15 g Agar) und 100 μg/mL Ampicillin (100 mg/mL Stammlösung).
    4. Die verbleibenden 75 μL der transformierten Zellen auf eine zweite identische Platte-Platte. Inkubieren Sie die Platten mit Deckel über Nacht bei 37 ° c
  2. Abrufen der Platten der transformierten E. Coli. Verwenden Sie eine einzige Kolonie 3 mL LB impfen (1 L LB: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefe Extrakt) mit 100 μg/mL Ampicillin in einem Rohr 14 mL Rundboden Polypropylen Kultur ergänzt. ~ 8 h bei 37 ° c mit schütteln 225 u/min inkubieren.
    1. 50 mL LB mit 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol (34 mg/mL Stammlösung) in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben ergänzt fügen Sie die 3 mL Kultur hinzu. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C mit schütteln 225 u/min.
    2. Übertragen Sie 53 mL Kultur auf 1 L LB, 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol in einem 4 L-Erlenmeyer-Kolben. Inkubation bei 37 ° C mit 225 u/min schütteln.
    3. Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Kultur in regelmäßigen Abständen. Zunächst prüfen der Kultur OD600 alle h. Da die Kultur der gewünschten OD600erreicht, überprüfen Sie alle 15 min nicht überwuchern. Wird die Kultur eines OD600 zwischen 0,9 und 1,0. Übertragen Sie die Flasche auf ein Eisbad und wirbeln um die Temperatur der Kultur zu reduzieren.
  3. Übertragen Sie 1 mL der Kultur auf eine 1,5 mL-Tube für eine spätere Analyse von denaturierenden SDS-PAGE-Analyse.
    1. Pellet-Zellen in der 1,5 mL Tube durch Zentrifugation für 1 min in einem Microfuge bei 14.000 x g bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den überstand. Das Pellet in 150 μL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Pipettieren aufzuwirbeln. Die PBS kann mit oder ohne CaCl2 und MgCl2sein.
    2. Fügen Sie 150 μL 2 x Probenpuffer SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1,2 % SDS, 30 % Glycerin, 15 % β-Mercaptoethanol (βME), 0,0018 % Bromophenol blue) durch Pipettieren oder Vortex mischen. Kochen für 3 min. Store bei-20 ° C.
  4. Die Bakterienkultur hinzufügen: eine Endkonzentration von 0,25 mM Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M Stammlösung) und 50 μM ZnCl2 (50 mM Stammlösung). IPTG induziert die Expression des Gens PFV IN aus dem T7-Promotor und ZnCl2 wird als eine Ergänzung für die korrekte Faltung einer amino terminal Zink-Finger-Domäne im PFV IN. Incubate die Kultur bei 25 ° C mit Schütteln bei 225 u/min für 4 Std. sofort hinzugefügt übertragen Sie den Kolben auf ein Eisbad. 1 mL der Kultur für die SDS-PAGE-Analyse nach dem gleichen Protokoll wie oben beschrieben in 1.3 zu retten.
  5. Übertragen Sie die Bakterienkultur auf entsprechend großen Zentrifuge Flaschen. Beispielsweise kann eine 1 L-Kultur auf vier sterile Einweg-250 mL konischen Boden aus Polypropylen Flaschen übertragen werden. Drehen Sie die Flaschen in einer gekühlten Tabletop Zentrifuge bei 3000 X g für 20 min bei 4 ° c. Verwerfen Sie Überstände durch Gießen.
    1. Aufschwemmen Sie aller die Pellets aus einem 1 L Bakterienkultur in einem Gesamtvolumen von 25 mL (6,25 mL pro Flasche) kaltem PBS (mit oder ohne CaCl2 und MgCl2) durch pipettieren. Kombinieren und die bakterielle Suspensionen auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Drehen Sie in einer gekühlten Zentrifuge bei 3.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand durch Eingießen oder Pipettieren zu verwerfen.
  6. Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in 10 mL Wiederfreisetzung Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, und 500 μM Phenylmethylsulfanoxide (PMSF) Protease-Hemmer) durch pipettieren. Snap freeze das Pellet indem man das Rohr in eine Dewar-Flasche mit flüssigem Stickstoff ausreicht, um die 50 mL-Tube zu tauchen. Sorgfältig entfernen Sie das Rohr aus flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° C.
    Hinweis: Bakterielle Pellets können für mehrere Monate bei-80 ° c gelagert werden Wir haben gesehen, kein Verlust des aktiven Proteins nach-80 ° C Lagerung für zwei Jahre.
  7. Die Pre-Induktion und Post-Induktion Proben analysieren von 8,3 cm breit, 7,3 cm hoch, 0,75 mm dick SDS-PAGE Gelen mit 1,5 mL 6 % Polyacrylamid Stapeln Schicht (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6 % Acrylamid, 0,1 % SDS, 0,1 % Ammonium Bleichen, 0,001 % TEMED) und 3,5 mL 10 % Polyacrylamid-Schicht zu lösen (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 % Acrylamid, 0,1 % SDS, 0,1 % Ammonium Bleichen, 0,001 % TEMED)12.
    1. Fügen Sie nach dem Gießen des stapelnden Gels, 10 gut Kamm. Wenn das Gel polymerisiert hat, montieren Sie die Seite Apparat, und fügen Sie ausreichend SDS-PAGE laufenden Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS hinzu).
    2. Last 10 μL jeder Probe und 4 μL prestained Protein-Standards. Laufen Sie mit 16,5 V/cm bis Farbstoff vorne den Boden des Gels, ca. 60 min erreicht.
    3. Zerlegen Sie die Gel-Platten und übertragen Sie das Gel auf eine Plastikwanne. Fügen Sie Coomassie Brilliant Blue Färbelösung (0,1 % Coomassie brilliant blue R-250, 40 % Methanol, 10 % Essigsäure) großzügig bedecken das Gel und Flecken für 20 min bei Raumtemperatur.
    4. Durch das Gießen der Färbelösung zu entfernen und ersetzen mit destain Lösung (40 % Methanol, 10 % Essigsäure) bis Bands gut sichtbar sind. Entfernen Sie die destaining Lösung durch Gießen und mit entionisiertem Wasser ersetzen. PFV IN sollte leicht in der Post-Induktion Probe identifiziert werden. PFV IN mit einem Hexahistidine Tag hat ein Molekulargewicht von 47374 Da.
    5. Wenn PFV IN nicht angezeigt wird, wiederholen Sie die Induktion, beginnend mit einer unterschiedlichen Kolonie von einem der Transformation Platten.

(2) Nickel Affinitätschromatographie

  1. Eine bakterielle Pellet auf Eis auftauen.
    Hinweis: Dies dauert viel Zeit (ca. 2-3 h). Wenn die Tablette für eine Zelle Gülle aufgetaut ist, fügen Sie eine zusätzliche 500 μM PMSF (100 mM Stammlösung).
  2. Halten Sie die 50 mL-Tube von Bakterien Gülle auf Eis. Beschallen die Bakterien bei 30 % Amplitude für 30 s (1 s, 1 s aus) pro Kugel abgeleitet von 1 L Kultur mit einem Sonikator mit einem 0,5 Zoll Durchmesser Bio Horn mit 0,125 Zoll Durchmesser verjüngt, Mikrospitze, einer Frequenz von 20 kHz und maximale Leistung von 400 w.
  3. Übertragen Sie die Zellprobe auf einem kalten Ultrazentrifugen Rohr. Verwenden Sie Polycarbonat Flasche Baugruppen (Durchmesser 25 mm, 89 mm Höhe) mit einem festen Winkel Rotor Typ 60 Ti kompatibel. Alternative Röhren und Rotoren können verwendet werden, wenn die gleiche Kraft der Gravitation erreicht wird. Spin-120.000 x g für 60 min bei 4 ° C. Es sollte eine offensichtliche Pellet. Der Überstand haben eine gelbe Farbe.
  4. Den Überstand durch Eingießen oder eine kalt 50 mL konische Röhrchen pipettieren zu übertragen. Beachten Sie die Lautstärke; Dieses Volumen sollte etwa das Volumen der Wiederfreisetzung Puffer vor dem Snap Einfrieren verwendet werden. Wenn der Überstand zähflüssig ist, kann es durch bakterielle DNA kontaminiert sein die die Chromatographiesäule verstopfen könnte. Wiederholen Sie in diesem Fall die Ultrazentrifugation um die bakterielle DNA pellet.
  5. Bereiten Sie 500 mL Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) und 500 mL Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM Imidazol).
    Hinweis: In diesem Protokoll halten Sie das schnelle Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System, alle Puffer und die Probe bei 4 ° C in einem kalten Raum.
    1. Sterilfilter Puffer A und B mit 0,2 μm Einweg Filtereinheiten. Je nach System FPLC waschen Sie Pumpe A und B Pumpe mit Puffer A und Puffer B bzw.. Durchfluss 90 % Puffer A und 10 % Puffer B durch das System bis zur Stabilisierung der Leitfähigkeit und UV-Lesungen. Die maximale Durchflussmenge hängt das Instrument; Verwenden Sie einen Durchfluss von 5 mL/min mit maximalem Druck maximal 1,0 MPa.
  6. Bereiten Sie eine 110 mm lange, 5 mm Durchmesser FPLC Spalte mit 1,5 mL Nickel-geladene Harz (maximale Bindungskapazität 50 mg/mL, max. Druck 1 MPa). Die Spalte kann am Vortag Reinigung vorbereitet und bei 4 ° c gelagert.
  7. Schließen Sie die Spalte an das FPLC Instrument. Equilibrate der Spalte mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B (20 mM Imidazol) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 0,5 MPa. Das Instrument sollte sammeln von Echtzeit-Daten von Leitfähigkeit und UV-Absorption bei 280 nm (ein280). Die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren sollte. Wenn diese Werte nicht stabilisiert haben, weiterhin fließen Puffer durch die Spalte bis sie stabil sind.
  8. Laden Sie die Protein-Probe (~ 10 mL pro Kugel) in die Spalte mit einer Durchflussrate von 0,15 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 0,5 MPa. Der Fließdruck Rate und Spalte bleibt unverändert während der Reinigung. Sammeln der Durchfluss in einem 50 mL-Tube.
    1. Waschen Sie die Spalte mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B. sammeln die Wäsche in einer 50 mL-Tube. Die Proteine mit einer 20 mL lineare Steigung von 10 % bis 100 % Puffer B (20 mM bis 200 mM Imidazol) eluieren.
    2. Schließlich waschen Sie die Spalte mit 5 mL 100 % Puffer B (200 mM Imidazol). Sammeln die gradient und letzte Wäsche in 0,27 mL Fraktionen.
  9. Kombinieren Sie 15 μl Probenpuffer 2 X SDS-PAGE mit 15 μl der Strömung durch Waschen und Peak A280 Brüche. Kochen Sie die Proben 3 min.
    1. Bereiten Sie zwei 10 %, die SDS-PAGE Gelen bereits in Schritt 1.6 außer mit 15 gut kämmen beschrieben. Last 10 μL jeder Probe, die Gele und 4 μL prestained Protein-Standards. Laufen Sie, färben Sie, und analysieren Sie die Gele zu, wie unter Punkt 1.6 beschrieben.
    2. Kombinieren Sie Brüche, die scheinbar fast reine PFV IN basierend auf visuelle Inspektion enthalten. Messen Sie das Volumen durch pipettieren, in der Regel 8 bis 10 mL.
    3. Mit einem Spektralphotometer, Messen Sie A280 der kombinierten Fraktionen und berechnen Sie die Gesamtmenge des PFV IN Protein; unsere typische Ausbeute ist ~ 10 mg / L der induzierten Kultur. Der vom Aussterben bedroht-Koeffizient der PFV IN mit dem Hexahistidine-Tag ist 59360 cm-1 M-1.
  10. Um den Hexahistidine-Tag entfernen, ergänzen Sie die PFV IN mit 10 mM Dithiothreitol (DTT, Stammlösung 1 M) und 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M-Stammlösung). Fügen Sie 15 μg des menschlichen Rhinovirus (HRV) 3C Protease pro mg PFV IN. Incubate bei 4 ° c über Nacht. Spaltung verringert das PFV IN Molekulargewicht von 47374 Da 44394 da und durch 10 % SDS-PAGE-Analyse überprüft werden kann.

(3) Heparin Affinitätschromatographie

  1. Bereiten Sie 250 mL Puffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DVB-t, 0, 1 mM EDTA, 500 μM PMSF) und 250 mL Puffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DVB-t, 0, 1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    Hinweis: In diesem Protokoll werden die FPLC System, Puffer und Probe in einem Kühlraum bei 4 ° c gehalten.
    1. Sterilfilter Puffer C und D mit 0,2 μm Einweg Filtereinheiten. Je nach System FPLC waschen Sie Pumpe A und B Pumpe mit Puffer C und Puffer D bzw.. Fließen Sie 80 % Puffer C und 20 % Puffer D durch das System, bis die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren. Die maximale Durchflussmenge hängt das Instrument; Wir verwenden routinemäßig einen Durchfluss von 5 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 1,0 MPa.
  2. Bereiten Sie eine 80 mm lange, 5 mm Durchmesser FPLC Spalte mit 1 mL Heparin-Sepharose-Harz (maximale Bindungskapazität 2,0 mg Rinder antithrombin III pro mL Harz; max. Druck 1,4 MPa). Die Spalte kann am Vortag Reinigung vorbereitet und bei 4 ° c gelagert Schließen Sie die Spalte an das FPLC Instrument.
    1. Equilibrate der Spalte mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einem maximalen Druck-Limit von 1 MPa. Das Instrument sollte sammeln von Echtzeit-Daten von Leitfähigkeit und UV-Absorption bei 280 nm (ein280). Die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren sollte. Wenn diese Werte nicht stabilisiert haben, weiterhin fließen Puffer durch die Spalte bis sie stabil sind.
  3. Reduzieren Sie die NaCl-Konzentration der Probe PFV IN bis zu 200 mM durch Zugabe von 1,5 Volumen Puffer C. Fügen Sie beispielsweise 15 mL Puffer C bis 10 mL PFV Zoll Die Gesamtmenge ist in der Regel ~ 25 mL.
  4. Belastung der verdünnten Probe der PFV IN der Heparin-Sepharose-Spalte bei 0,5 mL/min Durchflussmenge mit einem maximalen Druck 1,0 MPa zu begrenzen. Der Fließdruck Rate und Spalte bleibt unverändert während der Reinigung. Der Durchfluss in einem 50 mL konische Röhrchen zu sammeln.
    1. Waschen der Spalte mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl), sammeln die Wäsche in einem 50 mL konische Röhrchen. Die Spalte mit einer 30 mL lineare Steigung von 20 % bis 100 % Puffer D (200 mM bis 1 M NaCl) eluieren.
    2. Waschen Sie die Spalte mit 5 mL 100 % Puffer D. sammeln die Steigung und endgültige Wash in 0,37 mL Fraktionen.
  5. Last, Durchströmung, waschen und Brüche zu analysieren, um 8 % SDS-PAGE wie in 2,9 beschrieben. PFV IN nach Spaltung des Hexahistidine Tags hat ein Molekulargewicht von 44394 Da und die vom Aussterben bedroht-Koeffizient bleibt 59360 cm-1 M-1 ohne den Hexahistidine Tag. Speichern Sie alle Fraktionen bei 4 ° c bis zur Fertigstellung eines Nuklease-Assays.

4. Nuklease-assay

  1. Identifizieren von Heparin-Sepharose-Fraktionen, die scheinbar fast reine PFV Zoll kombinieren 3 μl Heparin Bruchteil und 50 enthalten ng 3 kb supercoiled Plasmid-DNA in Reaktion Puffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) mit einem Endvolumen von 15 μl. Inkubation bei 37 ° c für 90 min. Include eine Negativkontrolle mit keine PFV IN.
    1. Stoppen Sie die Reaktion mit 1 mg/mL Proteinase K (20 mg/mL Stammlösung) und 0,5 % SDS (10 % Stammlösung). Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde Proben bei-20 ° C für eine spätere Analyse gespeichert werden können.
  2. Bereiten Sie eine Gel 125 mL 1 % Gewicht pro Volumen (w/V) Agarose in 1 X TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) mit 0,1 µg/mL Interkalation Bromid (10 mg/mL Stammlösung)13. Schmelzen Sie die Agarose-Lösung und gießen Sie in ein 15 x 10 cm Gel Casting Tablett. Legen Sie einen 15 gut Kamm mit 5 mm breit, 0,75 mm dick Wells. Dünne Brunnen liefern besseren Band-Auflösung im Vergleich zu 1,5 mm Dicke Brunnen. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu festigen.
    1. Tauchen Sie das Gel in 1 X TAE mit 0,1 µg/mL Interkalation Bromid. Die Nuklease Assay Reaktionen fügen Sie 3,5 μl 6 x laden Farbstoff (50 % Glycerin, 0,15 % Orange G Farbstoff hinzu). Laden Sie das gesamte Volumen, das Gel. Führen Sie das Gel bei konstanter Spannung, 10 Volt pro cm (100 V) bei Raumtemperatur 1 Stunde oder bis Orange G Farbstoff vorne das Ende des Gels erreicht.
  3. Sofort Bild das Agarosegel mit einem fluoreszierenden Scanner Interkalation Bromid überschreitet. Lineare DNA sollte maßhaltig bei 3 kb laufen, supercoiled DNA laufen schneller (~ 2 kb) und entspannten Kreis DNA läuft langsamer (~3.5 kb).
    1. Berechnen Sie Bildanalyse-Software verwenden, die Pixel Volumen des Plasmids in jeder Bahn supercoiled, lineare und entspannten Kreis. Rufen Sie die Summe des Pixels Bände für diese drei DNA-Formen der "Gesamt-DNA" schätzen und es verwenden, um den Prozentsatz der linearen und entspannt Kreise berechnen. Z. B. gliedert sich die Pixel-Lautstärke entspannt Kreise durch DNA-Pixel den Gesamtwert in dieser Spur, multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um einen Prozentsatz zu ermitteln. Brüche, die kontaminierenden Nuklease enthalten zeigen einen höheren Prozentsatz der linearen und entspannt Kreise im Vergleich zu der negativen Kontrolle.
  4. Kombinieren Sie Heparin-Sepharose-Fraktionen, die nicht kontaminierenden Nuklease Aktivität angezeigt werden. Dialyse in 10 mm 6-8 kDa Molekulargewicht cutoff (MWCO) Dialyse Schläuche bei 4 ° C über Nacht gegen 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20 % Glycerin.
  5. Der Nuklease-freie PFV IN Sample von Dialyse Schläuche zu erholen. Messen Sie die A280 und berechnen Sie die endgültigen Proteinkonzentration. Aliquoten und Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie Aliquote bei-80 ° C.

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Representative Results

Rekombinante PFV IN ist oft mit einer bakteriellen Nuklease1kontaminiert. Biochemische Integration Tests hängen die Quantifizierung der Umwandlung von supercoiled Plasmid DNA zu entspannten Kreisen und lineare Produkte. Das Vorhandensein von kontaminierenden Nuklease könnten falsche Quantifizierung dieser Assays. Ausdruck von PFV IN mit einem Hexahistidine Tag in E. Coli (Abbildung 1) induziert und zuerst gereinigt durch Nickel-Affinitätschromatographie (Abbildung 2). Die Fraktionen mit fast reinem PFV IN kombiniert und das Hexahistidine-Tag ist durch eine Protease gespalten. Wir haben festgestellt, dass PFV IN und die kontaminierenden Nuklease unterschiedliche Affinitäten für Heparin Sepharose Chromatographie (Abbildung 3)1. PFV IN Sekundenbruchteilen nach Heparin Sepharose Chromatographie sind mit ein supercoiled Plasmid, für entspannte Kreise assay und linearisierten Plasmid, die Produkte der Nuklease Aktivität (Abbildung 4) inkubiert. Dieser Test ermöglicht die Identifikation von Proteinfraktionen ohne Nuklease (Abbildung 5). Diese Brüche können kombiniert, dialysiert und für zukünftige Experimente eingefroren.

Figure 1
Abbildung 1: Induktion von PFV IN E. coli . Zellen aus Kulturen vor (Bahn 2) und nach (Bahn 3) Induktion werden auf das Vorhandensein von PFV IN, 47374 da Proben analysiert wurden getrennt, um 10 % SDS-PAGE und mit Coomassie brilliant blau gefärbt. Bahn 1, Molekulargewicht Marker (kDa). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Nickel-Affinität Chromatographie Brüche. Lösliche bakterielle Lysates wurden durch Nickel Affinitätschromatographie getrennt. PFV IN mit einem Hexahistidine Tag wurde mit einem linearen Farbverlauf von 20 mM bis 200 mM Imidazol eluiert. Fraktionen wurden um 10 % SDS-PAGE und mit Coomassie brilliant blau gefärbt. PFV IN, 47374 Da ist deutlich erkennbar in der Probe in der Spalte (Last) geladen, aber ist weniger offensichtlich in der Durchströmung oder waschen. Brüche, die häufig schon früh im Verlauf Imidazol eluieren anzeigen eine langsamere Mobilität Verunreinigung in der Nähe von 75 kDa sowie einige schnelleren Mobilität Verunreinigungen an oder unter 25 kDa. Bei höheren Konzentrationen von Imidazol gibt es nicht ohne weiteres ersichtlich Verunreinigungen und PFV IN scheint relativ reines sein. In diesem Beispiel wurden Brüche #33 bis #84 kombiniert und weiter gereinigt. Molekulargewicht Marker (kDa) sind auf der linken Seite jedes Gel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Heparin-Sepharose-Chromatographie von PFV IN 1 . Nach Nickel Affinität und Protease entfernen der Hexahistidine Tag war PFV IN (44394 Da) durch Heparin Sepharose fraktioniert. Proteine wurden mit einem linearen Farbverlauf von 200 mM auf 1 M NaCl eluiert. Auch Brüche #12 und #44 wurden von 8 % bewertet, die SDS-PAGE mit Coomassie Blau gefärbt. Molekulargewicht Marker (kDa) sind auf der linken Seite jedes Gel. Diese Fraktionen wurden für Nuklease Aktivität getestet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Nuklease Assay der Heparin-Sepharose-Fraktionen 1 . Jede Heparin-Sepharose-Fraktion wurde supercoiled Plasmid DNA hinzugefügt. Bruchteil Zahlen beziehen sich auf die in Abbildung 3dargestellt. Nach Inkubation der Nuklease Reaktionen waren Deproteinated und getrennt durch 1 % Agarose mit Interkalation Bromid. Negativkontrollen gehören Plasmid-DNA mit kein Protein (nur Ziel) und eine vorherige Reinigung des Wildtyp PFV IN bekannt von Nuklease (PFV IN WT) zu befreien. Positivkontrolle für kontaminierende Nuklease Aktivität ist eine vorherige Reinigung von katalytisch inaktive PFV, die bekanntermaßen kontaminierenden Nuklease (PFV IN D128N). DNA-Markern Größe werden in kb angezeigt. Supercoiled Plasmid (SC), linear Plasmid (L) und entspannt Kreise (RC) sind angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Quantifizierung der Nuklease Assays 1. Agarose Gele wurden gescannt und Pixelwerte für supercoiled (SC), lineare (L) und entspannten Kreis (RC) Bands in jeder Bahn quantifiziert wurden. Bruchteil Zahlen beziehen sich auf diejenigen in den Figuren 3 und 4 dargestellt. Die Prozentsätze linear und entspannt Kreise wurden mit der Pixelwerte und der Gleichung berechnet. Zum Beispiel das Pixel Werte für Bruchteil #12-Bänder sind: 817636 supercoiled Plasmid, 50467 linear Plasmid und 112052 entspannt Kreisen. Der gesamte DNA Pixelwert für Bruchteil #12 ist die Summe dieser Werte, 980155. Der Prozentsatz der linearen DNA ist 50467 100 für den Prozentsatz multipliziert und dividiert durch die DNA-Gesamtwert entspricht 5,1 %. Der Anteil der entspannten Kreisen ist 112052 mit 100 multipliziert und dividiert durch die DNA-Gesamtwert entspricht 11,4 %. Die Summe der Prozentsätze linear und entspannten Kreis beträgt 16,5 %. Negativkontrolle Plasmid DNA mit kein Protein (keine IN, untere Grafik) zeigt, dass dieses Präparat von Plasmid 4,4 % der Gesamt-DNA als lineare oder entspannt Kreise enthalten. Eine zweite negative Kontrolle wurde eine vorherige Reinigung des Wildtyp PFV IN (WT), die 8,6 % der Gesamt-DNA als lineare oder entspannt Kreise angezeigt. Diese beiden Fahrspuren geben Sie den Hintergrund von geklaut oder linearisierten Plasmid mit dem Substrat allein und mit PFV Zoll vorhanden Positivkontrolle ist eine vorherige Reinigung von katalytisch inaktive PFV IN (D128N), die 23 % der Gesamt-DNA als linear und entspannt Kreise hatten. Die DNA ausgesetzt Heparin Sepharose Brüche #12 durch #22 führte > 10 % der DNA als linear und entspannt Kreise. In diesem Beispiel Brüche #24 bis #42 angezeigt < 10 % Umwandlung in linearen und entspannt Kreise. Diese Fraktionen wurden kombiniert und dialysiert. Aliquote wurden eingefroren und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Rekombinante Proteine, die DNA, interagieren, wie z. B. DNA-Reparatur Proteine, Sauerstofffänger Einzelmolekül-Mikroskopie-Anwendungen oder retroviral Integrases sollte frei von kontaminierenden Bakterien Nukleasen2,3sein. Diese Verunreinigungen können die Interpretation der Ergebnisse in loser Schüttung biochemische oder einzelne Molekül Assays verwechseln.

Wir haben festgestellt, dass eine bakterielle Nuklease Co häufig mit PFV Zoll reinigt PFV IN zeigt jedoch eine Affinität für Heparin-Sepharose, die leicht von der bakteriellen Nuklease Verunreinigung1zu unterscheiden ist. Der Schlüssel zur Vorbereitung der Nuklease-freie PFV IN ist die sorgfältige Quantifizierung der Nuklease Aktivität in jedem Bruchteil nach Gradienten Elution von Heparin Sepharose. Das Gefälle muss ausreichend flach, um die Trennung von PFV IN von der Nuklease Schadstoff zu ermöglichen; eine steile Steigung wäre nicht kompatibel mit effizienten Trennung. Darüber hinaus muss das Plasmid DNA Substrat einen niedrigen Anteil an entspannt Kreise um den Hintergrund des Nuklease Assays zu reduzieren. Wenn das Plasmid DNA Substrat einen hohen Hintergrund entspannt Kreise hat, sollte eine neue Reinigung von Plasmid DNA durchgeführt werden. Der Nuklease-Aktivität-Test zeigt die Anwesenheit von kontaminierenden Nuklease und Brüche, die verworfen werden sollte.

In einigen Fällen möglicherweise Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC) eine wirksame Methode zur Entfernung von kontaminierenden Nuklease2. Vorherigen Gruppen nutzten während der Reinigung des PFV IN4SEC. SEC hat eine begrenzte Ladevolumen und neigt dazu, die endgültige Proteinkonzentration zu reduzieren. Der große Vorteil, Affinität und Ionenaustausch-Chromatographie ist die Fähigkeit, ein wesentlich größeres Volumen als Sek. Laden

Tests für Nuklease Aktivität kann an verschiedenen Proteinen angepasst werden, die mit einer bakteriellen Nuklease Co reinigen. Hier erkennen wir IN PFV und kontaminierenden Nuklease durch Heparin Sepharose Chromatographie getrennt werden. Wir haben bereits gezeigt, dass PFV IN einem ähnlichen Profil zu Nuklease mit Mono-S-kation und Mono-Q Anion-Austausch-Chromatographie machen diese Harze ungeeignet für dieses Protein hat. Je nach Affinität Eigenschaften des gewünschten Proteins in Bezug auf die Nuklease kann dieses Protokoll mit Affinität oder Ionenaustausch Harze und Gradienten Elution verwendet werden. Der Schlüssel zur effektiven Entfernung von Nuklease Kontamination aus einem Protein des Interesses ist ein Unterschied in der Affinität für ein Harz. Jede Fraktion muss für Nuklease Aktivität untersucht werden. Die Chromatographie-Harze dieses Protokolls können nicht direkt auf alle Proteine angewendet werden, die mit bakteriellen Nukleasen Co reinigen. Jedoch kann das Gesamtkonzept der Verwendung eine Affinität oder Ionenaustauschharz schieden die Nuklease aus einem Protein von Interesse und testen Brüche für Nuklease Aktivität breit anwendbar sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

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References

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