Registrering og fjernelse af nukleasen forurening under oprensning af rekombinante Prototype skummende Virus Integrase

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Rekombinant prototype skummende virus integrase protein er ofte forurenet med en bakteriel nukleasen under rensningen. Denne metode identificerer nukleasen forurening og fjerner det fra den endelige udarbejdelse af enzymet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Integrase (IN) protein af retrovirus prototype skummende virus (PFV) er en model enzym til at studere mekanismen af retroviral integration. I forhold til IN fra andre retrovira, er PFV IN mere opløselige og mere medgørlige til eksperimentelle manipulation. Desuden, er det følsomme over for klinisk relevante human immundefekt virus (HIV-1) IN hæmmere, tyder på, at den katalytiske mekanisme for PFV i er svarer til at af HIV-1 i. IN katalyserer den kovalente sammenføjning af viral supplerende DNA (cDNA) til målet DNA i en proces kaldet strand overførsel. Denne strand overførsel reaktion introducerer rifter til target-DNA. Analyse af integration reaktionsprodukter kan blive forvirret af tilstedeværelsen af nukleaser, der ligeledes nick DNA. En bakteriel nukleasen har vist sig at co rense med rekombinante PFV IN udtrykt i Escherichia coli (E. coli). Her beskriver vi en metode til at isolere PFV i fra de kontaminerende nukleasen af heparin affinitet kromatografi. Fraktioner er let screenet for nukleasen kontaminering med supercoiled plasmid og Agarosen gelelektroforese. PFV i og de kontaminerende nukleasen vise alternative tilhørsforhold til heparin sepharose tillader en nukleasen-gratis forberedelse af rekombinante PFV i egnet til bulk biokemiske eller enkelt molekyle analyse af integration.

Introduction

Biokemiske og enkelt molekyle studier af protein interaktion med DNA kræver usædvanlig ren rekombinante proteiner. Forurener nukleaser fra bakterier kan sløre resultaterne af disse analyser. En kontaminerende nukleasen er blevet fundet i forberedelserne af rekombinante proteiner ilt scavenger protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) og prototype skummende virus (PFV) integrase (IN) isoleret fra Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.

Retroviral integration assays stole på konvertering af supercoiled DNA til hakker eller lineær produkter som en foranstaltning af aktivitet4. Under cellulære infektion tiltræder IN de to ender af en viral cDNA-vært kromatin5. Hver ende tiltræder reaktion kaldes strand overførsel. Assays af rekombinant IN aktivitet kan deltage to DNA oligomerer efterligne den viral cDNA slutter til en target-DNA i en samordnet integration reaktion4,5,6,7,8. Alternativt optages rekombinant IN kun en DNA ende i en ikke-fysiologisk relevante halv site integration reaktion9,10. Når supercoiled plasmid DNA er målet for integration, samordnet integration produkter er lineariseret DNA og halv site integration produkter er afslappet cirkler. Disse reaktionsprodukter identificeres af deres relative mobilitet under Agarosen gel elektroforese1. Hvis den rekombinante i har en kontaminerende nukleasen, vil der være spurious afslappet cirkler eller et eventuelt lineariseret plasmid forvirrende de eksperimentelle resultater. Viral DNA oligomerer kan mærkes fluorescently endegyldigt identificerer integration produkter, i modsætning til nukleasen produkter. Dog favoriserer i høj grad supercoiled DNA mål; tab af supercoiled plasmid til afslappet cirkler eller lineære DNA af kontaminerende nukleasen kunne skew resultaterne og fortolkningen af data11. Derfor er det bydende nødvendigt at fjerne bakteriel nukleaser fra retroviral i forberedelserne.

PFV i har en forskellig affinitet for heparin sepharose sammenlignet med bakteriel nukleasen1. PFV i og nukleasen kan adskilles ved en lineær gradient eluering fra heparin sepharose. Nukleasen registreres ikke let ved en ultraviolet (UV) absorbans ved 280 nm peak eller analytiske sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). I stedet, nukleasen er opdaget af en nukleasen aktivitet assay beskæftiger konvertering af en supercoiled plasmid til afslappet cirkler eller lineær produkter. Hver fraktion efter heparin sepharose kromatografi er testet for nukleasen aktivitet. PFV i og nukleasen forurenende har ingen forskel i affinitet for Mono-Q anion harpiks. Der er en lille forskel i affinitet for Mono-S kation harpiks. Mono-S opløsning af bakteriel nukleasen og PFV IN giver imidlertid ikke effektiv adskillelse af proteiner. I sidste ende, heparin sepharose affinitet rensning tilbyder den bedste adskillelse af bakteriel nukleasen fra PFV i og har fordelen af ubegrænset belastning volumen.

Testning for kontaminerende nukleasen aktivitet kan tilpasses andre proteiner. Protein af interesse vil sandsynligvis have alternative affinitet egenskaber end PFV i; forskellen i bindende Karakteristik af protein af interesse og nukleasen forurenende stoffer skal bestemmes empirisk. Denne metode til at identificere nukleasen kontaminering kan tilpasses andre harpikser, herunder Mono-S kation eller Mono-Q anion exchange harpiks. Affinitet og ionbyttende harpikser kan tilbyde en pålidelig metode til at isolere en rekombinant protein af interesse fra forurener nukleaser med ingen begrænsninger for mængden af protein i kromatografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fremkalde PFV i udtryk i E. coli

  1. Tilføje 1 μL PFV IN udtryk plasmid (10 ng/μl) til 20 μL af E. coli BL21(DE3) pLysS (20 μL alikvot af kommercielt tilgængelige celler har > 2 x 106 CFU/μg plasmid) i 1,5 mL rør. Bland forsigtigt af finger trykke eller svippede røret. Ruger på is 5 min.
    1. Heat shock for præcis 30 s i en 42 ˚C vand bad og derefter straks tilbage til is i 2 min.
    2. Tilsættes 80 μl stuetemperatur super optimal bouillon med catabolite undertrykkelse (SOC) medier. Inkuber i 1 time på 37 ˚C med 225 omdrejninger pr. minut (rpm) ryster.
    3. Plade 25 μL af blandingen på en 100 mm x 15 mm petriskål med 25 mL af Luria bouillon (LB) agar (1 L LB agar: 10 g bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g gærekstrakt, 15 g agar) og 100 μg/mL ampicillin (100 mg/mL stamopløsning).
    4. Plade de resterende 75 μl af de transformerede celler på en anden identisk plade. Inkuber pladerne med låg ned natten over ved 37 ° C.
  2. Hente plader af transformerede E. coli. Bruge en enkelt koloni til podes 3 mL af LB (1 L LB: 10 g af bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g gær extract) suppleret med 100 μg/mL ampicillin i 14 mL rund bund polypropylen kultur rør. Inkuber i ~ 8 timer ved 37 ˚C med 225 rpm ryster.
    1. Tilføj 3 mL af kultur til 50 mL LB suppleret med 100 μg/mL ampicillin og 34 μg/mL chloramphenicol (34 mg/mL stamopløsning) i en 250 mL Erlenmeyerkolbe. Inkuber kultur natten over ved 37 ° C med 225 rpm ryster.
    2. Overføre kultur 53 mL til 1 L LB, 100 μg/mL ampicillin og 34 μg/mL chloramphenicol i en 4 L erlenmeyerkolben. Der inkuberes ved 37 ° C med 225 rpm ryster.
    3. Måle den optisk tæthed på 600 nm (OD600) af kultur med jævne mellemrum. I første omgang, kontrollere kultur OD600 hver h. Som kulturen når det ønskede OD600, tjekke hver 15 min til ikke vokse hen over. Vokse kultur til en OD600 mellem 0,9 og 1.0. Overføre kolben til isbad og slyng for at reducere temperaturen i kulturen.
  3. Der overføres 1 mL af kulturen til en 1,5 mL tube til senere analyse af denatureringen SDS-PAGE analyse.
    1. Sammenpresse cellerne i 1,5 mL tube ved centrifugering for 1 min i en mikrofuge på 14.000 x g ved stuetemperatur. Supernatanten. Knyt resuspenderes i 150 μL fosfatbufferet saltopløsning (PBS) når der afpipetteres. PBS kan være enten med eller uden CaCl2 og MgCl2.
    2. Tilføj 150 μL af 2 x SDS-PAGE prøvebuffer (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1,2% SDS, 30% glycerol, 15% β-mercaptoethanol (βME), 0.0018% bromophenol blå) og blandes grundigt af med pipette overfoeres eller vortex. Kog i 3 min. opbevares ved-20 ° C.
  4. Tilføje til bakteriekulturen: en endelig koncentration på 0,25 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M stamopløsning) og 50 μM ZnCl2 (50 mM stamopløsning). IPTG inducerer udtryk af PFV IN gen fra T7 initiativtageren og ZnCl2 er tilføjet som et supplement til den korrekte foldning af en amino terminal zink finger domæne i PFV IN. Incubate kultur ved 25 ° C under omrystning på 225 rpm i 4 h. straks overføre kolben til isbad. Gem 1 mL af kultur for SDS-PAGE analyse efter samme protokol som ovenfor i punkt 1.3.
  5. Overføre bakteriekulturen til passende størrelse centrifuge flasker. For eksempel kan en 1 L kultur overføres til fire sterile engangs 250 mL konisk bund polypropylen flasker. Spin flasker i en nedkølet bordplade centrifuger på 3000 x g i 20 min. ved 4 ˚C. Kassér analysere ved at hælde.
    1. Resuspend alle piller fra en 1 L bakteriekultur i en samlet maengde paa 25 mL (6,25 mL pr. flaske) koldt PBS (med eller uden CaCl2 og MgCl2) når der afpipetteres. Kombinere og overføre de bakterielle suspensioner til en 50 mL konisk tube. Spin i en nedkølet centrifuge på 3.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Supernatanten ved at hælde eller pipettering.
  6. Resuspenderes bakteriel i 10 mL resuspension buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, og 500 μM phenylmethylsulfanoxide (PMSF) protease hæmmer) af pipettering. Snap fryse pellet ved at placere røret i en Dewar kolbe med flydende kvælstof nok til at oversvømme 50 mL tube. Forsigtigt fjerne røret fra flydende kvælstof og opbevares ved-80 ° C.
    Bemærk: Bakteriel pellets kan opbevares i flere måneder ved-80 ° C. Vi har set uden tab af aktive protein efter-80 ° C lagring i to år.
  7. Analysere de pre-induktion samt efter prøver ved 8,3 cm bred, 7,3 cm høj, 0,75 mm tyk SDS-PAGE geler med 1,5 mL 6% polyacrylamid stabling lag (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6% acrylamid, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfat, 0,001% TEMED) og 3,5 mL 10% polyacrylamid løse lag (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% acrylamid, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfat, 0,001% TEMED)12.
    1. Efter at hælde den stabling gel, indsætte en 10 godt kam. Når gel har polymeriserede, samle apparatet side, og tilføje tilstrækkelig SDS-PAGE kører buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS).
    2. Indlæse 10 μl af hver prøve og 4 μL af prestained protein standarder. Køre på 16,5 V/cm indtil farvestof foran når bunden af gelen, ca 60 min.
    3. Skil gel plader og overføre gel til en plastik badekar. Tilføje Coomassie strålende blå farvning løsning (0,1% Coomassie strålende blå R-250, 40% methanol, 10% eddikesyre) at generøst dækker gel og plet i 20 min. ved stuetemperatur.
    4. Fjerne Farvningsopløsningen ved at hælde og Erstat med destain løsning (40% methanol, 10% eddikesyre) indtil bands er let synlige. Fjerne den destaining løsning ved at hælde og erstatte med deioniseret vand. PFV i bør let identificeres i eksemplet efter induktion. PFV i med en hexahistidine tag har en molekylvægt på 47374 Da.
    5. Hvis PFV i ikke er synlige, Gentag induktion starter med en anden koloni fra en af transformation plader.

2. nikkel affinitet kromatografi

  1. Tø en bakteriel pellet på is.
    Bemærk: Dette vil tage betydelig tid (ca. 2-3 h). Når pelleten er optøet til en celle gylle, tilføje en ekstra 500 μM PMSF (100 mM stamopløsning).
  2. Holde 50 mL tube af bakterier gylle på is. Der sonikeres bakterier på 30% amplitude til 30 s (1 s på 1 s off) pr. pellet afledt af 1 L kultur ved hjælp af en sonikator med en 0,5 tommer diameter bio horn med 0,125 tommer diameter tilspidsede microtip, en frekvens på 20 kHz og motoreffekt på højst 400 W.
  3. Overføre den celle prøve til en kold ultracentrifuge tube. Bruge polycarbonat flaske forsamlinger (25 mm diameter, højde 89 mm) kompatibel med en Type 60 Ti fast vinkel rotor. Alternative rør og rotorer kan anvendes, hvis den samme gravitation styrke er opnået. Spin 120.000 x g for 60 min. ved 4 ° C. Der bør være en indlysende pellet. Supernatanten kan have en gul farve.
  4. Overføre supernatanten ved at hælde eller pipettering til en kold 50 mL konisk slange. Bemærk volumen; denne mængde skal være ca omfanget af resuspension buffer anvendt før snap frysning. Hvis supernatanten er tyktflydende, kan det være forurenet af bakteriel DNA-som kan tilstoppe kolonnen kromatografi. I dette tilfælde gentage ultracentrifugering for at pille den bakterielle DNA.
  5. Forberede 500 mL Buffer en (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) og 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazol).
    Bemærk: I denne protokol, holde hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system, alle buffere og prøven ved 4 ° C i et koldt rum.
    1. Sterile filter buffere A og B med 0,2 μm engangs filter enheder. Afhængigt af FPLC systemet, vaske pumpen A og pumpen B med Buffer A og Buffer B, henholdsvis. Flow 90% Buffer A og 10% Buffer B gennem systemet indtil ledningsevne og UV aflæsninger stabilisere. Den maksimale flow vil afhænge af instrumentet; bruge en gennemstrømningshastighed på 5 mL/min. med et maksimalt pres grænse på 1,0 MPa.
  6. Forberede en 110 mm lange, 5 mm diameter FPLC kolonne med 1,5 mL nikkel-opkrævet harpiks (maksimal bindende kapacitet 50 mg/mL, maksimale tryk 1 MPa). Kolonnen kan tilberedes dagen før rensning og opbevares på 4 ˚C.
  7. Tilslutte kolonnen FPLC instrument. Blandingen henstår kolonnen med 20 mL af 90% Buffer A og 10% Buffer B (20 mM imidazol) med en væskehastighed på 0,5 mL/min. med et maksimalt pres grænse på 0,5 MPa. Instrumentet bør samle real time data af ledningsevne og UV-absorbans ved 280 nm (en280). Ledningsevne og UV aflæsninger skal stabilisere. Hvis disse behandlinger ikke har stabiliseret, fortsat flow buffere gennem kolonnen indtil de er stabile.
  8. Indlæse protein prøven (~ 10 mL per pellet) til kolonnen med en væskehastighed på 0,15 mL/min. med et maksimalt pres grænse på 0,5 MPa. Flow sats og kolonne pres forbliver den samme i hele rensning. Indsamle gennemstrømningen i en 50 mL tube.
    1. Kolonnen udvaskes med 20 mL 90% Buffer A og 10% Buffer B. indsamle vask i en 50 mL tube. Elueres proteiner med en 20 mL lineær gradient på 10% til 100% Buffer B (20 mM til 200 mM imidazol).
    2. Endelig, vaske kolonnen med 5 mL 100% Buffer B (200 mM imidazol). Indsamle den gradient og sidste vask i 0,27 mL fraktioner.
  9. Kombinere 15 μL af prøvebuffer 2 x SDS-PAGE med 15 μl af gennemstrømningen, vask og peak A280 fraktioner. Kog prøver i 3 min.
    1. Forbered to 10% SDS-PAGE geler som tidligere beskrevet i trin 1,6 undtagen med 15 godt kamme. Indlæse 10 μl af hver prøve skal geler og 4 μL af prestained protein standarder. Køre, pletten, og analysere geler, som beskrevet i trin 1,6.
    2. Kombinere fraktioner, der synes at indeholde næsten ren PFV i baseret på visuel inspektion. Måle volumen af pipettering, typisk 8-10 mL.
    3. Bruger et spektrofotometer, måle A280 af de kombinerede fraktioner og beregne den samlede PFV i protein; vores typiske udbytte er ~ 10 mg / L af inducerede kultur. Udryddelse er af PFV i med hexahistidine tag 59360 cm-1 M-1.
  10. Hvis du vil fjerne koden hexahistidine, supplere den PFV i med 10 mM dithiothreitol (DTT, 1 M stamopløsning) og 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M stamopløsning). Tilføj 15 μg af menneskelige rhinovirus (HRV) 3C protease pr. mg PFV IN. Incubate på 4 ˚C natten over. Kavalergang reducerer PFV i molekylvægt fra 47374 Da 44394 da og kan verificeres ved 10% SDS-PAGE analyse.

3. heparin affinitet kromatografi

  1. Forberede 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF) og 250 mL Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    Bemærk: I denne protokol, FPLC system, buffere, og prøven opbevares i et koldt værelse på 4 ˚C.
    1. Sterile filter buffere C og D med 0,2 μm engangs filter enheder. Afhængigt af FPLC systemet, vaske pumpen A og pumpen B med C-Buffer og Buffer D, henholdsvis. Flow 80% Buffer C og 20% Buffer D gennem systemet indtil ledningsevne og UV aflæsninger stabilisere. Den maksimale flow vil afhænge af instrumentet; Vi bruger rutinemæssigt en gennemstrømningshastighed på 5 mL/min. med et maksimalt pres grænse på 1,0 MPa.
  2. Forberede en 80 mm lange, 5 mm diameter FPLC kolonne med 1 mL af heparin sepharose harpiks (maksimal bindende kapacitet 2,0 mg af kvæg antitrombin III pr. mL harpiks; maksimalt pres 1,4 MPa). Kolonnen kan tilberedes dagen før rensning og opbevares ved 4 ° C. Tilslutte kolonnen FPLC instrument.
    1. Blandingen henstår kolonnen med 20 mL af 80% Buffer C og 20% Buffer D (200 mM NaCl) med en væskehastighed på 0,5 mL/min. med et maksimalt pres grænse på 1 MPa. Instrumentet bør samle real time data af ledningsevne og UV-absorbans ved 280 nm (en280). Ledningsevne og UV aflæsninger skal stabilisere. Hvis disse behandlinger ikke har stabiliseret, fortsat flow buffere gennem kolonnen indtil de er stabile.
  3. Reducere NaCl-koncentration af 200 mM PFV i prøven ved at tilføje 1,5 diskenheder Buffer C. For eksempel, tilsættes 15 mL Buffer C til 10 mL PFV IN. Vores samlede volumen er typisk ~ 25 mL.
  4. Belastning fortyndet PFV i stikprøven til kolonnen heparin sepharose på 0,5 mL/min. strømningshastighed med maksimalt pres begrænse 1,0 MPa. Flow sats og kolonne pres forbliver den samme i hele rensning. Indsamle gennemstrømningen i en 50 mL konisk slange.
    1. Vask kolonnen med 20 mL 80% Buffer C og 20% Buffer D (200 mM NaCl), indsamle vask i en 50 mL konisk slange. Elueres kolonne med en 30 mL lineær graduering på 20% til 100% Buffer D (200 mM til 1 M NaCl).
    2. Vask kolonnen med 5 mL af 100% Buffer D. indsamle den gradient og sidste vask i 0,37 mL fraktioner.
  5. Analysere belastning, flow gennem, vask og fraktioner af 8% SDS-PAGE som beskrevet i 2.9. PFV i efter spaltning af hexahistidine tag har en molekylvægt på 44394 Da og udryddelse koefficient forbliver 59360 cm-1 M-1 uden hexahistidine tag. Gemme alle fraktioner på 4 ˚C indtil afslutningen af en nukleasen assay.

4. nukleasen assay

  1. Identificere heparin sepharose fraktioner, der synes at indeholde næsten ren PFV i. kombinere 3 μL af heparin fraktion og 50 ng af 3 kb supercoiled plasmid DNA i reaktion buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) med en endelige mængden af 15 μl. Der inkuberes ved 37 ˚C i 90 min. Medtag en negativ kontrol med ingen PFV IN.
    1. Stop reaktion med 1 mg/mL proteinase K (20 mg/mL stamopløsning) og 0,5% SDS (10% stamopløsning). Der inkuberes ved 37 ° C for 1 h. prøver opbevares ved-20 ° C til senere analyse.
  2. Forberede en 125 mL gel af 1% vægt pr. volumen (w/v) Agarosen i 1 x TAE buffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) med 0,1 µg/mL ethidium bromid (10 mg/mL stamopløsning)13. Smelt Agarosen løsning og hæld til en 15 cm x 10 cm gel støbning bakke. Indsæt en 15 godt kam med 5 mm bred, 0,75 mm tyk brønde. Tynde brønde give bedre band opløsning i forhold til 1,5 mm tyk brønde. Tillad gel til at størkne ved omgivelsestemperatur.
    1. Fordyb gel i 1 x TAE med 0,1 µg/mL ethidiumbromid. Tilføje 3,5 μL af 6 x lastning farvestof (50% glycerol, 0,15% Orange G farvestof) til nukleasen assay reaktioner. Indlæse hele diskenheden til gel. Kør gelen i konstant spænding, 10 volt pr cm (100 V) ved stuetemperatur i 1 time, eller indtil Orange G farvestof foran når enden af gelen.
  3. Straks billede agarosegel med en fluorescerende scanner indstillet til at opdage ethidiumbromid. Lineære DNA bør køre tro mod størrelse på 3 kb, supercoiled DNA skal køre hurtigere (~ 2 kb) og afslappet cirkel DNA bør køre langsommere (~3.5 kb).
    1. Brug billede analyse software, beregne pixel volumen af supercoiled, lineær og afslappet cirkel plasmid i hver bane. Kald summen af pixel diskenheder for disse tre DNA former "Samlede DNA" værdi og bruge den til at beregne procentdelen af lineære og afslappet cirkler. For eksempel pixel volumen af afslappet cirkler er divideret med den samlede DNA pixelværdi i vognbane, ganger dette antal med 100 for at bestemme en procentdel. Fraktioner, der indeholder forurenende nukleasen vise en højere procentsats af lineære og afslappet cirkler i forhold til den negative kontrol.
  4. Kombinere heparin sepharose brøker, der ikke viser kontaminerende nukleasen aktivitet. Dialyze i 10 mm 6-8 kDa molekylvægt cutoff (MWCO) dialyse slangen ved 4 ° C natten over mod 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glycerol.
  5. Genskab nukleasen-fri PFV i prøven fra dialyse slanger. Måle A280 og beregne den endelige proteinkoncentration. Alikvot og snap fryse i flydende kvælstof. Butik alikvoter ved-80 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinante PFV IN er ofte forurenet med en bakteriel nukleasen1. Biokemiske integration assays afhænger kvantitering af konvertering af supercoiled plasmid DNA til afslappet cirkler og lineær produkter. Tilstedeværelsen af en forurenende nukleasen kunne føre til falske kvantitering af disse assays. Udtryk for PFV i med en hexahistidine tag er induceret i E. coli (figur 1) og først renset af nikkel affinitet kromatografi (figur 2). Brøker med næsten ren PFV i kombineres og hexahistidine tag er kløvet af en protease. Vi har konstateret, at PFV i og de kontaminerende nukleasen har forskellige tilhørsforhold til heparin sepharose kromatografi (figur 3)1. PFV i fraktioner efter heparin sepharose kromatografi inkuberes med en supercoiled plasmid til assay for afslappet cirkler og lineariseret plasmid, produkter af nukleasen aktivitet (figur 4). Denne analyse giver mulighed for identifikation af protein brøker uden nukleasen (figur 5). Disse fraktioner kan kombineres, dialysebehandling og frosset til fremtidige eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: Induktion af PFV i i E. coli . Celler fra kulturer før (lane 2) og efter (lane 3) induktion er analyseret for tilstedeværelsen af PFV i, 47374 Da. prøver var adskilt af 10% SDS-PAGE og farves med Coomassie strålende blå. Lane 1, molekylvægt markører (kDa). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Nikkel affinitet kromatografi fraktioner. Opløselige bakterielle lysates var adskilt af nikkel affinitet kromatografi. PFV i med en hexahistidine tag blev elueret med en lineær gradient på 20 mM til 200 mM imidazol. Brøker blev evalueret af 10% SDS-PAGE og farves med Coomassie strålende blå. PFV i, 47374 Da, er umiddelbart indlysende i eksemplet indlæses til kolonnen (load), men er mindre synlige i flow gennem eller vask. Fraktioner, der elueres tidligt i imidazol gradient almindeligt vise langsommere mobilitet forurenende stof nær 75 kDa samt nogle hurtigere mobilitet forureninger på eller under 25 kDa. Ved højere koncentrationer af imidazol der er ikke umiddelbart indlysende, forurenende stoffer og PFV i synes at være forholdsvis ren. I dette eksempel blev brøker #33 gennem #84 kombineret og yderligere renset. Molekylær vægt markører (kDa) er på venstre side af hver gel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Heparin sepharose kromatografi af PFV i 1 . Efter nikkel affinitet og protease fjernelse af koden hexahistidine, var PFV i (44394 Da) fraktioneret af heparin sepharose. Proteiner blev elueret med en lineær gradient fra 200 mM til 1 M NaCl. Selv fraktioner #12 og #44 blev evalueret af 8% SDS-PAGE farves med Coomassie blå. Molekylær vægt markører (kDa) er på venstre side af hver gel. Disse fraktioner blev testet for nukleasen aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Nukleasen analyse af heparin sepharose fraktioner 1 . Hver heparin sepharose fraktion blev føjet til supercoiled plasmid DNA. Brøkdel numre korrelerer til dem vist i figur 3. Efter inkubationen nukleasen reaktioner var deproteinated og adskilt af 1% Agarosen med ethidiumbromid. Negative kontroller indeholde plasmid DNA med ingen protein (Target kun) og en tidligere rensning af vildtype PFV i vides at være fri af nukleasen (PFV i WT). En positiv kontrol for kontaminerende nukleasen aktivitet er en tidligere rensning af katalytisk inaktive PFV IN, der er kendt for at have kontaminerende nukleasen (PFV i D128N). DNA-markører, størrelse er vist i kb. Supercoiled plasmid (SC), lineære plasmid (L) og afslappet cirkler (RC) er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Kvantitering af nukleasen assays 1. Agarosen gels blev scannet og pixelværdier var kvantificeres for supercoiled (SC), lineære (L) og afslappet cirkel (RC) bands i hver bane. Brøkdel numre korrelerer til dem vist i figur 3 og 4. Procenter af lineære og afslappet kredse blev beregnet ved hjælp af pixelværdierne og ligningen vist. For eksempel, pixelen værdier for bands af brøkdel #12 er: 817636 supercoiled plasmid, 50467 lineære plasmid og 112052 afslappet cirkler. Den samlede DNA pixelværdi for brøkdel #12 er summen af disse værdier, 980155. Procentsats af lineære DNA er 50467 ganges med 100 for procentdelen og divideret med den samlede DNA værdi equaling 5,1%. Procentdelen af afslappet kredse er 112052 ganget med 100 og divideret med den samlede DNA værdi equaling 11,4%. Summen af lineære og afslappet cirkel procenter er 16,5%. Negativ kontrol plasmid DNA med ingen protein (ingen ind, nederste graf) angiver, at denne forberedelse af plasmid optaget 4,4% af den samlede DNA som lineær eller afslappet cirkler. En anden negativ kontrol var en tidligere rensning af vildtype PFV IN (WT), vises 8,6% af den samlede DNA som lineær eller afslappet cirkler. Disse to kontrol baner angive baggrundskoncentration af hakker eller lineariseret plasmid stede med substratet alene og med PFV IN. Positiv kontrol er en tidligere rensning af katalytisk inaktive PFV i (D128N), som havde 23% af den samlede DNA som lineære og afslappet cirkler. DNA udsat for heparin sepharose fraktioner #12 gennem #22 resulterede i > 10% af DNA som lineære og afslappet cirkler. I dette eksempel, brøker #24 til #42 vises < 10% konvertering til lineære og afslappet cirkler. Disse fraktioner var kombineret og dialysebehandling. Delprøver var frosset og opbevares ved-80 ° C til fremtidig brug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinante proteiner, der interagerer med DNA, såsom DNA reparere proteiner, ilt skraldemanden for enkelt molekyle mikroskopi applikationer eller retroviral integrases, bør være fri for kontaminerende bakteriel nukleaser2,3. Disse forurenende stoffer kan forvirre fortolkning af resultater under bulk biokemiske eller enkelt molekyle assays.

Vi har fundet, at en bakteriel nukleasen ofte Co renser med PFV IN. Imidlertid viser PFV i en affinitet for heparin sepharose, der let kan skelnes fra bakteriel nukleasen forurenende1. Nøglen til forberedelse af nukleasen-fri PFV i er den forsigtige kvanticering af nukleasen aktivitet i hver fraktion efter gradient eluering fra heparin sepharose. Gradient skal være tilstrækkeligt lavt til adskillelse af PFV i fra nukleasen forurenende stof; en stejl gradient ville ikke være forenelig med effektiv adskillelse. Derudover bør plasmid DNA substrat har en lav procentdel af afslappet kredse at reducere baggrund af nukleasen assay. Hvis plasmid DNA substrat har en stor baggrund af afslappet cirkler, skal en ny rensning af plasmid DNA udføres. Nukleasen aktivitet assay afslører tilstedeværelsen af kontaminerende nukleasen og fraktioner, der skal kasseres.

I nogle tilfælde kan størrelse udstødelse kromatografi (SEC) være en effektiv metode til fjernelse af en forurenende nukleasen2. Tidligere grupper har brugt sek under rensning af PFV i4. SEC har en begrænset belastning volumen og tendens til at reducere den endelige proteinkoncentration. Den store fordel at affinitet og ionbytning kromatografi er evnen til at indlæse en betydeligt større volumen end sek.

Testning for nukleasen aktivitet kan tilpasses forskellige proteiner, der co renser med en bakteriel nukleasen. Vi identificere her, PFV i og en kontaminerende nukleasen kan være adskilt af heparin sepharose kromatografi. Vi har tidligere vist, at PFV i har en lignende profil til nukleasen med Mono-S kation og Mono-Q anion exchange kromatografi gør disse harpikser uegnet til dette protein. Afhængigt af affinitet Karakteristik af det ønskede protein i forhold til nukleasen, kan denne protokol anvendes med affinitet eller ionbyttende harpikser og gradient eluering. Nøglen til effektiv fjernelse af nukleasen forurening fra et protein af interesse er en forskel i affinitet for en harpiks. Hver fraktion skal analyseres for nukleasen aktivitet. Kromatografi harpiks af denne protokol må ikke anvendes direkte til alle proteiner, der co renser med bakteriel nukleaser. Det overordnede koncept for at bruge en affinitet eller ionbytteren til at adskille nukleasen fra et protein af interesse og boltpistoler brøker for nukleasen aktivitet kan dog generelt gældende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH AI099854 og AI126742 til nøglen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics