Upptäckt och borttagning Nuclease kontamination vid rening av rekombinant prototyp skummande Virus integras

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Rekombinant prototyp skummande virus integras protein är ofta förorenade med en bakteriell nuclease under reningen. Den här metoden identifierar nuclease kontaminering och bort från den slutliga beredningen av enzymet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Integras (IN) proteinet av retrovirus prototyp skummande viruset (PFV) är ett enzym som modell för att studera mekanismen för retrovirala integration. PFV IN jämfört IN från andra retrovirus, och är mer lösliga och mer mottagliga för experimentell manipulation. Dessutom är det känsligt för kliniskt relevanta humant immunbristvirus (HIV-1) IN hämmare, tyder på att den katalytiska mekanismen av PFV i är liknande till att av HIV-1 IN. i katalyserar den kovalenta sammanfogningen av viral kompletterande DNA (cDNA) till mål DNA i en process som kallas strand överföring. Denna strand överföring reaktion introducerar nicks till mål-DNA. Analys av integration reaktionsprodukter kan förväxlas av närvaron av nukleaser som likaså nick DNA. En bakteriell nuclease har visats att samtidig rena med rekombinant PFV IN uttryckt i Escherichia coli (E. coli). Här beskriver vi en metod för att isolera PFV IN från det kontaminerande nuclease av heparin affinitetskromatografi. Fraktioner screenas enkelt för nuclease kontaminering med supercoiled plasmid och agaros gelelektrofores. PFV i och den kontaminerande nuclease visar alternativa tillhörigheter för heparin sepharose möjliggör en nuclease-fri beredning av rekombinant PFV i lämplig för biokemiska eller enda molekyl massanalys av integration.

Introduction

Biokemiska och enda molekyl studier av proteininteraktioner med DNA kräver exceptionellt ren rekombinanta proteiner. Kontaminerande nukleaser från bakterier kan dölja resultaten av dessa analyser. En kontaminerande nuclease har hittats i förberedelserna av rekombinanta proteiner syre gatsopare protocatechuate-3,4-dioxygenas (PCD) och prototyp skummande virus (PFV) integras (IN) isolerade från Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.

Retrovirala integration analyser lita på omvandlingen av supercoiled DNA till nicked eller linjära produkter som ett mått på i aktivitet4. Under cellulära infektion går IN med de två ändarna av en viral cDNA till värd kromatin5. Varje ände att gå reaktion kallas strand överföring. Analyser av rekombinant i aktivitet kan gå med två DNA oligomerer härma den viral cDNA avslutar till en mål-DNA i ett samordnat integration reaktion4,5,6,7,8. Rekombinant IN kan alternativt gå med endast en DNA ände i en icke-fysiologiskt relevanta halv webbplats integration reaktion9,10. När supercoiled plasmid DNA är målet för integration, samordnade integration produkter är linearized DNA och halv webbplats integrationsprodukter är avslappnad cirklar. Dessa reaktionsprodukter är identifierade genom deras relativa rörlighet under agaros gelelektrofores1. Om rekombinant IN har en kontaminerande nuclease, blir det falska avslappnad cirklar eller en möjligen linearized plasmid förvirrande experimentella resultat. Virala DNA oligomerer kan märkas fluorescently för att entydigt identifiera integrationsprodukter, i motsats till nuclease produkter. Dock gynnar i hög grad supercoiled DNA mål; förlust av supercoiled plasmid avslappnad cirklar eller linjära DNA av kontaminerande nuclease kunde skeva resultat och tolkning av data11. Således är det absolut nödvändigt att ta bort bakteriella nukleaser från retrovirala i beredningar.

PFV IN har en olika affinitet för heparin sepharose jämfört med bakteriell nuclease1. PFV IN och nuclease kan avskiljas genom en linjär övertoning eluering från heparin sepharose. Nuclease identifieras inte lätt genom ett ultraviolett (UV) absorbans vid 280 nm topp eller analytiska sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE). I stället detekteras nuclease av en nuclease aktivitet assay anställa omvandlingen av en supercoiled plasmid till avslappnad cirklar eller linjära produkter. Varje fraktion efter heparin sepharose kromatografi är testad för nuclease aktivitet. PFV i och det främmande ämnet på nuclease har ingen skillnad i affinitet för Mono-Q anjonharts. I området i närheten finns det en liten skillnad i affinitet för Mono-S katjonharts. Mono-S resolution av bakteriell nuclease och PFV i skulle dock inte tillåta effektiv separation av proteiner. I slutändan heparin sepharose affinitet rening erbjuder bästa separation av bakteriell nuclease från PFV IN och har fördelen av obegränsad ladda volym.

Testning för kontaminerande nuclease aktivitet får anpassas till andra proteiner. Proteinet av intresse kommer troligen att ha alternativa affinitet egenskaper än PFV i; skillnaden i bindande egenskaper av proteinet av intresse och det främmande ämnet på nuclease måste bestämmas empiriskt. Denna metod för att identifiera nuclease kontaminering kan anpassas till andra hartser inklusive Mono-S katjon eller Mono-Q anjonbytarresiner. Affinitet och jonbyte hartser kan erbjuda en pålitlig metod för att isolera ett rekombinant protein av intresse från att förorena nukleaser med inga begränsningar på mängden protein under kromatografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. framkalla PFV i uttrycket i E. coli

  1. Tillsätt 1 μL i PFV i uttrycket plasmid (10 ng/μl) 20 μL av E. coli BL21(DE3) pLysS (20 μl alikvot av kommersiellt tillgängliga celler har > 2 x 106 CFU/μg plasmid) i en 1,5 mL tub. Blanda försiktigt genom finger tapping eller snärta röret. Inkubera i is 5 min.
    1. Värme chock för exakt 30 s i en 42 ˚C vatten bad och sedan omedelbart återgå till is i 2 min.
    2. Tillsätt 80 μl av rumstemperatur super optimal buljong med catabolite förtryck (SOC) media. Inkubera i 1 h vid 37 ° c med 225 varv per minut (rpm) skakar.
    3. Tallrik 25 μL av blandningen på en 100 mm x 15 mm med 25 mL av Luria buljong (LB) agar petriskål (1 L LB agar: 10 g bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g jästextrakt, 15 g agar) och 100 μg/mL ampicillin (100 mg/mL stamlösning).
    4. Tallrik de återstående 75 μl en andra identiska platta transformerade celler. Inkubera plattorna med locken ner över natten vid 37 ° C.
  2. Hämta pläterar av omvandlade E. coli. Använd en enda koloni för att Inokulera 3 mL LB (1 L LB: 10 g bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g jäst extrakt) kompletteras med 100 μg/mL ampicillin i ett 14-mL rund botten polypropylen kultur rör. Inkubera i ~ 8 h vid 37 ° c med 225 rpm skakar.
    1. Lägga till de 3 mL av kultur i 50 mL LB kompletteras med 100 μg/mL ampicillin och 34 μg/mL kloramfenikol (34 mg/mL stamlösning) i en 250 mL-Erlenmeyerkolv. Inkubera kulturen över natten vid 37 ° C med 225 rpm skakar.
    2. Över kultur 53 mL till 1 L LB, 100 μg/mL ampicillin och 34 μg/mL kloramfenikol i en 4 L Erlenmeyerkolv. Inkubera vid 37 ° C med 225 rpm skakar.
    3. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) av kulturen med jämna mellanrum. Inledningsvis kontrollera kulturen OD600 varje h. Som kulturen når önskad OD600, kontrollera varje 15 min att inte växa över. Växa kulturen till en OD600 mellan 0,9 och 1,0. Överföra kolven till ett isbad och snurra för att sänka temperaturen av kulturen.
  3. Över 1 mL av kulturen till en 1,5 mL tub för senare analys av denaturering SDS-PAGE analys.
    1. Pellet cellerna i 1,5 mL röret genom centrifugering för 1 min i en microfuge vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 150 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) av pipettering. PBS kan vara antingen med eller utan CaCl2 och MgCl2.
    2. Tillsätt 150 μl av 2 x SDS-PAGE prov buffert (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1,2% SDS, 30% glycerol, 15% β-merkaptoetanol (βME), 0,0018% bromofenolblått) och blanda omsorgsfullt genom att Pipettera eller virvel. Koka i 3 min. förvaras vid-20 ° C.
  4. Lägg till bakteriella kulturen: en slutlig koncentration på 0,25 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M stamlösning) och 50 μM ZnCl2 (50 mM stamlösning). IPTG inducerar uttryck av genen PFV IN från T7 promotorn och ZnCl2 läggs till som ett tillägg för den rätta vikningen av en amino terminal zink finger domän i PFV IN. Incubate kulturen vid 25 ° C under skakning på 225 rpm för 4 h. omedelbart överföra kolven till ett isbad. Spara 1 mL av kultur för SDS-PAGE analys efter samma protokoll som ovan i punkt 1.3.
  5. Överföra den bakteriella kulturen till lämplig storlek centrifug flaskor. Till exempel kan en 1 L kultur överföras till fyra sterila disponibla 250 mL konisk botten polypropylen flaskor. Snurra flaskorna i en kyld bordsskiva Centrifugera vid 3000 x g i 20 min vid 4 ˚C. Kassera supernatanterna genom att hälla.
    1. Återsuspendera alla pellets från en 1 L bakteriekulturen i en total volym på 25 mL (6,25 mL per flaska) kalla PBS (med eller utan CaCl2 och MgCl2) av pipettering. Kombinera och överföra bakteriell upphängningarna till en 50 mL konisk tub. Snurra i en kyld centrifug vid 3 000 x g i 20 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten genom att hälla eller pipettering.
  6. Återsuspendera bakteriell pelleten i 10 mL resuspension buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, och 500 μM phenylmethylsulfanoxide (PMSF) proteashämmare) av pipettering. Snapin frysa pelleten genom att placera röret i en Dewar kolv med flytande kväve tillräckligt att dränka den 50 mL tub. Försiktigt bort röret från flytande kväve och lagra vid-80 ° C.
    Obs: Bakteriell pellets kan lagras i flera månader vid-80 ° C. Vi har sett ingen förlust av aktivt protein efter-80 ° C lagring för två år.
  7. Analysera proverna före induktion och efter induktion 8,3 cm breda, 7,3 cm hög, 0,75 mm tjock SDS-PAGE geler med 1,5 mL 6% polyakrylamid stapling lager (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% akrylamid, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfatoxidation, 0,001% TEMED) och 3,5 mL 10% polyakrylamid lösa lager (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% akrylamid, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfatoxidation, 0,001% TEMED)12.
    1. Efter hälla stapling gelen, infoga en 10 väl kam. När gelen har polymeriserat, montera sida apparaten, och tillsätt tillräckligt SDS-PAGE rinnande buffert (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS).
    2. Ladda 10 μL av varje prov och 4 μL av prestained protein standarder. Kör på 16,5 V/cm tills dye framdel når botten av gelen, ca 60 min.
    3. Demontera gel plattorna och överföra gelen till en plast badkar. Lägg till Coomassie Brilliant Blue färgning lösning (0,1% Coomassie brilliant blue R-250, 40% metanol, 10% ättiksyra) att generöst täcka gelen och fläcken under 20 minuter vid omgivningstemperatur.
    4. Ta bort färgningslösningen genom att hälla och Ersätt med Avfärga lösning (40% metanol, 10% ättiksyra) tills banden syns lätt. Ta den destaining lösningen genom att hälla och ersätta med avjoniserat vatten. PFV i bör identifieras enkelt i efter induktion provet. PFV IN med en hexahistidine-tagg har en molekylvikt av 47374 Da.
    5. Om PFV i inte är synlig, upprepa induktion börjar med en annan koloni från en av omvandling plattorna.

2. nickel affinitetskromatografi

  1. Tina en bakteriell pellets på is.
    Anmärkning: Detta tar betydande tid (cirka 2-3 h). När pelleten har tinats till en cell slurry, lägga till en ytterligare 500 μM PMSF (100 mM stamlösning).
  2. Hålla de 50 mL tub av bakterier flytgödsel på is. Sonikera bakterierna på 30% amplitud för 30 s (1 s på, 1 s off) per pellets härrör från 1 L kultur med en någon sonikator med en 0,5 tum diameter bio horn med en 0,125 tum diameter avsmalnande microtip, en frekvens av 20 kHz och maximal effekt på 400 W.
  3. Överföra cell provet till en kall ultracentrifugen tube. Använda polykarbonat flaska sammansättningar (25 mm diameter, höjd 89 mm) kompatibel med en typ 60 Ti fast vinkel rotor. Alternativa rör och rotorer kan användas om samma gravitation kraft uppnås. Spin 120 000 x g under 60 minuter vid 4 ° C. Det bör finnas en uppenbar pellet. Supernatanten kan ha en gul färg.
  4. Överför supernatanten genom hälla eller pipettering till ett kallt 50 mL koniska rör. Notera volymen; Denna volym bör vara ca volymen av resuspension buffert innan snapin frysning. Om supernatanten är trögflytande, kan det vara förorenat av bakteriell DNA som kan täppa till kolumnen kromatografi. I detta fall upprepa den ultracentrifugering för att pellets bakteriell DNA.
  5. Förbereda 500 mL buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) och 500 mL buffert B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM Imidazol).
    Obs: I detta protokoll, hålla snabba protein vätskekromatografi (FPLC) systemet, alla buffertar och provet vid 4 ° C i ett kallt rum.
    1. Sterila filter buffertar A och B med 0,2 μm engångsfiltret enheter. Beroende på systemet FPLC, tvätta pumpen A och pump B med buffert A och buffert B, respektive. Flöde 90% buffert A och 10% buffert B genom systemet tills den ledningsförmåga och UV avläsningar stabilisera. Det maximala flödet beror av instrumentet. Använd en flödeshastighet av 5 mL/min med en gräns som högsta tryck på 1,0 MPa.
  6. Förbereda en 110 mm lång, 5 mm diameter FPLC kolumn med 1,5 mL nickel laddade harts (maximal bindande kapacitet 50 mg/mL, maximalt tryck 1 MPa). Kolumnen kan förberedas dagen innan rening och lagras vid 4 ° c.
  7. Anslut kolumnen till FPLC instrumentet. Jämvikta kolonnen med 20 mL 90% buffert A och 10% buffert B (20 mM Imidazol) med en flödeshastighet på 0,5 mL/min med en maximalt tryck på högst 0,5 MPa. Instrumentet bör samla in realtidsdata ledningsförmåga och UV absorbansen vid 280 nm (en280). De ledningsförmåga och UV avläsningar bör stabiliseras. Om dessa värden inte stabiliserats, fortsätta att flödet buffertar genom kolonnen tills de är stabila.
  8. Läsa in protein provet (~ 10 mL per pellet) till kolonnen med en flödeshastighet av 0,15 mL/min med en maximalt tryck på högst 0,5 MPa. Flöde klassar och kolumn trycket förblir densamma under hela rening. Samla in flödet genom i en 50 mL tub.
    1. Tvätta kolonnen med 20 mL 90% buffert A och 10% buffert B. samla in tvätten i en 50 mL tub. Eluera proteinerna med en 20 mL linjär gradient på 10% till 100% buffert B (20 mM till 200 mM Imidazol).
    2. Slutligen, Tvätta kolonnen med 5 mL 100% buffert B (200 mM Imidazol). Samla den lutning och sista tvätten i 0,27 mL fraktioner.
  9. Kombinera 15 μL av 2 x SDS-PAGE prov buffert med 15 μL av flödet genom, tvätta och peak A280 fraktioner. Koka proverna för 3 min.
    1. Förbered två 10% SDS-PAGE geler som beskrivs tidigare i steg 1,6 utom med 15 väl vaxkakor. Ladda 10 μL av varje prov som gelerna och 4 μL av prestained protein standarder. Kör, fläcken och analysera gelerna som beskrivs i steg 1,6.
    2. Kombinera fraktioner som verkar innehålla nästan ren PFV i baserat på visuell inspektion. Mät volymen genom pipettering, vanligtvis 8-10 mL.
    3. Med en spektrofotometer, mäta den A280 av de kombinerade fraktionerna och beräkna den totala mängden PFV på protein; våra typiska avkastningen är ~ 10 mg per liter av inducerad kultur. Utrotning är PFV IN med taggen hexahistidine 59360 cm-1 M-1.
  10. Ta bort taggen hexahistidine, komplettera PFV IN med 10 mM Ditiotreitol (DTT, 1 M stamlösning) och 0,1 mM EDTA, pH 8,0 (0,5 M stamlösning). Lägg till 15 μg av humant rhinovirus (HRV) 3C proteas per mg PFV IN. Incubate vid 4 ° c över natten. Klyvning minskar PFV i molekylvikt från 47374 Da till 44394 Da och kan verifieras av 10% SDS-PAGE analys.

3. heparin affinitetskromatografi

  1. Bereda 250 mL buffert C (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) och 250 mL buffert D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    Obs: I detta protokoll, FPLC system, buffertar, och provet förvaras i ett kylrum vid 4 ˚C.
    1. Sterila filter buffertar C och D med 0,2 μm engångsfiltret enheter. Beroende på systemet FPLC, tvätta pumpen A och pump B med buffert C och buffert D, respektive. Flöde 80% buffert C och 20% buffert D genom systemet tills ledningsförmåga och UV avläsningar stabilisera. Det maximala flödet beror av instrumentet. Vi använder rutinmässigt en flödeshastighet av 5 mL/min med en gräns som högsta tryck på 1,0 MPa.
  2. Förbereda en 80 mm lång, 5 mm diameter FPLC kolonn med 1 mL heparin sepharose harts (maximalt bindande kapacitet 2,0 mg av nötkreatur antitrombin III per mL kåda; maximalt tryck 1,4 MPa). Kolumnen kan förberedas dagen innan rening och lagras vid 4 ° C. Anslut kolumnen till FPLC instrumentet.
    1. Jämvikta kolonnen med 20 mL 80% buffert C och 20% buffert D (200 mM NaCl) med en flödeshastighet på 0,5 mL/min med en gräns som maximalt tryck av 1 MPa. Instrumentet bör samla in realtidsdata ledningsförmåga och UV absorbansen vid 280 nm (en280). De ledningsförmåga och UV avläsningar bör stabiliseras. Om dessa värden inte stabiliserats, fortsätta att flödet buffertar genom kolonnen tills de är stabila.
  3. Minska NaCl koncentrationen av 200 mM PFV i provet genom att lägga till 1,5 volymer buffert C. Exempelvis lägga till buffert C 15 mL till 10 mL PFV IN. Vår totala volym är vanligtvis ~ 25 mL.
  4. Load PFV i utspädda provet till kolumnen heparin sepharose på 0,5 mL/min flödet med maximalt tryck begränsa 1,0 MPa. Flöde klassar och kolumn trycket förblir densamma under hela rening. Samla in flödet genom i en 50 mL konisk tub.
    1. Tvätta kolonnen med 20 mL 80% buffert C och 20% buffert D (200 mM NaCl), samla in tvätten i en 50 mL konisk tub. Eluera kolumnen med en 30 mL linjär gradient på 20% till 100% buffert D (200 mM till 1 M NaCl).
    2. Tvätta kolonnen med 5 mL 100% buffert D. samla toningen och slutliga tvätta 0,37 mL fraktioner.
  5. Analysera belastning, flödet genom, tvätta och fraktioner av 8% SDS-PAGE som beskrivs i 2,9. PFV IN efter klyvning av taggen hexahistidine har en molekylvikt av 44394 Da och extinktionskoefficient förblir 59360 cm-1 M-1 utan taggen hexahistidine. Lagra alla fraktioner vid 4 ° c fram till slutförandet av en nuclease assay.

4. nuclease assay

  1. Identifiera heparin sepharose fraktioner som verkar innehålla nästan ren PFV IN. kombinera 3 μL av heparin bråk och 50 ng 3 KB supercoiled plasmid DNA i reaktion buffert (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) med en slutlig volym av 15 μL. Inkubera vid 37 ° c för 90 min. inkludera en negativ kontroll med ingen PFV IN.
    1. Stoppa reaktionen med 1 mg/mL proteinas K (20 mg/mL stamlösning) och 0,5% SDS (10% stamlösning). Inkubera vid 37 ° C för 1 h. prover kan förvaras vid-20 ° C för senare analys.
  2. Förbereda en 125 mL gel 1% vikt per volym (w/v) agaros i 1 x TAE buffert (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) med 0,1 µg/mL etidiumbromid metylbromid (10 mg/mL stamlösning)13. Smälta agarosen lösningen och häll till en 15 x 10 cm gel gjutning facket. Infoga en 15 väl kam med 5 mm bred, 0,75 mm tjock brunnar. Tunn brunnar ge bättre band upplösning jämfört med 1,5 mm tjock brunnar. Låt gelen stelna i rumstemperatur.
    1. Sänk ner gelen i 1 x TAE med 0,1 µg/mL etidiumbromid. Tillsätt 3,5 μL av 6 x laddar färgämne (50% glycerol, 0,15% Orange G färgämne) på nuclease assay reaktionerna. Fyll hela volymen till gelen. Kör gelen vid konstant spänning, 10 volt per cm (100 V) vid rumstemperatur i 1 h eller tills Orange G dye framdel når slutet av gelen.
  3. Omedelbart bild på agarosgel med fluorescerande skanner anger att upptäcka etidiumbromid. Linjära DNA bör köra normal i storleken på 3 kb, supercoiled DNA ska köras snabbare (~ 2 kb) och avslappnad cirkel DNA bör köra långsammare (~3.5 kb).
    1. Med bild analys programvara, beräkna pixel volymen av supercoiled, linjär och avslappnad cirkel plasmiden i varje körfält. Ring summan av pixeln volymer för dessa tre DNA former ”totala DNA” värde och använda det för att beräkna procentandelen av linjära och avslappnad cirklar. Till exempel pixel volymen av avslappnad cirklar divideras med det totala DNA pixelvärdet i det körfält, multiplicera detta tal med 100 att fastställa en procentsats. Fraktioner som innehåller kontaminerande nuclease visar ett högre procenttal av linjära och avslappnad cirklar jämfört med den negativa kontrollen.
  4. Kombinera heparin sepharose fraktioner som inte visar kontaminerande nuclease aktivitet. Dialyze i 10 mm 6-8 kDa molekylvikt cutoff (MWCO) dialys slangar vid 4 ° C över natten mot 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glycerol.
  5. Återställa nuclease-fri PFV i provet från dialys slangar. Mät den A280 och beräkna den slutliga proteinkoncentration. Delprov och snap frysa i flytande kväve. Lagra alikvoter vid-80 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinant PFV i är ofta förorenade med en bakteriell nuclease1. Biokemiska integration analyser beror på kvantitering av omvandlingen av supercoiled plasmid DNA till avslappnad cirklar och linjära produkter. Förekomsten av en kontaminerande nuclease kan leda till falska kvantitering av dessa analyser. Uttryck för PFV IN med en hexahistidine-tagg är inducerad i E. coli (figur 1) och först renas genom nickel affinitetskromatografi (figur 2). Fraktioner med nästan ren PFV IN kombineras och taggen hexahistidine är klyvs av ett proteas. Vi har konstaterat att PFV IN och den kontaminerande nuclease har olika tillhörighet för heparin sepharose kromatografi (figur 3)1. PFV i bråk efter heparin sepharose kromatografi inkuberas med en supercoiled plasmid till assay för avslappnad cirklar och linearized plasmid, produkter av nuclease aktivitet (figur 4). Denna analys möjliggör identifiering av protein fraktioner utan nuclease (figur 5). Dessa fraktioner kan vara kombinerade dialyseras och frysta för framtida experiment.

Figure 1
Figur 1: Induktion av PFV i i E. coli . Celler från kulturer innan (lane 2) och efter (lane 3) induktion analyseras för förekomst av PFV i, 47374 Da. prover var åtskilda av 10% SDS-PAGE och fläckade Coomassie brilliant blue. Lane 1, molekylvikt markörer (kDa). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Nickel affinitet kromatografi fraktioner. Lösliga bakteriell lysates var åtskilda av nickel affinitetskromatografi. PFV i med en hexahistidine-tagg var elueras med en linjär gradient av 20 mM till 200 mM Imidazol. Fraktioner utvärderades med 10% SDS-PAGE och fläckade Coomassie brilliant blue. PFV i, 47374 Da, inte klart framgår i provet laddad till kolumnen (belastning), men är mindre uppenbar i flödet genom eller tvätta. Fraktioner som eluera tidigt i Imidazol övertoningen vanligen visar en långsammare rörlighet förorening nära 75 kDa samt vissa snabbare rörlighet föroreningar vid eller under 25 kDa. Vid högre koncentrationer av Imidazol finns det inga uppenbart föroreningar och PFV i verkar vara relativt ren. I det här exemplet var fraktioner #33 genom #84 kombinerat och ytterligare renas. Molekylvikt markörer (kDa) är till vänster om varje gel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Heparin sepharose kromatografi PFV i 1 . Efter nickel affinitet och proteas borttagning av taggen hexahistidine, PFV i (44394 Da) var fractionated av heparin sepharose. Proteiner var elueras med en linjär övertoning från 200 mM till 1 M NaCl. Även bråk #12 och #44 utvärderades med 8% SDS-PAGE med Coomassie färgas blå. Molekylvikt markörer (kDa) är till vänster om varje gel. Dessa fraktioner testades för nuclease aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Nuclease haltbestämning av heparin sepharose fraktioner 1 . Varje heparin sepharose bråkdel lades till supercoiled plasmid DNA. Fraktion siffrorna korrelera dem Figur3. Efter inkubering nuclease reaktionerna var deproteinated och åtskilda av 1% agaros med etidiumbromid. Negativa kontroller inkluderar plasmid DNA med ingen protein (mål endast) och en föregående rening av vildtyp PFV i fritt av nuclease (PFV i WT). En positiv kontroll för kontaminerande nuclease aktivitet är en föregående rening av katalytiskt inaktiva PFV i som är kända för att ha kontaminerande nuclease (PFV i D128N). DNA-markörer som storlek visas i kb. Supercoiled plasmid (SC), linjära plasmid (L) och avslappnad cirklar (RC) indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Kvantitering av nuclease analyser 1. agaros gel skannades och pixelvärden kvantifierades för supercoiled (SC), linjära (L) och avslappnad cirkel (RC) band i varje körfält. Fraktion siffrorna korrelera dem visas i figur 3 och 4. Procentsatserna för linjära och avslappnad cirklar beräknades med hjälp av pixelvärdena och den ekvationen. Till exempel pixel värden för i bråkdel #12 band är: 817636 supercoiled plasmid, 50467 linjär plasmid och 112052 avslappnad cirklar. Det totala DNA pixelvärdet för bråkdel #12 är summan av dessa värden, 980155. Procentandelen av linjära DNA är 50467 multipliceras med 100 för procent och dividerat med det totala DNA värdet equaling 5,1%. Procentuella andelen avslappnad cirklar är 112052 multiplicerat med 100 och dividerat med det totala DNA värdet equaling 11,4%. Summan av linjära och avslappnad cirkel procentsatser är 16,5%. Negativa kontrollplasmid-DNA med ingen protein (ingen IN, botten graf) betyder det att denna förberedelse av Plasmiden med 4,4% av den totala DNA som linjär eller avslappnad cirklar. En andra negativa kontrollen var en föregående rening av vildtyp PFV i (WT) som visas 8,6% av den totala DNA som linjär eller avslappnad cirklar. Dessa två kontroll körfält ange bakgrundsnivån av nicked eller linearized plasmid närvarande med substratet ensam och PFV IN. En positiv kontroll är en föregående rening av katalytiskt inaktiva PFV i (D128N) som hade 23% av den totala DNA som linjär och avslappnad cirklar. DNA utsätts för heparin sepharose fraktioner #12 genom #22 resulterade i > 10% av DNA som linjär och avslappnad cirklar. I det här exemplet fraktioner #24 till #42 visas < 10% konvertering till linjär och avslappnad cirklar. Dessa fraktioner var kombinerade och dialyseras. Alikvoter var frusen och lagras vid-80 ° C för framtida bruk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinanta proteiner som samverkar med DNA, såsom DNA reparation proteiner, syre asätare enda molekyl mikroskopi program eller retrovirala integrases, ska vara fria från kontaminerande bakteriell nukleaser2,3. Dessa föroreningar kan förvirra tolkning av resultat under bulk biokemiska eller enda molekyl analyser.

Vi har funnit att en bakteriell nuclease ofta samtidig renar med PFV IN. PFV i visas dock en affinitet för heparin sepharose som lätt kan särskiljas från den bakteriella nuclease förorening1. Nyckeln till beredning av nuclease-fri PFV i är noggrann kvantitering av nuclease aktivitet i varje bråk efter lutning eluering från heparin sepharose. Lutningen måste vara tillräckligt grunt att tillåta separation av PFV IN från det främmande ämnet nuclease; en brant lutning skulle inte vara förenligt med effektiv separation. Plasmid DNA substratet bör dessutom ha en låg andel av avslappnad cirklar att minska bakgrunden nuclease analysens. Om plasmid DNA substratet har en hög bakgrund av avslappnad cirklar, bör en ny rening av plasmid DNA utföras. Nuclease aktivitet analysen avslöjar förekomsten av kontaminerande nuclease och fraktioner som ska kasseras.

I vissa fall kan storlek utslagning kromatografi (SEC) vara en effektiv metod för borttagning av kontaminerande nuclease2. Tidigare grupper har använt SEC under reningen av PFV IN4. SEC har en begränsad lastvolym och tenderar att minska den slutliga proteinkoncentration. Den stora fördelen att affinitet och jonbyteskromatografi är möjligheten att ladda en betydligt större volym än SEK.

Testning för nuclease aktivitet kan anpassas till olika proteiner som tillsammans renar med en bakteriell nuclease. Vi identifiera här det PFV i och en kontaminerande nuclease kan avskiljas av heparin sepharose kromatografi. Vi har tidigare visat att PFV IN har en liknande profil nuclease med Mono-S ering och Mono-Q anjon exchange kromatografi vilket gör dessa hartser olämpliga för detta protein. Beroende på det önska proteinet i förhållande till nuclease affinitet egenskaper, kan detta protokoll användas med affinitet eller jonbyte hartser och gradient eluering. Nyckeln till effektiv borttagning av nuclease kontaminering från ett protein av intresse är en skillnad i affinitet för en harts. Varje fraktion måste analyseras för nuclease aktivitet. Kromatografi hartser av detta protokoll får inte tillämpas direkt på alla proteiner som tillsammans renar med bakteriell nukleaser. Det övergripande begreppet för att skilja nuclease från ett protein av intresse och testmetoder fraktioner för nuclease aktivitet med en affinitet eller jonbytare kan dock i huvudsak tillämpas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH AI099854 och AI126742 till nyckel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics