توجه موقع التثبيت من البروتين Morphogenetic 2 العظام للسطوح الصلبة بالكيمياء انقر فوق

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الحيوية يخدر بعظم Morphogenetic البروتين 2 (BMP2) استخدمت كاستراتيجية علاجية جديدة لشفاء كسور العظام غير الأعضاء في الاتحاد. للتغلب على الآثار الجانبية الناجمة عن إطلاق سراح منفلتة من العامل، فإننا نقترح وضع استراتيجية جديدة للموقع--شل مباشرة العامل، وبالتالي خلق المواد مع تحسين قدرات أوستيوجينيك.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Siverino, C., Tabisz, B., Lühmann, T., Meinel, L., Müller, T., Walles, H., Nickel, J. Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry. J. Vis. Exp. (133), e56616, doi:10.3791/56616 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

استراتيجيات علاجية مختلفة لعلاج تشوهات العظام الطويلة غير الشفاء قد تم التحقيق المكثف. وتستخدم حاليا العلاجات الحالية العديد من القيود التي أدت إلى استخدام المواد الحيوية في تركيبة مع أوستيوجينيك عوامل النمو، مثل البروتينات مورفوجينيتيك العظام (BMPs). تتطلب أساليب الاستيعاب أو تغليف استخداماً الفسيولوجية أعلاه مبالغ BMP2، عادة ما أسفر عن أثر الإفراج عن دفعة أولى ما يسمى يثير العديد من الآثار الجانبية السلبية الشديدة. استراتيجية ممكنة للتغلب على هذه المشاكل سيكون تساهمي زوجين البروتين السقالة. وعلاوة على ذلك، ينبغي إجراء اقتران بطريقة خاصة بالموقع لضمان التوصل إلى نتائج منتج استنساخه. ولذلك، قمنا بإنشاء متغير BMP2، الذي قدم حمض أميني اصطناعية (بروبارجيل-L-يسين) إلى الجزء ناضجة من البروتين BMP2 كودون استخدام التوسع (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk اقترن بالخرز فونكتيوناليزيد عن طريق أزيد تشجعهن النحاس-ألكاين سيكلواديشن (كواك). النشاط البيولوجي من جانب BMP2-K3Plk ثبت في المختبر وقد ثبت نشاط الخرز BMP2-K3Plk-فونكتيوناليزيد أوستيوجينيك في الخلية على أساس فحوصات. حبات فونكتيوناليزيد على اتصال بالخلايا C2C12 كانت قادرة على حمل التعبير الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) بالقرب من المحظورة محلياً من حبة. وهكذا، بهذا الأسلوب، يمكن إنتاج السقالات فونكتيوناليزيد التي يمكن أن تؤدي إلى تمييز الخلية نحو نسب أوستيوجينيك. بالإضافة إلى ذلك، تكفي جرعات BMP2 أقل بسبب توجه BMP2 إلى جانب توجيه الموقع التي تسيطر عليها. مع هذا الأسلوب، يتعرض BMPs دائماً على المستقبلات على سطح الخلية في الاتجاه المناسب، الذي ليس هو الحال إذا كانت تقترن العوامل عبر التقنيات الموجهة من موقع غير اقتران. نتائج المنتج يتم السيطرة عليها بدرجة عالية، وهكذا، ينتج مواد ذات خصائص متجانسة، وتحسين قابليتها لإصلاح الحجم الحرج العظام العيوب.

Introduction

الهدف النهائي لتجديد الهندسة والعظام أنسجة العظام التغلب على العوائق والقيود التي تحدث خلال فترة العلاج شيوعاً لكسور غير الأعضاء في الاتحاد. السيارات أو الو الزرع هي غالباً ما تستخدم كاستراتيجيات العلاج الحالية، على الرغم من أن كلا منهما لها عدة عيوب. وينبغي حمل الاختلاس العظام المثالي تكون العظم أوستيويندوكشن، فضلا عن أوستيوكوندوكشن، مما يؤدي إلى أوستيوينتيجريشن للفساد في العظام. في الوقت الحاضر، يعتبر فقط صناعة السيارات في زرع "المعيار الذهبي" حيث أنها تقدم كل الخصائص الاختلاس العظام المثالي. ولسوء الحظ، كما يعرض الجوانب السلبية الهامة، مثل أوقات جراحة طويلة وموقع صدمة ثانية التي عادة ما يستتبع مضاعفات أكثر (مثلاً، الألم المزمن، تشكيلات دموي، والالتهابات، وعيوب شكلية، إلخ). من ناحية أخرى بالطعوم allogenic، خصائص الأمثل لجميع الجوانب العامة1. التكنولوجيات الاختلاس العظام البديلة قد تحسنت في السنوات القليلة الماضية، بهدف إنتاج السقالات التي هي أوستيويندوكتيفي، أوستيوكوندوكتيفي، متوافق حيويا، وبيوريسوربابل. نظراً للعديد من المواد الحيوية لا تظهر كل هذه الخصائص أوستيوجينيك، قد أدمجت مختلف عوامل النمو، أساسا، BMP2 و BMP7، بغية تحسين إمكانات osteogenic سقالة خاصة2.

كمعيار أساسي، ينبغي أن توفر نظم إيصال عامل النمو هذه إطلاق سراح جرعة التي تسيطر عليها مع مرور الوقت بغية تيسير أحداث أساسية مثل تجنيد الخلية والمرفقات، وخلية إينجرووث والأوعية. ومع ذلك، BMPs، فضلا عن العوامل الأخرى النمو osteogenic عادة المعطل تداولها غير تساهمي3. تقنيات الامتزاز والفخ تتطلب استخدام المبالغ أعلاه الفسيولوجية للبروتين بسبب إطلاق سراح دفعة أولية، الأمر الذي يؤدي إلى عيوب خطيرة المجراة، عادة ما تؤثر على الأنسجة المحيطة بفرط العظام، عظام النهايات وتورم والتهاب4. وهكذا، يمكن الاحتفاظ بعوامل النمو في موقع التسليم لفترات أطول من الوقت بأساليب التثبيت التساهمي. تعديل كيميائيا BMP2 (سوكسينيلاتيد5، أسيتيلاتيد6 أو7من بيوتينيلاتيد)، المهندسة heterodimers8، أو BMP2 أوليجوبيبتيديس المشتقة9 تم تصميمها واستخدامها للتغلب على القيود المتصلة ب الاستيعاب. بيد أن بيو-نشاط هذه الثوابت لا يمكن التنبؤ بها نظراً للترتيب الذي يحتمل أن يمنع ربط يجند المعطل تداولها المستقبلات الخلوية. كما هو موضح سابقا، من الضروري أن جميع سلاسل مستقبلات الأربعة المشاركة في تشكيل مجمعات المنشط مستقبلات يجند التفاعل مع BMP2 المعطل تداولها بغية تنشيط جميع المتلقين للمعلومات مما يشير إلى الشلالات10بالكامل.

للتغلب على مشاكل نتيجة المنتج متنافرة مع قيود من حيث بيواكتيفيتي، والاستقرار، والتوافر البيولوجي العامل المعطل تداولها، قمنا بتصميم متغير BMP قادرة على تساهمي ملزمة السقالات في طريقة توجيه الموقع. وتضم هذا البديل، BMP2-K3Plk، ووصف حمض أميني اصطناعي الذي عرضته كودون الوراثية التوسع في11. ارتبط هذا البديل بنجاح إلى السقالات باستخدام استراتيجية اقتران التساهمية مع الحفاظ على نشاطها البيولوجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إنتاج BMP2 الخيار BMP2-K3Plk

  1. استنساخ من BMP2-K3Plk بالطفرات الموجهة من الموقع باستخدام PCR 12
    1. تضخيم البشري BMP2 الناضجة (hmBMP2) من ناقل p25N-hmBMP2 (انظر الجدول للمواد) مع تمهيدي إلى الأمام (جاككاجاكاتاتجكتكاجككتاجكاكااكاجك 3 '5') وإدخال تمهيدي عكس (ككاجاجاتككتاجكجاكاكككاكاكككت 3 '5') (كودون وقف العنبر العلامة) في موقف يسين أول جزء BMP2´s ناضجة. إجراء تفاعل PCR باستخدام ميليلتر 33.5 ح2س، 10 ميليلتر من مزيج تفاعل PCR، 1.5 ميليلتر من 10 ميكرون دنتب حل الأسهم، 1.5 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 pmol/ميليلتر)، 1.5 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 pmol/ميليلتر)، 1 ميليلتر من p25N-hmBMP2 (10 نانوغرام/ميليلتر) ، و 1 ميليلتر من بوليميريز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) في cycler حرارية (تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، دورات 30 من تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 1، الصلب في 60 درجة مئوية 1 دقيقة واستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تمديد نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
    2. تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً عقب توصيات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
    3. هضم المنتج بكر مع إنزيم التقييد ندى في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة باستخدام ميليلتر 16 ح2س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط الإنزيم عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 5 هضم المنتج بكر مع إنزيم التقييد بامهي في 37 درجة مئوية ح 1 استخدام ميليلتر 16 ح2س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط الإنزيم عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. هضم ناقل pET11a-بيرترنا مع ندى في 37 درجة مئوية ل 2 ح و 45 دقيقة باستخدام ميليلتر 16 ح2س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط عند 65 درجة مئوية لهضم دقيقة 5 ناقلات pET11a-بيرترنا مع بامهي في 37 درجة مئوية ح 1 استخدام ميليلتر 16 ح2س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. إلغاء تنشيط الحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. فصل المتجهات هضمها عن ناقلات عسر الهضم ومخلفات الهضم قبل [اغروس] هلام التفريد (0.8% [اغروس]، 60 دقيقة في 100 V). اضطر إدراج BMP2-K3TAG هضمها مع العمود الفقري هضمها pET11a-بيرترنا في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 2 استخدام 100 نانوغرام pET11a-بيرترنا العمود الفقري و 34.5 نانوغرام إدراج BMP2-K3TAG (نسبة المولى 1:3). رد فعل خليط يحتوي على العمود الفقري الحمض النووي وإدراج، 2 ميليلتر من المخزن المؤقت ليجاسى، 1 ميليلتر ليجاسى الحمض النووي، وح2س إلى إجمالي حجم 20 ميليلتر.
    6. تؤدي إلى تحول المشارك في pET11a-بيرترنا-BMP2-K3Plk وزلي-دويتو-بيرترناسينث في البكتيريا BL21(DE3):
      1. إضافة 50 نانوغرام لكل بلازميد للبكتيريا، وضع الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة، وصدمتها الحرارة 42 درجة مئوية لمدة 50 s، ضع على الجليد لمدة 5 دقائق وإضافة 500 ميليلتر من متوسطة مرق ليسوجيني (رطل) في الخليط ويهز 300 لفة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.
      2. نشر 100 ميليلتر من خليط البكتيرية على كاناميسين المعالجون مسبقاً (50 ميكروغرام/مل)/لوحات الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل)، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. التعبير وتنقية BMP2-K3Plk 13 , 14
    1. نشر مستعمرة واحدة بين عشية وضحاها في 50 مل متوسطة رطل مع 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين عند 37 درجة مئوية.
    2. تمييع بين عشية وضحاها الثقافات 01:20 إلى 800 مل من مرق رائع (السل) المتوسطة وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين، وتنمو في 37 درجة مئوية حتى يتم التوصل إلى التطوير التنظيمي600 من 0.7. أضف بروبارجيل-L-يسين إلى تركيز نهائي 10 مم. جمع 100 عينة ميليلتر من الثقافة قبل الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) التعريفي.
    3. حمل التعبير الجيني بإضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 1 مم. تنمو الثقافة في 37 درجة مئوية ح 16 في شاكر مداري 180 لفة في الدقيقة. جمع عينة 100 ميليلتر من الثقافة.
    4. الطرد المركزي ثقافة كاملة في 9000 x ز عن 30 دقيقة تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند بيليه البكتيرية في 30 مل من تبسي المخزن المؤقت (10 ملم تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا)) مع 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (أضيف حديثا).
      تنبيه: تعامل مع 2-mercaptoethanol تحت غطاء الدخان. تجنب ملامسة الجلد والعيون. تجنب استنشاق بخار أو الضباب. تنفيذ كافة الخطوات استثارة مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على 2-mercaptoethanol تحت غطاء الدخان.
    5. تزن الكأس فارغ للطرد مركزي ونقل بيليه ريسوسبينديد في الكأس الفارغ. الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن الكأس مع بيليه. قم بطرح وزن الكأس فارغة لحساب وزن بيليه.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تجميد بيليه في-20 درجة مئوية في الأجل القصير أو في-80 درجة مئوية في الأجل الطويل. عند استئناف البروتوكول، ذوبان الجليد بيليه في الرايت
    6. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت الظريف (10 ملم تريس pH 8.0؛ 150 مم كلوريد الصوديوم؛ يدتا 1 مم، السكروز مم 375 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (أضيف حديثا)). استخدام 200 مل صق المخزن المؤقت لكل 10 جرام من بيليه.
    7. Sonicate تعليق على الجليد (10 دقيقة مع نبض s 40، 20 ثانية فرامل والسعة 30%). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه. كرر الخطوات سونيكاتيون والطرد المركزي 4 مرات.
    8. ريسوسبيند بيليه في 100 مل من TBS المخزن المؤقت (10 ملم تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
    9. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت نوكلاس (100 مم تريس، 1 مم يدتا، مجكل 3 مم2) مع إضافة طازجة 80 نوكلاس يو/مليلتر (مثلاً، بينزوناسي) باستخدام 10 مل/ز بيليه. احتضان تعليق بين عشية وضحاها في RT على لوح التحريك (30 لفة في الدقيقة).
    10. إضافة المخزن المؤقت تريتون (60 مم يدتا، 1.5 م كلوريد الصوديوم، 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-تيتراميثيلبوتيل) البولي فينيل جليكول) إلى التعليق. حجم المخزن المؤقت تريتون لإضافة يتوافق مع حجم 0.5 جزء من التعليق. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت (لا التحريك). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
    11. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (100 مم تريس، 20 مم يدتا) استخدام مل 8/ز بيليه. الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
    12. ريسوسبيند بيليه بإضافة 4 مل/ز من 25 مم NaAc pH 5.0 و 5 مل/g لمن جوكل م 6 مع 1 مم ديثيوثريتول (DTT) (أضيف حديثا). احتضان تعليق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على لوح التحريك (30 لفة في الدقيقة).
    13. الطرد المركزي في 75,500 س ز لمدة 20 دقيقة. وتتضمن المادة طافية الآن البروتين أحادي BMP2 تكشفت. جمع المادة طافية وتركز هذا استخراج إلى 20 مليلتر OD استخدام غشاء كاتشين 3 وقف (موكو) وزن الجزيئي في التركيز الخلية (انظر الجدول للمواد).
    14. إضافة مونومرات تتركز في قطره واحدة إلى المخزن المؤقت ريناتوريشن (2 م ليكل، 50 مم تريس، الفصول 25 مم، 5 ملم يدتا، 1 مم الجلوتاثيون ثنائي كبريتيد (جسج)، 2 مم الجلوتاثيون (المدفع جريازيف)) أثناء التحريك (30 لفة في الدقيقة). تبني على RT ح 120 في الظلام.
      ملاحظة: خلال هذه الفترة الحضانة، ريفولدينج occours. ويتضمن الحل من هذه الخطوة فصاعدا مطوية ديميريك BMP2-K3Plk.
    15. ضبط الأس الهيدروجيني للحل إلى 3.0 استخدام مركزة HCl. دياليزي الحل ضد 1 مم HCl. وتركز الحل دياليزيد باستخدام غشاء وقف إنتاج المواد الانشطارية (موكو) وزن الجزيئي كاتشين 10 في خلية تركيز.
    16. حجته أن الحل عن طريق إضافة مخزن مؤقت (20 مم NaAc، الايزوبروبانول 30%). إضافة حجم المخزن المؤقت بالمقابل إلى وحدة تخزين 30% من الحل. الطرد المركزي الحل في 4700 x ز لمدة 15 دقيقة.
    17. حجته العمود للتبادل الأيوني على نظام لوني سائل (فبلك) بروتين سريع15 مع 150 مل من المخزن المؤقت تحميل ألف محلول البروتين على العمود متوازن. الوت الكسور باستخدام تدرج خطي للمخزن المؤقت ب (20 مم NaAc، الايزوبروبانول 30 ٪، كلوريد الصوديوم م 2) استخدام 100 مل من المخزن المؤقت ب جمع 2 مل الكسور.
      ملاحظة: تركيز البروتين قبل التحميل للعمود وفقا لحجم إجمالي العمود. يجب أن يكون حجم البروتين النهائي < 5% حجم إجمالي العمود.
    18. تحليل 20 ميليلتر من كل جزء من الحزب الديمقراطي الصربي Polyacrylamide هلام (12 ٪) التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) 16 و المصبوغة "أخذ الرائعة الأزرق"17 (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: "أخذ الأزرق اللامع" الملون جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يظهر الكسور التي تحتوي على dimers (26 كاتشين) والكسور التي تحتوي على مونومرات (كاتشين 13).
    19. تجمع الكسور التي تحتوي على ديمر. دياليزي تجمع ديمر التي تحتوي على كسور بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ضد 1 مم HCl (حجم 5 لتر). التركيز المنتج النهائي باستخدام كاتشين 10 تركيز وحدة تصفية الطرد المركزي (انظر الجدول للمواد). تحليل المنتج النهائي بالتفريد جل Polyacrylamide (12 ٪) من الحزب الديمقراطي الصربي (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وتلطيخ "أخذ الأزرق الرائعة".
      ملاحظة: شريط "أزرق لامع أخذ" الملون الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام ينبغي إظهار الفرقة واحد فقط في كاتشين 26. وهذا هو BMP2-K3Plk المنتج النهائي.

2-الاستغلال الأمثل للنحاس (I)-حفز أزيد ألكاين سيكلواديشن (كواك) الشروط

  1. تأثير الصوديوم اسكوربات (ناعس) والنحاس (II) كبريتات (CuSO 4 ) على نوع البرية BMP2 (BMP2-WT)
    1. احتضان 20 ميكرومتر WT BMP2 مع نسب مختلفة من ناعس إلى CuSO4. استخدام 0.5 مم ناسك و 0.5 مم CuSO4 (ابتداء من تركيز) في وحدة تخزين 50 ميليلتر. الشروع بالنسب التالية من ناعس CuSO4: (1:1)، (1.7:1)، (10:1)، حفظ تركيز4 CuSO المستمر في 0.5 مم (20:1)، وضبط تركيز ناعس تبعاً لذلك. تنفيذ رد الفعل في ح2س في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها في الرايت
    2. إعداد عينات المخفضة عن طريق إضافة تحميل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 5% 2-mercaptoethanol واحتضان عينة عند 95 درجة مئوية لخفض الحد الأدنى 6 تحليل وعينات غير محدود من الحزب الديمقراطي الصربي Polyacrylamide هلام التفريد (12 ٪) (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وتلطيخ "أخذ الزرقاء الرائعة". كوماسي الملون الجل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تظهر العصابات في نطاق كاتشين 13 (انخفاض conditons) 26 كاتشين وارتفاع الوزن الجزيئي (الحد من غير شروط).
  2. أثر Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) أمين (ثبتا) في "رد فعل كواك"
    1. احتضان ميكرومتر 20 BMP2-K3Plk مع نسب مختلفة من ثبتا إلى CuSO4. استخدام 5 مم ناعس، و 200 ميكرومتر 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين (تبقى ناعس و 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين ثابتة). استخدام 50 ميكرومتر ثبتا و 0.5 مم من CuSO4 كبداية تركيزات. استخدام نسب مختلفة من ثبتا إلى CuSO4: (7:1)؛ (10:1)؛ (12:1)؛ (15:1)؛ (20:1)-تنفيذ رد فعل في ح2س (الحجم الإجمالي 50 ميليلتر) لح 24 في RT في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة).
    2. عند اقتران، يصبح 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين صبغة فلورسنت. إعداد عينات في ظروف انخفاض وعدم تخفيض وتحليلها بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة. تصور المواد الهلامية تحت قناة الإثارة مع طول موجي محدد ل 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين (λإس = 404 نانومتر؛ λم = 477 nm).

3-التساهمي اقتران تقنية BMP2-K3Plk لأزيد فونكتيوناليزيد الخرز [اغروس]

  1. احتضان ميكرومتر 20 BMP2-K3Plk أو BMP2-WT (يستخدم كمراقبة سلبية) مع 20 ميليلتر من الخرز [اغروس] تنشيط أزيد في إجمالي حجم 500 ميليلتر في رد فعل المخزن المؤقت (0.1 M حبيس pH 7.0، اليوريا 3.9 متر، 50 ميكرون CuSO4، 250 ميكرون ثبتا، اسكوربات الصوديوم 5 مم) ح 2 في RT على روتاتي خلاط نغ (20 لفة في الدقيقة). وقف رد الفعل بإضافة 5 مم يدتا (تركيز النهائي).
  2. تبني على RT لمدة 15 دقيقة في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة). الطرد المركزي عينات من 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة في جمع الرايت سوبيرناتانتس.
  3. تغسل بيليه الذي يحتوي على الخرز ثلاث مرات مع 1,000 ميليلتر من ميزانيات500 المخزن المؤقت (50 مم حبيس، 500 مم كلوريد الصوديوم)، ثلاث مرات مع ميليلتر 1,000 مجكل م 42، ومرتين مع 1,000 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). في كل خطوة من خطوات الغسيل، الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة على RT وجمع سوبيرناتانتس. المخزن إلى جانب الخرز في ميليلتر 1,000 لبرنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
    تنبيه: عدم الإزعاج بيليه حبة أثناء إزالة المادة طافية.

4-التحقق من الوجود والنشاط البيولوجي المعطل تداولها BMP2-K3Plk استخدام تكساس الأحمر المسمى مستقبلات BMP أنا اكتودومين (بمبر-IA الجماعة الأوروبية )

  1. احتضان 50 ميليلتر الخرز BMP2-K3Plk فونكتيوناليزيد مع 1 ميكرومتر من "تكساس الأحمر" المسمى بمبر-IAالمفوضية الأوروبية مع 150 ميليلتر من ميزانيات500 المخزن المؤقت (50 مم حبيس، 500 ملم كلوريد الصوديوم) على RT ح 1 في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة).
  2. الطرد المركزي الخرز في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة في الرايت تجاهل المادة طافية. أغسل حبات مع 1000 ميليلتر من ميزانيات500 المخزن المؤقت. كرر الخطوة الغسيل إضافية 3 مرات. غسالة أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة على RT بعد كل خطوة.
  3. ريسوسبيند الخرز في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني و "الماصة؛" 50 ميليلتر على شريحة غطاء زجاج. تعيين عامل تصفية مجهر بين 561 أو 594 شمال البحر الأبيض المتوسط. كشف تكساس الأحمر-بمبر-IAEC-BMP2-K3Plk فونكتيوناليزيد الخرز استخدام صور مجهرية وتأخذ الفلورسنت.

5-قياس الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) التعبير لإثبات بيواكتيفيتي في المختبر إنتاج BMP2-K3Plk قبل و "بعد رد اقتران".

  1. تحليل الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)
    1. الثقافة بروميوبلاستيك C2C12 الخلايا (ATCC CRL-172) في المتوسط (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) والبنسلين يو/مليلتر 100 ز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%2.
    2. البذور C2C12 الخلايا في كثافة 3 × 104 خلايا/بئر إلى ميكروسكوبية 96-جيدا. السماح للخلايا إرفاق بين عشية وضحاها. إزالة المتوسطة واحتضان خلايا C2C12 حضور 0.5-200 نانومتر BMP2 WT أو BMP2-K3Plk في 100 ميليلتر/جيدا من دميم (FCS 2%، 100 يو/مليلتر البنسلين G و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%2 لح 72.
    3. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني كل بئر. خلايا في الرايت ح 1 من المخزن المؤقت لتحلل 100 ميليلتر/جيدا (1% NP-40، جليكاين م 0.1، pH 9.6، 1 مم مجكل2, 1 ملم زنكل2) على هز لوحة (220 لفة في الدقيقة).
    4. إضافة من الب المخزن المؤقت (0.1 M جليكاين، pH 9.6، 1 مم مجكل2، 1 مم زنكل2) 100 ميليلتر/جيدا مع 1 ملغ/مل فنيتروفينيلفوسفاتي (أضيف حديثا) إلى الخلية ليستي.
    5. قياس الامتصاص في 405 نانومتر في قارئ مولتيبلاتي بعد إضافة المخزن المؤقت لحزب العمال الأسترالي، وكل 5 دقائق حتى يكتمل وضع اللون. إنشاء منحنيات استجابة الجرعة وقيم EC50 باستخدام نموذج سوقي، y = أ2 + (أ1-أ2)/(1 + (x/x0)p).
  2. تلوين الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)
    1. الثقافة بروميوبلاستيك C2C12 الخلايا (ATCC CRL-172) في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) والبنسلين يو/مليلتر 100 ز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%2.
    2. البذور C2C12 الخلايا في كثافة 3 × 104 خلايا/بئر ميكروسكوبية 96-جيدا. السماح للخلايا إرفاق بين عشية وضحاها. إزالة المتوسطة وإضافة 20 ميليلتر/بئر BMP2-K3Plk، إلى جانب الخرز. BMP2-K3Plk، إلى جانب الخرز في 1000 ميليلتر لتعليق برنامج تلفزيوني.
    3. تعد حلاً من 0.4 في المائة نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في دميم. تذوب في الميكروويف (600 واط لمدة 3 دقائق) وندعه يبرد في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    4. إضافة 20 ميليلتر من 0.4 في المائة نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في كل بئر (تغطي الخرز والخلايا). أجهزة الطرد المركزي في عام 2000 x ز لمدة 5 دقائق في 20 درجة مئوية. إضافة 80 ميليلتر دميم (FCS 2%، 100 يو/مليلتر البنسلين G و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) واحتضان في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%2 لح 72.
    5. إزالة المتوسطة، مع الحرص على عدم فصل في طدت 0.4% [اغروس]. إضافة 100 ميليلتر/بئر NBT الخطوة 1/بسب (كلوريد تيترازوليوم نيترو--الأزرق، الملح ف 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate-تولويدين) الركيزة الحل.
    6. تحليل الفوسفاتيز القلوية تلطيخ استخدام مجهر الضوء فورا بعد تلطيخ الأرجواني يصبح واضحا. استخدام مجهر الحقل مشرق والتقاط الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه المقالة، يصف لنا طريقة لزوجين متغير جديد BMP2، BMP2-K3Plk، تساهمي لأزيد المتاحة تجارياً فونكتيوناليزيد [اغروس] الخرز (الشكل 1). تم التحقق من صحة بيواكتيفيتي الخيار BMP2-K3Plk المنتجة باستحثاث الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) التعبير الجيني في الخلايا C2C12. الاختبار في المختبر يظهر مستويات مماثلة من التعبير الب الناجمة عن نوع البرية BMP2 (BMP2-WT) و BMP2-K3Plk (الشكل 2).

تفاعلات الأكسدة والاختزال بين النحاس (II) كبريتات (CuSO4) والصوديوم اسكوربات (ناعس) توليد أنواع الأكسجين التفاعلية التي قد تؤثر على السلامة الهيكلية، وتؤثر بالتالي بيواكتيفيتي BMP2-K3Plk. للتحقق من السلامة الهيكلية للبروتين، أجرينا حضانة بين عشية وضحاها مع CuSO4 وناعس، تبين تدهور BMP2 WT بطريقة تعتمد على تركيز (تصور بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحت ظروف انخفاض (الشكل 3 ألف1 )) وتشكيل مولتيميرس أو المجاميع التي تظهر في حوالي 40 كاتشين (تحت ظروف غير تخفيض) (الشكل 3 ألف2). لتجنب تدهور البروتين، تريس (3-هيدروكسيبروبيلتريازوليل-ميثيل) أمين (ثبتا) كان يستخدم كعامل حماية (الشكل 3B). يمنع استخدام ثبتا تجزئة BMP2، في حين لا يمكن منع تكوين هياكل الوزن الجزيئي أعلى بإضافة ثبتا. إدخال المزيد من التحسينات رد فعل لدى تكوين المخزن المؤقت رد فعل ورد فعل درجة الحرارة ووقت رد الفعل (البيانات لا تظهر). ووصف البروتوكول هنا تفاصيل الإنجازات النهائية فيما يتعلق بتكوين رد فعل المخزن المؤقت، ودرجة الحرارة، ووقت رد الفعل.

للتأكد من أن يحتفظ BMP2-K3Plk بيواكتيفيتي بعد اقتران، استخدمنا مستقبلات فلوريسسينتلي المسمى اكتودومين البروتين من النوع أنا مستقبلات (بمبر-IAEC) لإثبات أنه لا يزال قادراً على ربط مستقبلات هذا البروتين المعطل تداولها. حبات المغلفة مع BMP2-K3Plk عن طريق الكيمياء كواك أسفرت عن الأسفار عند المحتضنة مع المسمى صبغ بمبر-IAالمفوضية الأوروبية (الشكل 4). في التباين، والخرز غير المغلفة أو الخرز التي كانت المحتضنة مع BMP2-WT أظهر لا الأسفار مستويات الإشارة أعلاه الخلفية (البيانات لا تظهر)14.

بعد التأكد من قدرات ربط مستقبلات ليجند المعطل تداولها في المختبر، نحن أيضا اختبار ما إذا كانت الاستجابات البيولوجية التي يمكن أن تحدثها الخرز فونكتيوناليزيد في تحليل يستند إلى الخلية. الب وساطة تلطيخ وقعت فقط في تلك الخلايا التي كانت على اتصال مباشر مع الخرز BMP2-K3Plk-فونكتيوناليزيد (الشكل 5). وهذا يؤكد أن البروتين مرتبط في الواقع تساهمي الخرز وليس مجرد استيعابها، منذ أكثر من انتشار بقع على مسافات أكبر بالخرز أن خلاف ذلك فقد لوحظ.

Figure 1
رقم 1: تصوير BMP2-K3Plk-(أ) وصف الخيار BMP2-K3Plk مع إضفاء الطابع المحلي على استبدال حمض أميني أدخلت. (ب) الربط بين نظام: رد فعل "كواك" BMP2-K3Plk مع أزيد فونكتيوناليزيد الخرز. طبع بإذن من تابيسز et al(تكييف). (2017): توجه موقع التثبيت BMP-2: نهجين لإنتاج السقالات أوستيويندوكتيفي مبتكرة. بيوماكروموليكوليس. 18 (3)، 695-708. (جمعية الكيميائية أمريكا 2017 حقوق التأليف والنشر) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: بيواكتيفيتي متغيرات BMP2- مقارنة بين بيواكتيفيتيس (الب المقايسة) BMP2-K3Plk و wildtype BMP2 (BMP2-WT). المحور السيني يمثل تركيز BMP2 WT أو BMP2-K3Plk المستخدمة في المقايسة. وتمثل البيانات EC50 القيم الوسطية والانحرافات المعيارية للتجارب الفردية 4 (N = 4). طبع بإذن من تابيسز et al(تكييف). (2017): توجه موقع التثبيت BMP-2: نهجين لإنتاج السقالات أوستيويندوكتيفي مبتكرة. بيوماكروموليكوليس. 18 (3)، 695-708. (جمعية الكيميائية أمريكا 2017 حقوق التأليف والنشر) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تأثير عامل تخفيض على سلامة BMP2. (أ) BMP2-WT تعرضت لنسب المولى مختلفة من اسكوربات الصوديوم (ناسك) للنحاس (ثانيا) كبريتات (CuSO4). تم تحليل العينات بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي وتلطيخ "أخذ الأزرق الرائعة" تحت مخفضة (الشكل A1) وظروف عدم تخفيض (A2 الرقم). تمثل الأسهم الحمراء في ظروف انخفاض (A1)، ملصوق BMP2-WT. في الظروف غير تخفيض (A2)، تشير الأسهم الحمراء مولتيميريك BMP2-WT. يتم الإشارة إلى عصابات تمثل الأنواع BMP2 ملصوق سهم أزرق. أسطورة: تخفيض NCR -BMP2-WT غير المعالجة؛ نورث كارولاينا--BMP2--وزن دون علاج؛ 1:1-20:1-زيادة نسب المولى من اسكوربات الصوديوم إلى CuSO4. (ب) كان BMP2 K3Plk بالإضافة إلى 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين استخدام شروط رد فعل كواك تكملها ثبتا. عند اقتران يصبح 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين صبغة فلورسنت. أسطورة: NC-BMP2-WT تجاوب مع 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين؛ 7:1 إلى 20:1 زيادة نسب المولى ثبتا إلى CuSO4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: بيواكتيفيتي المعطل تداولها BMP2-K3Plk في المختبر. صورة الممثل للتفاعل بين K3Plk BMP2 المعطل تداولها مع بمبر-IA تكساس--الأحمر--وصفتالمفوضية الأوروبية. طبع بإذن من تابيسز et al(تكييف). (2017): توجه موقع التثبيت BMP-2: نهجين لإنتاج السقالات أوستيويندوكتيفي مبتكرة. بيوماكروموليكوليس. 18 (3)، 695-708. (جمعية الكيميائية أمريكا 2017 حقوق التأليف والنشر) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: بيواكتيفيتي K3Plk BMP2 المعطل تداولها في تحليل يستند إلى الخلية. (أ) صورة تمثيلية الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) تلطيخ على المعاملة مع الخرز بالإضافة إلى حبات BMP2-K3Plk فونكتيوناليزيد. (ب) الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) تلطيخ على المعاملة مع 25 القابلة للذوبان نانومتر BMP2-K3Plk-ريبرينتيد (تكييف) بإذن من تابيسز وآخرون. (2017): توجه موقع التثبيت BMP-2: نهجين لإنتاج السقالات أوستيويندوكتيفي مبتكرة. بيوماكروموليكوليس. 18 (3)، 695-708. (جمعية الكيميائية أمريكا 2017 حقوق التأليف والنشر) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توليد المتغيرات البروتين الموسومة بتوسيع كودون الوراثية يسمح الأخذ بمختلف الأحماض الأمينية غير طبيعية النظير أساسا في أي موضع من تسلسل البروتين الأساسي. في حالة BMPs مثل BMP2, العلامات المشتركة مثل علامة 6-الحامض الأميني (له) لا يمكن عرض ن لا شفاء منها، منذ نهاية protein´s ج-الطرفية مدفونة داخل هيكل البروتين العالي، ومما لا يمكن الوصول إليها من الخارج. في مواقع أخرى، قد من المرجح جداً أن يؤدي حجم العلامة أدخلت التعديلات الهيكلية التي وبالتالي طمس بيواكتيفيتي BMP´s. علاوة على ذلك، إدخال طفرة في تسلسل BMP2 يمكن أن تؤثر على فعالية ريفولدينج، ويمكن أيضا تغيير معلمات البروتين الأخرى مثل نقطة isoelectric من البروتين المعدل. وبالتالي، قد تحتاج كل خطوة واحدة في بروتوكول إنتاج بروتين المقررة تكييفها وفقا لخصائص variant´s البروتين غيرت. إنتاج BMP2-K3Plk الواقع تطلبت تعديلاً للطريقة المتبعة للتعبير عن نوع البرية BMP2. مرات ثقافة مختلفة أو تركيزات بروبارجيل-L-يسين (Plk) تم اختبارها (البيانات لا تظهر) بغية الوصول إلى أعلى محصول التعبير. ريفولدينج، خطوات فصل وتنقية لحسن الحظ لا تتطلب المزيد من أدابتيونس. لقد سبق أن أبلغ أن في حالة المتغيرات BMP2 الأخرى المنتجة في معمل لدينا، بعض خصائص البروتين تم تغيير إلى حد كبير، التي تتطلب تعديل عدة خطوات ل أسلوب الإنتاج BMP18. BMP2-K3Plk المنتجة أظهرت النشاط البيولوجي يمكن مقارنته بالبروتين نوع البرية. يحدث فرقا في تركيزات عالية في BMP2، ربما نتيجة ذوبان أقل الخيار BMP2-K3Plk في المتوسط مقارنة بنوع البرية BMP2.

على الرغم من المزايا المعروفة لحفز النحاس أزيد-ألكاين سيكلواديشن (كواك)19، ينبغي أن تكون ردود فعل كواك تكييفها بعناية لتطبيقات معينة. واظهرنا كيف يمكن تجزئة BMP2 أو إنشاء المجاميع أو مولتيميرس نظراً للظروف رد فعل قوي الحد. وهكذا، كان كل رد فعل المعلمات يتم تحليلها بالتفصيل بغية إيجاد الظروف التي تترك البروتين لم تتأثر.

يمكن أن يتحقق النهج الذي نتبعه تساهمي زوجين في متغير BMP2 بالخرز [اغروس] فونكتيوناليزيد أزيد بالكيمياء انقر بكفاءة عالية أدى الخرز فونكتيوناليزيد تسبب تمايز osteogenic في المختبر. عندما استخدمت نوع البرية BMP2 البروتين في رد فعل مع الخرز بدلاً من ذلك، يمكن أن نلاحظ ضعف فقط تلطيخ الب التعبير، مما يشير إلى أن اقتران حدث في الواقع شديدة على وجه التحديد عن طريق بقايا بروبارجيل-L-ليزين BMP2-K3Plk.

ويعكس هذا التحديد اقتران الموضعية تحسنا كبيرا مقارنة بإجراءات التثبيت التي تشمل الكلاسيكية دائرة الصحة الوطنية/تنمية الصادرات الكيمياء. في مثل هذه الحالات، يحدث اقتران عشوائية، شملت أساسا الجماعات أمين الأولية الموجودة في المخلفات يسين. وقد البروتين يزوج على نشاط أوستيوجينيك متغير، ونظرا لتعدد الاتصالات الممكنة السقالة، مما يؤدي إلى توجهات مختلفة من البروتين نحو مستقبلات الخلية.

استخدام الموقع المباشر BMP2 المعطل تداولها قد التغلب على العوائق المذكورة تتصل بجرعات عالية من BMP2 القابلة للذوبان، التي هي بحاجة للحث على تكوين العظام. وبالإضافة إلى ذلك، تشير النتائج بوضوح أن بعض الاستجابات الخلوية، مثل التفريق بين الخلايا C2C12، أوستيوجينيك هي بدأتها تماما BMP2 المعطل تداولها، على الرغم من الدراسات التي أجريت مؤخرا مدعيا أن الإشارة توصيل يتطلب الالتقام من [ليغند]/[ليغند]-مستقبلات معقدة20،21. النتائج التي توصلنا إليها الاتفاق مع دراسات أخرى تبين أن BMP2، الذي إلى جانب تساهمي (ولكن ليس موجها على موقع) على الأسطح غير اندوسيتوسابل، لا يزال قادراً على حمل osteoblast التمايز22.

وبالنظر إلى أننا استخدمنا تركيزات أعلاه الفسيولوجية BMP2 لرد فعل اقتران، مبلغ BMP2 المعطل تداولها قد مزيد من خفض بينما لا يزال الحفاظ على خصائص الخرز أوستيوجينيك. قبل هذه الخطوات الأمثل، ومع ذلك، يحتاج سقالة BMP2-K3Plk-فونكتيوناليزيد لاختبارها في التجارب على الحيوانات لإثبات المحتملة لها osteogenic فيفو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور م. روبيني (كونستانز، ألمانيا) لتوفير بلازميد ترميز بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال وتوفير برسفدويت-بيرترناسينث ترميز سينثاتيز aminoacyl-الحمض الريبي النووي النقال المطابق.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1-Step NBT/BCIP Thermo Fisher 34042 Add solution to cells
3-Azido-7-hydroxycoumarin BaseClick BCFA-047-1 Chemical used for click reaction
Agarose low melting point Biozym 840101 Agarose for ALP assay 
Azide agarose beads Jena Bioscience CLK-1038-2 Beads used for reaction
BamHI (Fast Digest enzyme) Thermo Fisher Scientific FD0054 Restriction enzyme
BMP receptor IA (BMPR-IAEC) -- -- Produced in our lab
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye Thermo Fisher Scientific 20279 Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE
Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) Alfa Aesar A13986 Chemical used for click reaction
DNA Polymerase and reaction buffer  Kapabiosystems KK2102 KAPA HiFi PCR Kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX Gibco 61965-026 Cell culture media
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich GmbH E5134-1kg Chemical used to stop click reaction
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Carl Roth GmbH 2316.5 Bacteria induction (1mM final concentration) 
NdeI (Fast Digest enzyme) Thermo Fisher Scientific ER0581 Restriction enzyme
NHS-activated Texas Red Life technologies T6134 Coupled to receptor
P- Nitrophenyl Phosphate Sigma Aldrich GmbH N4645-1G Alkaline Phosphatase
p25N-hmBMP2  -- -- Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel
pET11a-pyrtRNA -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
propargyl-L-lysine (Plk) -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
pSRFduet-pyrtRNAsynth -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Gel Purification
Qiagen PCR purification Kit Qiagen 28104 PCR Purification 
Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich GmbH A7631-100G Chemical used for click reaction
T4 DNA Ligase ThermoScientific EL0011 Ligation 
tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) BaseClick BCMI-006-100 Chemical used for click reaction
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol Sigma Aldrich GmbH X100-1L Triton X 100 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amicon concentrating cell 400 ml  Merck KGaA UFSC40001 Concentrating unit
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck KGaA UFC901024 Concentrating centrifugal unit
ÄKTA avant FPLC ÄKTA -- FPLC machine
Avanti J-26XP Beckman Coulter  393124 Centrifuge for bacterial culture
Bacterial Shaking Incubator Infors HT Shaking incubator for bacterial culture
FluorChem Q system proteinsimple -- Imaging and analysis system for SDS-PAGE
Fluorescent miscroscope Keyence BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M) Merck KGaA 116882 Ion Exchange Chromatography column material
Greiner CELLSTAR® 96 well plates Sigma M5811-40EA 96 well plates for cell culture (ALP Assay)
Heraeus Multifuge X1R ThermoScientific -- Centrifuge
M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor ThermoScientific 75003624 Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining
Microcentrifuge - 5417R Eppendorf -- Centrifuge
OriginPro 9.1 G  OriginLab -- software for stastic analysis of ALP assay data
Polysine Slides ThermoScientific 10143265 microscope slides
Rotor JA-10 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JLA 8.1 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JA 25.50 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Tecan infinite M200 multiplate reader Tecan Deutschland GmbH -- Multiplate reader for ALP assay
Thermocycler - Labcycler Gradient SensoQuest GmbH -- PCR
TxRed - microscope filter Keyence Filter for fluorescent microscope 
Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa Merck KGaA PLBC04310 used with amicon concentrating cell 400ml
Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa Merck KGaA PLGC04310 used with amicon concentrating cell 400ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
  2. Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40, (5), 459-481 (2014).
  3. Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58, (2), 197-208 (2004).
  4. Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31, (12), 1817-1824 (2009).
  5. Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31, (3), 303-318 (1998).
  6. Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50, (2), 227-238 (2000).
  7. Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65, (6), 668-672 (1999).
  8. Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210, (3), 670-677 (1995).
  9. Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50, (3), 405-409 (2000).
  10. Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382, (8), 1189-1195 (2001).
  11. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
  12. Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  13. Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468, (2-3), 215-219 (2000).
  14. Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18, (3), 695-708 (2017).
  15. Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
  16. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
  17. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
  18. Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19, (13), 3314-3324 (2000).
  19. Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39, (4), 1302-1315 (2010).
  20. Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126, (Pt 1), 117-127 (2013).
  21. Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
  22. Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8, (2), 772-780 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics