سير عمل شامل للتعرف على نطاق الجينوم والتحليل التلوي التعبير الأسرة الجينات ATL E3 Ubiquitin ليجاسى في الكرمة

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

توضح هذه المقالة الإجراء لتحديد وتوصيف لأسرة جين في الكرمة ينطبق على الأسرة من نبات Tóxicos في ليفدورا (ATL) E3 أوبيكويتين ليجاسيس.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ariani, P., Vandelle, E., Wong, D., Giorgetti, A., Porceddu, A., Camiolo, S., Polverari, A. Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine. J. Vis. Exp. (130), e56626, doi:10.3791/56626 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التصنيف والتسميات للجينات في أسرة يمكن أن تسهم إلى حد كبير لوصف تنوع البروتينات المشفرة والتنبؤ بوظائف الأسرة استناداً إلى العديد من الميزات، مثل وجود زخارف تسلسل أو خاصة مواقع لتعديل بوستترانسلاشونال والشخصية التعبير لأفراد الأسرة في ظروف مختلفة. ويصف هذا العمل بروتوكول مفصل لتوصيف الأسرة الجينات. هنا، يتم تطبيق الإجراء إلى توصيف الأسرة ليجاسى ubiquitin E3 نبات Tóxicos في ليفادورا (ATL) في العنب. وتشمل الأساليب التعرف على نطاق الجينوم لأفراد الأسرة، وصف الترجمة الجينات، والهيكل، والازدواجية، تحليل البروتين المصانة زخارف، والتنبؤ بمواقع التعريب والفسفره البروتين، وكذلك التنميط الجيني التعبير عبر الأسرة في مجموعات مختلفة من البيانات. يمكن تطبيق مثل هذا الإجراء، الذي يمكن أن يمتد إلى تحليلات أخرى تبعاً للأغراض التجريبية، لأية أسرة جين في أي نوع من النباتات التي تتوفر عنها بيانات الجينوم، ويوفر معلومات قيمة لتحديد المرشحين للاهتمام للدراسات الفنية، إعطاء رؤى الآليات الجزيئية للنبات التكيف مع بيئتهم.

Introduction

وخلال العقد الماضي، نفذت الكثير من البحوث في علم الجينوم الكرمة. هو الكرمة محصولاً اقتصاديا ذات صلة المعترف بها، التي أصبحت نموذجا للبحوث في التنمية الفاكهة والردود الواردة من النباتات الخشبية الإجهادات الحيوية واللاحيويه. في هذا السياق، أدى الإفراج عن الجينوم عام PN40024 كرمه العنب الأوروبي في 20071 ونسخته المحدثة في 20112 تراكم سريع للبيانات "اوميكس" النطاق واندفاع للدراسات الفائق. استناداً إلى البيانات المنشورة التسلسل، إجراء تحليل شامل لأسرة جين معين (تتألف عموما من البروتينات تقاسم زخارف المصانة والتشابه الهيكلي و/أو الفنية والعلاقات التطورية)، يمكن الآن إجراء للكشف عن ما وظائف الجزيئي وتطور التشكيلات الجانبية للتعبير الجيني. هذه التحليلات يمكن أن تسهم في فهم كيفية التحكم الجيني الأسر العمليات الفسيولوجية على مستوى المنظومة الجينوم.

وينظم العديد من جوانب دورة حياة النبات ubiquitin بوساطة تحلل البروتينات الرئيسية، التي تتطلب دوران ضبطها بدقة لضمان العمليات الخلوية العادية. هام من مكونات عملية تدهور ubiquitin بوساطة E3 ubiquitin ligases، التي هي المسؤولة عن مرونة النظام، بفضل تعيين أهداف محددة3. وبناء على ذلك، تمثل هذه الإنزيمات عائلة جينات ضخمة، مع حوالي 1,400 E3 ليجاسى-ترميز الجينات وتوقع في التمويل نبات الجينوم4، كل ليجاسى ubiquitin E3 أوبيكويتيناتيون البروتينات المستهدفة المحددة. وعلى الرغم من أهمية الركيزة الخاصة أوبيكويتيناتيون في التنظيم الخلوي في النباتات، يعرف الكثير عن كيف ينظم في مسار أوبيكويتيناتيون وتم تحديد البروتينات المستهدفة إلا في حالات قليلة. فك رموز هذه الآليات الخصوصية والتنظيم يعتمد أولاً على تحديد وتوصيف للمكونات المختلفة للنظام، وبخاصة E3 ligases. بين ليجاسيس أوبيكويتين، تتميز بأعضاء 91 حددت في التمويل (أ) عرض H2 خاتم إصبع مجال5،6، بعض من لهم دور في الدفاع وهرمون الردود7الفصيلية ATL.

الخطوة الحاسمة الأولى لتعريف أعضاء عائلة الجينات الجديدة هو التعريف الدقيق لميزات الأسرة، مثل زخارف توافق الآراء والمجالات الرئيسية وخصائص تسلسل البروتين. في الواقع، يتطلب استرداد موثوق بها الجين جميع أفراد الأسرة على أساس تحليل انفجار بعض خصائص تسلسل إلزامية، في مجالات خاصة البروتين المسؤول عن البروتين الدالة/النشاط، بمثابة التوقيع البروتين. هذا يمكن سهلت بتوصيف السابقة من نفس عائلة الجينات في الأنواع النباتية الأخرى أو يتحقق من خلال تحليل جينات مختلفة مزعومة الذين ينتمون إلى نفس الأسرة في الأنواع النباتية المختلفة، عزل تسلسلات مشتركة. أفراد الأسرة يمكن ثم فردياً تسمية اتباع القواعد المشتركة استقر اتحادات دولية لأنواع النباتية معين. في الكرمة، على سبيل المثال، مثل هذا الإجراء يخضع لتوصيات "اللجنة التسميات" فائقة "العنب الجينات الشرح" (سنكجا)، إنشاء بناء شجرة النشوء والتطور بما في ذلك ضد العنب الأوروبي و ألف-التمويل جين أفراد الأسرة السماح بالشرح الجينات استناداً إلى تسلسل النوكليوتيدات8.

تعريب كروموسوم من أفراد الأسرة، واستقصاء الازدواجية الجينات السماح لتسليط الضوء على وجود كل الجينوم أو متعاضدا الجينات المكررة. تظهر هذه المعلومات مفيدة لكشف وظائف الجينات المفترضة، نظراً لأنه قد تبين التكرار الوظيفي أو تكشف عن حالات مختلفة، أي، غير الروغان، الروغان الأجسام القريبة من الأرض، أو الروغان الفرعية9. كلا الجدد-وشبه-فونكتيوناليزيشن هي الأحداث الهامة التي تخلق الجدة الوراثية، توفير المكونات الخلوية الجديدة لمصنع التكيف مع تغير البيئات10. على وجه الخصوص، كانت ازدواجية جينات الأجداد وإنتاج جينات جديدة متكررة جداً أثناء تطور الجينوم الكرمة وشكلت حديثا الجينات التي تنشأ من الازدواجية الدانية ومتعاضدا في الكرمة كانوا أكثر عرضه لإنتاج جديد وظائف11.

هو عامل رئيسي آخر في فك رموز الجينات وظيفة الأسرة الشخصية ترانسكريبتوميك. يمكن استغلال توافر قواعد البيانات العامة مما يتيح الوصول إلى كمية هائلة من البيانات ترانسكريبتوميك وبالتالي لتعيين المهام المفترضة لأفراد الأسرة الجينات تستخدم على نطاق واسع في السيليكون تعبير تحاليل. في الواقع، يمكن إعطاء بعض التلميحات بشأن الأدوار المفترضة من البروتينات المقابلة في ظروف محددة تنفرد بها التعبير عن بعض الجينات في أجهزة مصنع معين أو استجابة لبعض الضغوط، وتقديم الدعم إلى فرضيات ممكنة الفرعية الروغان جينات المكررة على الاستجابة لتحديات مختلفة. ولهذا الغرض، من المهم النظر في عدة مجموعات البيانات: هذه يمكن أن تكون الجينات المتاحة بالفعل مصفوفات التعبير، مثل أطلس ترانسكريبتوميك الجينوم على نطاق المنظومة لأجهزة الكرمة و12من مراحل النمو، أو يمكن أن يبني المخصص قبل استرداد مجموعات البيانات ترانسكريبتوميك للأنواع النباتية خاصة تعرض لتشدد على المعرفة. وعلاوة على ذلك، نهج بسيط باستخدام المصفوفات اثنين، واحد مع بيانات عشوائية من التشابه والآخر مع معاملات التعبير المشارك العشوائية يمكن تطبيقها لتقييم العلاقات بين أنماط التشابه وتعبير تسلسل داخل أسرة جين.

ويهدف هذا العمل تقديم نهج عالمي، تعريف بنية الجينات وزخارف البروتين المصانة وموقع كروموسومية، الازدواجية الجينات وأنماط التعبير، بوصفها أيضا التنبؤ بمواقع التعريب والفسفره البروتين، لتحقيق توصيف حصرية لعائلة الجينات في النباتات. يتم تطبيق هذا نهج شامل هنا لتوصيف الأسرة ليجاسى ubiquitin ATL E3 في الكرمة. وفقا للدور الناشئ لأعضاء فصيلة ATL في تنظيم العمليات الخلوية الأساسية7، هذا العمل يمكن أن تساعد أيضا تحديد مرشحين أقوياء للدراسات الفنية، وفي نهاية المطاف كشف الآليات الجزيئية التي تنظم وتكييف هذا المحصول الهام لبيئتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-تحديد ATL المفترضة أسرة جين عضو (أعضاء)

  1. إصدار ويب هذه المبادرة بين انفجار
    1. فتح صفحة ويب في الانفجار13 وفوق المقطع الانفجار البروتين.
    2. في الحقل "تسلسل أدخل الاستعلام"، قم بإدخال تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين (VIT_05s0077g01970 هنا) التي سيتم استخدامها كالتحقيق للتعرف على أفراد الأسرة الآخرين.
      ملاحظة: يجب أن يكون بروتين ممثل حسن استخدامها (بروتين عرض كافة الميزات الهامة التي تميز الأسرة).
    3. في حقل "اختيار مجموعة البحث"، حدد قاعدة البيانات "مرجع البروتين" (refseq_protein) والكائنات الحية للفائدة (ف العنب الأوروبي -taxid:29760).
    4. في حقل "اختيار البرنامج،" حدد خوارزمية انفجار هذه المبادرة وانقر فوق الزر الانفجار لتشغيل التحليل.
      ملاحظة: بالنقر على "معلمات خوارزمية" من الممكن لضبط بعض المعلمات المتقدمة (ماكس الهدف تسلسل، مصفوفة سجل، عتبة الانفجار هذه المبادرة، إلخ).
    5. انفجار أول جولة باسترداد كافة تسلسل عرض المباريات ذات الصلة مع الاستعلام (e-قيمة أعلى من العتبة المحددة-بشكل افتراضي 0.005؛ 0.001 في هذه التجربة). إلغاء تحديد كافة الإدخالات، وضوح لا تنتمي إلى الأسرة تحت الفحص عن طريق النقر على القراد في العمود "حدد لانفجار هذه المبادرة" وتشغيل التكرار هذه المبادرة-الانفجار الثاني بواسطة النقر فوق الزر الانفجار كما في الخطوة 1.1.4.
    6. يتم تمييز تسلسلات حديثا المحددة باللون الأصفر. إلغاء تحديد يضرب استرداد الخطأ الواضح، والكشف عن مزيد من التكرار كما هو موضح في الخطوة 1.1.5.
    7. تواصل مع التكرار حتى الخوارزمية لا يجد أي دخول ذات الصلة أو تصل إلى التقارب (تم العثور على لا إدخالات جديدة). تنزيل قائمة بأفراد الأسرة الجينات المفترضة لمزيد من التحليلات. افحص بصريا يضرب المستردة في كل تكرار لتجنب وجود إيجابيات كاذبة.
  2. الإصدار المستقل من هذه المبادرة بين انفجار
    1. تنزيل الإصدار المستقل من الانفجار بواسطة النقر فوق الزر "تحميل الانفجار" على الصفحة الرئيسية لانفجار13.
      ملاحظة: البرنامج الانفجار مستقل إصدار سطر أوامر من واجهة ويب المذكورة قبل. ويمكن تنفيذ البحث هذه المبادرة-الانفجار ضد قاعدة بيانات محلية أو بعيدة مخصصة. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح البحث مع المعرفة مسبقاً موقف معين نقاط مصفوفة (بسم).

2-دليل التفتيش أفراد الأسرة التعرف على الانفجار PSI

  1. محاذاة متعددة
    1. تجميع تسلسل الحمضية الأمينية التي سبق تحديدها في ملف بتنسيق فاستا وتحميله في البرامج الضخمة14 المضي قدما في محاذاة متعددة.
    2. فتح البرامج الضخمة، انقر فوق الزر "محاذاة"، انقر فوق "محاذاة تحرير/إنشاء"، انقر فوق "إنشاء محاذاة جديدة"، انقر فوق "البروتين".
    3. انقر فوق "تحرير" من القائمة المحاذاة وإدراج تسلسل من "ملف". الاستعراض بحثاً عن ملف فاستا الذي تم إنشاؤه من قبل، والتأكد من تحميل كافة التسلسلات التي شملتها الدراسة الاستقصائية.
    4. انقر فوق "محاذاة" من القائمة المحاذاة و "بمحاذاة العضلات". استخدام المعلمات الافتراضية، انقر فوق زر "حساب"، والانتظار لانتهاء محاذاة متعددة.
    5. افحص بصريا المحاذاة متعددة إلى استبعاد أفراد الأسرة المتوقعة بشكل غير صحيح. الكنسي ككسكسك (13 س) بكسككسهكسهكسككسسو (7 س) ككسكسكو عزر، (وبخاصة وجود بقايا برولين قبل سيستين الثالثة)، هو الميزة الرئيسية المطلوبة لتعريف أفراد الأسرة ATL.
  2. تحليل لشعار معين
    1. يقدم قائمة نهائية لأفراد الأسرة (96 الكرمة تسلسل يفي بالمتطلبات التي سينظر فيها ATL) إلى "م متعددة" للاستثارة عزر (ميمي)15 تعريف زخارف حفظت عبر الأسرة.
    2. من الصفحة الرئيسية لميمي، انقر فوق الزر "ميمي"، وإكمال "تقديم نموذج البيانات" مع معلومات خاصة فيما يتعلق بالأسرة للفائدة.
    3. استخدام تحليل ميمي لتأكيد وجود زخارف المتوقعة اثنين ضمن أفراد الأسرة ATL الكرمة أيوخاتم-H2 وزخارف شعبة الشؤون القانونية العامة.
  3. وبدلاً من ذلك، قم بإجراء الخطوات 2.1 و 2.2 في وقت واحد باستخدام برمجيات المعلوماتية الحيوية (انظر الجدول للمواد).
    1. تحميل ملف فاستا (راجع الخطوة 2.1.1) في الجناح. حدد "ملف" من القائمة، ثم "استيراد" ثم انقر فوق "من ملف". استعراض ملف فاستا وانقر فوق "فتح".
    2. حدد كافة تسلسلات المستوردة في القائمة وانقر فوق الزر "محاذاة/تجميع" في شريط الأدوات، ثم انقر فوق "بيرويس متعددة محاذاة". حدد "محاذاة العضلات" وانقر فوق "موافق" لبدء المحاذاة باستخدام المعلمات الافتراضية.
    3. لتصور شعار المحاذاة، انقر فوق "الرسوم البيانية" ← "خيارات" وحدد "تسلسل شعار".

3-تحليل البروتين البارامترات الفيزيائية ومجالات

  1. كما أن تعريف المعلمات المادية المختلفة لأفراد الأسرة الذين استطلعت آراؤهم من المهم أن يكون وصفاً شاملا للأسرة، وتقديم قائمة بأفراد الأسرة إلى أدوات ويب محددة.
    1. Isoelectric نقطة (pI) والوزن الجزيئي (كاتشين)، استخدم أداة بروتبارام16 على موقع اكسباسي مع المعلمات الافتراضية.
    2. للتعريب سوبسيلولار البروتين، استخدام أدوات مختلفة للحصول على تنبؤ أكثر موثوقية مثل نجلوك v1.017 مع الإعدادات الافتراضية، تارجيتب v1.118 مع الإعدادات الافتراضية، والبروتين والمتصيد التعريب سوبسيلولار v1.219 مع وقف احتمال 0.5. لمواقع الفسفرة، استخدم أداة ويب v1.0 موست20 مع المعلمات الافتراضية.
  2. التحقيق في المجالات البروتين الإضافي في أفراد الأسرة.
    1. فتح صفحة ويب قاعدة البيانات فام21، حدد أداة "تسلسل البحث"، وتقديم تسلسل البروتين في مربع الاستعلام، وانقر فوق "الانتقال" إلى تشغيل التحليل.
      ملاحظة: يتم تحليل تسلسل البروتين كل على حدة. ه قيمة 1.0 في الإعداد الافتراضي يتيح التمييز بين عدد الزيارات الهامة وغير الهامة.
    2. فتح "ملقم تمهمم"22 من مركز "تحليل تسلسل البيولوجية" للتحقيق في وجود مناطق transmembrane المفترضة.
لصق كافة بروتين تسلسل في نفس الوقت في مربع الاستعلام (أو بدلاً من تحميل ملف نصي بما في ذلك جميع البروتين تسلسل في تنسيق FASTA) وانقر فوق "إرسال" لتشغيل التحليل.
  • تحليل البروتينات التي تفتقر إلى توقع مجالات transmembrane، وفقا تمهمم (الخطوة 3.2.2)، باستخدام أداة بروتسكالي لتحديد مناطق مسعور المفترضة. فتح صفحة ويب بروتسكالي23. لصق كل تسلسل البروتين في مربع الاستعلام وحدد "هفوب. /Kyte & دوليتل "كمقياس من الأحماض الأمينية. انقر فوق "إرسال" لتشغيل التحليل.
  • 4-الصبغية التوزيع، والازدواجية وتنظيم إكسون-إنترون

    1. قم بتعيين أفراد الأسرة ATL على الكروموسومات استناداً إلى المعلومات التي تم استردادها من موقع مركز التكنولوجيا الحيوية كريبي الجينوم الكرمة24.
      1. تصفح الصفحة الرئيسية لموقع على شبكة الإنترنت فينوجرام25. كتابة "ملف الإدخال" كملف نصي محدد بعلامات جدولة مع السمات المحددة للجينات ليتم تعيينها على الكروموسومات، وفقا لمبادئ توجيهية شاملة والأمثلة المتعلقة بتجميع الملف المتوفر بعد المسار "فينوجرام" → " الوثائق "←" خيارات "←" ملف الإدخال ".
      2. كتابة "العنوان" للعمل. حدد الجينوم التي يمكن استخلاصها. للجينوم لم تنفذ في البرنامج، مثل الجينوم الكرمة، حدد "أخرى" في القائمة المنسدلة. كتابة ملف الجينوم وفقا للمبادئ التوجيهية والأمثلة المقدمة، بعد المسار "فينوجرام" ← "الوثائق" ← "الخيارات" ← "الجينوم"، وقم بتحميلها.
      3. استخدام المعلمات الافتراضية من "تباعد النمط الظاهري" أو "لون النمط الظاهري" أو "تنسيق صورة" أو تحديد البدائل في القوائم الخاصة بكل منها، وانقر فوق "مؤامرة" للحصول على تصور الجينات على الكروموسومات.
    2. تعريف الدولة ازدواجية أفراد الأسرة استخدام البرمجيات مكسكانكس26.
      1. تحميل وفك ضغط نسخة مكسكانكس على جهاز محلي تشغيل أسطر الأوامر 1 (1 ملف تكميلي). أدخل المجلد مكسكانكس وإنشاء الملفات التنفيذية المطلوبة تشغيل أسطر الأوامر 2 (1 ملف تكميلي).
        ملاحظة: تثبيت مكسكانكس المعروف أن تفشل في بعض الأجهزة لينكس 64 بت بسبب قضية بشأن chdir الدالة. إذا تم إرجاع رسالة خطأ ذات الصلة إلى هذه الدالة على جعل تنفيذ الأمر، يجب أن يتم تشغيل أسطر الأوامر 3 (تكميلية ملف 1) وينبغي محاولة الأمر "جعل" بعد ذلك.
      2. تحميل البروتينات ف العنب الأوروبي وملف التعليق التوضيحي تشغيل أسطر الأوامر 4 (1 ملف تكميلي).
        ملاحظة: يحتاج ملف التعليق التوضيحي الكرمة لتكون محلول والقطة معلومات الكروموسومات واحد في ملف فريد عن طريق تشغيل أسطر الأوامر 5 (1 ملف تكميلي).
      3. تشغيل "الجميع مقابل الجميع" بلاستب البحث باستخدام الملف البروتين ف العنب الأوروبي الاستعلام وهذا الموضوع.
      4. إنشاء قاعدة بيانات انفجار لبحث استخدام ف العنب الأوروبي البروتين الملف تشغيل أسطر الأوامر 6 (1 ملف تكميلي). إجراء البحث بلاستب باستخدام ملف البروتينات ف العنب الأوروبي كاستعلام على قاعدة بيانات تم إنشاؤها مسبقاً عن طريق تشغيل أسطر الأوامر 7 (تكميلية ملف 1).
      5. تحويل ملف التعليق التوضيحي في شكل مناسب مكسكانكس. تشغيل أسطر الأوامر 8 (1 ملف تكميلي) لتحميل parseMSCanXgff.pl البرنامج النصي perl مخصصة. إجراء تحليل تشغيل أسطر الأوامر 9 (1 ملف تكميلي).
        ملاحظة: يتم إنشاء من ملف vitis.gff يحتوي على إحداثيات الجينات في التنسيق التالي:
        س # الجينات ابتداء من موقف إنهاء الموقف
        حيث "س" رمز حرف اثنين للأنواع (ت ت للعنب) بينما "#" هو اسم السقالة. علما بأن برل المخصصة المقدمة مناسبة لتحويل معظم، على الرغم من أن بعض التعليمات البرمجية التعديل قد يكون مطلوباً في بعض الحالات المحددة نظراً لتنوع المعلومات المقدمة في ملف التعليق التوضيحي المتاحة.
      6. شن مكسكانكس تشغيل أسطر الأوامر 10 (تكميلية ملف 1).
        ملاحظة: "كرمه" هي البادئة الشرح وملف الإخراج الانفجار. وهذا يمثل شرطا إلزامياً بتشغيل البرنامج.
      7. تحليل نتائج مكسكانكس. وتنتج مكسكانكس من ملف نصي "vitis.collinearity"، الذي يحتوي على كتل تربطها علاقة خطية متداخلة. يمكن فتش هذا ملف بواسطة أي محرر نصوص (انظر المثال الإخراج 1 1 ملف تكميلي).
        ملاحظة: يتم إنشاء دليل "mcscaxOutput.html" الذي يحتوي على ملفات html يضم التحالفات عدة كتل متداخلة ضد كل كروموسوم مرجع. يمكن أن تفقد هذه الملفات من خلال مستعرض ويب.
      8. تصنيف الجينات بارالوجوس استناداً إلى مواقعها النسبية في الكروموسومات تشغيل أسطر الأوامر 11 (تكميلية ملف 1).
        ملاحظة: يرد تصنيف الجينات بارالوجوس التكميلية الجدولالثاني. ملف الإخراج الذي تم إنشاؤه "vitis.gene_type" يحتوي على جميع المعلومات المنشأ بشكل بسيط بعلامة جدولة.
      9. إجراء تحليل لتخصيب اليورانيوم تقييم ما إذا كانت قد نشأت أسرة جين سائد إليه محددة لتشغيل أسطر الأوامر 12 (تكميلية ملف 1).
        ملاحظة: يتم إنشاء ملف "vitis.gene_type" في حين يمثل الملف "gene_family_file" ملف نص سطر واحد فيه اسم العائلة (مثلاً، ATL_genes) هو متبوعة بأسماء موقعا للجينات جميع الذين ينتمون إلى الأسرة في خطوة 4.2.8، مفصولة بعلامة تبويب. اختبار الإحصائية التطبيقية لتخصيب اليورانيوم هو اختبار فيشر دقيق و فيتم تخزين قيم أصول مختلفة في ملف "outputFile.txt".
    3. تصور المنظمة إكسون-إنترون الجينات باستخدام "شجرة الحياة التفاعلية" (إيتل)27، أداة على الإنترنت للعرض والشرح، وإدارة أشجار النشوء والتطور.
      1. تحميل شجرة النشوء والتطور في المقطع "تحميل" من الموقع الإلكتروني إيتل. يتم بناء الشجرة طبقاً للقسم 5 أدناه. لكل فرد من أفراد الأسرة الجينات، استرداد التنبؤ ببنية المورثات من الشرح V1 الجينوم الكرمة (كريبي الموقع الشبكي المذكور أعلاه). حساب الطول (في شركة بريتيش بتروليوم) exons المفترضة، وإينترونس، ومناطق غير مترجمة (تحيلها).
      2. استخدام dataset "نطاقات البروتين" عن التصور رسومية لنمط إكسون-إنترون.
    كتابة ملف نص عادي، بما في ذلك أطوال المحسوب وفقا للمواصفات المقدمة عقب ← "أنواع البيانات" ← المسار "مساعدة" ← "صفحات المساعدة" "نطاقات البروتين" في موقع إيتول27. استخدام dataset "نطاقات البروتين"، "المستطيل (RE)" والأشكال "فجوة المستطيل (GP)" تمثل في إكسون وتحيلها، على التوالي.

    5-تحليل النشوء والتطور والمصطلحات

    1. تحليل العلاقات بين أفراد الأسرة ATL من خلال بناء شجرة عالية الجودة النشوء والتطور، وتعريف إلى مصطلحات الأسرة.
      1. لأسرة جين الكرمة، اتبع القواعد التي وضعتها "اللجنة التسميات سوبر الكرمة"8.
      2. استرداد تسلسل ATL التمويل ألف ، المطلوب كمرجع للعنب الجينات التسميات8، من قاعدة البيانات أونيبروت28 .
      3. كتابة ملف فاستا بما في ذلك كافة تسلسل النوكليوتيدات من الكرمة و التمويل ألف مورثة أفراد الأسرة التي ستدرج في تحليل النشوء والتطور. تسلسل النوكليوتيدات التي تسمح بأقصى قدر التباين بين أفراد الأسرة (بالمقارنة مع تسلسل البروتين).
    2. شجرة النشوء والتطور
      ملاحظة: استخدام خط الأنابيب 29 Phylogeny.fr الموصى به للحصول على شجرة عالية جودة النشوء والتطور، ولكنه ليس إلزامياً.
      1. تصفح الصفحة الرئيسية Phylogeny.fr29، وحدد خط الأنابيب "نسأله التحليل".
        ملاحظة: "نقرة واحدة" هو مناسب في معظم الحالات، ولكن إذا لزم الأمر من الممكن لتحديد إعدادات متقدمة معينة ("خيارات متقدمة") أو حتى بتحليل مخصص بالكامل ("حسب الطلب"؛ انظر الخطوة 5.2.5).
      2. كتابة "اسم للتحليل،" تحميل الملف فاستا تم إنشاؤها مسبقاً (الخطوة 5.2.1، وانقر فوق "إرسال" لتشغيل التحليل.
      3. وبدلاً من ذلك، إذا كان الإجراء الموصوف أعلاه (الخطوات 5.2.1، 5.2.2) النتائج في رسالة إعلام بخطأ، إكمال كل خطوة من خط الأنابيب جناح نسأله على حدة، على النحو التالي.
        1. من الصفحة الرئيسية للعضلات البرمجيات30، حدد تحميل الملف فاستا في "الخطوة 1"، "بيرسون/فاستا" "تنسيق الإخراج" في "الخطوة 2"، وانقر فوق "إرسال" في "الخطوة 3" لمحاذاة سلاسل الاستعلام.
        2. انقر فوق "تحميل ملف المحاذاة" وحفظها كملف فاستا لاتخاذ مزيد من الخطوات.
        3. عملية الملف FASTA المحاذاة للقضاء على سوء محاذاة مواقع باستخدام أداة خادم جبلوكس31. لتحميل ملف FASTA المحاذاة، حدد "الحمض النووي" ك "نوع من التسلسل" واختيار خيار (خيارات) التشدد الذي يناسب بشكل أفضل مع التحليل (مثلاً، للعنب ATL الجينات العائلية حدد جميع الخيارات الثلاثة المقترحة ل "أقل انتقاء صارمة" لأن تسلسل عالية التباين). انقر فوق "الحصول على كتل" لتشغيل التحليل.
        4. انقر فوق "محاذاة الناتجة" في الجزء السفلي من الصفحة الإخراج وحفظ النتائج كملف فاستا جديد.
        5. من الصفحة الرئيسية Phylogeny.fr29، حدد "بالانتقائية" أنابيب "نسأله التحليل". ثم، قم بإلغاء تحديد "محاذاة متعددة" و "محاذاة curation". انقر فوق "إنشاء سير العمل" وتحميل الملف فاستا رعاية جبلوكس (الخطوة 5.2.5.4)، حدد "إجراء Bootstrapping" مع المعلمات الافتراضية في "إعدادات" وانقر فوق "إرسال" لتشغيل التحليل.
      4. انهيار سيئة دعم الفروع (أي، القيم bootstrap < 70%) بواسطة النقر فوق "فروع طي" في القسم "تحديد والعمل" وتحميل النتائج النهائية في شكل نيوك لمزيد من التحليلات.
    3. قم بتعيين اسم جينات استناداً إلى نسأله.
      1. استعراض شجرة النشوء والتطور لتقييم مدى موثوقية بنية الشجرة بتحميله إلى جناح إيتل المذكورة أعلاه (الفرع 4-3).
      2. تعيين اسم جينات يدوياً لكل أفراد الأسرة. وفي حالة أورثولوجويس رأس برأس، تعيين نبات-مثل اسم (مثلاً، AtATL3 ← VviATL3). التفريق بين الجينات الكرمة (اثنين أو أكثر) المستمدة من هومولوج نبات واحد مع نفس المسافة النشوء والتطور باستخدام الأرقام، أو رسائل إذا كان الجين نبات ينتهي برقم (مثلاً، AtATL23 ← VviATL23a، VviATL23b).
      3. في حالة أورثولوجويس واحد-إلى-أطراف أو أطراف بأطراف، قم بتعيين اسم جينات جديدة تتألف من نبات-مثل اسم (هنا، "ATL") يقترن بعدد أكبر من عدد أعلى استخدام الفعل ف العنب الأوروبي ونبات (على سبيل المثال., VviATL83).
      4. إكمال تسمية الأسرة المعرفة حديثا تنازلياً من الأعلى إلى أسفل الشجرة النشوء والتطور.

    6-الكرمة الجهاز والمرحلة التنميط التعبير

    1. توليد العامل البيانات مصفوفة تحتوي على تعبير البيانات لأفراد الأسرة.
      1. تحميل ف العنب الأوروبي عام كورفينا الجينات التعبير أطلس داتاماتريكس من الارتباط الموزع على منصة ريسيرتشجاتي32. يحتوي هذا الملف على قيم التعبير RMA تطبيع لاستخدامها في الخطوات التالية.
      2. استخراج قيم التعبير الجيني الأسرة كل من داتاماتريكس أطلس وكتابة "داتاماتريكس عامل" الذي يحتوي على صف رأس نفسه داتاماتريكس أطلس. حفظ "داتاماتريكس العمل" كملف نصي محدد بعلامات جدولة.
    2. إجراء تحليل ثنائية عنقودية هرمية استخدام البرمجيات "متعددة التجربة عارض" (مليون إلكترون فولط).
      1. تحميل وتثبيت البرمجيات مليون إلكترون فولط33.
      2. تحميل "داتاماتريكس العامل" (الخطوة 6.1.2) عقب المسار "ملف" ← "تحميل البيانات" ← "استعراض" وحدد الملف النصي. حدد "صفيف أحادي اللون" وإزالة القراد من "تحميل الشرح" عندما لا يتوفر توضيحي تلقائي. حدد قيمة التعبير أقصى اليمين العلوي لمعاينة الجدول التعبير، وانقر فوق الزر "تحميل".
      3. ضبط البيانات تطبيق التحويل Log2 ("تعديل البيانات" ← "سجل تحولات" ← "تحويل Log2") والتطبيع الجيني/الصف ("تعديل البيانات" ← "تعديلات الجين/صف" ← "الوسيط مركز الجينات/صف"). تعيين حد حجم مناسب ("عرض" ← "تعيين لون مقياس الحدود").
      4. حساب "تجميع التسلسل الهرمي" التالية المسار "تحليل" ← "تجميع" ← "قائمة توافق الأجهزة".
    حدد "تحسين ترتيب أوراق الجينات" وتحسين "عينة النظام" في طلب التحسين "الميدان"، "الارتباط بيرسون" في حقل "اختيار مصفوفة المسافة" ومن "متوسط ربط التجميع" أوراق في حقل "اختيار أسلوب الربط". ثم انقر فوق "موافق" لتشغيل التحليل.
  • عرض النتائج في قائمة "قائمة توافق الأجهزة" ← "نتائج تحليل" في اللوحة اليسرى من الإطار. تصدير مخطط الحرارة عن طريق النقر فوق "حفظ الصورة" في القائمة "ملف".
  • 7-التعبير التنميط في الاستجابة للضغوط الحيوية وغير الحيوية

    1. كرر الخطوة 6، 1 مع معرف الانضمام إلى فريق الخبراء العلميين التي تم الحصول عليها من دراسات التحقيق الإجهاد الحيوية وغير الحيوية في العنب والمنشورات الخاصة بكل منها. على سبيل المثال، يمكن تصفحها تجارب توفير التشكيل الجانبي الترنسكربيتوم التوت العنب المصابة مع مسببات الأمراض الفطرية أسود Botrytis استخدام ميكرواري العنب نمبلجين الجامعة-الجينوم مع معرف فريق الخبراء العلميين من GSE52586. كرر الخطوتين 6.1.1 و 6.1.2.
    2. البحث في "أرشيف ما يلي تسلسل نكبي"34 مع "معرف" SRA/بيوبروجيكت (مثلاً، SRP055458 أو PRJNA275778 لتجارب "الكرمة زهرة التظليل") وتحميل المرتبطة بها جميع ما يلي تسلسل الخام. تتم معالجة مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من العديد من الدراسات المختلفة باستخدام خط أنابيب مفرد للاتساق.
      1. بإيجاز، تقليم تسلسل الخام فستق ما يلي (واحد-والزوج-نهاية) وتصفية نوعية مع تريموماتيك35. استخدام أفجكوال ومينلين تصفية 20 و 40، على التوالي، وجميع المعلمات الافتراضية.
      2. مؤشر 12 × الكرمة إشارة الجينوم1 باستخدام Bowtie236. تحميل 12 X الكرمة إشارة الجينوم (مثلاً، bowtie2--بناء) قبل تشغيل الأمر bowtie2 .
      3. الحصول على حساب مصفوفة الجداول مع العد هتسيق37 استخدام ملف التعليق التوضيحي (المهرجان/الفروق) الطراز الجيني V1 الكرمة.
    3. القيام بتحليل الجينات التفاضلية التعبير (re-) في ص38 مع مكتبات39 ليما لمصفوفات تطبيع الجيش الملكي المغربي ومكتبات40 DESeq2 لحساب مصفوفة الجداول التي تم الحصول عليها من الخطوات 7.1.1 و 7.2.1، على التوالي.
      1. تنفيذ مقارنة "المجموعتين" قياسي (أي، "العلاج"/"التحكم"). ضمان أن يتم تحديد في تصميم المصفوفة المجموعات من شروط "ضوابط" و "المعاملة" بشكل صحيح.
        ملاحظة: نموذجي تصميم ميكرواري التعبير التفاضلية تحليل (GSE52586) لمقارنة 33 ش التوت المصابين Botrytis أسود ضد التوت (صحية) التحكم في مرحلة التنمية نفسها مع ليما تشغيل أسطر الأوامر ويرد 13 في 1 ملف تكميلي. ويبين تصميم نموذجي لتحليل التعبير التفاضلية تسلسل الحمض النووي الريبي (SRP055458 أو PRJNA275778) لمقارنة زهرة (في 7 أيام بعد سقوط سقف) تحت العلاج الظل ضد عنصر التحكم مع DESeq2 تشغيل أسطر الأوامر 14 التكميلية ملف 1 .
      2. الحصول على قوائم الأثران عن الجينات (DEG) في كل التباين، ليماواستخدام الوظائف lmFit()، تليها eBayes()، وثم بمهام توبتابل()، بينما بالنسبة DESeq2، استخدم في DESeqDataSetFromMatrix()، DESeq()، ووظائف results() . أدناه، سير عمل نموذجية التي يمكن اتباعها.
        1. لتحليل ميكرواري التعبير التفاضلية، راجع أسطر الأوامر 15 (1 ملف تكميلي). لتحليل الحمض النووي الريبي seq التعبير التفاضلية انظر أسطر الأوامر 16 (1 ملف تكميلي). كرر الخطوات أعلاه لكل أخرى يتناقض مع مخطط التصميم المناسب مختلفة (انظر الأمثلة في الخطوة 7.3.1)
    4. من قائمة ديجس التي تم إنشاؤها، استخراج كافة الصفوف التي لا تتوافق مع انضمام ATL V1، والإبقاء على الأعمدة التي تحتوي على "التغيير أمثال" log2 (العلاج/التحكم) > | 0.5 | وتعدل فالقيم (FDR) < 0.05، ودمج لهم تبعاً لذلك إلى جدول مصفوفة، عما إذا كانت دراسة يندرج "اللاأحيائية" أو "التفاعل الحيوية/الممرض" خلاصات وافية.
    5. بناء heatmaps متفاوت المسافات الهرمية (خلاصات اللاأحيائية والأحيائية) في البحث والتطوير باستخدام مكتبات جبلوتس.
      ملاحظة: استدعاء الدالة heatmap.2 بنيات heatmap جنبا إلى جنب مع ديندروجرامس صف من جداول المصفوفة الخاصة بكل منها. تعمل وسائط إضافية باستخدام سيلنوتي يساعد على التمييز بين خلطات أعرب (log2FC > 0.5، فرانكلين روزفلت < 0.05) ATL الجينات في كل مقارنة عبر مجموعة كبيرة من الظروف التجريبية قبل * رمز. تطبيق سير العمل النموذجية في R تشغيل أسطر الأوامر 17 (1 ملف التكميلية)، أو بدلاً من ذلك، كرر الخطوات من 6.2.2 إلى 6.2.5 لبناء heatmaps تستخدم البرمجيات مليون إلكترون فولط.

    8-تحليل العلاقات بين اختلاف تسلسل بارالوجوس والتعبير الجيني المشارك

    1. بناء مصفوفة تحتوي على التشابه العشوائية. هي عناصر المصفوفة تشابه القيم لتسلسل تشابه محسوبة من أن التحالفات البروتين العشوائية.
      1. استخدام ملقم ويب إبرة مزخرف41 مع الإعدادات الافتراضية لجعل تسلسل عشوائية التحالفات وحفظ كملف نصي. فتح ملف نص الإخراج وإزالة كافة أسطر التعليقات، جنبا إلى جنب مع أسماء الأعمدة والصفوف إنشاء ملف يسمى "similarityTable.txt".
        ملاحظة: هذا جدول يتميز خط لكل الجينات ATL الإبلاغ عن التشابه بين القيم المحسوبة في كل من المحاذاة العشوائية. ترتيب المكاني في الصفوف والأعمدة هو نفسه حيث أنه يتم إنشاء مصفوفة المتناظر مع احترام القيم قطري.
    2. بناء المصفوفة مع البيانات التعبير المشترك عن طريق حساب معامل ارتباط Pearson. يتطلب الإجراء التالي في الوحدة النمطية بيرل PDL والتطوير.
      1. تحميل قيم التعبير للجينات ATL 96 تشغيل أسطر الأوامر 18 (1 ملف تكميلي) داخل محطة طرفية. إجراء تحليل للمشارك تعبير باستخدام برنامج نصي perl مخصصة التي يمكن تحميلها عن طريق تشغيل أسطر الأوامر 19 (تكميلية ملف 1). مثل هذا السيناريو سيتم حساب معامل ارتباط Pearson بين أزواج من المكاني ATL كما ذكر سابقا.
      2. إطلاق البرنامج النصي تشغيل أسطر الأوامر 20 (تكميلية ملف 1) واتبع الإرشادات التي تظهر في الإخراج.
    سوف ينتج البرنامج النصي ملف إخراج (إلا وهي "coexpressionTable.txt") يحتوي على مصفوفة تعبير المشارك تتميز بنفس ترتيب أسماء موقعا للمصفوفة التي تم الحصول عليها في الخطوة 8، 1 (هذا الطلب ضروري لتشغيل الاختبار رف، انظر أدناه).
  • إجراء اختبار رف بين مصفوفات البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوات 8.1 و 8.2. بعد إدخال البيئة R (تشغيل الأمر "R" من داخل المحطة طرفية)، تحميل مكتبة ade4 باستخدام الأمر التالي: library(ade4)
    1. تشغيل الاختبار رف بتحميل مصفوفات البيانات اثنين وإجراء الإحصائيات تشغيل أسطر الأوامر 21 (1 ملف التكميلية)، مع "نريب" يمثل عدد التباديل. الاختبار يتكون من حساب الترابط بين عناصر هذه المصفوفات، المصفوفات بيرموتينج وثم حساب إحصائية الاختبار نفسه مرة أخرى.
      ملاحظة: تستخدم كافة القيم التي تم الحصول عليها من اختبار إحصاء لبناء توزيع إشارة اختبار الإحصاء، التي سيتم استخدامها لحساب فالقيمه المراد اختبارها للأهمية. ويحدد عدد التباديل الدقة التي فيمكن الحصول على قيمة.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    جين VIT_05s0077g01970، حددت على نحو آخر مماثل التمويل (أ) ATL2 (At3g16720) من خلال بحث بلاستب، استخدمت مسبار لمسح أعضاء الأسرة ATL في الجينوم الكرمة (cvف العنب الأوروبي بينوت نوير PN40024). تحليل هذه المبادرة--انفجار المتقاربة بعد دورات قليلة تكشف عن قائمة جينات المفترضة لعائلة الجينات ATL الكرمة (الشكل 1A). وجرى تقييم وجود المجال الدائري-H2 المتعارف عليه لكل مرشح بالفحص البصري لمحاذاة العضلات كافة الإدخالات المحددة في التحليل (الشكل 1B). فقط تلك الجينات التي تحتوي على الأحماض الأمينية المصانة متباعدة بشكل صحيح، وبقايا الحامض الأميني اثنين، فضلا عن بقايا برولين قبل سيستين الثالثة اعتبرت يستخدم الجيش الإسرائيلي وفقا لتعريف ATL الأصلي في نبات5. الوفاء بالمتطلبات إجمالي 96 الكرمة الجينات واعتبرت لمزيد من الوصف. وقد تم تحليل كل أفراد الأسرة ATL لتعريف الخصائص المحددة للجينات والمناظرة مرمزة البروتين، أيوجود الأخرى المجال المنسوخ المعروفة بالإضافة إلى خاتم-H2، ترانسميمبراني أو مسعور المناطق الغنية، سوبسيلولار الترجمة، ومواقع الفسفرة المفترضة (الجدول 1 و الجدول 2).

    Figure 1
    رقم 1: مسح هذه المبادرة-الانفجار والمحاذاة من الكرمة المفترضة يستخدم الجيش الإسرائيلي- (أ) لقطة من أعلى 10 يضرب في البحث التكرار انفجار هذه المبادرة الأولى باستخدام تسلسل البروتين VIT_05s0077g01970 كطعم. (ب) جزء من محاذاة الكرمة المختارة 96 المفترضة يستخدم الجيش الإسرائيلي عرض النطاق الدائري-H2 وشعار المناظرة الحصول عليها باستخدام مجموعة من البيولوجيا الجزيئية (انظر الجدول للمواد). مستنسخة من والشىء et al. مرخص تحت الإبداعي لجنة إسناد رخصة الدولية 4.042.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الاسم معرف الجينات طول الجينات (bp) عدد إنترون معرف أونيبروت طول البروتين (أإ) خاتم-H2 عزر رقم المجال TM/H مجالات أخرى
    VviATL3 VIT_09s0002g00220 1245 0 F6HXK6 304 بكسك 1
    VviATL4 [VviRHX1A] VIT_15s0021g00890 1827 3 D7SM36 203 بكسك 0
    VviATL18 VIT_11s0118g00780 1113 2 F6HCI8 193 جهاز الكمبيوتر 0
    VviATL23a VIT_18s0001g01060 935 0 F6H0E4 114 بكسك 0.5
    VviATL23b VIT_18s0001g01050 399 0 E0CQX3 132 بكسك 1
    VviATL24 VIT_17s0000g06460 4466 4 D7SI89 217 بكسك 1
    VviATL27 VIT_00s0264g00020 2554 4 D7T1R5 235 بكسك 1
    VviATL43 VIT_11s0052g00530 1576 2 D7SQD9 457 بكسك 3
    VviATL54a VIT_18s0001g06640 3221 1 F6H0Y5 405 بكسك 1
    VviATL54b VIT_03s0017g00670 2774 1 F6HTI0 427 بكسك 1
    VviATL55 [VviRING1] VIT_07s0191g00230 1844 0 F6HRP9 372 بكسك 1
    VviATL63 VIT_06s0004g06930 804 0 D7SJU6 267 بكسك 1
    VviATL65 VIT_03s0063g01890 2068 0 F6HQI8 396 بكسك 1
    VviATL82 VIT_01s0026g02540 820 0 F6HPQ9 233 جهاز الكمبيوتر 0.5
    VviATL83 VIT_17s0000g08400 1887 0 F6GSQ4 143 جهاز الكمبيوتر 0
    VviATL84 VIT_06s0004g00120 1853 0 F6GUP5 368 جهاز الكمبيوتر 0.5 zf-RING_3
    VviATL85 VIT_12s0034g01400 786 0 F6H965 261 جهاز الكمبيوتر 0.5
    VviATL86 VIT_12s0034g01390 1434 1 D7T016 451 جهاز الكمبيوتر 0.5
    VviATL87 VIT_18s0001g03270 1002 0 F6H0T2 333 جهاز الكمبيوتر 0.5 zf-RING_3
    VviATL88 VIT_08s0040g00590 1320 0 F6HQR2 314 جهاز الكمبيوتر 0 zf-RING_3

    الجدول 1: أول 20 ففياتل الجينات والخصائص تسلسل البروتينات المقابلة. الخرائط المواضيعية: ترانسميمبراني؛ H: مسعور؛ 0.5 يدل على وجود واحد أو أكثر من مناطق مسعور. مستنسخة من والشىء et al. مرخص تحت الإبداعي لجنة إسناد رخصة الدولية 4.042.

    Table 2
    الجدول 2: تفاصيل عن 20 الأولى ففياتل موقف الجينات في خامسا-العنب الأوروبي الجينوم وازدواجية الدولة، والخصائص الفيزيائية-الكيميائية البروتين ATL والموقع. () عدد مواقع الفسفرة التي تنبأ بها موست؛ ويسلط الضوء على توقعات مماثلة (ب) التي تم الحصول عليها مع اثنين على الأقل من البرمجيات في غامق؛ واستخدمت نجلوك مع الإعدادات الافتراضية، في حين استخدمت v1.1 تارجيتب و "البروتين والمتصيد سوبسيلولار التعريب" مع وقف احتمال 0.5. نشاط، ونواة؛ معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، الميتوكوندريا؛ شيلي، بلاستيدات الخضراء؛ جيش التحرير الشعبي الصيني، غشاء البلازما؛ S، مسار الافرازية (وجود الببتيد إشارة)؛ M، الميتوكوندريا؛ ج، بلاستيدات الخضراء؛ O أو-، مواقع أخرى؛ الثانية، لم تحدد (أي، قيمة العتبة). مستنسخة من والشىء et al. مرخص تحت الإبداعي لجنة إسناد رخصة الدولية 4.042. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    إجراء تحليل النشوء والتطور بما في ذلك تسلسل النوكليوتيدات الكرمة المحددة ATL-ترميز الجينات جنبا إلى جنب مع تسلسل الأسرة الجينات ATL التمويل (أ) إشارة كان يستخدم للتسميات ATL الكرمة، وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها سنكجا8. ستة وتسعين و 83 من تسلسل النوكليوتيدات من العنب الأوروبي ف و التمويل (أ)، على التوالي، قد تعرضوا لخط أنابيب Phylogeny.fr للحصول على شجرة النشوء والتطور يمكن الاعتماد عليها.تسلسل هذه الأخيرة التي استخدمت لاحقاً لإضافة تعليقات توضيحية واسم الجينات الكرمة على أساس علاقات متينة (الشكل 2). اتباع هذا النهج، 13 من أصل 96 العنب يستخدم الجيش الإسرائيلي تلقي معرفاً محددة النظر بهم أورثولوجي رأس برأس مع التمويل (أ) atl. تم تعيين أسماء 83 جينات أخرى استناداً إلى الشجرة النشوء والتطور، ومع تقدمي الترقيم من أعلى إلى أسفل، بدءاً من عدد جينات ATL أعلى من المستخدمة في رقم أعلى التمويل (أ).

    Figure 2
    الشكل 2: شجرة النشوء والتطور ف العنب الأوروبي و التمويل (أ) ATL E3 ubiquitin ليجاسى-ترميز الجينات. تم إنشاء شجرة أونرووتيد مع جناح Phylogeny.fr (ف العنب الأوروبي (باللون الأخضر) والجينات ATL 83 من التمويل (أ) ذكرت في قاعدة أونيبروت (باللون الأصفر). وتم الحصول على فرع الدعم القيم من 100 bootstrap replicates. النجوم الحمراء تشير إلى وجود مجال الإصبع (بزف) BCA2 الزنك في البروتينات المقابلة. مستنسخة من والشىء et al. مرخص تحت الإبداعي لجنة إسناد رخصة الدولية 4.042. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    تعيين ATL-ترميز الجينات على الكروموسومات الكرمة أظهر توزيع على نطاق واسع في جميع أنحاء الجينوم، تشير إلى ازدواجية كل الجينوم كقوة تطورية رئيسية في توسيع نطاق الأسرة الجينات ATL في الكرمة. وفي الواقع، تم العثور على 31 يستخدم الجيش الإسرائيلي في المناطق الكروموسومات المتجانسة المحتملة الناشئة من أحداث ازدواجية الجينوم المجزأ أو كله. وعلاوة على ذلك، أبرزت نفس التحليل الجينات المكررة تانديملي 13 وتكرار الدانية أحد التكرارات مشتتة 51 (الشكل 3). ونظرا للعدد الكبير جداً من الجينات المكررة في الأسرة ATL، أجرينا تجربة تخصيب (اختبار فيشر الدقيق) للتأكد من الاحتفاظ التفضيلي بالجينات المكررة أثناء وجود الجينوم. مع فالقيمه < 0.001، أكد هذا الاختبار تم الإبقاء على فرضية أن تكرار الجينات ATL عشوائياً أكثر من المتوقع، مما يشير إلى دور لأسرة جين ATL خلال الكرمة التكيف والتطور.

    Figure 3
    الشكل 3: الكرمة ATL-ترميز توزيع الجينات على الكروموسومات ف العنب الأوروبي وازدواجية الدولة. تم تعيين الجينات ATL الكرمة 96 بالضبط الصبغية المعلومات المتوفرة في قاعدة البيانات إلى 19 ف العنب الأوروبي الكروموسومات. تشير الألوان إلى حدث ازدواجية الأصلي. خطوط حمراء وخطوط سوداء عمودية تحديد أزواج المستمدة من الترادف التكرار والازدواجية الجينوم كله، على التوالي. مستنسخة من والشىء et al. مرخص تحت الإبداعي لجنة إسناد رخصة الدولية 4.042. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    مواصلة التحقيق في الوظائف البيولوجية المفترضة ليستخدم الجيش الإسرائيلي في الكرمة، أجرى تحليل تلوي في عام ف العنب الأوروبي التعبير الجيني العالمي كورفينا أطلس12. Dataset تتضمن قيم التعبير كل الجينوم 54 الكرمة مختلف هيئاتها ومراحل النمو، واستخدمت لإجراء تحليل ثنائية عنقودية هرمية. وأكدت النتائج ليس فقط أن يستخدم الجيش الإسرائيلي 96 كانت أعربت في واحد على الأقل من الأنسجة 54/المراحل، ولكن أشارت أيضا إلى وجود خمس مجموعات رئيسية من ملامح التعبير (الشكل 4 أ). بإيجاز، أظهرت المجموعات A و E مقابل السلوكيات، خاصة الأولى تتسم downregulation عامة للجينات ATL في عينات الأحداث، بما في ذلك المراحل المبكرة من التوت وأوراق الشباب، المحلاق، نورات ومعظم مراحل برعم. من ناحية أخرى، الذبول عينات ناضجة مثل التوت في إنضاج وما بعد الحصاد في نفس المجموعة A، مراحل والأنسجة الخشبية والمراحل المتأخرة من تطوير البذور ATL الجينات أظهرت upregulation الغالبة. من الجينات في "الفئة جيم" دوونريجولاتيد أساسا في معظم العينات، بينما الجينات ATL في المجموعة د كثيرا ما أوبريجولاتيد في المراحل المتأخرة من تطوير بيري. وأخيراً، لم تظهر المجموعة ب أي تباين ذات الصلة في ملامح التعبير.

    تم تطبيق نهج مماثل لدراسة التعبير عن ATL الكرمة أفراد الأسرة في الاستجابة للضغوط الحيوية وغير الحيوية، باستخدام مجموعات البيانات المحددة التي بنيت لهذا الغرض. وتتوفر كمية ضخمة من البيانات التعبير المستمدة من ميكرواري وتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي من قواعد بيانات access العامة مثل الجامع التعبير الجيني (GEO) وأراييكسبريس. بمجرد جمع وتطبيع مريح، استغلت المعلومات لزيادة ثاقبة وظيفة يستخدم الجيش الإسرائيلي المحتملة استجابة النبات لتؤكد. تحليل ملامح التعبير العنب يستخدم الجيش الإسرائيلي ردا على الضغوط الحيوية كشفت عن أن 62 من أصل 96 النصوص تبين تعديل كبير (log2 إضعاف-التغيير (FC) > | 0.5 |) في ظروف اثنين على الأقل، مع معدل اكتشاف كاذبة (FDR) < 0.05 ( الشكل 4). العدد يزيد على 81 النظر في العتبة فرانكلين روزفلت في شرط واحد فقط. واقترحت هذه النتائج بقوة مشاركة مباشرة للأسرة الجينات ATL في التصدي للعوامل الممرضة أيضا في العنب. على وجه الخصوص، مجموعة من الجينات 12 (VviATL3-27-54b-55-90-97-123-144-148-149-156) بشدة أوبريجولاتيد في الاستجابة لمعظم مسببات الأمراض، بما في ذلك بيوتروفيك والفطريات نيكروتروفيك واكلات العشب، وهكذا، جديرة بالاهتمام لزيادة وظيفية التحليلات.

    Figure 4
    الشكل 4: كلوستيرينجوف الهرمية ATL التعبير الجيني في الكرمة أطلس وفي الكرمة الحيوية المتصلة بالإجهاد dataset. (أ) التعبير سجل تحويل قيم جينات ATL العنب في الكرمة أطلس12 استخدمت لتحليل مجموعة هرمية يستند إلى قياس المسافة بيرسون. لون مقياس يمثل أعلى (أحمر) أو تعبير السفلي (الأخضر) المستويات فيما يتعلق بوفرة الوسيط نسخة من كل الجينات عبر كافة العينات. تشير الأحرف من A إلى E على الجانب الأيمن إلى مختلف المجموعات المحددة.AB: بعد الاندفاع؛ باء: الاندفاع؛ w: برعم برعم الشتاء؛ واو: المزهرة؛ إف ب: يبدأ المزهرة؛ خ م: مجموعة الفاكهة؛ G: الأخضر؛ السيد: منتصف-إنضاج؛ PFS: الفاكهة بعد مجموعة؛ فوي-ثانيا-ثالثا: ما بعد الحصاد الذبول أشهر 1 و 2 و 3؛ R: إنضاج؛ S: مسن؛ w: الجذعية الجذعية الخشبية؛ خامسا: فيرايسون؛ WD: متطورة؛ ص: الشباب. (ب) اللون الجدول يمثل زيادة (أحمر) أو ينقص التغييرات حظيرة (أزرق) للتعبير الجيني ATL الكرمة في العينات المصابة بالمقارنة مع عناصر تحكم لكل شرط. تشير العلامات النجمية إلى التعبير التفاضلية الهامة (فرانكلين روزفلت < 0.05) لكل ATL ظروف المقابلة. مستنسخة من والشىء et al. مرخص تحت الإبداعي لجنة إسناد رخصة الدولية 4.042. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    التكميلية الجدول 1: ATL الجينات المرشحين للربط بديلة. () ATL معرف الجينات وفقا للتنبؤ بالجينات العنب V1 والشرح، (ب) ATL الجينات معرف وفقا V2 الجينات العنب التنبؤ والشرح43، (ج) عدد المفترضة ATL البديلة الربط المتغيرات، (د) مزيد من المعلومات حول الترميز تسلسل لكل متغير ATL المفترضة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    التكميلية الجدول 2: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    الملف التكميلي 1: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    في عصر الجينوم، اتسمت العديد من الجينات الأسر عميقا في العديد من الأنواع النباتية. هذا المعلومات التمهيدية للدراسات الفنية وتوفير إطار لمواصلة التحقيق في دور مختلف أعضاء في أسرة. وفي هذا السياق، هناك أيضا حاجة إلى نظام التسمية السماح لكل عضو في أسرة، تجنب التكرار وارباكات قد تنشأ عندما يتم تعيين الأسماء بشكل مستقل إلى جينات مختلفة من مجموعات بحثية مختلفة بشكل فريد.

    بعد النظر في التفكير، والمجتمع العلمي الكرمة اتفقت على اسم الكرمة الجينات في عائلة استناداً إلى أوجه التشابه مع جينات نبات وإنشاء مجموعة من القواعد التي يجب تطبيقها لوصف أسر مورثة جديدة في الكرمة، أساسا بدءاً من النشوء والتطور مقارنة تسلسل النوكليوتيدات بين الكرمة وأعطيت أفراد الأسرة8. ولذلك، يمكن استخدام الجينات فقط التي هي بالفعل المشروح واسمه بشكل صحيح في نبات في التسميات الكرمة. ولذلك نفذ الإجراء المطبق لتحديد هوية أورثولوجويس ATL الكرمة في نبات الموصوفة هنا فقط للوفاء بشرط تعيين تسميات الأسرة الجينات الكرمة الصحيح. النهج البديلة للأنواع النباتية الأخرى، على الرغم من ذلك، يمكن أن يكون خياراً. على سبيل المثال، أورثولوجي يمكن أن يستدل عليها باستخدام يضرب انفجار ثنائي الاتجاه (BBH)، حيث يتم تعريف أورثولوجويس كأزواج من الجينات في نوعين من أنواع متشابهة أكثر (أي، مع محاذاة لأعلى درجة) إلى واحدة آخر من إلى أي الجينات الأخرى في الآخر 44من الأنواع. ومع ذلك، يمكن أن يغيب هذا الأسلوب العديد من أورثولوجويس في حالة ارتفاع معدل تكرار الجينات، كما هو الحال في النباتات والحيوانات45. وعلاوة على ذلك، في حالة ATL-ترميز الجينات، قد استرداد BBH الجينات التي تفتقر إلى هيكل ATL من نوع RING-H2 دقيقة (بما في ذلك بقايا برولين) أو الجينات التي لا المشروح واسمه يستخدم الجيش الإسرائيلي في نبات. على الرغم من أن قد يكون هذا البحث من منظور تطوري ذات الصلة، على استرجاع أورثولوجويس التي هي ليست المشروح سوف لا وفت نطاق الكرمة ATL الجينات العائلية الشرح، والتسميات، وأورثولوجويس التي هي غير مشروحة كما يستخدم الجيش الإسرائيلي لا يمكن استخدام اسم الكرمة أفراد الأسرة. إمكانية أخرى هي الاستدلال أورثولوجي استناداً إلى الأحماض الأمينية بدلاً من متواليات النوكليوتيدات باستخدام إينبارانويد46، أو 2 هيرانويد الأخيرة47، أن كانت مهام سير العمل هذه لا ينصح صراحة من المجتمع العلمي.

    التعبير التحليل التلوي، التي يمكن تعريفها بأنها أسلوب منهجي لدراسة والجمع بين مستودعات البيانات المتاحة للجمهور مختلفة من البيانات التعبير، يسمح لتسليط الضوء على الآليات الجزيئية المشتركة والمختلفة في مجموعة متنوعة من الظروف. وهكذا، يمكن تحسين إدماج المعلومات التعبير الجيني من تجارب ترانسكريبتوميك واسعة النطاق متعددة التوصيف لأسرة جين، بتحديد ملامح التعبير أفراد الأسرة عبر التجارب، وبالتالي التقليل إلى أدنى حد تأثير عوامل محددة للتجربة ودعم افتراض أكثر قوة بوظيفة الجينات المفترضة في عمليات معينة. ومع ذلك، يتطلب استخدام البيانات ميكرواري إدماج التعبير البيانات التي تم الحصول عليها مع منصات مختلفة، النظر في القيود الخاصة بها. على سبيل المثال، في منصة ميكرواري نمبلجين الكرمة، ونسبة كبيرة من بروبيسيتس للجينات المقابلة ممثلة في الصفيف (~ الجينات 13,000) لديها قضايا يحتمل أن الصليب-التهجين48. وفي حالة الأسرة ATL الكرمة، الجينات 15 قد تتأثر بهذه الظاهرة. ومع ذلك، كما ناقشها كريمر et al. 48، عبر-التعرف على أفراد الأسرة الجينات مشابهة جداً بالتحقيق نفسه يمكن أن يوفر معلومات مثيرة للاهتمام فيما يتعلق بالتعبير، في ظروف محددة، جينة واحدة بل اثنين للجينات أكثر مشاركة تسلسل عالية أوجه التشابه، وهكذا يحتمل أن تكون مشاركة أهداف ووظائف. مشكلة محتملة أخرى تتصل بمجموعات البيانات ميكرواري هو الحد الكشف عن التعبير لمنصات ميكرواري، التي ليست حساسة للغاية. لحل كل الشواغل، أي.، عبر التهجين وإشارة حساسية، يمكن أن يكون حلاً ممكناً للنظر في مجموعات رناسيق التعبير البيانات فقط. ومع ذلك، التحليل التلوي رناسيق البيانات لمجموعات البيانات الكبيرة جداً من العديد من الدراسات المختلفة يمكن أن تصبح تستغرق وقتاً طويلاً جداً، وقد تتطلب الكثير من الموارد الحاسوبية والخبرة العالية.

    على الرغم من أن النهج الذي قدم هنا تهدف إلى أن تكون شاملة، يمكن أن تكون زيادة التأكيد تكمل مع غيرها من التحليلات. أولاً، لتحقيق مزيد من رؤى في التطور الجزيئي والنشوء والتطور العلاقة بين أفراد الأسرة الجينات في النباتات، تحليل النشوء والتطور يمكن تمديده بناء التحالفات تسلسل العديد من أفراد الأسرة باستخدام شجرة النشوء والتطور من العديد من الأنواع النباتية. من الممكن أيضا حساب الوقت التطوري بالجينات الأسرة، وتقدير معدلات الاستبدال مترادفين وغير مترادفين أثناء تطور، بواسطة تحديد قيم Ks (عدد الاستبدالات مرادف كل موقع مترادفين في معين فترة من الوقت) وكا (عدد الاستبدالات نونسينونيموس كل موقع غير مترادفين في نفس الفترة). يتم استخدام نسبة كا/Ks الاستدلال آليات أحداث الازدواجية الجينات بعد انحراف عن أسلافهم. قيمة كا/Ks = 1 يوحي بالتحديد محايدة، قيمة كا/Ks < 1 يشير إلى تنقية التحديد، وقيمة كا/Ks > 1 يوحي بالتحديد الإيجابي49. وعلاوة على ذلك، إذا كان تحليل الهيكل الجيني يكشف عن وجود introns، توصيف الأسرة الجينات ويمكن تمديد الكشف عن بديل الربط المتغيرات. في الواقع، استناداً إلى دراسة عميقة من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من أنسجة مختلفة، ظروف الإجهاد والأنماط الجينية43، 21 (من 96) يستخدم الجيش الإسرائيلي على مرشحين أقوياء لإحداث الربط بديلة، مع العدد المحتمل من isoforms تتراوح من 2 إلى 16 ليستخدم الجيش الإسرائيلي هذه (انظر التكميلية الجدول 1). النصوص البديلة كثيرا ما تنتج isoforms البروتين التي تختلف في سلاسل الأحماض الأمينية وهذه التغييرات قد تغير خصائص البروتينات الخلوية وقد يسبب تغييرات من التحوير خفية إلى فقدان وظيفة منتج الجين. ولهذا السبب، أحداث الربط بديلة قد شاركت في مهام محطة هامة، بما في ذلك استجابة الإجهاد ومقاومة الأمراض والتمثيل الضوئي والمزهرة50،51.تكامل المعلومات المروج الجينات ATL يحتوي على المفترضة رابطة الدول المستقلة-ويمكن أيضا استكمال العناصر التنظيمية52 أو العثور على جزيئات (مثلاً، ميكرورنا والجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز) استهداف يحتمل أن يستخدم الجيش الإسرائيلي53 إلى وتكشف عن رؤى النظام في تنظيم الجزيئية المعقدة والتفاعل من العنب يستخدم الجيش الإسرائيلي.

    وفي الختام، يتم اختيار التحليلات التي يتعين القيام بها، فضلا عن الإجراءات التي ستطبق على تميز عائلة جينات جديدة في أنواع النباتية أساسا مدفوعة على قواعد المجتمع العلمي وكذلك نطاق تحديد الجينات العائلية. من المهم أن نأخذ في الاعتبار الخطوات الممكنة التحقيق اللاحقة، التي سوف تستغل مجموعة المعلومات، بين الذي يتضمن التطور الجيني بين الأنواع النباتية، ووصف هيكل الجينوم، أو المرشحين يمكن الاعتماد عليها لتحديد في الوظيفية الدراسات.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgements

    وأيد الأعمال جامعة فيرونا في إطار المشروع المشترك 2014 (وصف للأسرة الجينات ATL في العنب ومشاركتها في المقاومة إلى Plasmopara viticola).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Personal computer
    Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
    Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) http://www.megasoftware.net/
    Motif-based sequence analysis tools (MEME) http://meme-suite.org/
    Geneious Biomatters Limited http://www.geneious.com/
    ProtParam Tool http://web.expasy.org/protparam/
    ngLOC http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html
    TargetP v1.1 Server http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
    Protein Prowler http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/
    MUsite http://musite.sourceforge.net/
    Pfam http://pfam.xfam.org/
    TMHMM Server v. 2.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
    ProtScale http://web.expasy.org/protscale/
    Grape Genome Database (CRIBI) http://genomes.cribi.unipd.it/grape/
    PhenoGram http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot
    MCScanX http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/
    Interactive Tree Of Life (iTOL) http://itol.embl.de/
    UniProt http://www.uniprot.org/
    Phylogeny.fr http://www.phylogeny.fr/index.cgi
    MUSCLE http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
    Gblocks Server http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
    Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_
    datamatrix_geneIDs_Fasoli2012
    Multi Experiment Viewer (MeV) http://mev.tm4.org/#/welcome
    Sequence Read Archive (SRA) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra
    R https://www.r-project.org/
    EMBOSS Needle (EMBL-EBI) http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449, (7161), 463-467 (2007).
    2. Adam-Blondon, A. -F., et al. Genetics, Genomics, and Breeding of Grapes. Science Publishers. 211-234 (2011).
    3. Chen, L., Hellmann, H. Plant E3 Ligases: Flexible Enzymes in a Sessile World. Mol. Plant. 6, (5), 1388-1404 (2013).
    4. Vierstra, R. D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (6), 385-397 (2009).
    5. Serrano, M., Parra, S., Alcaraz, L. D., Guzmán, P. The ATL Gene Family from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa Comprises a Large Number of Putative Ubiquitin Ligases of the RING-H2 Type. J. Mol. Evol. 62, (4), 434-445 (2006).
    6. Aguilar-Hernández, V., Aguilar-Henonin, L., Guzmán, P. Diversity in the Architecture of ATLs, a Family of Plant Ubiquitin-Ligases, Leads to Recognition and Targeting of Substrates in Different Cellular Environments. PLoS One. 6, (8), e23934 (2011).
    7. Guzmán, P. The prolific ATL family of RING-H2 ubiquitin ligases. Plant Signal Behav. 7, (8), 1014-1021 (2012).
    8. Grimplet, J., et al. The grapevine gene nomenclature system. BMC Genomics. 15, 1077 (2014).
    9. Prince, V. E., Pickett, F. B. Splitting pairs: the diverging fates of duplicated genes. Nat. Rev. Genet. 3, (11), 827-837 (2002).
    10. Magadum, S., Nerjee, U., Murugan, P., Gangapur, D., Ravikesavan, R. Gene duplication as a major force in evolution. J. Gen. 92, (1), 155-161 (2013).
    11. Wang, N. Patterns of Gene Duplication and Their Contribution to Expansion of Gene Families in Grapevine. Plant Mol. Biol. Rep. 31, (4), 852-861 (2013).
    12. Fasoli, M. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24, (9), 3489-3505 (2012).
    13. BLAST. BLAST2.6.0. Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2016).
    14. MEGA. MEGA7.0.25 build 7170412. Available from: http://www.megasoftware.net/ (2017).
    15. MEME. MEME Suite Version 4.11.4. Available from: http://meme-suite.org/ (2017).
    16. ProtParam. ExPASy Server. Available from: http://web.expasy.org/protparam/ (2005).
    17. ngLOC v1.0. Available from: http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html (2007).
    18. TargetP v1.1 Server. Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ (2000).
    19. Prowler v1.2. Available from: http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/ (2005).
    20. MuSite v1.0. Available from: http://musite.sourceforge.net/ (2010).
    21. Pfam. Pfam version 31.0. Available from: http://pfam.xfam.org/ (2016).
    22. TMHMM v2.0c. Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ (2007).
    23. ExPASy. ProtScale. Available from: http://web.expasy.org/protscale/ (2005).
    24. CRIBI. Grape genome database. Available from: http://genomes.cribi.unipd.it/grape/ (2012).
    25. PhenoGram. Available from: http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot (2012).
    26. ScanX v0.8. Available from: http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/ (2013).
    27. Interactive Tree Of Life (iTOL). Version3.5.3. Available from: http://itol.embl.de/ (2016).
    28. UniProt. Available from: http://www.uniprot.org/ (2016).
    29. Phylogeny.fr. Available from: http://www.phylogeny.fr/index.cgi (2008).
    30. MUSCLE. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ (2017).
    31. Gblocks Server. Version 0.91b. Available from: http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html (2002).
    32. Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas. Available from: https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_datamatrix_geneIDs_Fasoli2012 (2015).
    33. Multiple Experiment Viewer (MeV). Version 4.8.1. Available from: http://mev.tm4.org/ (2017).
    34. Sequence Read Archive (SRA). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra (2017).
    35. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, (15), 2114-2120 (2014).
    36. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9, (4), 357-359 (2012).
    37. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq-a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31, (2), 166-169 (2015).
    38. R. Version 3.4.1. Available from: https://www.r-project.org/ (2017).
    39. Ritchie, M. E. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43, (7), e47 (2015).
    40. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, (12), 550 (2014).
    41. EMBL-EBI. EMBOSS Needle. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ (2017).
    42. Ariani, P. Genome-wide characterisation and expression profile of the grapevine ATL ubiquitin ligase family reveal biotic and abiotic stress-responsive and development-related members. Sci. Rep. 6, 38260 (2016).
    43. Vitulo, N., et al. A deep survey of alternative splicing in grape reveals changes in the splicing machinery related to tissue, stress condition and genotype. BMC Plant Biol. 14, (1), 99 (2014).
    44. Overbeek, R., Fonstein, M., D'Souza, M., Pusch, G. D., Maltsev, N. The use of gene clusters to infer functional coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, (6), 2896-2901 (1999).
    45. Dalquen, D. A., Dessimoz, C. Bidirectional Best Hits Miss Many Orthologs in Duplication-Rich Clades such as Plants and Animals. Genome Biol. Evol. 5, (10), 1800-1806 (2013).
    46. Remm, M., Storm, C. E. V., Sonnhammer, E. L. L. Automatic clustering of orthologs and in-paralogs from pairwise species comparisons1. J. Mol. Biol. 314, (5), 1041-1052 (2001).
    47. Kaduk, M., Sonnhammer, E. Improved orthology inference with Hieranoid 2. Bioinformatics. 33, (8), (2017).
    48. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 370 (2014).
    49. Juretic, N., Hoen, D. R., Huynh, M. L., Harrison, P. M., Bureau, T. E. The evolutionary fate of MULE-mediated duplications of host gene fragments in rice. Genome Res. 15, (9), 1292-1297 (2005).
    50. Filichkin, S. A. Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana. Genome Res. 20, (1), 45-58 (2010).
    51. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22, (12), 3142-3152 (2003).
    52. Wong, D. C. J., Gutierrez, R. L., Gambetta, G. A., Castellarin, S. D. Genome-wide analysis of cis-regulatory element structure and discovery of motif-driven gene co-expression networks in grapevine. DNA Res. 24, (3), 311-326 (2017).
    53. Wong, D. C. J., Matus, J. T. Constructing Integrated Networks for Identifying New Secondary Metabolic Pathway Regulators in Grapevine: Recent Applications and Future Opportunities. Front. Plant Sci. 8, 505 (2017).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics