인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

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Developmental Biology

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Summary

Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

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Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

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Abstract

인간의 두뇌 개발 초기 단계 확산, 마이그레이션 및 neurite 결과; 고유와 정확 하 게 조율 된 프로세스의 시리즈를 통해 진행 그리고 후기 축 삭/모 수석 파생물 및 시 냅 스 형성에 의해 특징. neurodevelopmental 장애, 종종 이러한 프로세스 중 하나 이상을 교란, 두뇌 형성과 기능에 이상이 선도. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술의 출현, 연구원은 지금 뉴런을 포함 한 거의 모든 세포 유형으로 분화 될 수 있다 인간 세포의 풍부한 공급이 있다. 이 세포는 정상적인 두뇌 개발 및 질병의 병 인 연구에 사용할 수 있습니다. HiPSCs 말기 정신병 질환 사용 모델을 사용 하 여 프로토콜 수 분화 신경 또는 3D 문화 시스템을 사용 되 나 organoids. 이러한 방법은 인간의 질병 병 인 공부에 귀중 한 입증 했다, 몇 가지 단점이 있습니다. HiPSCs 신경 세포로의 분화 및 organoids의 생성 하는 실험 및 평가 될 수 있는 변수의 수에 영향을 미칠 수 있는 긴 하 고 비용이 많이 드는 프로세스. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids 질병 관련 프로세스, 모 수석 파생물, synaptogenesis, 등의 연구를 허용 하는 동안 그들은 확산 및 마이그레이션 같은 이전 프로세스의 연구를 배제. Neurodevelopmental 장애, 자폐증, 등에서 풍부한 유전과 사후 증거는 초기 발달 과정에서 결함을 나타냅니다. 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식 세포 인구 ontogenetic 프로세스 및 질병 개시에 대 한 질문에 적합 한 모델을 수 있습니다. 우리는 지금 인간 Npc에 마우스와 쥐 대뇌 피 질의 문화에서 개발 공부에서 배운 방법론을 확장 합니다. NPCs의 사용 우리가 질병 관련 고기를 조사 하 고 어떻게 다른 변수 (예를 들어, 성장 요인, 마약) 충격 발달 과정 등 확산, 마이그레이션, 차별화 몇 일만에 정의할 수 있습니다. 궁극적으로,이 도구 집합 질병 특정 메커니즘 및 neurodevelopmental 장애에 고기 식별 하 재현성 및 높은 처리량 방식으로 사용할 수 있습니다.

Introduction

간단한 유기 체와 마우스 모델을 사용 하 여 기본 두뇌 개발 질병 pathogenesis의 메커니즘을 해명 했습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 많은 정신병 무질서의 병 인 간단한 유기 체에 있는 모든 발견은 인간 질병의 복잡 한 측면에 직접 관련이 있기 때문에 애매 남아 있습니다. 또한, 인간의 두뇌의 더 복잡 종종 모델 인간 개발을 어렵게 하 고 동물에 장애. 진화와 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 기술의 진보와 함께 체세포 줄기 세포로 재설정 고 인간의 질병을 연구 하는 신경 세포로 분화 될 수 있습니다. (유전체학, transcriptomics, proteomics, metabolomics) hiPSCs 및 "omic" 기술의 발전 인간 두뇌 개발의 이해에 혁명을 약속 드립니다. 이러한 기술은 지금 가능 하 게 "정밀 의학" 접근에 사건-의해-사건을 기준으로 정신병 질환의 특성에.

HiPSC 질병-모델링 분야에서 현재 주식은 특정 신경 하위는 단층으로 세포 분화 하거나 두뇌 개발1,2,의 측면을 정리 하는 organoid 라는 3D 문화 시스템을 사용 하 3. 이러한 시스템은 엄청나게 공부 하 고 인간의 개발 및 질병4,5,,67의 독특한 측면을 잠복 근무에 귀중 한 되었습니다. 그러나, 신경 문화와 organoids 종종 필요 어디서 나 주에서 문화에서 개월 공부 준비가 되기 전에. 이러한 프로토콜의 이러한 문화 시스템 자주 수행 될 수 있는 실험의 수 및 테스트할 수 있는 성장 요인 또는 (마약) 처럼 변수 수 제한 유지 하는 데 필요한 리소스의 양을 소모 자연. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids를 이용 하 여 많은 연구 개발에서 나중에 발생 하는 모 수석 파생물 또는 시 냅 스 형성, 등의 프로세스에 집중 했다. 이러한 프로세스 발달 장애 자폐증과 정신 분열 증 등의 병 리에 연루 되어, 이전 확실 한 신경 분화 하기 전에 발생 하는 개발 이벤트는 질병 병 인8에 대 한 중요 한 ,,910,11,,1213. 실제로, 최근 게놈 연구 보여줍니다 확산, 프로세스 파생물 및 마이그레이션 구성 되어, 중반에 태아 기간 자폐증 pathogenesis11,14에서 특히 중요 하다. 따라서, 신경 줄기와 조상 세포 인구 이러한 이전 프로세스를 보다 잘 이해 하려면 공부 하는 것이 중요 하다. Organoid 시스템을 더 나은 간주 정리 인간의 두뇌 개발 3D 자연 조직된 구조 때문에, 이러한 이전 이벤트의 일부 연구 활용 되어 조상 수영장을 포함지 않습니다. 그러나, organoids에 조상 인구 종종 스파스 이며 신경 줄기 또는 조상 세포5,15보다 광선 glial 세포 처럼. 따라서, 그것은 neurodevelopment 적극적으로 증식 세포 인구에서의 초기 단계를 공부 하는 높은 처리량 방법을 도움이 될 것 이다.

연구실에서 우리 hiPSC 파생 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식, 확산, 세포 이동 등 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하는 신경 줄기와 조상 세포의 혼합된 인구를 사용 하는 프로토콜을 만들었습니다 그리고 초기 프로세스 (neurite) 확장입니다. 이 분석 실험은 성공적으로 쥐와 쥐 대뇌 피 질의 문화16,17,,1819,20, neurodevelopment 공부를 수십 년 동안 우리가 실험실에서 사용 되는 기술에서 개발 되었다 21,,2223. 중요 한 것은, 그것은 또한 고기 및 쥐 및 마우스 문화 시스템에 정의 된 규정 신호는 매우 활성 vivo에서, 이러한 기술을16, 의 값을 나타내는 메커니즘의 예측 표시 했다 17,18,,1924. NPCs에 hiPSCs의 초기 분화 후 이러한 방법을 수 일의 문제에 중요 한 발달 과정을 연구. 이러한 방법에는 많은 이점이 있다: (1) 그들은 약간 정교한 장비가 필요 하 고 구현 하기 쉬운, (2) 수많은 실험적인 복제 시간, 결과, 그리고 (3)의 재현성의 빠른 확인을 위해 수 있도록 짧은 기간에 지휘 될 수 있다 신속 하 고 비용 효율적으로 코팅 행렬, 성장 요인의 효과 약물의 활동 문화 변수를 테스트할 수 있습니다. 또한, 우리 확고 역할 extracellular 성장 요인의 다양 한 개발 프로세스의 중요 한 레 귤 레이 터의 활용. NPCs는 직접 확산, neurite 결과, 및 셀 마이그레이션 같은 이벤트를 자극 하 고 그들은 제어 조건19 에 명백한 되지 않은 결함을 식별 하는 기능을 강화 하는 것을 발견 했다 발달 신호 선택에 노출 됐다 , 25 , 26 , 27 , 28. 마찬가지로, 약물 평가의 용이성 제공 다양 한 치료 적 개입의 효율성을 테스트할 정밀 의학 기술을 채택 하는 강력한 애비뉴. 따라서,이 프로토콜은 재현성, 높은 처리량 및 초기 두뇌 발달, 질병의 병 인, neurodevelopmental 고기에 성장 요인 및 약물의 잠재적인 유익한 효과 공부 하 고 간단한 방법론을 촉진 한다.

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Protocol

1. 안전 절차 및 Biosafety 내각 유지 보수

  1. Biosafety 수준 2 (BSL-2) 안전 절차
    1. BSL-2 재료 작업에 기관의 지침에 따라. 기관의 관행에 따라 BSL-2 자료는 삭제 합니다. 객실과 BSL-2 재료에 사용 되는 장비를 나타냅니다. 모든 개인 보호 장비 (PPE), 실험실 코트와 장갑 등을 착용 합니다.
  2. Biosafety 내각 유지 보수
    1. Biosafety 내각 BSL-2 레벨 재료의 사용에 대 한 인증을 사용 합니다.
    2. 표면 10% 표 백제 솔루션 다음 스프레이 적어도 15 분 동안 캐비닛는 biosafety에 UV 빛을 켜고. 허용 15 분 동안 앉아, 캐비닛, 아래로 닦 고 사용 하기 전에 공기를 켭니다 하 표 백제 솔루션.
  3. 방사성 Tritiated [3H]-티 미 딘 (트리 티 움) 안전 절차
    참고: 트리 티 움은 카테고리 5 방사성 소스, '가장 가능성이 위험' 카테고리. 방사능 작업에 대 한 기관의 지침에 따라. 일부 기관 인증 해야 하거나 움 처리를 허용 합니다.
    1. 제대로 처리 하 고 트리 티 움의 처분 방법에 교육 기관에서 교육을 받을 수 있습니다. 기관의 정책에 따라 적절 한 그릇에 방사성 폐기물의 처분. 트리 티 움 작업할 때 보호구를 착용 하십시오.

2. 신경 유도 Ipsc에서

참고: Npc 수 있도록, 상업적으로 이용 가능한 신경 유도 키트를 함께 제공 하는 프로토콜의 약간 수정된 된 버전 뒤를 이었다. Neurobasal (NB) 미디어와 신경 유도 보충 (NIS), 신경 유도 매체 (님) x 1을 확인 하는 데 사용 되는 x 50 키트에 의하여 이루어져 있다. NIS는 또한 100% 확인 하는 데 사용 됩니다 확장 매체 (섹션 3.1 참조). 프로토콜에 대 한 링크 자료와 장비 및 참조 섹션43에서 발견 된다.

  1. 70-80% 합칠 때에 Ipsc를 통과
  2. 플레이트 300000 Ipsc hESC 자격의 1 세포 외 매트릭스-모방 젤 (ECM 모방 젤) 코팅 6 잘 플레이트 락 억제제의 5 μ M와 iPSC 공급기 무료 매체의 2 개 mL를 포함 하. ECM 모방 젤 코팅 우물에 섹션 3.2 참조 하십시오.
  3. 언젠가 나중에, iPSC 매체 + 1 x PBS와 한 번 록 제와 워시 Ipsc 제거 합니다. Ipsc를 님의 2 개 mL를 추가 합니다.
    참고: 님의 50 mL NB 미디어의 49 mL를 국정원과 페니실린/스 (P/S)의 250 µ L (단위/50ml, 5 μ/mL) x 50의 1 mL을 추가 하 여 이루어집니다.
  4. 신경 유도 발음 하 여 매 2 일 변경 미디어 매체와 님의 2 mL와 함께 교체 셀 confluent 된다 (약 4-5 일)까지 보냈다. 일단 셀 confluent 미디어를 매일, 변경 합니다.
  5. 님에 ECM 모방 젤으로 접시 7 일 후 통과 셀 100% 확장 미디어, 5 μ M 바위 억제제의 2 개 mL를 포함 하는 6 잘 플레이트 코팅. 셀 통로 0 (P0) 여겨진다 NPCs이 시점에서. 100% 확장 미디어를 만들기 위해 지침에 대 한 아래 섹션 3.1을 참조 하십시오.
  6. 통로 셀 부분에 설명 된 방법을 사용 하 여. 셀 P2에 도달 되며 confluent NPC 마커 및 도금 실험 (그림 1)에 대 한 얼룩을 해리 하기 전에 때까지 기다립니다.

3. 문화 미디어, 코팅, 및 Npc의 유지 보수

  1. Npc (100% 확대 미디어)의 유지 보수에 대 한 미디어 준비:
    1. NB.의 24.5 mL과 DMEM/F12의 24.5 mL을 결합 하 여 100% 확장 미디어의 50 mL를 만들기
    2. DMEM/F12 + NB 솔루션 50 x NIS의 1 mL를 추가 합니다. 미디어를 250 μ P/S 솔루션을 추가 합니다.
      참고: 미디어 냉장된 (4 ° C) 수 있으며 최대 2 주 동안 사용. DMEM의 볼륨을 조정 하 여 미디어의 작은 볼륨을 만들 수 있습니다 / F12 + NB + 국정원 50 mL 볼륨에 관해서는 동일한 비율을 사용 하 여.
  2. ECM 모방 젤의 준비 NPC 유지 보수에 대 한 문화 플레이트 코팅
    1. 작업 솔루션의 6 mL를 만드는 데 필요한 볼륨에서 aliquot ECM 모방 젤. ECM 모방 젤 희석 요인 때문에, 인증서 분석 시트를 보면 aliquot 볼륨 일괄 처리에서 일괄와 많은 많은 변화를 계산 합니다.
    2. 얼음에는 ECM 모방 젤 약 수를 해 동 하 고 찬 DMEM/F12 미디어의 6 mL로.
    3. 6 잘 플레이트의 각 음에 ECM 모방 젤/DMEM/F12 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 6 잘 플레이트 솔루션과 ECM 모방 젤-37 ° c.에 30 분 동안 품 어
    4. 외피의 30 분 후 ECM 모방 젤 솔루션을 발음 하 고 100% 확장 미디어 대체 하거나 접시를 냉장 보관 (4 ° C, 최대 1 주) ECM 모방 젤-솔루션을 발음 하지 않고.
  3. NPCs의 유지 보수
    1. 플레이트 NPCs 젤 코팅 잘 100% 확장 미디어의 2 개 mL를 포함 하는 ECM 모방으로 1.5 백만 셀의 밀도.
    2. 5% CO2와 습 한 환경에서 37 ° C에서 Npc를 품 어.
    3. NPCs P3 또는 낮은, 또는 과도 한 세포 죽음을 방지 하기 위해 해 동된 NPCs 미디어 락 억제제의 5 μ M를 추가 합니다. 바위 억제제를 제거를 24 h 후 미디어를 변경 합니다.
    4. 통로 셀 confluent 될 때에 따라 4-9 일 마다. 밀도가 포장된 단층 접시 표면 전체 바닥을 커버 될 때 셀 confluent 간주 됩니다.
    5. 6 잘 플레이트 한 우물 당 1 1.5 백만 셀의 밀도에서 Npc를 접시 (부분 참조). 지출된 미디어 모든 48 h를 제거 하 고 100% 확장 미디어의 2 개 mL를 바꿉니다.
  4. 리프트, 해리, 및 실험 조건에 대 한 유지 보수 및 도금 NPCs를 펠 렛
    1. 중간, 세척 셀 한번 1 x PBS와 발음 PBS를 발음 하 고 confluent NPCs. 품 37 ° c.에서 10 분의 1로 500 μ 1 x 셀 분리 솔루션의 추가
    2. 실 온 (RT) PBS의 500 μ를 추가 하 고 잘 사용 P-1000 피펫으로 세포의 제거를 위해 세척. 15 mL 원뿔 튜브로 셀 + PBS 솔루션을 수집 합니다. 1 mL의 PBS로 다시 접시를 세척 하 고 튜브에 액체를 추가 합니다.
    3. 펠 렛을 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.
    4. 셀 펠 릿에서 상쾌한을 제거 하 고 다시 미리 따뜻하게 DMEM/F12 미디어의 1-5 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 세포 미디어의 1 4 백만 셀/mL의 조밀도를 희석. 계량 한 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
    5. 플레이트의 NPC 유지 보수 (섹션 3.3) 또는 (대 한 자세한 내용은 다음 섹션을 참조) 실시 되 고 개별 분석 결과 대 한 특정 셀의 필요한 수.
    6. 15 ~ 100 μ 셀의 사이 각 잘/요리 사용 됩니다 셀 서 스 펜 션 볼륨 미디어를 조정 합니다. 이 작은 도금 볼륨도 셀 배포는 성장 요인, 약물, 또는 매체에 기판 하지 희석 하면 됩니다.
    7. 37 ° c.에 세포를 품 어 미디어 NPC 유지 보수에 대 한 모든 48 h를 변경 하거나 개별 분석 실험에 대 한 특정 세부 정보를 참조 하십시오.
  5. 실험 조건 (30% 확장 미디어)에 대 한 미디어 준비
    1. 70%로 100% 확장 미디어를 희석 (30% 되 나 확장) 1:1 DMEM/F12 + NB 솔루션 실험 조건에 대 한 미디어를 추가 하 여.
    2. 6 mL 100% 확장 미디어의 추가 및 7 mL NB의과 DMEM/F12 미디어의 7 mL로 희석 하 여 20 mL의 30% 확장 미디어를 확인 합니다. P/S 솔루션의 5 µ L/mL를 추가 합니다.
      참고: 100% 미디어 P/S 이미 있으면 추가 결합 DMEM 대 5 μ/mL / F12 + NB (14 mL) = (5 μ/mL) x 100µL 대신 P/s 70 μ =.
    3. 원하는 농도 30% 확장 미디어에서 코팅 기판 및 성장 요소를 추가 합니다.

4. 평가 DNA 합성, S 단계 항목 및 Npc의 핸드폰 번호

  1. DNA 합성, S 단계, 및 셀 번호 시험 준비
    1. DH2O에서에서 폴 리-D-리 (PDL)의 1 mg/mL 재고 솔루션을 만들고 필터를 소독. DH2O 0.1 mg/mL PDL 솔루션으로 만들기를 하 고 300 μ 35 mm 접시에 1 mL 또는 24 잘 플레이트의 각 음에에서 1시 10분 희석. 실시간에서 20 분 동안 품 어
    2. PDL 웰 스 dH2O. Aspirate dH2O 5 분 동안 3 번 세척 하 고 300 μ/잘 또는 1 mL/접시 laminin (5 μ g/mL) 1 x PBS에 희석의 추가. Parafilm으로 접시를 커버 하 고 RT (12 ~ 24 h)에서 하룻밤 캐비닛 살 균, biosafety에 유지.
    3. 12 ~ 24 h. 추가 차량, 성장 인자, 또는 볼륨을 30%에서 NIS를 diluting 피하기 위해 총 솔루션의 10% 미만에서 원하는 농도에 대 한 관심의 약 30% 확장 미디어 (섹션 3.5 참조)를 준비 확장 매체.
    4. 각 씻어 24 잘 플레이트 1 x PBS (각 5 분)와 두 번의 잘. 1 x PBS를 발음 하 고 미디어 (없이 또는 약/성장 인자)의 450 μ를 추가 합니다. 셀을 도금 하기 전에 적어도 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
    5. 각 실험에 대 한 2-3 웰 스 또는 요리 당 상태를 설정 합니다.
    6. 플레이트 NPCs (부분 참조):
    7. 24 잘 플레이트에 셀/잘 NPC DNA 종합 분석 결과: 100000
    8. S 단계 항목: 500, 000 셀/35 m m 접시
    9. 셀/잘 24-잘 접시에에서 셀 번호 분석 결과: 50000
  2. 신경 선구자 세포 DNA 종합 분석 결과
    1. 100000 셀/24-잘 접시에 잘 접시 및 3 중/상태에서 평가.
    2. 추가 방사성, tritiated [3H]-46 h 문화에 후 각 잘에서 배양 (1.5 μCi/mL)에 티 미 딘. 셀 h 2에 대 한 37 ° C에서 품 어.
      참고: 때 방사성 물질을 사용 하 여, 기관, 따라 방사능 안전 프로토콜, 그리고 적절 하 게 지정된 폐기물 저장소에서 방사성 물질의 dispose에서 교육을 받을.
    3. 제거 제대로 각 우물에 방사성 미디어의 2 h. 추가 300 μ는 0.25 %trypsin-EDTA (0.5 m m)에 미리 예 열 후 처분 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어
    4. 셀 수확기에 설정 (재료 및 장비 참조 섹션)와 펌프 펌프 압력이 200 PSI 아래 인지 확인 하 고. 셀 수확기에 공간을 통해 필터 종이 놓고 용지 방향 표시 하려면 오른쪽 모서리에서 눈물.
    5. 빈 "빈" 트레이 셀 수확기의 수집 튜브를 삽입 하 고 필터 종이 축 축 하 게 prewash를 누릅니다. 샘플 우물에 수집 튜브를 놓고 (시작)을 실행 합니다.
    6. 셀 수확기 샘플 수집 완료 되 면, 모든 샘플 집합에 대 한 반복을 클램프 및 사전 필터 종이 들어올립니다. 항상 빈, "빈" 접시에 prewash.
    7. 광원에서 필터 종이 건조 하 고 쟁반에 해당 튜브를 설정 합니다. 종이 투표용지 튜브로 밖으로 펀치 하 고 각 유리병에 액체 섬광 칵테일의 2 개 mL를 추가 합니다. 캡 및 레이블 튜브입니다.
    8. 액체 섬광 섬광 기계에 (CPMs) 분당 수 읽기 전에 적어도 1 시간에 대 한 칵테일에 튜브를 품 어.
  3. NPC S 단계 항목 분석 결과
    1. 참고 섹션 단계 리프트, 해리, 작은, 및 다시 셀을 일시 중단.
    2. 섹션 4.1,이 단계에 대 한 단 1 접시/조건에에서는 35mm 요리에 접시 당 500000 세포를 플레이트.
    3. 셀의 동등한 배급을 보장 하기 위해 모든 방향에서 이리저리 요리를 교 반 하십시오. 셀 46 h 37 ° C에서 품 어.
    4. 준비 후 24 h 조건 당 PDL/Laminin 코팅 3 35 mm 판. 예를 들어 30% 확장 미디어의 한 35mm 접시와 30% 확장 미디어 + FGF의 1 35 mm 접시 (10 ng/mL) 다음 다음 날에 사용 하기 위해 6 PDL/Laminin 플레이트 코트.
    5. 2 h 46 헤 품 후 문화를 5mm 듀의 2 μ/mL를 추가 합니다.
    6. 해리 그리고 작은 셀 (부분 참조). 다시 3 mL의 30% 확장 미디어 또는 30% 확장 미디어 + 원하는 성장 인자/약 3 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
    7. 플레이트 미리 코팅된 PDL/Laminin 요리에 접시 당 1 mL. 셀의 동등한 배급을 보장 하기 위해 모든 방향에서 이리저리 요리를 교 반 하십시오. 접시에 셀 수 있도록 2 h 37 ° C에서 품 어. 단순화 된 타임 라인에 대 한 그림 2 를 참조 하십시오.
  4. S 단계 항목 분석
    1. 얼음 4% 요리 해결 Paraformaldehyde (1 x PBS에 PFA) 20 분. 다음, 3 번 1 x PBS 가진 5 분 동안 요리를 씻어.
    2. 0.05 %1 x PBS의 1 mL을 추가 세균 및 곰 팡이 성장을 방지 하기 위해 나트륨 아 지 드. 셀 경우 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 6 개월 (parafilm으로 밀봉) 요리 PBS + 나트륨에 지켜진다 아 지 드 솔루션, 비록 모든 면역 항은 잘 보존 된 분석에 있는 긴 지연 후.
    3. 상업적인 듀 반응을 사용 하 여 셀 시험 키트 (제조 업체의 프로토콜 참조). DAPI 또는 다른 핵 마커를 사용 하 여 셀을 얼룩 그리고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지.
    4. 10 체계적으로 임의의 필드 (10 배)의 총 라이브 셀 (전체 휴대폰 번호) 맹인에 듀 긍정적인 세포의 비율을 평가 합니다. 분석에서 죽은 세포를 포함 하지 마십시오.
    5. 단계 대조 이미지 및 형광 이미지 긍정적인 듀 얼룩을 확인 하 고 확인 셀은 죽은 또는 살아 (그림 3)를 사용 합니다.
    6. 수 있는 모든 셀 모두 부드러운도 위상 대비 설정에서 세포 막 그리고 형광 DAPI 핵에 의해 큰 조각난된 핵 얼룩, 이러한 셀 (3A 그림-B) 살고 있다.
    7. 밝은 단계 모든 셀 제외 부러진된 고르지 세포 막 있고 DAPI 형광 이미징,이 세포는 죽은 (그림 3A-B)에 의해 시각으로 작은, 압축 된 핵을가지고. 밝은 형광 듀 취재 전체 핵 또는 핵 (그림 3C)에 얼룩 덜 룩 한 형광 얼룩 얼룩 있는 셀을 식별 하 여 듀의 표현에 대 한 라이브 셀을 평가 합니다.
  5. NPC 셀 번호 분석 결과
    1. 2 일 후에 문화, 라벨 그리고 microcentrifuge 튜브 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 0.5 mL를 준비. 각 0.5 mL 튜브에 Trypan 파랑의 5 μ를 추가 합니다.
    2. 24 잘 플레이트의 각 잘 제거 매체를 10 ~ 15 분 동안 인큐베이터에서 셀 분리 솔루션 및 장소 x 1의 200 μ를 추가 합니다.
    3. 할당 된 시간 후 세포가 해제 되 면 각 음을 1 x PBS의 원하는 금액을 추가 합니다.
      참고: 일반적으로, 하루에 2, 추가 300 μ 1 x PBS의 잘 포함 셀 플러스 500 μ의 전체 볼륨에 대 한 분리 솔루션의 200 μ. 추가 문화 보육 시간, 셀 더 confluent 되, 필요에 따라 희석 볼륨 증가. 예를 들어 하루 4, 500 μ 주 6에 PBS, x 1의 추가, 800 μ 1 x PBS의 추가. 총 볼륨 700 μ 및 1 mL, 각각 될 것입니다.
    4. P-1000 피 펫을 사용 하 여, 위쪽 및 아래쪽 셀을 제거 하 5 번에 잘 각 4에서 플라스틱. 모든 세포가 분리 되도록 현미경 접시를 검사 합니다. 1.5 mL 튜브에 세포를 전송.
    5. 2 ~ 3 배 희석 셀 1.5 mL 튜브 반전. 그렇다면 50 μ 튜브의 중간에서 셀의 aliquot 고 Trypan 파랑 0.5 mL 튜브에 추가 (4.5.1 참조).
    6. 2-3 번 왔다 갔다 피 펫 셀 솔루션. hemocytometer에 셀을 추가 하 고 즉시 분석. 이상 10 분 세포 죽음 또는 Trypan 파랑 찍은 셀의 존재 증가 시킬 수 있습니다에 대 한 기다리고 있습니다.
    7. 신중 하 게 복제 계산을 수행 하기 위해 hemocytometer의 각 측에 10 µ L 셀 + Trypan 블루 혼합물을 추가 합니다. 단계 대조 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 죽은 세포 또는 Trypan 파랑 찍은 어두운 파란색 세포를 포함 하지 않습니다.
    8. 평균 총 셀 번호, 사용을 얻기 위해 휴대폰 번호는 hemocytometer의 4 구석에 서 계산 하 고 다음 방정식을 적용:
      미디어 볼륨 (mL) x 10,000 x 셀 번호 의미 = 총 셀 수/잘
    9. 발음 하 고 나머지 우물에서 절차를 반복 합니다. 미디어 계산 되지 않습니다 되 고, 모든 48 h. 반복 분석 결과 일 4 & 6 셀을 변경 합니다.

5. NPC Neurite 분석 결과

  1. Neurite 분석 결과 대 한 요리와 미디어 준비
    1. DH2O에서에서 폴 리-d-리 (PDL)의 1 mg/mL 재고 솔루션을 만들고 필터를 소독. DH2O 0.1 mg/mL PDL 솔루션을 만들고 각 35 mm 접시에 1 mL을 추가 하기 1시 10분 희석. 실시간에서 20 분 동안 품 어
    2. 한편, 30% 확장 미디어 (섹션 3.5 참조)를 준비 하 고 미디어 Fibronectin 솔루션 (재고 1 mg/mL)의 5 μ g/mL (5 µ L/mL)를 추가 합니다.
    3. 미디어가 준비 되 면 원하는 농도에서 차량, 성장 인자, 또는 관심의 약물을 추가 합니다.
      참고: 최고의 차량, 성장 인자, 또는 마약, 볼륨에 추가 하는 <는 fibronectin 및 30% 확장 매체의 다른 구성 요소를 diluting 하지 않으려면 솔루션의 10%.
    4. 20 분 후 3 번 dH2O 초과 PDL를 제거 하려면 5 분 동안 PDL 요리 세척. 요리는 미디어를 추가 하기 전에 건조를 확인 합니다.
    5. 각 PDL 코팅된 접시에 미디어 (또는 약/성장 인자 없이) + Fibronectin 솔루션의 1 mL를 놓습니다.
    6. PDL에는 Fibronectin의 적절 한 첨부 되도록 셀을 도금 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 요리를 품 어.
    7. 각 실험에 대 한 조건 (예를 들어, 3 차량 포함 된 요리, 3 약물 포함 된 요리) 당 2-3 접시를 설정 합니다.
  2. NPCs Neurite 분석 결과 대 한 도금
    1. 참고 섹션 단계 리프트, 해리, 작은, 및 셀을 resuspend.
    2. 섹션 5.1에서 준비 하는 요리에 접시 당 50000 세포를 플레이트. 셀의 동등한 배급을 보장 하기 위해 모든 방향에서 이리저리 요리를 교 반 하십시오.
    3. 48 h에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어.
  3. Neurites의 분석
    1. 48 h에 대 한 셀을 잠복기 후 매체, 발음 및 해결 요리 얼음 찬 4% PFA 20 분.
    2. 20 분 후 씻어 요리 1 x PBS 가진 5 분을 위한 3 시간. 최종 세척 후 0.05 %1 x PBS의 1 mL을 추가 나트륨 아 지 드.
    3. 32 X 단계 대조 현미경에 맹목적으로 요리를 분석 합니다. 총 셀과 neurites 하지만 재현할 수 위치에서 무작위로 선택한 3, 1 cm 행에 있는 셀을 계산 합니다. 적절 한 샘플링을 보장 하기 위해 요리 당 150 셀의 최소를 계산 합니다.
      참고:는 neurite은 세포 체에서 확장 (프로세스)로 정의 됩니다 > 2 셀 바디 직경 길이에서. 여러 프로세스가 있는 셀에 대 한 가장 긴 프로세스는 기준에 대 한 간주 됩니다. 프로세스와 셀 < 2 셀 바디 길이 직경 되지 않습니다 (그림 4) 포함.
    4. 함께 셀의 총 수와 neurites 셀의 총 개수에에서 추가 각 접시. Neurites 셀의 %를 계산 합니다. 평균 neurites 복제 요리에서 포함 된 셀의 비율. 때 각 접시 내 모든 행 비슷합니다, 그리고 요리 중 평균 표준 오차 (SEM) 의미의와 매우 유사한 실험의 재현성에 대 한 신뢰 설정 < 10%.
    5. 또는, neurites 베타-III-tubulin (TUJ1) 같은 표식에 대 한 immunocytochemistry를 실시 하 여 분석 또는 MAP2. 관심의 마커 얼룩 후 10 X 10 체계적으로 무작위 이미지 형광 현미경에 걸릴. 적어도 200 셀 이미지. 이 경우에 접시의 가장자리에 너무 가까이 하지 이미지 획득. TUJ1 또는 MAP2 + neurites (예를 들어 그림 10 참조)에 포함 된 셀의 비율을 분석 합니다.

6. NPC Neurosphere 마이그레이션 분석 결과

  1. Neurosphere 형성
    1. 없는 코팅 기판으로 35 mm 접시에 100% 확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다. 전에 셀 마이그레이션 분석 결과 대 한 충분 한 neurospheres 될 것입니다 도금 NPCs 준비 되도록 거기 2-3 접시 37 ° C에 적어도 15 분 동안 요리를 품 어.
      참고: 코팅 기판의 부재 NPCs neurosphere 형성을 위해 필수적 이다 미디어 정지 남아 보장 합니다. 코팅 요리 neurosphere 형성이 되지 것입니다.
    2. 리프트, 해리, 작은 셀 하는 단계에 부분을 참조 하십시오. 미리 데워 진된 100 %2-5 mL에 셀 펠 릿 resuspend 확장 미디어. 6.1.1 단원에 각 35 mm 접시에 1 백만 NPCs 플레이트.
    3. 집계 및 양식 neurospheres Npc 수 48-96 시간 37 ° C에서 Npc를 품 어. 단계 대조 현미경에 라이브 눈금자를 사용 하 여 영역 크기를 평가 합니다. 100 µ m (± 20 μ m)의 대략적인 직경에 도달 대부분 분야까지 기다립니다 (그림 5). 작은 분야 완전히 분산 하 고 마이그레이션 분석 결과 중 분리.
  2. 접시의 Neurosphere 마이그레이션 분석 결과 대 한 준비
    1. 30% 확장 미디어의 6 mL에 ECM 모방 젤 aliquots (섹션 3.2 참조)을 분해. ECM 모방 gel/30% 확장 미디어 솔루션 준비 되 면 원하는 농도에서 차량, 성장 인자, 또는 관심사의 약물을 추가 합니다.
      참고: 차량, 마약, 그리고 성장 인자 농도 섹션 6.3에 neurospheres의 200 µ L의 추가 대 한 계정에 증가 해야 합니다.
    2. 플레이트 ECM-모방의 1 mL 6 잘 플레이트의 한 잘에 30% 확장 미디어 솔루션 (± 차량, 성장 인자, 또는 약물)를 젤. 실험 조건 당 2-3 웰 스를 확인 합니다. 또한, 35 mm 요리를 사용할 수 있습니다. 37 ° C. 에서 적어도 30 분에 대 한 번호판을 품 어
      참고:이 분석 결과 대 한 확장 미디어 솔루션의 ECM 모방 gel/30%를 발음 하지 마십시오. 도금 분야 aspirated ECM 모방 젤에 신속 하 고 초과 마이그레이션 이어질 것입니다.
  3. Neurospheres 도금
    1. 6.1 단원에서에서 형성 하는 neurospheres를 수집 하 고 원뿔 튜브에 넣어. 워시 모든 neurospheres를 위해 1 x PBS의 1 mL와 함께 요리를 수집 35 m m. 5 분 x 100g에서 수집 된 neurospheres 아래로 회전 합니다.
    2. 미리 데워 진된 30 %1-3 mL에는 neurospheres를 다시 중단 확장 미디어. Neurospheres의 1 접시, 수집 매체의 1 mL resuspend 분야에 사용 됩니다. 2 요리를 수집 하는 경우 미디어의 2 mL 분야를 resuspend에 추가 됩니다, 그리고 부드럽게 플라스틱만 P-1000 분야 깨진 되지 않습니다을 사용 하 여.
    3. ECM 모방 gel/30% 6.2 단원에서에서 만든 확장 솔루션으로 resuspended neurospheres의 200 μ 플레이트. 모든 방향으로 균일 하 게 배포 neurospheres 락 접시. 37° C에서 48 h에 대 한 번호판을 품 어
    4. ECM 모방 gel/30% 확장 미디어 솔루션을 제거 하 고 4 %PFA, 세척, 및 계속 셀 PBS + 0.05% x 1에 있는 셀을 수정 나트륨 아 지 드.
  4. Neurospheres의 분석
    1. 10 X에서 위상 대비 설정을 사용 하 여 전체 neurospheres의 이미지를 취득 합니다. 분야는 서로 감동 하지는 확인 하십시오. 평균 마이그레이션 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 측정 합니다.
    2. 자유형 선 도구를 사용 하 여 neurosphere의 외부 컨투어를 추적 합니다. 자유형 선 "직선" 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 액세스할 수 있습니다. 수동으로 추적 마우스를 사용 하 여입니다.
    3. 측정 함수를 사용 하 여 추적의 면적을 계산. "지역" 분석 탭 아래 "측정 설정" 창에서 읽기로 선택 되어 있는지 확인 합니다. 파란색으로 외부 컨투어 추적 그림 6 을 참조 하십시오.
    4. 추적 영역 및 측정 영역의 내부 세포 질량. 빨간색으로 내부 윤곽선의 추적 그림 6 을 참조 하십시오. 평균 마이그레이션 총 neurosphere 영역에서 안 세포 질량을 빼서 계량.
    5. 연속 카펫 (그림 6)로 마이그레이션 하는 세포 밀도가 포장된 안 세포 질량을 측정 neurospheres
    6. 양탄자 또는 측정 neurosphere에서 분리 된 세포를 포함 하지 마십시오. 예를 들어 외부 카펫 측정에서 제외 됩니다 (흰색에서 동그라미) 셀의 그림 6 을 참조 하십시오. 각 조건에 대해 20 neurospheres의 최소를 분석 합니다.

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Representative Results

이러한 연구의 한 목표 Npc, 즉, 셀 숫자 증가의 증식 활동을 정의 하는. 이것은 전체 세포 인구 세포 추출 물에 방사성 추적 tritiated 티 미 딘의 설립이 고 그들이 인지 S 단계에 종사 하는 모든 셀을 반영 하는 높은 처리량 접근 방식의 DNA 합성을 평가 함으로써 얻을 수 5 분 또는 전체 2 시간에 대 한 합성. 또한, 이러한 분석 실험 S-위상 및 총 세포 숫자, 단일 셀의 더 노동 집약적인 분석 결과 입력 하는 셀의 비율의 결정을 수 있습니다. 세포는 유사 분열 및 세포 분열, 세포 수를 증가 하기 위하여 발생 한다 앞 단계 S 단계에서 DNA 음성 합성. 이러한 프로세스에는 시간이 좀 걸릴, 이후 48 시간에서 평가 하는 DNA 합성에 변화 변화이 시간 포인트에서 핸드폰 번호에 연결 하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 48 시간에서 DNA 합성에 변화 안정적으로 4-6 일에 세포 수의 증가 예측 발견 되었다.

DNA 종합 평가, 셀 24-잘 접시에 100000 셀 (~ 50% 합칠)의 밀도에서 도금 고 측정을 하기 전에 48 시간 동안 성장 수 있습니다. 이 밀도 사용 하 여 셀의 단층 환경 비슷하지만, 또한 성장 하지 않는다 이렇게 빨리 미디어 되 너무 산 성 48 h 동안에서 보장 합니다. 너무 산 성 미디어 크게 세포 대사에 영향을 미칠 하 고 따라서, 확산 결과 변경할 수 있습니다. 특정 셀 라인은 높은 증식, 연구원 세포 밀도, 미디어 볼륨을 변경 고려해 야 또는 높은 산 성 조건을 방지 하기 위해 주파수를 교환 하는 미디어. 조건이 변경 되 면 셀 연락처 종속 변경 확실히 성장 속도 영향을 때문에 다른 세포를 비교 했을 때 일관 되 게 중요 하다. 이러한 분석의 간단 디자인 다른 성장 인자를 테스트할 수 있습니다. 그림 7, 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF, 10 ng/mL)의 추가에 대 한 본 48 시간 DNA 합성 ~ 40% 증가 합니다. 또한, DNA 종합 분석 결과 모든 클론으로 재현할 수 이며 개인 FGF 자극 후 DNA 합성에서 증가 보여. 기준선과 FGF의 다양성에 대 한 잠재력 동일한 개인에서 클론 다양성 표 1에서 설명에 대 한 가능성 뿐 아니라 다른 영향을 받지 않는 개인 중 DNA 합성을 자극. 이 가변성으로 인해 개인, 당 여러 iPSC 클론을 테스트 하 고 각 다른 iPSC 클론에서 파생 된 3 ~ 5 NPC 선의 최소 평가 중요 하다. 각 NPC 라인 3 실험의 최소 수행 되었다.

DNA 종합 분석 결과 빠르게 수많은 실험적인 그룹 높은 처리량 패션을 평가 하기 위해 수 고 측정 S 단계 기간 (2 시간 5 분)에 DNA 종합의 합계를 반영 한다. S 단계에 종사 하는 셀의 비율을 정의 하려면 S 단계 항목 분석 결과 고용 되었다. 이 분석 결과 대 한 셀은 앞서 언급 했 듯이 단층 같은 역학 발생을 허용 하는 동일한 조밀도에 성장 하지만 그들은 2 일 후에 해리 그리고 짧게 단일 세포 분석에 접시를 준수 수 있습니다. 단층에 셀 계산 높은 셀 연락처 및 접시에 지역 다양성 어려울 수 있습니다. 이 패러다임은 단층으로 셀 모델을 단일 셀으로 분석 수 있습니다. 그것은 또한 DNA 종합 분석 결과에서 얻은 데이터의 그릇 독립적인 확인 역할을 합니다. 그림 8에서 보듯이 FGF (10 ng/mL) 자극의 48 시간 25 %S 단계를 입력 하면 셀의 비율을 증가 한다.

핸드폰 번호 평가, 낮은 세포 밀도 보다 전술 분석에는 24의 당 도금 되 고 50000 셀 판 잘 사용 됩니다. 다시,이 밀도 빠른 셀 라인 성장 하지 않는다 이렇게 빨리 6 일간의 기간 동안 매체의 pH도 산 성 되 고 노란색 되도록 선택 되었다. 그림 9, 셀 숫자 되지 않을 수도 있습니다 제어 및 FGF (10 ng/mL) 그룹 사이 크게 다른 2 일, 48 h (그림 7)에서 DNA 합성에 변화에 핸드폰 번호에 변화의 예측 4 ~ 6 일에.

NPCs 일반적으로 높은 밀도에서 교양, 동안 neurite 분석 결과 단일 세포 평가 35 mm 접시에 도금 하는 50, 000 셀의 밀도에서 실시 됩니다. 이 낮은 밀도 에서도 NPC 문화 익스프레스 cytoskeletal 단백질 및 녹음 방송 요인 NESTIN, SOX2, PAX6 등 Npc의 특성 (그림 10 A-D). 이 저밀도 경작 변경 되지 않으며 크게 세포 운명이 기간에 나타냅니다. 또한, 비슷한 낮은 조건에서에서 사용 된 쥐와 쥐 문화 시스템 감지 했다 궁극적으로 재현할 수 비보에16,17,,1819, 고기를 20,21,,2223. 48 시간 후 부 화, NPCs의 작은 비율 그림 11A와 B 에서 보듯이 neurites 확장을 시작 하 고 그림 11C에 그래프에서 계량. 발달 매개 변수를 평가 하기 위해 neurites, neurites의 길이 그리고 neurites/셀의 수를 확장 하는 셀의 비율을 측정할 수 있습니다. 정확 하 게 평가 neurite 결과 포함 된 셀의 비율, 그것은 중요 한 세포는 단일 셀 또는 클러스터의 도금 < 5 셀과 같이 큰 집계. 그림 10 E-F에서 볼 베어링 neurites (흰색 화살표)도 셀 미 숙 신경 마커 베타-III tubulin (TUJ1)를 표현 한다. TUJ1 스테인드 NPCs의 형광 이미지를 얻을 수 있다는 방법에서 설명 했 듯이, 그리고 이러한 이미지 프로세스의 신경 기원 되도록 neurites TUJ1 +의 비율에 대 한 계산 하실 수 있습니다. 우리 실험실에서 어느 방법으로 분석은 통계적으로 유사한 결과 얻지 못했다.

간단한 디자인과 neurite 분석 결과의 급속 한 자연 또한 우리가 발달 관련 성장 인자, cytokines와 펩 티 드의 효과 테스트할 수 있습니다. 예를 들어 그림 11 보여줍니다 neuropeptide 뇌 adenylate 있고 polypeptide 활성화 (PACAP, 3 nM) Npc PACAP에 증가 neurite 결과 CNS에 폭 식에 표시 되었습니다 중요 한 발달 요소 이다 두뇌 발달에 중요 하다. 우리의 실험실 및 다른 실험실에서 설치류 연구 PACAP neurite 결과, 마이그레이션, 및 모두는 hindbrain 및 개16,22, 확산 통제 등 광범위 한 무대-종속 발달 효과 발견 29,,3031. 아타만 외. 에 의해 최근 연구 인간 경작 (2016)를 사용 하 여 태아의 대뇌 피 질의 세포 신경 활동은 인간의 신경 개발32에서 펩 티 드의 중요성을 나타내는 PACAP 유전자 발현 증가 유도 나타냅니다. 2 제어 및 PACAP neurites의 비율을 표시 하는 사실, (3 nM) 영향을 받지 않는 개인에서 파생 된 수많은 라인 사이 조건. 표 2에서 보듯이 다른 클론 같은 개인 및 다른 개인에서 파생 된 NPCs에서에서 파생 된 셀 라인에 표현 neurites의 비율에서 몇 가지 변화가 있다. 그러나, 이러한 영향을 받지 않는 개인에 있는 증가 분석 실험의 재현성을 나타내는 PACAP에 neurite 결과.

Neurite 결과, 같은 셀 마이그레이션 중요 한 개발 프로세스는 적절 한 연결, 조직, 및 두뇌의 배선을 위해 필수적 이다. Neurospheres-셀 Npc (그림 12) 사이 접촉을 유지 하는 전형적인 고밀도 상태에서 NPC 마이그레이션 공부 수 있습니다. 발달 관련 요소 마이그레이션에 미치는 영향을 평가 하기 위해 neurospheres에 테스트할 수 있습니다. 예를 들어 그림 12 보여줍니다 PACAP (10 nM) NPCs의 증가.

Figure 1
그림 1: 통로 3에서 Npc. P3에 Npc 익스프레스 (A) 만능 전사 인자, SOX2 등 여러 무대 전용 마커 (B) 녹음 방송 요인 개 NPCs, PAX6, 특정 NPC cytoskeletal 단백질 NESTIN 및. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: S 단계 항목 분석 결과의 도식. S 단계 항목 분석 결과 연대기 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: S-단계 항목 측정. (A) 단계 이미지 보여주는 단계-다크 라이브 셀 (흰색 화살표), 한 단계 밝은 죽은 세포 (화이트 스타)와 단계 밝은 라이브 셀 (녹색 화살표). (B) 형광 DAPI 라이브 셀 (흰색과 녹색 화살표)에 죽은 세포 (화이트 스타)에 응축된 핵 그리고 큰 핵을 보여주는 얼룩. (C) 형광 듀 이미지 보여주는 밝은 듀 긍정적인 핵 (빨간색 화살표)과 얼룩 덜 룩 한 듀 긍정적인 핵 (레드 스타). (D) 단계 고 형광 병합의 이미지 3A-3 C.

Figure 4
그림 4: neurites 식별. 단계-이미지 프로세스 NPCs. (A) A 셀 > 길이, 따라서 회의 neurite에 대 한 기준에서 2 셀 시체. (B) 프로세스와 셀 < 길이에 따라서 하지 간주 neurite-베어링 2 셀 시체. (C) 와 2 프로세스-더 과정 neurite 기준에 대 한 평가 셀을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 마이그레이션 분석 결과 대 한 neurospheres 선택. (A) 단계 대조 이미지 24 h.에서 neurospheres의 대표적인 분야의 분야 모든 100 μ m 이며, 따라서, 마이그레이션 분석 결과 대 한 수집 하지 않습니다. (B) 단계 대비 이미지 72 h에 neurospheres의 대표적인 분야입니다. 모든 분야 100 μ m ± 20 µ m 범위, 수집 마이그레이션 분석 결과 대 한 준비를 나타내는 있습니다.

Figure 6
그림 6: 마이그레이션 측정. (A)는 대표적인 neurosphere의 위상 대비 이미지. (B) 파란색 윤곽선 추적 총 neurosphere 지역 측정을 표시 합니다. 레드 대량 내부 셀의 영역을 측정 하는 데 사용 하는 윤곽선을 표시 합니다. 마이그레이션 총 neurosphere 영역 내 셀 대용량 영역으로 정의 됩니다. 참고, 흰 동그라미 표시 연속 카펫에 있지 않은 셀이이 셀 마이그레이션 윤곽에서 제외 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: DNA 합성 평가. 48 h에 FGF 취급 NPCs. FGF (10 ng/mL) 증가 DNA 합성 대 제어의 대표적인 결과 (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 웰 스/그룹/실험; 3 실험). 오차 막대 표시 SEM.

Figure 8
그림 8: S 단계를 입력 하면 셀의 비율. NPC 셀 (A) 단계 이미지 FGF (10 ng/mL) 대우 미디어 대 컨트롤에 48 h. 인세트 대표 셀 제어 및 10 ng/mL FGF 미디어에서 형광 듀 마커 얼룩의 더 높은 확대 이미지에 대 한 인 큐베이 팅. 빨간색 화살표 셀 듀 긍정적이 고 흰색 화살표 표시 부정적인 듀 셀을 나타냅니다. FGF 대 제어의 대표적인 결과의 (B) 그래프 (10 ng/mL)에서 48 h NPCs FGF 증가 S 단계 항목 처리 (p ≤1 x 10-3). (n = 2-4 요리/그룹/실험; 3 실험). 오차 막대 표시 SEM.

Figure 9
그림 9: 2, 4, 6 일에 세포를 열거. (A) 2, 4, 및 6 일 셀 제어와 FGF (10 ng/mL) 대우 미디어에 이미지를 단계. (B) 그래프의 대표적인 결과; 참고 해당 FGF (10 ng/mL) 증가 하지 않습니다 항상 핸드폰 번호 2 일에는 4 ~ 6 일에 증가 명백한 (p 0.05). (n = 2-4 웰 스/그룹/실험; 3 실험). 오차 막대 표시 SEM.

Figure 10
그림 10: 밀도가 낮은 조건에서 Npc의. (A, C, E) 낮은 조건에 Npc 이미지 단계. (B) Npc 익스프레스 줄기/뿌리 세포 마커 NESTIN (녹색), SOX2 (빨간색), 및 핵 마커 DAPI (파란색). (D) PAX6 (빨강), DAPI (파란색). (F) 에 저밀도, 셀 neurites (흰색 화살표)도 확장 표현 미 숙 신경 마커 TUJ1 (녹색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 11
그림 11: Neurite 결과. (A) NPCs의 위상 대비 이미지. 검은 화살표 neurites 셀을 가리킵니다. Neuropeptide PACAP의 (B) 추가 (3 nM) neurites 포함 된 셀의 비율을 증가 (p ≤1 x 10-2). (C) 제어와 3 nM PACAP 포함 미디어에 neurite 결과의 정량화. (n = 2-4 요리/그룹/실험; 3 실험). 오차 막대 표시 SEM.

Figure 12
그림 12: Neurosphere 마이그레이션. (A) neurospheres 이미지를 단계. (B) PACAP 추가 (10 nM) neurosphere 셀 마이그레이션 (p ≤ 10-2) 증가 세포 이동의 (C) 정량화. (n = 20 분야/그룹/실험, 3 실험). 오차 막대 표시 SEM.

미디어
환자 # 복제 CTRL 키 FGF
(10 ng/mL)
환자 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
환자 2 1 7,664 14,060
2 16,573 30,087

표 1: DNA 합성. DNA 합성 값 (CPMs) NPCs의 요약 두 영향을 받지 않는 개인 당 두 iPSC 클론에서 파생.

미디어
환자 # 복제 CTRL 키 PACAP
(3 nM)
환자 1 1 13.60% 18.10%
2 16.50% 21.10%
환자 2 1 8.90% 14.10%
2 14.20% 21.10%

표 2: Neurites 포함 된 셀의 비율. NPCs neurites 베어링 셀의 비율의 요약 두 영향을 받지 않는 개인 당 두 iPSC 클론에서 파생.

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Discussion

여기에 제시 된 프로토콜 기본 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하 고 성장 인자와 약물 hiPSC 파생 신경 선구자 세포를 사용 하 여 테스트를 신속 하 고 간단한 방법을 설명 합니다. hiPSC 기술 사는 영향을 받는 개인에서 인간의 신경 세포를 전례 없는 접근 제공 하 여 neurodevelopmental 질병의 병 인 연구를 혁명을 했다. 실제로, 레트 증후군, 티 모 증후군, 연약한 X 증후군을 포함 한 neurodevelopmental 장애의 수많은 hiPSC 연구 되었습니다 및 정신 분열 증, 질병 특정 차 모 수석에서 출토 있다, synapses, 그리고 신경 기능4,33,,3435,36. 이러한 연구의 대부분 주로에 초점을 맞춘 말기 분화, 포스트 mitotic 신경 하지만 상대적으로 기능적으로 미숙한 간주 제외 이전 neurodevelopmental의 연구는 이러한 프로세스를 확산 및 마이그레이션. 이러한 후자의 프로세스 neurodevelopmental 장애의 병 인에 무 겁 게 연루 되었습니다 및 영장 더 공부8,,910,,1112 , 35 , 37 , 38. NPCs의 사용 또한 같은 미 숙 축 삭/모 수석 (neurites)를 확장 하는 세포의 기능이 더 성숙 프로세스를 조사 하는 기회를 제공 하면서 이러한 중요 한 이전 이벤트를 공부 하도록 해줍니다. 또한,이 분석 실험의 일부 또한 공부 neurite 길이, 번호, 및 분기 셀에 의해 여행 먼 거리 등 다른 매개 변수를 확장할 수 있습니다.

일부 최신 연구 이전 발달 이벤트 "미니 뇌 시스템" 3 차원에서 공부 organoid 모델 시스템 사용1,,3940. 그러나, 이러한 organoid 시스템에도 증식 전조 세포 인구 제한 및 조기 성숙 이며 마이그레이션15,39공부 하기 곤란 하다. 제한 외에 연구, 발달 현상 이전 활용의 말기 분화 신경 또는 organoids는 종종 시간이 걸리는, 비용이 많이 드는, 그리고 시스템에서 평가 될 수 있는 변수의 수를 제한. 이것은 신경 세포를 만들기 때문에 고 organoids 바이러스 유도 프로토콜, 특수 인큐베이터 및 장비, 시간, 그리고 미디어의 여러 주를 요구할 수 있습니다. 대조적으로, (이 아래 나중 제시 된다) DNA 종합 분석 결과의 예외와 함께이 프로토콜 neurodevelopmental 장애의 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다 하 고 광범위 한 훈련, 비용이 많이 드는 도구 및 리소스, 또는 소프트웨어를 요구 하지 않습니다. 편리 하 고 상대적으로 저렴 한 비용으로 이러한 분석 실험에서 약물 및 성장 요인 추가 neurodevelopmental 및 정신병 질환에 대 한 다양 한 잠재적인 치료를 테스트 하려면이 프로토콜 유용한 높은 처리량 기술을 확인 합니다. 또한, 성장 인자 법을 통해 세포 신호 경로 정의 때문에 그들은 또한 사용할 수 있습니다 도구로 신호 시스템 개발에 결함 가능성에 대 한 테스트. 마지막으로 NPCs 증식 자체 갱신 인구 때문에, 세포의 대량 생산 될 수 있다 고 cryopreserved Ipsc는 NPCs에 만들 때마다 필요 없이 효율적으로 실시 될 수 있도록 실험.

성공적으로이 분석, 그것은 다음 중요 한 단계를 주의 하는 것이 중요입니다. 이 프로토콜 유지 보수 및 확장 실험 대에 대 한 서로 다른 조건에서 Npc를 배치합니다. 특히, NPCs 유도 된다, 성장, 및 신경 유도 보충 (NIS)를 포함 하는 매체에 passaged 우리의 실험 조건 줄일 보충 기회를 다시 추가할 수 있도록 제한 환경에서 셀이 70% 그리고 중요 한 성장 요인의 효과 테스트. 둘째, NPCs의 통로를 추적 필수적 이다. 우리의 연구에 P3-P8에서에서 셀 라인의 통과 번호를 제한 일반적으로 있다. 구절에서 P3, 이전의 일부 라인 표현 하지 않습니다 튼튼하게 특성 마커. 높은 구절에서 일부 셀 라인 매우 일관 된 성장 속도 또는 응답 성장 요인, 동안 다른 셀 라인 세포 성장 또는 응답에 있는 극적인 변화 할 수 있습니다. 아니라 정기적으로 보고, 비록 우리가, 그리고 많은 다른 높은 구절에서 증식 속도에이 극적인 변화를 경험 했다. 이유 이것은 불확실 하지만이 변화는 NPCs. 제한 된 자기 갱신 기능 반영 될 수 있습니다 정의 확산 속도 변경 확장된 구절에 왜, 어떻게 수 있습니다 개발 및 질병 병 인에 대 한 통찰력을 제공 하지만 추가 연구 해야 할 필요 합니다. 마지막으로, 우리가 사용 하는 상용 신경 유도 프로토콜 얻을 수 있습니다 때로는 품질 신경 줄기 세포, 특히 있다면 시작 Ipsc 높은 품질의 (즉,., 차별화 셀 셀 식민지의 국경에 있다 이상이 karyotype). 경우에 따라 셀 형태를 왜곡 하 고 표현의 표식 표시 되지 않습니다. 이러한 문화를 사용 하지 마십시오. 다른 경우에 Npc 아첨 "오염 물질" 세포로, 실험에서 사용 하기 전에 거의 순수한 NPC 인구를 차동 셀 분리 솔루션 치료를 사용 하 여 제거 될 수 있는 성장. 높은-품질 NPCs가 적절 한 결과 위해 중요 한: 높은 품질과 낮은 NPCs의 이미지를 찾을 수 있는 신경 유도 프로토콜에 대 한 링크에 대 한 자료와 장비 섹션 참조.

제시 하는 분석 실험의 각, 그것은 다음 중요 한 단계, 잠재적인 오류 및 문제 해결 팁을 참고 하는 것이 중요입니다. 휴대폰 번호, DNA 합성, 그리고 neurite 분석 실험에 대 한 단일 세포를 해리 하 고 수 풀, 아니라 이것으로 기울일 수 DNA 합성, 셀 카운트 측정값과 neurite 동작 플레이트 셀에 중요 하다. 세포의 덩어리는 도금 하지 있도록 P1000, 접시, 슬라이드에 포함 된 셀의 작은 볼륨을 시음 하 고 셀 덩어리 존재 확인. 덩어리는 언급 하는 경우 위쪽 및 아래쪽을 수동으로 도금 하기 전에 떨어져 덩어리 셀 플라스틱. DNA 합성 및 셀 번호 분석 결과, 셀 계산 및 분석을 위한 효소 해제 됩니다. 그것은 시각적으로 셀 완전히 정확한 카운트를 문화 선박에서 고 효소 인큐베이션 장기간 사용할 수 있는 필요한 경우를 확인 하는 중요 한. 낮은 셀 수 또는 DNA 종합 분석 결과 대 한 낮은 하락과, 세포는 높은 초기 밀도, 방사성 tritiated [3H]에서 도금 될 수 있다-티 미 딘은 두 배 시간 (2 대신 4 시간), 또는 tritiated [3H]에 대 한 추가할 수 있습니다-티 미 딘 농도 두 배가 될 수 있습니다. Neurite 분석 결과 대 한 초기 도금 밀도 증가 셀을 접촉 위험 없이 두 배로 수 있습니다. 요리를 통해 세포의 분포에 주의 및 1 cm 행 접시의 각 부분 샘플링 되는. Neurite 비율 48 h에 너무 낮은 경우, 분석 결과 6 일 또는 코팅 기판 형식까지 연장 될 수 있습니다 또는 농도 홍보 neurites의 큰 비율을 변경할 수 있습니다. 그러나, 그것은 코팅 시간과 우리는 프로토콜에서 제시 하는 방법을 최적의 neurite 결과, 세포 건강에 대 한 수많은 다른 기질, 기질 농도, 그리고 코팅 번 테스트 후 선택 했다 하는 것이 중요. Neurosphere 분석 결과 대 한 작은 pipettors (P20, p 200)의 사용 전단 및 파손 더 큰 분야의 발생할 수 있습니다. 따라서, 그것을 부드럽게 하 고는 P1000 또는 혈 청 학적인 피 펫으로 이루어집니다 pipetting 필수적입니다. neurospheres 산에 대 한 낮은 속도 (300 x g 대신 100 x g) 또한 neurosphere 분리를 방지 하기 위해 권장 됩니다. 구형 도금 동안 구형-구형 연락처 마이그레이션 영향을 미칠 수로 분야 떨어져 간격 적절 하 게는 확인 합니다. 마이그레이션이 너무 빠르거나 너무 느린 경우, 보육 시간 감소 하거나 각각 증가 될 수 있습니다. 코팅 기판 마이그레이션 속도 변경 하려면 변경할 수 있습니다.

사용 기법, 간단한 빠르고 neurodevelopmental 장애의 연구에 적용 가능한 동안, 특정 제한이 있습니다. 한, 많은 분석 발표 (셀 번호 분석 결과, neurite 분석 결과, 마이그레이션 분석 결과)의 주관적인 결정을 내릴 수 사관 요구 (예를 들어,이 neurite? 이 셀 죽)? 잠재적으로 탐정 바이어스 및 낮은 재현성을 선도. 그러나, 실시 맹인 분석과 분석 결과, 내 각 결정에 대 한 엄격한 기준을 설정 방법에서 볼 수 있듯이 이러한 편견 개량 수 있습니다. 마찬가지로, 이러한 분석 수동 측정 및 조사 시간과 노동 집약 될 수 있는 필요 합니다. 그러나, 실험실 장비 및 기술 리소스,이 분석 실험 수 수 가속화 자동된 셀 카운터 및 자동된 측정41,42를 수행할 수 있는 프로그램의 사용. DNA 종합 분석 결과 경우이 메서드는 우리의 세포 수확 및 섬광 기계에 (재료 및 장비 참조); 그러나, 다른 사용 가능한 모델 및 Omnifilter-95 셀 수확기 등 동일한 정보를 얻을 하는 데 사용할 수 있는 방법 있다. 일부 기관에 대 한 방사성 자원의 사용 가능한 않을 수 있습니다. 이 경우에, 형광 티 미 딘 아날로그, 듀, 형광 microplate 리더에 분석 등을 사용 하 여 다른 방법 DNA 합성44의 대량 분석에 동일한 정보의 수집에 대 한 수 있습니다.

우리의 낮은 문화 시스템 개별 셀 또는 작은 덩어리, 개발 신경 관에서 Npc의 밀도가 포장된 자연 다른 조건으로 NPCs를 구분 합니다. 그러나, NPCs는 건강 하 고 표현 적절 한 표식 (그림 1, 그림 10). 또한, 마우스와 쥐 대뇌 피 질의 문화를 보여주는 우리의 이전 연구 결과 생체 외에서 문화, 병렬 그리고 vivo에서 모델 나타냅니다 유틸리티와이 사용 하 여 값 접근16,,1718 , 19 , 24. 또한,이 시스템은 세포의 성숙에 대 한 이해와 셀 하위 인구를 공부 하는 강력한 접근 방식을 제공. 예를 들어 immunohistochemistry neurite 분석 결과 특정 신경 세포 유형과 neurite 연장 결정 하에 수행할 수 있습니다. 궁극적으로, 몇 가지 한계에도 불구 하 고이 독특한 프로토콜 neurodevelopmental 장애를 연구 하, 강력한, 간단 하 고 빠른 방법을 제공 합니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품은 의료 연구 및 치료의 자폐증 (CAUT13APS010;에 대 한 뉴저지 주지사의 위원회에 의해 지원 되었다 CAUT14APL031; CAUT15APL041), 낸시 Lurie 표시 Mindworks 자선 리드 신뢰, 가족 재단과 큰 보스턴과 뉴저지의 유태인 공동체 기초.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

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