Hurtig påvisning af udviklingsforstyrrelser fænotyper i menneskelige neurale forløber celler (NPC)

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Neuro-udviklingsmæssige processer såsom spredning, migration og neurite udvækst er ofte desorienterede i neuropsykiatriske sygdomme. Dermed, vi præsenterer protokoller for at hurtigt og reproducerbar vurdere disse Neuro-udviklingsmæssige processer i menneskelig iPSC-afledte NPCs. Disse protokoller tillader også vurdering af virkningerne af relevante vækstfaktorer og therapeutics på NPC udvikling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Menneskelige hjerne udvikling skrider frem gennem en serie af netop orkestreret processer, med tidligere stadier fornem spredning, migration og neurite udvækst; og senere stadier karakteriseret ved axon/dendrit udvækst og synapse dannelse. I nervesystemets udvikling, er ofte en eller flere af disse processer forstyrret, fører til abnormiteter i hjernen dannelsen og funktionen. Med fremkomsten af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) teknologi har forskere nu en rigelig forsyning af humane celler, der kan opdeles i stort set enhver celletype, herunder neuroner. Disse celler kan bruges til at studere både normal hjernens udvikling og sygdom patogenese. Et antal protokoller ved hjælp af hiPSCs at modellere neuropsykiatriske sygdomme brug terminalt differentieret neuroner eller brug 3D kultur systemer betegnes organoids. Mens disse metoder har vist sig uvurderlige i at studere menneskelig sygdom patogenese, er der nogle ulemper. Differentiering af hiPSCs i neuroner og generation af organoids er lange og dyre processer, der kan påvirke antallet af eksperimenter og variabler, der kan vurderes. Hertil kommer, mens post mitotiske neuroner og organoids giver mulighed for undersøgelse af sygdom-relaterede processer, herunder dendrit udvækst og synaptogenesis, udelukker de undersøgelse af tidligere processer som spredning og migration. I nervesystemets såsom autisme, rigelige genetiske og post mortem tyder på, mangler i tidlige udviklingsprocesser. Neurale forløber celler (NPC), en meget proliferativ celle population, kan være en velegnet model til at stille spørgsmål om ontogenetiske processer og sygdom indledning. Vi udvider nu metoder lært af at studere udvikling i mus og rotter kortikale kulturer til menneskelige NPCs. Brug af NPCs tillader os at undersøge sygdomsrelaterede fænotyper og definere hvordan forskellige variabler (fx, vækstfaktorer, narkotika) indvirkning udviklingsmæssige processer herunder spredning, migrering og differentiering i kun et par dage. I sidste ende, dette værktøjssæt kan bruges i en reproducerbar og høj overførselshastighed måde for at identificere sygdoms-specifikke mekanismer og fænotyper i nervesystemets udvikling.

Introduction

Brug af enklere organismer og musemodeller har belyst mekanismerne af grundlæggende hjernens udvikling samt sygdom patogenese. Trods disse fremskridt stadig ætiologien af mange neuropsykiatriske lidelser undvigende fordi ikke alle resultater i enklere organismer er direkte relevante for komplekse aspekter af sygdomme hos mennesker. Yderligere, den større kompleksitet af den menneskelige hjerne ofte gør det vanskeligt at model menneskelig udvikling og lidelser i dyr. Med evolution og udvikling af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) teknologi, kan somatiske celler omprogrammeres til stamceller og derefter opdeles i neuronale celler til at studere sygdomme hos mennesker. Fremskridt i hiPSCs og "omic" teknologier (genomforskning, transcriptomics, proteomics, metabolomics) lover at revolutionere forståelse af menneskelige hjerne udvikling. Disse teknologier nu gøre muligt et "præcision medicin" tilgang til karakterisering af neuropsykiatriske sygdomme på et sag til sag grundlag.

Den nuværende hæfteklamme i feltet hiPSC sygdom-modellering er at differentiere celler i specifikke neuronal undertyper i en éncellelag eller bruge et 3D kultur system kaldet en organoid til at sammenfatte aspekter af hjernens udvikling1,2, 3. Disse systemer har været utrolig værdifuld i at undersøge og afdække unikke aspekter af menneskelig udvikling og sygdom4,5,6,7. Men både neuronal kulturer og organoids kræver ofte overalt fra uger til måneder i kultur før de er klar til at studere. Tidskrævende arten af disse protokoller og de nødvendige midler til at opretholde disse kultur systemer ofte begrænse antallet af eksperimenter, der kan udføres, og antallet af variabler (som vækstfaktorer eller narkotika), der kan testes. Desuden, mange undersøgelser bruger post mitotiske neuroner og organoids har fokuseret på processer såsom dendrit udvækst eller synapse dannelse, som opstår senere i udvikling. Mens disse processer har været impliceret i patologi af udviklingsforstyrrelser som autisme og skizofreni, er tidligere udviklingsmæssige hændelser, der indtræffer før endelige neuronal differentiering også vigtige for sygdom patogenese8 ,9,10,11,12,13. Ja, de seneste genomisk undersøgelser viser, at de midten af fostrets periode, som består af spredning, proces udvækst og migration, er særlig vigtigt i autisme patogenese11,14. Derfor er det vigtigt at studere neurale stamceller og stamfader cellepopulationer til bedre at forstå disse tidligere processer. Organoid systemer, der er anset for bedre at kunne sammenfatte menneskelige hjerne udvikling på grund af deres 3D karakter og organiseret struktur, indeholder en stamfader pool, der har været udnyttet til at studere nogle af disse tidligere hændelser. Men stamfader befolkningen i organoids er ofte sparsom og mere som radial gliaceller end neurale stamceller eller stamfader celler5,15. Det ville således være gavnligt at have en høj overførselshastighed metode til at studere tidlige stadier af nervesystemets udvikling i befolkningens aktivt proliferativ celle.

I laboratoriet, har vi lavet en protokol, der bruger hiPSC-afledte neurale forløber celler (NPC), en blandet befolkning af neurale stamceller og stamceller, der er meget proliferativ, at studere Neuro-udviklingsmæssige processer såsom spredning, celle migration, og indledende proces (neurite) forlængelse. Disse undersøgelser blev udviklet fra teknikker, der anvendes i vores lab i årtier at kunne studere nervesystemets udvikling i rotter og mus kortikale kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Vigtigere, blev det også vist sig at fænotyper og regulerende signaler defineret i rotter og mus kultur systemer er meget intelligent af mekanismer, der er aktive i vivo, der angiver værdien af disse teknikker16, 17,18,19,24. Efter indledende differentiering af hiPSCs til NPCs, disse metoder giver os mulighed at studere vitale udviklingsmæssige processer i løbet af få dage. Disse metoder har mange fordele: (1) de kræver lidt avanceret udstyr og er nem at implementere, (2) talrige eksperimentelle replikater kan gennemføres i en kort periode, giver mulighed for hurtig bekræftelse af reproducerbarhed af resultaterne, og (3) kultur variabler som belægning matricer, virkningerne af vækstfaktorer og aktivitet af narkotika kan testes, hurtigt og omkostningseffektivt. Desuden, vi drage fordel af ekstracellulære vækstfaktorer veletableret rolle som kritiske regulatorer af forskellige udviklingsprocesser. NPCs var udsat for at vælge udviklingsmæssige signaler, der direkte stimulerer begivenheder som spredning, neurite udvækst og celle migration, og har fundet de forbedre evnen til at identificere mangler, der ikke er synlige i kontrol betingelser19 , 25 , 26 , 27 , 28. på samme måde at lette vurderingen af lægemidler giver en kraftfuld avenue for at vedtage præcision medicin teknikker for at teste effektiviteten af forskellige terapeutiske indgreb. Således, denne protokol giver en høj overførselshastighed, reproducerbar, og enkel metode til at studere tidlige hjernens udvikling, sygdom patogenese og de potentielle gavnlige effekter af vækstfaktorer og narkotika på udviklingsforstyrrelser fænotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sikkerhedsprocedurer og biosikkerhed kabinet vedligeholdelse

  1. Biosikkerhed niveau-2 (BSL-2) sikkerhedsprocedurer
    1. Følg retningslinjerne for institutionens arbejde med BSL-2 materialer. Bortskaffe BSL-2 materialer ifølge institutionens praksis. Angive lokaler og udstyr, der bruges til BSL-2 materialer. Bære alle personlige værnemidler (PPE), herunder laboratoriekittel og handsker.
  2. Biosikkerhed kabinet vedligeholdelse
    1. Bruge en biosikkerhed kabinet certificeret til brug af BSL-2 niveau materialer.
    2. Drej på UV-lyset i biosikkerhed kabinet i mindst 15 min., og derefter spray overflader med 10% blegemiddelopløsning. Tillad blegemiddelopløsning at sidde i 15 min., tørre ned i kabinettet og tænde luftstrømmen før brug.
  3. Radioaktivt tritium [3H]-thymidine (Tritium) sikkerhedsprocedurer
    Bemærk: Tritium er en kategori 5 radioaktiv kilde, «den mest usandsynlige farlige» kategori. Følg institutionens retningslinjer for at arbejde med radioaktivitet. Nogle institutioner kan kræve certificeringer eller tillader for at håndtere tritium.
    1. Modtage undervisning fra institution om, hvordan man korrekt håndtere og bortskaffe tritium. Bortskaffelse af radioaktivt affald i passende beholdere, ifølge institutionens politik. Bære PPE, når du arbejder med tritium.

2. neurale induktion fra iPSCs

Bemærk: For at gøre NPCs, en let ændret udgave af en protokol, der ledsager et kommercielt tilgængelige neurale induktion kit blev fulgt. Sættet består af Neurobasal (NB) medier og et 50 x neurale induktion Supplement (NIS), som bruges til at gøre en 1 x neurale induktion Medium (NIM). NIS bruges også til at gøre 100% udvidelse Medium (Se afsnit 3.1). Et link til protokollen er fundet i materialer og udstyr samt referencer afsnit43.

  1. Passage iPSCs når de bliver 70-80% sammenflydende.
  2. Plade 300.000 iPSCs til 1 godt af en menneskelige stamceller-kvalificeret ekstracellulære matrix-efterligne gel (ECM-efterligne gel) belagt 6-godt plade med 2 mL af feeder-fri iPSC medium med 5 μM af ROCK hæmmer. Se punkt 3.2 instruktioner på belægning brønde med ECM-efterligne gel.
  3. En dag senere, fjerne iPSC medium + ROCK-hæmmer og vask iPSCs gang med 1 x PBS. Tilsættes 2 mL af NIM til iPSCs.
    Bemærk: 50 mL af NIM er lavet ved at tilføje 1 mL 50 x NIS og 250 µL (50 enheder/mL, 5 μl/mL) Penicillin/Streptomycin (P/S) til 49 mL af NB medier.
  4. Change media af neurale induktion hver 2 dage ved sugning brugt medium og erstatter med 2 mL af NIM indtil celler blive sammenflydende (omkring 4-5 dage). Ændre medierne dagligt, når cellerne er sammenflydende.
  5. Passage celler efter 7 dage i NIM og plade i en ECM-efterligne gel belagt 6-godt plade med 2 mL af 100% udvidelse Media og 5 μM ROCK inhibitor. Cellerne betragtes Passage 0 (P0) NPCs på dette punkt. Se punkt 3.1 nedenfor for instruktioner til at gøre 100% udvidelse medier.
  6. Passage celler ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i afsnit 3.4. Vent, indtil cellerne har nået P2 og er sammenflydende inden fællesinstansen for at plette for NPC markører og plating for eksperimenter (figur 1).

3. dyrkningsmedier, overfladebehandling og vedligeholdelse af NPCs

  1. Media forberedelse til vedligeholdelse af NPCs (100% udvidelse medier):
    1. Gøre 50 mL 100% udvidelse medier ved at kombinere 24,5 mL af DMEM/F12 med 24,5 mL NB.
    2. Der tilsættes 1 mL af 50 x NIS til DMEM/F12 + NB løsning. Tilføje 250 μL af P/S løsning til medier.
      Bemærk: Medier kan være køle (4 ° C) og bruges i op til 2 uger. Mindre mængder af medier kan gøres ved at justere mængderne af DMEM / F12 + NB + NIS ved hjælp af de samme forhold som for 50 mL volumen.
  2. Forberedelse af ECM-efterligne Gel belagt kultur plader for NPC vedligeholdelse
    1. Alikvot ECM-efterligne gel på diskenheden skulle lave 6 mL brugsopløsning. Beregn rumfanget af kigge på arket analyse certifikat siden ECM-efterligne gel fortyndingsfaktoren varierer fra batch til batch og lot til lot.
    2. Tø en ECM-efterligne gel alikvot på is og opløses i 6 mL af kolde DMEM/F12 medier.
    3. Der tilsættes 1 mL af ECM-efterligne gel/DMEM/F12 løsning til hver brønd med en 6 godt plade. Inkuber 6-godt plade med ECM-efterligne gel-løsning til 30 minutter ved 37 ° C.
    4. Opsug ECM-efterligne gelopløsning efter 30 min inkubation og erstatte med 100% udvidelse medier eller opbevares i køleskab plader (4 ° C, op til 1 uge) uden sugning ECM-efterligne gel-løsning.
  3. Vedligeholdelse af NPCs
    1. Plade NPCs med en tæthed på 1,5 millioner celler ind i en ECM-efterligne gel-belagte godt indeholdende 2 mL af 100% udvidelse medier.
    2. NPCs der inkuberes ved 37 ° C i et fugtigt miljø med 5% CO2.
    3. Tilføj 5 μM af ROCK hæmmer til medierne for NPCs på P3 eller lavere eller optøede NPCs at forhindre overdreven celledød. Ændre medier efter 24 timer til at fjerne ROCK inhibitor.
    4. Passage celler hver 4-9 dage, afhængig af hvornår de bliver sammenflydende. Celler betragtes sammenflydende, når de bliver et tæt pakket éncellelag der dækker hele bunden af skålen overfladen.
    5. Plade NPCs med en tæthed på 1-1,5 millioner celler pr. én brønd af et 6-godt plade (Se afsnit 3.4). Fjerne brugte medier hver 48 h og erstatte med 2 mL af 100% udvidelse medier.
  4. Løft, adskille, og Pellet NPCs for vedligeholdelse og/eller Plating for forsøgsbetingelser
    1. Opsug medium, vaske cellerne en gang med 1 x PBS. Opsug PBS og tilsæt 500 μL af 1 x celle detachement løsning i 1 godt af sammenflydende NPCs. Incubate i 10 minutter ved 37 ° C.
    2. Tilsæt 500 μL af stuetemperatur (RT) PBS og vask det godt med en P-1000 pipette for at sikre fjernelse af celler. Indsamle PBS løsning + celler ind i en 15 mL konisk rør. Vaske pladen igen med 1 mL PBS og tilføje flydende til røret.
    3. Spin cellerne ned ved 300 x g i 5 min til pellet.
    4. Fjern supernatanten fra celle pellet og genopslæmmes celler i 1-5 mL af pre varmede DMEM/F12 medier. Fortynd celler til en tæthed på 1 til 4 millioner celler/mL af medier. Kvantificere celler ved hjælp af en hemocytometer.
    5. Plade det krævede antal celler, specifikke for enten NPC vedligeholdelse (afsnit 3.3) eller den enkelte analyse gennemføres (Se efterfølgende afsnit for flere detaljer).
    6. Juster suspension cellevolumen med medierne, så mellem 15 til 100 μL af celler, der bruges til hver brønd/parabol. Denne lille plating volumen sikrer at der er endog celle fordeling og at vækstfaktorer, narkotika eller substrater i mediet ikke udvandes.
    7. Inkuber celler ved 37 ° C. Ændre media hver 48 h for NPC vedligeholdelse eller se de specifikke oplysninger om individuelle assays.
  5. Media forberedelse til eksperimentelle betingelser (30% udvidelse medier)
    1. Fortyndes 100% udvidelse medier af 70% (såkaldte 30% udvidelse) ved at tilføje 1:1 DMEM/F12 + NB løsning for at gøre medierne for forsøgsbetingelser.
    2. Gøre 20 mL 30% udvidelse medier ved at tilføje 6 mL 100% udvidelse medier og fortynding med 7 mL af NB og 7 mL DMEM/F12 medier. Der tilsættes 5 µL/mL af P/S løsning.
      Bemærk: Hvis 100% medier indeholder allerede P/S, derefter tilføje 5 μl/mL for kombineret DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 μl/mL) = 70 μL af P/S i stedet for 100µL.
    3. Tilføje belægning substrater og vækstfaktorer på ønskede koncentrationer til 30% udvidelse medier.

4. vurdering af DNA-syntese, S-fase indrejse og celle numre af NPCs

  1. Forberedelse til DNA-syntese, S-fase indrejse og celle nummer Assay
    1. Gøre en 1 mg/mL stamopløsning af poly-D-lysin (PDL) i dH2O og filter sterilisere. Fortyndes 1:10 i dH2O at gøre en 0,1 mg/mL PDL løsning og tilsæt 300 μl til hver brønd af en 24 godt plade eller 1 mL til en 35-mm ret. Inkuber i 20 min. på RT.
    2. Vaske PDL wells 3 gange for 5 min med dH2O. aspirat dH2O og tilføje 300 μL/brønd eller 1 mL/fad laminin (5 μg/mL) fortyndet i 1 x PBS. Dække plader med parafilm og holde i et sterilt, biosikkerhed kabinet overnatning på RT (12-24 h).
    3. Forberede 30% udvidelse Media (Se afsnit 3.5) efter 12-24 h. Tilføj køretøjer, vækstfaktorer eller narkotika af interesse i den ønskede koncentration i mængder, der er mindre end 10% af den samlede løsning til at undgå fortynding NIS i 30% udvidelse Medium.
    4. Vask hver godt af 24-godt plade to gange med 1 x PBS (5 min). Opsug 1 x PBS og tilføje 450 μL af medier (uden eller med narkotika/vækstfaktorer). Inkuber plade ved 37 ° C i mindst 15 min før plating celler.
    5. Til hvert eksperiment, oprette 2-3 brønde eller retter pr. betingelse.
    6. Plade NPCs (Se afsnit 3.4):
    7. NPC DNA syntese Assay: 100.000 celler/brønd i en 24 godt plade
    8. S-fase Entry: 500.000 celler/35 mm parabol
    9. Celle nummer Assay: 50.000 celler/brønd i en 24-godt plade
  2. Neurale forløber celle DNA syntese Assay
    1. Plade 100.000 celler/brønd i en 24-godt plade og vurdere i tre eksemplarer/tilstand.
    2. Tilføje radioaktivt, tritiumholdigt [3H]-thymidine til næringssubstratet (1,5 μCi/mL) i hver brønd efter 46 h i kultur. Inkuber celler ved 37 ° C i 2 timer.
      Bemærk: Når du bruger radioaktive materialer, modtage undervisning fra din institution, Følg radioaktivitet sikkerhed protokoller og bortskaffe radioaktive materialer i de behørigt udpegede affald beholdere.
    3. Fjerne og korrekt bortskaffe radioaktive medier efter 2 h. tilføje 300 μL pre varmede 0,25% trypsin-EDTA (0,5 mM) til hver brønd og Inkuber i 20 min ved 37 ° C.
    4. Drej på celle mejetærsker (Se materialer og udstyr afsnit) og pumpen og sikre, at pumpetryk er under 200 PSI. Placer filtrerpapir gennem rummet i celle mejetærsker og rive den højre hjørne for at markere papirretning.
    5. Placer indsamling rør af celle mejetærsker i en tom "blank" bakke og tryk på prewash at fugte filtrerpapir. Placer indsamling rør i stikprøven brønde og køre (start).
    6. Når cellen harvester er færdig med indsamling af prøver, løfte klemme og advance filtrerpapir gentage for alle prøve sæt. Altid prewash i en tom, "Tom" plade.
    7. Tørt filtrerpapir under en lyskilde og oprette tilsvarende hætteglas i en bakke. Punch ud papir chads i hætteglas og tilsættes 2 mL flydende scintillation cocktail til hvert hætteglas. Cap og etiket hætteglas.
    8. Inkuber hætteglas i flydende scintillation cocktail i mindst 1 time før du læser tæller pr. minut (CPM'er) på en scintillation maskine.
  3. NPC S-fase post Assay
    1. Se afsnit 3.4 for trin til at løfte, adskille, pellet og genopslæmmes celler.
    2. Plade 500.000 celler pr. parabol i 35 mm retter tilberedt i afsnit 4.1, kun 1 fad/betingelse for dette trin.
    3. Agitere retter frem og tilbage i alle retninger for at sikre ligelig fordeling af celler. Inkuber celler ved 37 ° C i 46 h.
    4. Forberede tre 35 mm plader overtrukket med PDL/Laminin pr. tilstand efter 24 timer. For eksempel, hvis der er en 35 mm skål af 30% udvidelse medier og en 35 mm skål af 30% udvidelse medier + FGF (10 ng/mL) derefter pels 6 PDL/Laminin plader til brug på den næste dag.
    5. Tilføje 2 μl/mL 5 mm EdU til kulturer efter 46 h. Incubate i 2 timer.
    6. Adskille og sammenpresse cellerne (Se afsnit 3.4). Genopslæmmes celle pellet i 3 mL 30% udvidelse medier eller 3 mL 30% udvidelse medier + ønskede vækstfaktorer/narkotika.
    7. Plade 1 mL pr parabol på forhånd belagte PDL/Laminin retter. Agitere retter frem og tilbage i alle retninger for at sikre ligelig fordeling af celler. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer til at tillade cellerne til at holde sig til fadet. Se figur 2 for en forenklet tidslinje.
  4. S-fase post analyse
    1. Lave retter med iskold 4% PARAFORMALDEHYD (PFA i 1 x PBS) i 20 min. Derefter, vaske op 3 gange i 5 min. med 1 x PBS.
    2. Der tilsættes 1 mL af 1 x PBS med 0,05% natriumazid at undgå bakterie-og svampevækst. Celler kan opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder hvis retter (forseglet med parafilm) holdes i PBS + natrium indeholder løsning, selv om ikke alle immunologiske antigener er godt bevaret efter lange forsinkelser i analysen.
    3. Assay celler ved hjælp af en kommerciel EdU reaktion kit (Se producentens protokol). Pletten celler ved hjælp af DAPI eller en anden nukleare markør, og billedet ved hjælp af Fluorescens mikroskopi.
    4. Vurdere andelen af EdU positive celler over samlede levende celler (cellen total antal) blind i 10 systematisk tilfældige felter (10 x). Medtag ikke døde celler i analysen.
    5. Udnytte både fase kontrast billeder og fluorescerende billeder til at bestemme positive EdU farvning og til at fastslå, hvilke celler der er døde eller levende (figur 3).
    6. Tælle alle celler, der har både glat og endda cellemembranen i fase kontrastindstillinger, og en stor fragmenteret kerne af fluorescerende DAPI nukleare pletten, da disse celler er live (figur 3A-B).
    7. Udelukke alle celler, der er fase lyse, har en brudt ujævn cellemembranen og har en lille, kondenseret kerne som visualiseret ved DAPI fluorescerende imaging, da disse celler er døde (figur 3A-B). Vurdere levende celler for udtryk for EdU ved at identificere celler, der har lyse fluorescerende EdU pletten dækker hele kernen eller plettet fluorescerende farvning i cellekernen (figur 3 c).
  5. NPC celle nummer Assay
    1. Efter 2 dage i kultur, etiket og forberede 1,5 mL microcentrifuge rør og 0,5 mL microcentrifuge rør. I hver 0,5 mL tube, tilsættes 5 μl af Trypan blå.
    2. Til hver brønd med en 24 godt plade, fjerne medium og tilføje 200 μl 1 x celle detachement løsning og plads i rugemaskine for 10-15 min.
    3. Efter den tildelte tid, når cellerne har ophævet, tilsæt den ønskede mængde 1 x PBS til hver brønd.
      Bemærk: Typisk på dag 2, tilføje 300 μL 1 x PBS til godt indeholdende cellerne plus 200 μl af detachment løsningen, for en samlet maengde paa 500 μL. Med ekstra kultur inkubationstiden, som cellerne bliver mere sammenflydende, øge fortyndingsvolumen som nødvendigt. For eksempel på dag 4, tilsæt 500 μL af 1 x PBS og på dag 6, tilføje 800 μL 1 x PBS. Samlede diskenheder bliver 700 μL og 1 mL, henholdsvis.
    4. Bruger en P-1000 pipette, pipetteres op og ned i hver godt 4 til 5 gange for at fjerne celler. Undersøge plade under et mikroskop for at sikre, at alle celler er skilt. Overfør celler til 1,5 mL rør.
    5. Invertere 1,5 mL rør med fortyndet celler 2 til 3 gange. Derefter tage en 50 μL alikvot af celler fra midten af røret og tilføje til 0,5 mL rør med Trypan blå (Se 4.5.1).
    6. Pipette celle løsning op og ned 2 til 3 gange. Føje celler til hemocytometer og analysere straks. Venter længere end 10 min kan øge celledød eller tilstedeværelsen af celler, der har overtaget Trypan blå.
    7. Forsigtigt tilføje 10 µL af celle + Trypan blå blanding til hver side af hemocytometer til at udføre Repliker tæller. Tælle celler ved hjælp af fase kontrast mikroskop. Tæl ikke med døde celler eller de mørke blå celler, der har overtaget Trypan blå.
    8. For at opnå den samlede celle nummer, brug gennemsnitlige celle nummer tælles fra 4 hjørner af hemocytometer og anvende følgende ligning:
      Betyde cell antal x media volumen (mL) x 10,000 = samlede celle nummer/brønd
    9. Opsug og Gentag proceduren på resterende brønde. Ændre medier på de celler, der ikke er regnes, hver 48 h. Repeat assay på dage 4 & 6.

5. NPC Neurite analyse

  1. Forberedelse af retter og medier for Neurite analyse
    1. Gøre en 1 mg/mL stamopløsning af poly-d-lysin (PDL) i dH2O og filter sterilisere. Fortyndes 1:10 i dH2O til at gøre en 0,1 mg/mL PDL løsning og tilsættes 1 mL til hver 35-mm ret. Inkuber i 20 min. på RT.
    2. I mellemtiden forbereder 30% udvidelse Media (Se afsnit 3.5) og tilføje 5 μg/mL (5 µL/mL) af fibronektin løsning (1 mg/mL stock) til medierne.
    3. Når medierne er forberedt, tilføje køretøjer, vækstfaktorer eller narkotika af interesse på ønskede koncentrationer.
      Bemærk: Det er bedst at tilføje køretøj, vækstfaktorer eller narkotika, ved mængder < 10% af den samlede løsning til at undgå at udvande fibronektin og andre komponenter i 30% udvidelse medium.
    4. Efter 20 min, vaske PDL op 3 gange for 5 min med dH2O at fjerne overskydende PDL. Sikre retter er tørre før du tilføjer medier.
    5. Sted 1 mL af medier (med eller uden narkotika/vækstfaktorer) + fibronektin løsning i hver PDL belagt parabol.
    6. Inkuber retter ved 37 ° C i mindst 30 min før plating celler for at sikre ordentlig fastgørelse af fibronektin PDL.
    7. Til hvert eksperiment, opsætning af 2-3 retter pr. betingelse (fx, 3 køretøj-holdige retter, 3 stof-holdige retter).
  2. Plating NPCs for Neurite analyse
    1. Se afsnit 3.4 for trin til at løfte, adskille, pellet og resuspend celler.
    2. Plade 50.000 celler pr. parabol i retter tilberedt i afsnit 5.1. Agitere retter frem og tilbage i alle retninger for at sikre en jævn fordeling af celler.
    3. Inkuber celler ved 37 ° C i 48 timer.
  3. Analyse af Neurites
    1. Efter inkubation celler for 48 h, Aspirér medium og lave retter med is kold 4% PFA i 20 min.
    2. Efter 20 min, vaske op 3 gange i 5 min. med 1 x PBS. Efter den sidste vask, tilsættes 1 mL af 1 x PBS med 0,05% natriumazid.
    3. Analysere retter blindt på en fase-kontrast mikroskop på 32 X. Tælle samlede celler og celler med neurites i 3, 1 cm rækker, udvælges tilfældigt men reproducerbare positioner. Regne mindst 150 celler pr. parabol til at sikre passende stikprøver.
      Bemærk: En neurite er defineret som en udvidelse (proces) fra cellen organ, der er > 2 cellen kroppen diametre i længden. I celler med flere processer betragtes den længste proces til kriteriet. Celler med processer, der er < 2 cellen kroppen diametre i længde ikke er inkluderet (figur 4).
    4. Tilføje sammen det samlede antal celler og det samlede antal celler med neurites i hver skål. Beregne % af celler med neurites. Gennemsnitlig procentdel af celler med neurites på tværs af replikat retter. Tillid til eksperimentelle reproducerbarhed er etableret når alle rækker i hver tallerken er ens, og gennemsnit blandt retter er meget ens, med standard fejl af middelværdien (SEM) < 10%.
    5. Alternativt kan du analysere neurites ved at gennemføre immuncytokemi for markører som beta-III-tubulin (TUJ1) eller MAP2. Efter farvning for markør af interesse, skal du tage 10 systematisk tilfældige billeder på et fluorescerende mikroskop på 10 X. Billede mindst 200 celler. I dette tilfælde erhverve billeder ikke for tæt på kanten af skålen. Analysere procentdelen af celler med TUJ1 eller MAP2 + neurites (Se figur 10 for et eksempel).

6. NPC Neurosphere Migration Assay

  1. Neurosphere dannelse
    1. Der tilsættes 1 mL 100% udvidelse medier til en 35-mm skål med ingen belægning substrat. Inkuber retter i mindst 15 min. ved 37 ° C, før plettering NPCs. Forbered 2-3 retter for at sikre, at der vil være nok neurospheres til celle migration assay.
      Bemærk: Fraværet af en belægning substrat sikrer at NPCs forblive suspenderet i medierne, som er afgørende for neurosphere dannelse. Belægning retter vil forhindre neurosphere dannelse.
    2. Se afsnit 3.4 på trin at løfte, adskille, og pellet celler. Resuspend celle pellet i 2-5 mL af pre varmede 100% udvidelse medier. Plade 1 million NPCs i hver 35-mm skål forberedt i afsnit 6.1.1.
    3. NPCs der inkuberes ved 37 ° C i 48 til 96 h vil tillade NPCs aggregat og form neurospheres. Vurdere sfære størrelse ved hjælp af en live lineal på en fase-kontrast mikroskop. Vente på de fleste områder at nå frem til en anslået diameter 100 µm (± 20 μm) (figur 5). Mindre kugler vil helt sprede og bryde fra hinanden under migration assay.
  2. Fremstilling af plader til Neurosphere Migration Assay
    1. Opløses ECM-efterligne gel delprøver (Se afsnit 3.2) i 6 mL 30% udvidelse medier. Når ECM-efterligne gel/30% ekspansion Media løsning er forberedt, tilføje køretøjer, vækstfaktorer eller narkotika interesser på ønskede koncentrationer.
      Bemærk: Køretøj-, narkotika- og vækstfaktor koncentrationer skal øges til konto for tilsætning af 200 µL af neurospheres i afsnit 6.3.
    2. Plade 1 mL af ECM-efterligne gel /30% udvidelse Media løsning (± køretøjer, vækstfaktorer eller stoffer) i en brønd på en 6-godt plade. Gøre 2-3 boringer pr. eksperimentelle tilstand. Alternativt kan der anvendes 35-mm retter. Inkuber plader til mindst 30 minutter ved 37 ° C.
      Bemærk: Ikke Aspirér ECM-efterligne gel/30% ekspansion Media løsning til dette assay. Plating kugler på en indsugning ECM-efterligne gel vil føre til hurtige og overskydende migration.
  3. Plating Neurospheres
    1. Indsamle neurospheres dannet i afsnit 6.1 og placere dem i en konisk slange. Vask 35 mm retter med 1 mL af 1 x PBS til at sikre, at alle neurospheres er indsamlet. Spin ned de indsamlede neurospheres på 100 x g i 5 min.
    2. Genopslæmmes i neurospheres i 1-3 mL af pre varmede 30% udvidelse medier. Hvis 1 fad med neurospheres indsamles, bruges 1 mL af medier til resuspend kugler. Hvis 2 retter er indsamlet, 2 mL af medier er tilføjet til resuspend sfærer, etc. afpipetteres forsigtigt og brug kun en P-1000 til at sikre områder ikke er brudt.
    3. Plade 200 μl af den resuspenderede neurospheres i ECM-efterligne gel/30% udvidelsesløsning fremstillet i afsnit 6.2. Rock plader i alle retninger for at jævnt distribuere neurospheres. Inkuber plader i 48 timer ved 37° C.
    4. Fjerne ECM-efterligne gel/30% ekspansion Media løsning og løse celler i 4% PFA, vask og holde celler i 1 x PBS + 0,05% natriumazid.
  4. Analyse af Neurospheres
    1. Erhverve billeder af hele neurospheres ved hjælp af fase kontrastindstillinger på 10 X. Sikre kugler ikke rører hinanden. Måle gennemsnitlige migration ved hjælp af ImageJ software.
    2. Spore den ydre omrids af neurosphere ved hjælp af værktøjet frihånd linje. Freehand linjen kan tilgås ved at højreklikke på ikonet "straight" linje. Manuelt spore ved hjælp af en mus.
    3. Brug funktionen til at beregne området i sporingen. Sikre, at "område" er valgt som en læse-out i vinduet "Sæt målinger" findes under fanen analyser. Se figur 6 for spor af ydre omrids i blå.
    4. Spore den indre cellemasse af området område og foranstaltning. Se figur 6 for spor af indre kontur i rød. Kvantificere gennemsnitlige migration ved at fratrække den indre cellemasse fra det samlede neurosphere område.
    5. Foranstaltning neurospheres, der udviser en tætpakket indre cellemasse med celler migrerer ud som en sammenhængende tæppe (figur 6).
    6. Medtag ikke celler uden for gulvtæppet eller løsrevet fra neurosphere for måling. Se figur 6 eksempler på celler (cirkel i hvidt), der er udelukket fra det ydre tæppe måling. Analysere et minimum af 20 neurospheres for hver betingelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ét mål af disse undersøgelser er at definere den proliferativ aktivitet af NPC'ere, dvs en stigning i celle antal. Dette opnås ved at vurdere DNA syntese af cellen total befolkning, en høj overførselshastighed tilgang, der måler iblanding af radioaktive sporstof tritiumholdigt thymidine i celle ekstrakter, og afspejler alle celler involveret i S-fase, uanset om de er syntese i 5 minutter eller hele to timer. Derudover tillade disse assays bestemmelse af andelen af celler, som angiver S-fase, og cellen total numre, en mere arbejdskrævende assay af enkelt celler. Celler syntetisere DNA i S-fase, et skridt, der går forud for mitosen og celledeling, som skal ske for at øge celle numre. Da disse processer tage nogen tid, kan ændringer i DNA syntese vurderet på 48 timer ikke være forbundet med ændringer i celle numre på dette tidspunkt. Ikke desto mindre, konstateredes det, at ændringer i DNA syntese på 48 timer pålideligt forudsige stigninger i celle numre på dage 4 og 6.

I vurderingen af DNA-syntese, celler er belagt med en tæthed på 100.000 celler (~ 50% sammenflydende) i en 24-godt plade og får lov til at vokse i 48 timer før du foretager målinger. Ved hjælp af denne tæthed sikrer, at cellerne ligner deres éncellelag miljø, men også dyrker ikke så hurtigt i løbet 48 h, at medierne bliver for sure. Medier, thats for sure kan påvirke cellestofskiftet og således ændre spredning resultater. Hvis specifikke cellelinjer er meget proliferativ, forskeren bør overveje at ændre celle tæthed, medier volumen, eller medier udveksle frekvens for at undgå stærkt sure betingelser. Hvis betingelserne er ændret, er det afgørende at være konsekvent, når man sammenligner forskellige cellelinjer, fordi celle-til-celle kontakt afhængige ændringer helt sikkert påvirke vækstrater. Den enkle design af disse assays gør det muligt for os at teste forskellige vækstfaktorer. Som det ses i figur 7, tilsætning af fibroblast vækstfaktor (FGF, 10 ng/mL) for 48 timer stigninger DNA syntese af ~ 40%. Derudover DNA syntese assay er reproducerbare som alle kloner og enkeltpersoner viser en stigning i DNA-syntese efter FGF stimulation. Potentialet for variabiliteten af baseline og FGF stimuleret DNA syntese blandt forskellige upåvirket individer såvel som potentialet for klonede variabilitet i samme individ er vist i tabel 1. Denne variation er det vigtigt at teste flere iPSC kloner pr. individ, samt vurdere et minimum af 3 til 5 NPC linjer stammer fra hver forskellige iPSC klon. Et minimum af 3 forsøg for hver NPC linje blev udført.

DNA syntese assay tillader os hen til hurtigt at vurdere talrige eksperimentelle grupper i en høj overførselshastighed mode og foranstaltningen afspejler den samlede sum af DNA syntese uanset S-fase varighed (5 minutter til 2 timer). For at definere andelen af celler involveret i S-fase, var S-fase post assay ansat. Til dette assay celler dyrkes på det samme densitet som tidligere nævnt for at tillade éncellelag-lignende dynamics at forekomme, men derefter de adskilles efter 2 dage og tilladt at kortvarigt overholde plader at foretage single-celle analyse. Tælle celler i en éncellelag kan være vanskelig på grund af høje celle til celle kontakt og regional variation i pladen. Dette paradigme tillader os at model cellerne som en éncellelag og derefter analysere dem som enkelt celler. Det fungerer også som en metodisk uafhængig bekræftelse af data indhentet i DNA syntese assay. Som det ses i figur 8, øger 48 timer af FGF (10 ng/mL) stimulation andelen af celler ind i S-fase af ~ 25%.

I vurderingen af celle tal, bruges en lavere celle tæthed end i de førnævnte assays, med 50.000 celler bliver forgyldt pr. brønd med en 24 godt plade. Igen, denne tæthed blev valgt til at sikre, at hurtigere cellelinjer ikke vokser så hurtigt over 6-dages periode, pH af mediet bliver for sure og bliver gul. I figur 9, mens celle numre ikke kan være betydeligt forskellige mellem kontrol og FGF (10 ng/mL) grupper på 2 dage, er ændringer i DNA-syntese ved 48 h (figur 7) egnede til forudsigelse af ændringer i celle numre på 4-6 dage.

Mens NPCs er typisk kulturperler på høj densitet, er neurite analysen udført med en tæthed på 50.000 celler forkromet til en 35-mm skål for at vurdere enkelte celler. Selv ved denne lave tæthedsgrad, NPC kulturer express cytoskeletal proteiner og transskriptionsfaktorer karakteristisk for NPCs såsom NESTIN, SOX2 og PAX6 (fig. 10 A-D). Dette angiver, at en lav densitet dyrkning ikke væsentligt ændrer celle skæbne i denne tidsramme. Derudover har lignende low-density betingelser været brugt i rotter og mus kultur systemer for at opdage fænotyper, der var i sidste ende reproducerbare i vivo16,17,18,19, 20,21,22,23. Efter 48 timers inkubation, en lille del af NPCs begynde at udvide neurites, som det ses i fig. 11A og B, og kvantificeres i grafen i figur 11C. Andelen af celler, der strækker sig neurites, neurites længde og antallet af neurites/celle kan måles for at vurdere udviklingsmæssige parametre. For at præcist at vurdere andelen af celler med neurite udvækst, er det vigtigt, at cellerne er forgyldt som enkelt celler eller klynger af < 5 celler og ikke så store aggregater. Som det ses i figur 10 E-F, udtrykke cellerne forsynet med neurites (hvid pil) også umodne neuronal markør beta-III tubulin (TUJ1). Som nævnt i metoderne, fluorescerende billeder kan erhverves af TUJ1 plettet NPCs og derefter disse billeder kan tælles for andelen af TUJ1 + neurites at sikre neuronal oprindelsen af processer. I vores laboratorium, har analyser af enten metoden viste statistisk lignende resultater.

Den enkle design og den hurtige karakter af neurite analysen også tillade os at teste effekten af udviklingshæmmede relevante vækstfaktorer, cytokiner og peptider. For eksempel Figur 11 viser, at neuropeptid hypofyse adenylate cyclase aktivering polypeptid (PACAP, 3 nM) øger neurite udvækst i NPCs. PACAP er en vigtig udviklingsmæssige faktor, der har bred udtryk i CNS og har vist sig at være vigtigt i hjernens udvikling. Gnaver undersøgelser i vores lab og andre labs har fundet at PACAP har udbredt fase afhængige af udviklingsmæssige virkninger såsom regulering af neurite udvækst, migration og spredning i både baghjernen og forhjernen16,22, 29,30,31. Nylige undersøgelser af Ataman et al. (2016) ved hjælp af kulturperler menneskelige føtal kortikale celler viser, at neuronal aktivitet inducerer en 9-fold stigning i PACAP genekspression, der angiver peptider betydning i menneskers neuronal udvikling32. Ja, tabel 2 viser procentdelen af neurites i kontrol og PACAP (3 nM) forhold mellem talrige linjer stammer fra upåvirket individer. Som det ses i tabel 2, er der nogle variation i procentdelen af neurites udtrykt i cellelinjer stammer fra forskellige kloner fra samme person og fra NPCs stammer fra forskellige individer. Disse upåvirket individer har imidlertid en stigning i neurite udvækst svar på PACAP, der angiver assays reproducerbarhed.

Ligesom neurite udvækst er celle migration en vigtig udviklingsmæssige proces afgørende for ordentlig forbindelse, organisation og ledninger af hjernen. Neurospheres gøre det muligt for os at studere NPC migration i en typisk high-density betingelse, der vedligeholder celle-celle kontakt blandt NPCs (figur 12). Udviklingshæmmede relevante faktorer kan også blive testet på neurospheres at vurdere deres virkninger for migration. For eksempel figur 12 viser, at PACAP (10 nM) øger migration af NPC'ere.

Figure 1
Figur 1: NPCs på passage 3. NPCs på P3 express flere fase-specifikke markører herunder (A) pluripotente transkriptionsfaktor, SOX2 (B) transkriptionsfaktor specifikke for forhjernen NPCs, PAX6, og NPC cytoskeletal proteiner NESTIN. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk af S-fase post assay. Tidslinje for S-fase post Assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvantificere S-fase posten. (A) fase billede viser fase-mørke levende celler (hvide pile), en fase-lyse døde celle (hvid stjerne) og en fase-lyse levende celle (grøn pil). (B) fluorescerende DAPI pletten viser kondenseret kernen i en død celle (hvid stjerne) og store kerner i en levende celle (hvide og grønne pile). (C) fluorescerende EdU billede viser lyse EdU positive kerner (rød pil) og plettet EdU positive kerner (rød stjerne). (D) fase og fluorescerende fletning af billeder 3A - 3 C.

Figure 4
Figur 4: identificerer neurites. Fasekontrast billeder af NPCs. (A) A celle med en proces > 2 celle organer i længden, og dermed opfylder kriteriet for en neurite. (B) en celle med en proces < 2 celle organer i længden, og derfor ikke betragtes som neurite-bærende. (C) repræsenterer en celle med 2 processer-den længere proces er vurderet til neurite kriterium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: at vælge neurospheres for migration assay. (A) fase kontrast billede af en repræsentant inden for neurospheres på 24 h. kugler er alle mindre end 100 μm og er således ikke indsamles for migration assay. (B) fase kontrast billede af en repræsentant inden for neurospheres på 72 h. Alle områder er inden for det 100 μm ± 20 µm interval, der viser de er klar til at blive indsamlet til migration assay.

Figure 6
Figur 6: kvantificere Migration. (A) fase kontrast billede af en repræsentativ neurosphere. (B) blå kontur viser spor til at måle samlede neurosphere område. Rød viser konturen bruges til at måle området af den indre celle masse. Migration er defineret som samlede neurosphere område-indre celle masse område. Bemærk, de hvide cirkler viser celler, ikke der i en sammenhængende tæppe, da disse celler er udelukket fra migration konturer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: vurdering af DNA syntese. Repræsentative resultater af kontrol versus FGF-behandlede NPCs. FGF (10 ng/mL) stiger DNA syntese på 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 brønde/gruppe/eksperiment; 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.

Figure 8
Figur 8: andelen af celler ind i S-fase. (A) fase kontrast billeder af NPC cellerne inkuberes i kontrol versus FGF (10 ng/mL) behandlede medier for 48 h. mellemværker repræsenterer højere forstørrelse billeder af celler farves for fluorescerende EdU markør i kontrol og 10 ng/mL FGF medier. Røde pile indikerer celler, der er EdU positive og hvide pile viser celler, der er EdU negative. (B) grafen for repræsentative resultater af kontrol versus FGF (10 ng/mL) behandlet NPCs. FGF stigninger S-fase post på 48 h (p ≤1 x 10-3). (n = 2-4 retter/gruppe/eksperiment; 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.

Figure 9
Figur 9: optæller celler på dag 2, 4 og 6. (A) fase kontrast billeder af celler i kontrol og FGF (10 ng/mL) behandlede medier på dag 2, 4 og 6. (B) grafen for repræsentative resultater; Bemærk at FGF (10 ng/mL) øger ikke altid celle numre på 2 dage, men på 4-6 dage stigninger er tilsyneladende (p ≤0.05). (n = 2-4 brønde/gruppe/eksperiment; 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.

Figure 10
Figur 10: karakterisering af NPCs i lavdensitet betingelser. (A, C, E) Fase kontrast billeder af NPCs i low-density betingelser. (B) NPCs express stem/stamceller celle markører NESTIN (grøn), SOX2 (rød) og nukleare markør DAPI (blå). (D) PAX6 (rød), DAPI (blå). (F) på lav densitet, celler udvide neurites (hvid pil) også udtrykke umodne neuron markør TUJ1 (grøn). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: Neurite udkommet. (A) fase kontrast billede af NPC'ere. De sorte pile peger på celler med neurites. (B) tilsætning af neuropeptid PACAP (3 nM) øger procentdelen af celler med neurites (p ≤1 x 10-2). (C) kvantificering af neurite udvækst i kontrol og 3 nM PACAP indeholdende medier. (n = 2-4 retter/gruppe/eksperiment; 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.

Figure 12
Figur 12: Neurosphere Migration. (A) fase kontrast billeder af neurospheres. (B) tilsætning af PACAP (10 nM) øger neurosphere celle migration (p ≤10-2) (C) kvantificering af celle migration. (n = 20 kugler/gruppe/eksperiment, 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.

Medier
Patienten Klon # CTRL FGF
(10 ng/mL)
Patient 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
Patienten 2 1 7,664 14,060
2 16,573 30,087

Tabel 1: DNA syntesen. Et resumé af DNA syntese værdier (i CPM'er) af NPCs stammer fra to iPSC kloner pr. to upåvirket individer.

Medier
Patienten Klon # CTRL PACAP
(3 nM)
Patient 1 1 13.60% 18.10%
2 16.50% 21,10%
Patienten 2 1 8,90% 14.10%
2 14.20% 21,10%

Tabel 2: Procentdel af celler med Neurites. Et resumé af procentdelen af cellerne forsynet med neurites i NPCs stammer fra to iPSC kloner pr. to upåvirket individer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollerne præsenteres her illustrere hurtige og enkle metoder til at studere grundlæggende udviklingsforstyrrelser processer og teste vækstfaktorer og narkotika ved hjælp af hiPSC-afledte neurale forløber celler. hiPSC teknologi har revolutioneret studiet af patogenesen af udviklingsforstyrrelser sygdomme ved at forsyne os med hidtil uset adgang til levende menneskelige neuronale celler fra berørte personer. Faktisk har der været talrige hiPSC undersøgelser af nervesystemets udvikling herunder Rett syndrom, Timothy syndrom, skrøbelige-X syndrom, og skizofreni, som har afdækket sygdoms-specifikke afvigelser i dendritter, synapser, og neuronal funktion4,33,34,35,36. De fleste af disse undersøgelser har primært fokuseret på terminalt differentieret, post mitotiske neuroner, der selv betragtes som relativt funktionelt umodne, udelukker undersøgelse af tidligere udviklingsforstyrrelser processer såsom spredning og migration. Disse sidstnævnte processer har været stærkt involveret i patogenesen af nervesystemets udvikling og arrestordre yderligere undersøge8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. brugen af NPCs gør det muligt for os at studere disse vigtige tidligere begivenheder og giver samtidig mulighed for at undersøge mere modne processer som celler evne til at udvide umodne axoner/dendritter (neurites). Yderligere, nogle af disse assays kan også udvides til at studere andre parametre, såsom neurite længde, antallet, og forgrener sig eller den længst afstand, som en celle.

Nogle nyere undersøgelser har brugt organoid modelsystemer for at studere tidligere udviklingsmæssige begivenheder i en 3-D "mini hjernen system"1,39,40. Endnu, selv i disse organoid systemer, proliferativ forløber celle befolkning er begrænset og tidlige modning og migration er vanskelige at studere15,39. Ud over at begrænse undersøgelsen af tidligere udviklingsmæssige fænomener, brugen af terminalt differentieret neuroner eller organoids er ofte tidskrævende, dyrt, og begrænser antallet af variabler, der kan vurderes i systemet. Dette er fordi at gøre neuroner og organoids kan kræve viral induktion protokoller, særlige væksthuse og udstyr, flere uger af tid og store mængder af medier. I modsætning, med undtagelse af DNA syntese analysen (som er behandles senere nedenfor), denne protokol let kan anvendes på studiet af nervesystemets udvikling og kræver ikke omfattende uddannelse, dyre værktøjer og ressourcer eller software. Den lethed og relativt lave omkostninger ved at føje narkotika og vækstfaktorer i disse assays, gør denne protokol en nyttig høj overførselshastighed teknologi til at teste forskellige mulige behandlinger for udviklingsforstyrrelser og neuropsykiatriske sygdomme. Desuden, da vækstfaktorer handling via defineret cellulær signalering veje, de kan også bruges som værktøjer til at teste for potentielle signalering defekter i udvikle systemer. Endelig, da NPCs er en proliferativ selvstændig fornyelse befolkning, store mængder af celler kan produceres og befrugtede tillade eksperimenter skal udføres effektivt uden at gøre NPCs fra iPSCs hver gang.

For at kunne ansætte disse assays, er det vigtigt at bemærke følgende kritiske trin. Denne protokol placerer NPCs i forskellige betingelser for vedligeholdelse og udvidelse versus eksperimenter. Specifikt, mens NPCs er induceret, reducere vokset, og passaged i medium indeholdende neurale induktion supplere (NIS), vores forsøgsbetingelser tillægget med 70%, hvilket placerer celler i en begrænsende miljø, giver os mulighed for at tilføje tilbage og afprøve virkningerne af vigtige vækstfaktorer. For det andet er det vigtigt at holde styr på passage af NPCs. I vores undersøgelser, har vi generelt begrænset passage antallet af cellelinjer fra P3 - P8. I passager udtryk tidligere end P3, nogle linjer ikke håndfast karakteristiske markører. På højere passager, mens nogle cellelinjer har meget konsekvent vækstrate eller svar til vækstfaktorer, muligvis andre cellelinjer dramatiske ændringer i cellevækst eller svar. Skønt ikke rutinemæssigt rapporterede, har vi, og mange andre oplevet denne dramatiske ændring i proliferativ satser på højere passager. Grunden kan til dette er usikkert, men denne ændring kan afspejle en begrænset selvfornyelse kapacitet af NPCs. definere, hvorfor og hvordan spredning priser ændres over udvidede passager give indsigt i udvikling og sygdom patogenese, men yderligere forskning vil savn at blive gennemstegt. Endelig, den kommercielle neurale induktion protokol, som vi bruger kan undertiden give dårlig kvalitet neurale stamceller, især hvis de begyndende iPSCs ikke er af høj kvalitet (dvs., har differentiere celler på grænsen af celle kolonier, karyotype abnormiteter). I nogle tilfælde, celle morfologi er forvrænget og udtryk af markører er ikke til stede. Brug ikke disse kulturer. I andre tilfælde vokse NPCs med fladere "forurenende" celler, som kan fjernes ved hjælp af en differentieret celle detachement løsning behandling for at sikre næsten ren NPC populationer før brug i eksperimenter. At have høj kvalitet NPCs er afgørende for korrekt resultater: Se materialer og udstyr afsnittet for et link til en neurale induktion protokol, hvor man kan finde billeder af høj og lav kvalitet NPC'ere.

For hver af assays præsenteret, er det vigtigt at bemærke følgende kritiske trin, potentielle fejl og fejlfindingstip. For celle nummer, DNA-syntese og neurite assays er det vigtigt at pladen celler, som dissocieres enkelt celler og ikke som klumper, som dette kan forvrænge DNA syntese foranstaltninger, celletal og neurite adfærd. For at sikre klumper af celler ikke er belagt, prøve en lille mængde af celler med en P1000, plade på et dias, og kontrollere hvis cellen klumper er til stede. Hvis klumper er noteret, afpipetteres celler op og ned for at manuelt break apart klumper før plating. DNA-syntese og celle nummer assay, er celler løftet med enzymer til optælling og analyse. Det er afgørende at visuelt bekræfte celler er helt ophævet fra kultur fartøj til at få nøjagtig tæller og eventuelt enzym inkubation længere kan bruges. Lavt celletal eller lav CPM'er for DNA syntese assay, celler kan være forgyldt ved højere indledende tætheder, radioaktivt tritium [3H] - thymidine kan føjes til dobbelt tid (4 timer i stedet for 2) eller tritiumholdigt [3H] - thymidine koncentration kan blive fordoblet. For neurite analysen, kan indledende plating tæthed fordobles uden at risikere øget celle til celle kontakt. Være opmærksom på fordelingen af celler på tværs af en parabol og tælle 1 cm rækker, således at hver del af skålen er med i stikprøven. Hvis neurite procentdel er for lavt på 48 h, analysen kan udvides op til 6 dage eller typen belægning substrat eller koncentration kan ændres til at fremme større procentdel af neurites. Det er dog vigtigt at bemærke, at belægningen gange og metoder vi har præsenteret i protokollen blev udvalgt til optimal neurite udvækst og celle sundhed efter at teste mange forskellige substrater, substrat koncentrationer og belægning gange. For neurosphere analysen, kan brug af mindre multikanalpipetter (P20, P200) føre til klipning og brud på større områder. Det er således bydende nødvendigt, at pipettering gøres forsigtigt og med en P1000 eller en serologisk pipette. For pelleringsmidler neurospheres, anbefales lavere hastigheder (100 x g i stedet for 300 x g) også at forhindre neurosphere dissociation. Under kuglen plating, sikre at kugler er tilstrækkeligt lange mellemrum, som kugle for kugle kontakt kan påvirke migration. I tilfælde, hvor overførslen er for hurtigt eller for langsomt, kan inkubationstiden faldt eller steg henholdsvis. Belægning substrater kan også ændres for at ændre migration priser.

De anvendte metoder er hurtige, enkle og gælder for studiet af nervesystemets udvikling, er der visse begrænsninger. For én, mange af analyserne præsenteret (celle nummer assay, neurite assay, migration assay) kræver efterforskerne at gøre subjektive beslutninger (f.eks., er det en neurite? Er denne celle død?) potentielt fører til investigator bias og lavere reproducerbarhed. Imidlertid kan gennemføre analyser blinde og fastsættelse af strenge normer for hver beslutning inden for en analyse, som illustreret i metoderne, forbedre disse fordomme. Disse assays kræver ligeledes manuelle målinger og tæller, hvilket kan være tidskrævende og labor intensiv. Men i laboratorier, der har udstyr og tekniske ressourcer, disse assays kan være drønede med brug af automatiserede celle tællere og programmer, der kan udføre automatiske målinger41,42. I tilfælde af DNA syntese assay, disse metoder er specifikke for vores celle mejetærsker og scintillation maskine (Se materialer og udstyr); men der er andre tilgængelige modeller og metoder, der kan bruges til at få de samme oplysninger, som Omnifilter-95 celle mejetærsker. For nogle institutioner, kan anvendelse af radioaktive kilder ikke være muligt. I dette tilfælde en alternativ metode ved hjælp af en fluorescerende thymidine analog, såsom EdU, analyseret på en fluorescerende mikrotiterplade læser, vil give mulighed for erhvervelse af de samme oplysninger på bulk analyse af DNA syntese44.

Vores low-density kultur system adskiller NPCs i enkelte celler eller små klumper, en betingelse, der adskiller sig fra den tætpakkede arten af NPCs i udviklingslandene neuralrøret. NPCs er dog sunde og udtrykkelige rigtige markører (figur 1, figur 10). Desuden vores forudgående undersøgelser af mus og rotter kortikale kulturer viser parallelle resultater i in vitro- kulturer, og i vivo modeller angive den nytte og værdi af benytter indeværende henvende16,17,18 , 19 , 24. Desuden, dette system giver en kraftfuld tilgang for at forstå modning af celler og studere cellen delpopulationer. For eksempel, kan Immunhistokemi udføres på neurite analysen til at fastslå, hvilke specifikke neuronal celletype udvider en neurite. I sidste ende, trods nogle begrænsninger, denne unikke protokol giver enkel, kraftfuld og hurtige metoder til at studere nervesystemets udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af New Jersey guvernør Rådet for medicinalforskning og behandling af autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerer Family Foundation, Mindworks velgørende bly tillid og jødiske samfund grundlaget for større MetroWest NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9, (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20, (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60, (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320, (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66, (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94, (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155, (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171, (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474, (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155, (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33, (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139, (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21, (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29, (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72, (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26, (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66, (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90, (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5, (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33, (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39, (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10, (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47, (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539, (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23, (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20, (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45, (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15, (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22, (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1, (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5, (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics