Rask påvisning av Neurodevelopmental fenotyper i menneskelig Neural Precursor celler (NPC)

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Neurodevelopmental prosesser som spredning, migrering og neurite resultatet er ofte opprørt i nevropsykiatriske sykdommer. Derfor presenterer vi for å raskt og reproduserbar vurdere prosessene neurodevelopmental i menneskelig iPSC-avledet NPCer. Disse protokollene kan også vurdering av virkningene av relevante vekstfaktorer og therapeutics på NPC-utvikling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Menneskelige hjerne utviklingen fortsetter gjennom en rekke nettopp orkestrert prosesser, med tidligere stadier atskilt av spredning, migrering og neurite utvekst; og senere stadier preget av axon/dendrite utvekst og synapse formasjon. I neurodevelopmental lidelser, er ofte én eller flere av disse prosessene forstyrret, fører til unormalt i hjernen dannes og funksjon. Med bruk av menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSC) teknologi har forskere nå rikelig av menneskelige celler som kan differensieres til nesten en celle type, inkludert nerveceller. Disse cellene kan brukes både normale hjernens utvikling og sykdom patogenesen. Flere protokoller bruker hiPSCs modell nevropsykiatriske sykdom bruk terminalt differensiert nerveceller eller bruk 3D kultur systemer kalt organoids. Disse metodene har vist seg uvurderlig i å studere menneskelig sykdom patogenesen, finnes det noen ulemper. Differensiering av hiPSCs i nerveceller og generasjon av organoids er lange og kostbare prosesser som kan påvirke antallet eksperimenter og variabler som kan vurderes. Dessuten, mens etter mitotisk neurons og organoids tillater studiet av sykdom-relaterte prosesser, inkludert dendrite utvekst og synaptogenesis, utelukke de studiet av tidligere prosesser som spredning og overføring. I neurodevelopmental lidelser, som autisme, indikerer rikelig genetiske og evaluering bevis feil i tidlig utviklingsprosesser. Neural precursor celler (NPC), en svært proliferativ celle befolkningen, kan være en passende modell å stille spørsmål om ontogenetiske prosesser og sykdom innvielse. Vi nå utvide metoder lært å studere utviklingen i musen og rotten kortikale kulturene menneskelige NPCer. Bruk av NPCer tillater oss å undersøke sykdom-relaterte fenotyper og definere hvordan ulike variabler (f.eks, vekstfaktorer, narkotika) innvirkning utviklingsprosesser inkludert spredning, migrasjon og differensiering i bare noen få dager. Til slutt kan denne verktøysett brukes i en reproduserbar og høy gjennomstrømming måte for å identifisere sykdom-spesifikke mekanismer og fenotyper i neurodevelopmental lidelser.

Introduction

Bruk av enklere organismer og musen modeller har belyst mekanismer for grunnleggende hjernens utvikling samt sykdom patogenesen. Til tross for disse fremskrittene forblir etiologien mange nevropsykiatriske lidelser unnvikende fordi ikke alle funn i enklere organismer er direkte relevante for kompliserte aspektet av menneskelig sykdom. Videre større kompleksiteten i den menneskelige hjernen ofte gjør det vanskelig å modell menneskelig utvikling og lidelser i dyr. Med evolusjon og utvikling av menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) teknologi, kan somatiske celler omprogrammeres til stamceller og deretter differensiert i neuronal celler å studere menneskelig sykdom. Fremskritt innen hiPSCs og «omic» teknologier (genomics, transcriptomics, Proteomikk, metabolomics) lover å revolusjonere forståelsen av menneskelige hjernens utvikling. Disse teknologiene nå gjøre mulig en "presisjon medisin"-tilnærming til karakterisering av nevropsykiatriske sykdom på et sak-til-sak grunnlag.

Gjeldende stiften i feltet hiPSC sykdom-modellering er å skille celler i bestemte neuronal subtyper i en monolayer eller bruke et 3D kultur system kalt en organoid til recapitulate aspekter av hjerne utviklingen1,2, 3. Disse systemene har vært utrolig verdifull i å studere og avdekke unike aspekter av menneskelig utvikling og sykdom4,5,6,7. Men krever både neuronal kulturer og organoids ofte hvor som helst fra uker til måneder i kultur før de er klare til å studere. Tidkrevende natur disse protokollene og mengden ressurser som er nødvendig for å opprettholde disse kultur systemene ofte begrense antall eksperimenter som kan utføres og antall variabler (som vekstfaktorer eller narkotika) som kan testes. Videre har mange studier utnytte etter mitotisk neurons og organoids fokusert på prosesser som dendrite utvekst eller synapse formasjon, som oppstår senere i utviklingen. Mens disse prosessene har vært innblandet i patologi utviklingsforstyrrelser lidelser som autisme og schizofreni, er tidligere utviklingsmessige hendelser som skjer før definitive neuronal differensiering også viktig for sykdom patogenesen8 ,,9,,10,,11,,12,,13. Faktisk viser genomisk studier at midt-fosterets perioden, som består av spredning, prosessen utvekst og migrasjon, er spesielt viktig i autisme patogenesen11,14. Dermed er det viktig å studere nevrale stammen og stamfar celle populasjoner å forstå disse tidligere prosesser. Organoid systems, som er vurdert å bedre recapitulate menneskelige hjerne utviklingen på grunn av sin 3D-natur og organisert struktur, inneholder en stamfar basseng som har blitt benyttet for å studere noen av disse tidligere hendelser. Men stamfar befolkningen i organoids er ofte sparsom og mer som radial gliacellene enn neural celler5,15-med stammen eller stamfar. Dermed vil det være gunstig å ha en høy gjennomstrømning metode å studere tidlige stadier av neurodevelopment i et aktivt proliferativ celle befolkningen.

I laboratoriet, har vi laget en protokoll som bruker hiPSC-avledet neural precursor celler (NPC), en blandet befolkning av nevrale stammen og progenitor celler som er svært proliferativ, å studere neurodevelopmental prosesser som spredning, celle migrasjon, og innledende prosess (neurite) forlengelsen. Disse analyser ble utviklet fra teknikker som brukes i vår lab for flere tiår å kunne studere neurodevelopment i rotte og mus kortikale kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Viktigst, det ble også vist at fenotyper og regulatoriske signaler definert i kultur rotte og musen er svært forutsigende av mekanismer som er aktive i vivo, som angir verdien av disse teknikkene16, 17,18,19,24. Etter innledende differensiering av hiPSCs med NPC tillater disse metodene oss å studere viktige utviklingsprosesser i løpet av dager. Disse metodene har mange fordeler: (1) de krever litt avansert utstyr og er lett å implementere, (2) rekke eksperimentelle gjentak kan gjennomføres i en kort periode, slik at for rask bekreftelse av reproduserbarhet resultater, og (3) kultur variabler som belegg matriser, effekter av vekstfaktorer og aktivitet av narkotika kan testes raskt og kostnadseffektivt. Videre, tar vi nytte av veletablerte rolle ekstracellulære vekstfaktorer som kritisk regulatorer av ulike utviklingsprosesser. NPCer ble utsatt for å velge utviklingsmessige signaler som direkte stimulerer hendelser som spredning, neurite utvekst og celle migrasjon, og har funnet de forbedrer muligheten til å finne feil som ikke er i kontroll forhold19 , 25 , 26 , 27 , 28. likeledes brukervennlighet vurdere narkotika gir en kraftig avenue å vedta presisjon medisin teknikker for å teste effekten av ulike terapeutiske tiltak. Denne protokollen forenkler dermed en høy gjennomstrømning, reproduserbare, og enkel metode for å studere tidlig hjernens utvikling og sykdom patogenesen de mulige gunstige effektene av vekstfaktorer og narkotika på neurodevelopmental fenotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. prosedyrer og Biosafety regjering vedlikehold

  1. Biosikkerhet nivå-2 (BSL-2) sikkerhetsprosedyrer
    1. Følg institusjonens retningslinjer på arbeide med BSL-2 materialer. Kast BSL-2 materialer i henhold til institusjonens praksis. Angi rom og utstyr som brukes for BSL-2 materialer. Bruk alle personlig beskyttende utstyr (PPE), inkludert Laboratoriefrakk og hansker.
  2. Biosikkerhet regjering vedlikehold
    1. Bruk en biosafety regjering godkjent for bruk av BSL-2 nivå materialer.
    2. Slå på UV-lyset i fravær av smittefarlige stoffer skap i minst 15 min, og så spray overflater med 10% bleike løsning. Tillate den bleike løsningen å sitte i 15 min, tørke ned kabinettet, og slå på luftstrømmen før bruk.
  3. Radioaktivt Tritiated [3H]-thymidine (Tritium) sikkerhetsprosedyrer
    Merk: Tritium er en kategori 5 radioaktivt kilde, 'de mest usannsynlige å være farlig' Kategori. Følg institusjonens retningslinjer for å arbeide med radioaktivitet. Noen institusjoner kan kreve sertifiseringer eller tillater for å håndtere tritium.
    1. Få opplæring fra institusjonen på hvordan du skal håndtere og avhende tritium. Kast radioaktivt avfall i riktig beholdere, ifølge institusjonens retningslinjer. Bruk PPE når du arbeider med tritium.

2. neural induksjon fra iPSCs

Merk: For å gjøre NPCer, en litt modifisert versjon av en protokoll som følger en kommersielt tilgjengelig neural induksjon kit ble fulgt. Settet består av Neurobasal (NB) media og en 50 x Neural induksjon Supplement (NIS), som brukes til å lage en 1 x Neural induksjon Medium (NIM). NIS brukes også til å gjøre 100% utvidelse Medium (se avsnitt 3.1). En kobling for protokollen er funnet i materialer og utstyr og referanser delen43.

  1. Passasjen iPSCs når de blir 70-80% confluent.
  2. Plate 300.000 iPSCs i 1 godt av en hESC-kvalifiserte ekstracellulær matrix-etterligne gel (ECM-etterligne gel) belagt 6-vel plate inneholder 2 mL mater-fri iPSC middels med 5 μM av ROCK inhibitor. Se delen 3.2 for instruksjoner på belegg brønner med ECM-etterligne gel.
  3. En dag senere, fjerne iPSC medium + ROCK hemmer og vask iPSCs gang med 1 x PBS. Legge til 2 mL NIM i iPSCs.
    Merk: 50 mL av NIM gjøres ved å legge 1 mL av 50 x NIS og 250 µL (50 enheter/mL, 5 μL/mL) av Penicillin/Streptomycin (P/S) til 49 mL NB Media.
  4. Endre media av neural induksjon hver 2 dager av aspirating brukte medium og erstatter med 2 mL NIM til celler bli confluent (rundt 4-5 dager). Endre media daglig, når cellene er confluent.
  5. Passasjen celler etter 7 dager i NIM og plate i en ECM-etterligne gel belagt 6-vel plate inneholder 2 mL 100% utvidelse medier og 5 μM ROCK inhibitor. Cellene anses passasje 0 (P0) NPCer på dette punktet. Se avsnitt 3.1 nedenfor å gjøre 100% utvidelse medier.
  6. Passasjen celler ved hjelp av metodene som er beskrevet i delen 3.4. Vent til celler har nådd P2 og er confluent før dissociating til stain for NPC markører og plating for eksperimenter (figur 1).

3. kultur medier, belegg og vedlikehold av NPCer

  1. Media forberedelse for vedlikehold av NPCer (100% utvidelse medier):
    1. Gjøre 50 mL av 100% utvidelse medier ved å kombinere 24,5 mL DMEM/F12 med 24,5 mL NB.
    2. Legg 1 mL av 50 x NIS DMEM/F12 + NB løsning. Legge 250 μL P/S løsning til media.
      Merk: Media kan være kjøleskap (4 ° C) og brukes for opptil 2 uker. Mindre mengder media kan gjøres ved å justere volum av DMEM / F12 + NB + NIS bruker de samme forholdene som for 50-mL volumet.
  2. Utarbeidelse av ECM-etterligne Gel kultur plater med teflonbelegg for NPC vedlikehold
    1. Aliquot ECM-etterligne gel volumet måtte ta 6 mL av fungerende løsning. Beregne aliquot volumet ved å se på sertifikat av analysen ark siden ECM-etterligne gel fortynningsfaktoren varierer fra parti til parti og parti for parti.
    2. Tine en ECM-etterligne gel aliquot på is og oppløses i 6 mL kaldt DMEM/F12 medier.
    3. Tilsett 1 mL av ECM-etterligne gel/DMEM/F12 løsning hver brønn av en 6 godt plate. Inkuber 6-vel platen med ECM-etterligne gel-løsning for 30 min på 37 ° C.
    4. Sug opp ECM-etterligne gel løsning etter 30 min med inkubering og erstatte med 100% utvidelse medier eller kjøle plater (4 ° C, opp til 1 uke) uten aspirating ECM-etterligne gel-løsning.
  3. Vedlikehold av NPCer
    1. Plate NPCer på en tetthet av 1,5 millioner celler i en ECM-etterligne gel-belagt godt med 2 mL av 100% utvidelse medier.
    2. Inkuber NPCer på 37 ° C i et fuktig miljø med 5% CO2.
    3. Legge til 5 μM av ROCK hemmer media for NPCer på P3 eller lavere eller tinte NPCer, å forhindre overdreven celledød. Endre media etter 24 h fjerne ROCK inhibitor.
    4. Passasjen cellene hver 4-9 dager, avhengig av når de blir confluent. Celler anses confluent når de blir en tett pakket monolayer som dekker hele bunnen av parabolen overflaten.
    5. Plate NPCer på en tetthet av 1 til 1,5 millioner celler per en brønn av en 6-vel plate (se avsnitt 3.4). Fjerne brukte media hver 48t og erstatte med 2 mL av 100% utvidelse medier.
  4. Løft distansere og pellets NPCer for vedlikehold og/eller Plating for eksperimentelle forhold
    1. Sug opp medium, vask celler når med 1 x PBS. Sug opp PBS og Legg til 500 μL 1 x cell avdeling løsningen i 1 godt av confluent NPCer. Incubate for 10 min på 37 ° C.
    2. Legg til 500 μL romtemperatur (RT) PBS og vaske det godt med en P-1000 pipette for å sikre fjerningen av celler. Samle celler + PBS løsning i et 15-mL konisk rør. Vaske platen igjen med 1 mL av PBS og legge flytende til røret.
    3. Nedspinning cellene på 300 x g for 5 min til pellets.
    4. Fjerne nedbryting fra cellen pellets og å suspendere cellene i 1-5 mL forvarmes DMEM/F12 media. Fortynne cellene til en tetthet på 1 til 4 millioner celler/mL av media. Kvantifisere celler ved hjelp av en hemocytometer.
    5. Plate antall celler, bestemt for NPC vedlikehold (seksjon 3.3) eller individuelle analysen blir utført (se etterfølgende avsnittene for mer informasjon).
    6. Juster celle suspensjon volum med media slik at mellom 15 til 100 μL celler brukes for hver brønn/rett. Dette lille plating volumet sikrer at selv cellen distribusjon og at vekstfaktorer, narkotika eller underlag i mediet ikke er utvannet.
    7. Inkuber celler på 37 ° C. Endre media hver 48t NPC vedlikehold eller se bestemte detaljer for individuelle analyser.
  5. Media forberedelse til eksperimentelle forhold (30% utvidelse medier)
    1. Fortynne den 100% utvidelse mediet med 70% (kalt 30% utvidelse) ved å legge til 1:1 DMEM/F12 + NB løsning for å gjøre medier for eksperimentelle forhold.
    2. Gjøre 20 mL 30% utvidelse medier ved å legge til 6 mL av 100% utvidelse medier og fortynne med 7 mL av NB og 7 mL av DMEM/F12 media. Legge til 5 µL/mL P/S løsning.
      Merk: Hvis 100% mediet allerede inneholder P/S, deretter legge 5 μL/mL for kombinert DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 μL/mL) = 70 μL P/S i stedet for 100µL.
    3. Legge belegg underlag og vekstfaktorer på ønsket konsentrasjoner til 30% utvidelse medier.

4. vurdere DNA-syntese, S-fase oppføring og celle tall av NPCer

  1. Forberedelse til DNA-syntese, S-fase inngang og celle tall analysen
    1. Lage en 1 mg/mL lager løsning av poly-D-lysine (PDL) i dH2O og filteret sterilisere. Fortynne 1:10 i dH2O lage en 0,1 mg/mL PDL løsning og legge til 300 μL hver brønn av en 24 godt plate eller 1 mL til en 35 mm-rett. Inkuber etter 20 min på RT.
    2. Vask PDL brønner 3 ganger i 5 min med dH2O. leveringstanken dH2O og legge til 300 μL/godt eller 1 mL/rett av laminin (5 μg/mL) fortynnet i 1 x PBS. Dekker platene med parafilm og holde en steril, biosafety CAB overnatting på RT (12 til 24 h).
    3. Forberede 30% utvidelse medier (se Seksjon 3.5) etter 12 til 24 h. Legg til biler, vekstfaktorer eller narkotika av interesse på ønsket konsentrasjonen i volumer som er mindre enn 10% av den totale løsningen å unngå fortynne NIS på 30% utvidelse Medium.
    4. Vask hver godt av 24-vel plate to ganger med 1 x PBS (5 min hver). Sug opp 1 x PBS og legge til 450 μL media (uten eller med narkotika/vekstfaktorer). Inkuber platen på 37 ° C i minst 15 min før plating celler.
    5. For hvert eksperiment, definere 2-3 brønner eller retter per betingelse.
    6. Plate NPCer (se avsnitt 3.4):
    7. NPC DNA syntese analysen: 100 000 celler/godt i en 24 godt plate
    8. S-fase Entry: 500.000 celler/35 mm rett
    9. Celle nummer analysen: 50 000 celler/godt i en 24-vel plate
  2. Neural Precursor celle DNA syntese analysen
    1. Plate 100.000 celler/godt i en 24-vel plate og vurdere i tre eksemplarer/tilstand.
    2. Legge til radioaktive, tritiated [3H]-thymidine til kultur medium (1,5 μCi/mL) i hver brønn etter 46 h i kultur. Inkuber celler ved 37 ° C i 2 timer.
      Merk: Når du bruker radioaktivt materiale, får opplæring fra din institusjon, følge radioaktivitet sikkerhet protokoller og kast radioaktivt materiale i de passende utpekte sløseri receptacles.
    3. Fjerne og riktig kast radioaktivt media etter 2 h. legger 300 μL pre varmet 0,25% trypsin-EDTA (0,5 mM) hver brønn og ruge etter 20 min på 37 ° C.
    4. Slå på cellen innhøsting (se materialer og utstyr delen) og pumpen og sikre pumpetrykk er under 200 PSI. Plasser filter papir gjennom rommet i cellen innhøsting og rive av høyre å markere papirretning.
    5. Plasser samle rør av cellen innhøsting i en tom "blank" brett og trykk prewash til å fukte filter papir. Plasser samle rør i prøven brønner og kjøre (start).
    6. Når cellen innhøsting er ferdig samle eksempler, løft klemme og advance filterpapir Gjenta for alle Prøvesett. Alltid prewash i en tom, "blank" plate.
    7. Tørr filter papir under en lyskilde og angi tilsvarende ampuller i en skuff. Slå ut papir chads i ampuller og legge 2 mL væske scintillation cocktail til hvert hetteglass. Cap og etiketten hetteglass.
    8. Inkuber ampuller i flytende scintillation cocktailparty for minst 1 time før du leser teller per minutt (CPMer) på en scintillation maskin.
  3. NPC-S-fase adgang analysen
    1. Se delen 3.4 for trinn å løfte, distansere, pellets og å suspendere celler.
    2. Plate 500.000 celler per fat i 35 mm rettene tilberedt i delen 4.1, bare 1 rett/betingelse for dette trinnet.
    3. Agitere retter og tilbake i alle retninger for å sikre jevn fordeling av celler. Inkuber celler ved 37 ° C i 46 h.
    4. Forberede tre 35 mm platene belagt med PDL/Laminin per betingelse etter 24 timer. For eksempel, hvis det er en 35 mm rett 30% utvidelse medier og en 35 mm rett av 30% utvidelse medier + FGF (10 ng/mL) deretter pels 6 PDL/Laminin plater for bruk på neste dag.
    5. Legge til 2 μL/mL 5 mM EdU kulturer etter 46 h. Incubate 2 h.
    6. Distansere og pellets cellene (se avsnitt 3.4). Nytt avbryte celle pellet 3 mL 30% utvidelse medier eller 3 mL 30% utvidelse medier + ønsket vekstfaktorer/narkotika.
    7. Plate 1 mL per fat pre belagt PDL/Laminin retter. Agitere retter og tilbake i alle retninger for å sikre jevn fordeling av celler. Ruge på 37 ° C for 2T til at cellene å overholde parabolen. Se figur 2 for en forenklet tidslinje.
  4. S-fase oppføring analyse
    1. Fastsette retter med iskald 4% Paraformaldehyde (PFA i 1 x PBS) for 20 min. Deretter vaske 3 ganger i 5 min med 1 x PBS.
    2. Legge 1 mL 1 x PBS 0,05% Natriumazid å hindre vekst av bakterier og sopp. Celler kan lagres på 4 ° C for inntil 6 måneder hvis retter (forseglet med parafilm) blir holdt i PBS + natrium Azide løsning, men ikke alle immunologiske antigener er godt bevart etter forsinkelser i analysen.
    3. Analysen celler med en EdU reaksjonen kit (se produsentens protokollen). Stain celler med DAPI eller en annen kjernefysiske indikator og bildet bruker fluorescens mikroskopi.
    4. Vurdere andelen EdU positiv celler over totalt lever celler (total-celle nummer) blind i 10 systematisk tilfeldig felt (10 x). Inneholde ikke døde celler i analysen.
    5. Bruke både fase kontrast bilder og fluorescerende bilder å fastslå positiv EdU flekker og å fastslå hvilke celler som er døde eller levende (Figur 3).
    6. Teller alle celler som har både glatt og selv cellemembranen i fase kontrastinnstillinger, og en stor ufragmentert kjerne av fluorescerende DAPI kjernefysiske flekken, som disse cellene er live (figur 3A-B).
    7. Ekskludere alle celler som er fase lyse, har en ødelagt ujevn cellemembranen, og har en liten, kondensert kjerne som visualisert ved DAPI fluorescerende tenkelig, som disse cellene er død (figur 3A-B). Vurdere lever celler for uttrykk for EdU ved å identifisere celler som har lyse fluorescerende EdU flekken dekker hele kjernen eller flekkete fluorescerende flekker i kjernen (Figur 3 c).
  5. NPC celle nummer analysen
    1. Etter 2 dager i kultur, etikett og forberede 1,5 mL microcentrifuge rør og 0,5 mL microcentrifuge rør. I hvert 0,5 mL tube, tilsett 5 μL av Trypan blå.
    2. Hver brønn av en 24 godt plate, fjerner middels og legge 200 μL av 1 x cell avdeling løsningen og sted i inkubator for 10 til 15 min.
    3. Etter tidsramme, når cellene har løftet, tilsett ønsket mengde av 1 x PBS hver brønn.
      Merk: Vanligvis på dag 2, Legg 300 μL 1 x PBS også inneholder cellene pluss 200 μL avdeling løsningen, et totalt volum på 500 μL. Med ekstra kultur inkubasjon tid, som celler blir mer confluent, øke fortynning volum etter behov. For eksempel på dag 4, legge til 500 μL 1 x PBS, og på dag 6, legge til 800 μL 1 x PBS. Totalt volum vil være 700 μL og 1 mL, henholdsvis.
    4. Bruker en P-1000 pipette, Pipetter opp og ned i hver godt 4 til 5 ganger å fjerne celler. Undersøke platen under et mikroskop for å sikre at alle celler har frittliggende. Overføre celler til 1,5 mL rør.
    5. Invertere 1,5 mL rør med fortynnet celler 2 til 3 ganger. Så ta en 50 μL aliquot celler fra midten av røret og legge til 0,5 mL rør med Trypan blå (se 4.5.1).
    6. Pipetter cell løsningen opp og ned 2 til 3 ganger. Legge til celler i hemocytometer og analysere umiddelbart. Venter lenger enn 10 min kan øke celledød eller tilstedeværelse av celler som har tatt opp Trypan blå.
    7. Forsiktig legge 10 µL av cellen + Trypan blå blanding på hver side av hemocytometer å utføre Repliker teller. Telle celler av fase kontrast mikroskopet. Tell ikke døde celler eller mørk blå celler som har tatt opp Trypan blå.
    8. For å få total-celle tall, bruk gjennomsnittet celle nummer regnet fra 4 hjørner av hemocytometer og bruk denne formelen:
      Mener celle nummer x media volum (mL) x 10,000 = Total-celle nummer/godt
    9. Sug opp og gjenta på gjenværende brønner. Endre media på cellene som ikke blir regnet, hver 48 h. Gjenta analysen på dager 4 og 6.

5. NPC Neurite analysen

  1. Utarbeidelsen av retter og Media for Neurite analysen
    1. Lage en 1 mg/mL lager løsning av poly-d-lysine (PDL) i dH2O og filteret sterilisere. Fortynne 1:10 i dH2O lage en 0,1 mg/mL PDL løsning og legge til 1 mL i hver 35 mm rett. Inkuber etter 20 min på RT.
    2. I mellomtiden, forberede 30% utvidelse medier (se Seksjon 3.5) og legge til 5 μg/mL (5 µL/mL) Fibronectin løsning (1 mg/mL stock) til media.
    3. Når media er forberedt, legger du til biler, vekstfaktorer eller narkotika rundt i ønsket konsentrasjoner.
      Merk: Det er best å legge kjøretøy, vekstfaktorer eller narkotika, med volum < 10% av den totale løsningen å unngå fortynne fibronectin og andre komponenter i 30% utvidelse medium.
    4. Etter 20 min, vaske PDL 3 ganger i 5 min med dH2O fjerne overflødig PDL. Kontroller retter er tørr før du legger til media.
    5. Plass 1 mL av media (med eller uten rusmidler/vekstfaktorer) + Fibronectin løsning i hver PDL belagt rett.
    6. Inkuber retter på 37 ° C i minst 30 min før plating celler for å sikre riktig vedlegg av Fibronectin til PDL.
    7. For hvert eksperiment, må du definere på 2-3 retter per betingelse (f.eks, 3 bilen inneholder retter, 3 narkotika inneholder retter).
  2. Plating NPCer for Neurite analysen
    1. Se delen 3.4 for trinn å løfte, distansere, pellets og resuspend celler.
    2. Plate 50.000 celler per fat i rettene tilberedt i delen 5.1. Agitere retter og tilbake i alle retninger for å sikre en jevn distribusjon av celler.
    3. Inkuber celler ved 37 ° C i 48 timer.
  3. Analyse av Neurites
    1. Etter rugende celler for 48t, Sug opp medium og fikse retter med is kaldt 4% PFA for 20 min.
    2. Etter 20 min, vaske 3 ganger i 5 min med 1 x PBS. Etter siste vask, Legg 1 mL 1 x PBS 0,05% Natriumazid.
    3. Analysere retter blindt på fase kontrast mikroskop ved 32 X. Telle totalt celler og celler med neurites på 3, 1 cm rader, valgt tilfeldig men reproduserbar posisjoner. Telle minst 150 celler per fat å sikre tilstrekkelig prøvetaking.
      Merk: En neurite er definert som en forlengelse (prosess) fra celle kroppen som > 2 celle kroppen diameter i lengde. For celler med flere prosesser regnes den lengste prosessen for kriteriet. Celler med prosesser som < 2 celle kroppen diameter i lengden ikke er inkludert (Figur 4).
    4. Legge sammen antall celler og antall celler med neurites i hver rett. Beregne % av celler med neurites. Gjennomsnittlige prosentandelen av celler med neurites over Repliker retter. Tillit i eksperimentell reproduserbarhet opprettes når alle radene i hver rett er like, og gjennomsnitt blant rettene er svært like, med standard feil av gjsnitt (SEM) < 10%.
    5. Alternativt kan du analysere neurites ved å utføre immunocytochemistry for markører som beta-III-tubulin (TUJ1) eller MAP2. Etter for markøren rundt ta 10 systematisk tilfeldige bilder på fluorescerende mikroskop på 10 X. Bildet minst 200 celler. I dette tilfellet erverve bildene ikke for nær kanten av parabolen. Analysere prosentandelen av celler med TUJ1 eller MAP2 + neurites (se Figur 10 for et eksempel).

6. NPC Neurosphere overføring analysen

  1. Neurosphere formasjon
    1. Legge til 1 mL av 100% utvidelse medier i en 35 mm parabolen med ingen Pulverlakkering underlaget. Inkuber retter i minst 15 min på 37 ° C før plating NPCer. Forbered 2-3 retter for å sikre at det vil være nok neurospheres for celle migrasjon analysen.
      Merk: Fraværet av en Pulverlakkering underlaget sikrer at NPCer forblir suspendert i media, som er avgjørende for neurosphere-formasjonen. Belegg retter vil hindre neurosphere formasjon.
    2. Se delen 3.4 trinnene for å løfte distansere og pellets celler. Resuspend celle pellet i 2-5 mL forvarmes 100% utvidelse medier. Plate 1 million NPCer i hver 35 mm parabolen utarbeidet i delen 6.1.1.
    3. Inkuber NPCer ved 37 ° C i 48 til 96 h å tillate NPCer å samlet og form neurospheres. Vurdere sfære størrelse med en live linjal på kontrast mikroskop. Venter på de fleste områder å nå en omtrentlig diameter på 100 µm (± 20 μm) (figur 5). Mindre kulene vil helt spre og bryte under overføring analysen.
  2. Utarbeidelse av plater for Neurosphere overføring analysen
    1. Oppløses ECM-etterligne gel dele (se delen 3.2) i 6 mL av 30% utvidelse medier. Når ECM-etterligne gel/30% utvidelse medier løsning er forberedt, legger du til biler, vekstfaktorer eller narkotika interesser i ønsket konsentrasjoner.
      Merk: Kjøretøy, narkotika og vekstfaktor konsentrasjoner må økes kontoen for tillegg av 200 µL av neurospheres i delen 6.3.
    2. Plate 1 mL av ECM-forhåndsvisningen gel /30% utvidelse medier løsning (± kjøretøy, vekstfaktorer eller narkotika) i en brønn av en 6-vel plate. Gjøre 2-3 brønner per eksperimentelle tilstand. Alternativt, 35 mm retter kan brukes. Inkuber plater for minst 30 min på 37 ° C.
      Merk: Ikke Sug opp ECM-etterligne gel/30% utvidelse medier løsning for denne analysen. Kontaktflate kuler på en aspirerede ECM-etterligne gel vil føre til raske og overskytende migrasjon.
  3. Plating Neurospheres
    1. Samle neurospheres dannet i Seksjon 6.1 og plassere dem i en konisk rør. Vask 35 mm retter med 1 mL 1 x PBS å sikre alle neurospheres er samlet. Nedspinning de innsamlede neurospheres 100 x g i 5 min.
    2. Nytt suspendere neurospheres i 1-3 mL forvarmes 30% utvidelse medier. Hvis 1 rett av neurospheres er samlet, 1 mL av media til å resuspend kuler. Hvis 2 retter er samlet, 2 mL media legges til resuspend kuler, etc. Pipetter forsiktig og bruke bare en P-1000 for å sikre kuler ikke er brutt.
    3. Plate 200 μL av resuspended neurospheres i ECM-etterligne gel/30% løsning i Seksjon 6.2. Rock plater i alle retninger for å fordele jevnt neurospheres. Inkuber platene for 48 h på 37° C.
    4. Fjerne ECM-etterligne gel/30% utvidelse medier løsning og løse celler i 4% PFA, vask og holde celler i 1 x PBS + 0,05% Natriumazid.
  4. Analyse av Neurospheres
    1. Hente bilder av hele neurospheres med fase kontrastinnstillinger på 10 X. Sikre kuler ikke berører hverandre. Måle gjennomsnittlig overføring ved hjelp av programmet ImageJ.
    2. Spor ytre konturene av neurosphere ved hjelp av verktøyet frihåndslinje. Frihåndslinje kan nås ved å høyreklikke på ikonet "rett". Manuelt spor ved hjelp av musen.
    3. Bruk funksjonen mål til å beregne arealet av spor. Kontroller at "området" er valgt som en lese-out i vinduet "Sette mål" funnet under kategorien analyser. Se figur 6 spor av ytre kontur i blått.
    4. Spore den indre cellemasse sfære og mål. Se figur 6 spor av indre kontur i rødt. Kvantifisere gjennomsnittlig overføring ved å trekke den indre cellemasse fra totalt neurosphere området.
    5. Tiltak neurospheres som viser en tett pakket indre cellemasse cellene migrerer ut som sammenhengende gulvteppet (figur 6).
    6. Ikke ta med celler utenfor teppet eller løsrevet fra neurosphere for måling. Se figur 6 eksempler på celler (innringet i hvitt) som er utelatt fra ytre teppe målingen. Analysere minst 20 neurospheres for hvert vilkår.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett mål av disse studiene er å definere proliferativ aktiviteten av NPCer, dvs en økning i cellen tallene. Dette oppnås ved å vurdere DNA-syntese av total-celle befolkningen, en høy gjennomstrømming tilnærming som måler inkorporering av radioaktivt tracer tritiated thymidine i celle ekstrakter, og gjenspeiler alle celler i S-fase, enten de er syntetisere i 5 minutter eller hele to timer. I tillegg kan disse analyser fastsettelse av andelen av cellene angir S-fase og total-celle tall, en mer arbeidskrevende analysen av enkeltceller. Celler syntetisere DNA i S-fase, et skritt foran mitose og celledeling, som må skje for å øke cellen tallene. Siden disse prosessene ta tid, kan endringer i DNA-syntese vurdert på 48 timer ikke være knyttet til endringer i cellen tallene på dette tidspunkt. Likevel ble det funnet at endringer i DNA-syntese i 48 timer sikkert forutsi økning av cellen tallene dager 4 og 6.

Vurdere DNA-syntese, celler er belagt på en tetthet av 100.000 celler (~ 50% confluent) i en 24-vel plate og tillates å vokse i 48 timer før mål. Denne tetthet sikrer at cellene ligner monolayer miljøet, men også vokser ikke så raskt i løpet 48t media blir for surt. Medier som for surt kan påvirke celle metabolisme og dermed endre spredning resultater. Hvis bestemte linjer er svært proliferativ, forskeren bør vurdere å endre celle tetthet, media volum, eller media bytte frekvens for å hindre svært sure forhold. Hvis forholdene endres, er det viktig å være konsekvent når du sammenligner ulike cellelinjer celle til celle avhengige endres sikkert påvirker vekst. Den enkle utformingen av disse analyser tillater oss å teste ulike vekstfaktorer. Som vist i figur 7, tillegg av fibroblast vekst faktor (FGF, 10 ng/mL) for 48 timer øker DNA-syntese av ~ 40%. Videre DNA syntese analysen er reproduserbare som alle kloner og personer viser en økning i DNA-syntese etter FGF stimulering. Potensialet for variasjon av baseline og FGF stimulert DNA-syntese blant annet upåvirket enkeltpersoner, samt potensialet for klonal variasjon i samme individ er vist i tabell 1. Fordi denne variasjon er det viktig å teste flere iPSC kloner per person, i tillegg til å vurdere minst 3 til 5 NPC linjer fra hver annen iPSC klone. Minimum 3 eksperimenter for hver NPC linje ble utført.

DNA syntese analysen tillater oss å raskt vurdere mange eksperimentelle grupper i en høy gjennomstrømming mote og mål gjenspeiler summen av DNA-syntese uavhengig S-fase varighet (5 minutter til 2 timer). Definere andelen av celler i S-fase, var S-fase adgang analysen ansatt. For denne analysen, celler dyrkes på samme tetthet som tidligere nevnt for å tillate monolayer-lignende dynamics oppstår, men de er atskilt etter 2 dager og kan kort overholder til å gjennomføre encellede analyse. Telle celler i et monolayer kan være vanskelig på grunn av høy celle til celle kontakt og regionale variasjoner i platen. Dette paradigmet lar oss modellen cellene som en monolayer og deretter analysere dem som enkeltceller. Den fungerer også som en metodologisk uavhengig bekreftelse av data innhentet i DNA syntese analysen. Som vist i Figur 8, øker 48 timer av FGF (10 ng/mL) stimulering andelen celler inn S-fase med ~ 25%.

Vurdere celle tall, brukes cellen lavere tetthet enn i de nevnte analyser, med 50 000 celler blir belagt per brønn en 24 godt plate. Igjen, dette tetthet ble valgt til å sikre at raskere cellelinjer ikke vokser så raskt i 6-dagers perioden at pH i mediet blir for surt og gulner etterhvert. I figur 9er cellen tallene ikke kanskje er signifikant forskjellig mellom kontrollen og FGF (10 ng/mL) grupper på to dager, endringene i DNA-syntese i 48 timer (figur 7) prediktive for endringer i cellen tallene i 4 og 6 dager.

Mens NPCer er vanligvis kultivert på høy tetthet, er neurite analysen gjennomført på en tetthet på 50 000 celler belagt i en 35 mm parabol for å vurdere enkeltceller. Selv på dette lav tetthet, NPC kulturer uttrykke cellen cytoskjelett proteiner og transkripsjonsfaktorer karakteristisk for NPCer som NESTIN, SOX2 og PAX6 (Figur 10 A-D). Dette indikerer at en lav dyrking ikke vesentlig endrer celle skjebne i dette tidsrommet. Videre har like lav forhold blitt brukt i kultur rotte og mus for å oppdage fenotyper som var til slutt reproduserbar i vivo16,17,18,19, 20,21,22,23. Etter 48 timer med inkubering, en liten andel av NPCer begynner å utvide neurites som vist i figur 11A og B og kvantifisert i grafen i figur 11C. Andelen av celler som utvider neurites, lengden på neurites og antall neurites/mobiltelefon kan måles for å vurdere utviklingsmessige parametere. For å nøyaktig vurdere andelen celler med neurite utvekst, er det viktig at cellene er belagt som enkeltceller eller klynger av < 5 celler og ikke så stor aggregat. Som vist i Figur 10 E-F, uttrykke celler med neurites (hvit pil) også umodne neuronal markør beta-III tubulin (TUJ1). Som nevnt i metoder, fluorescerende bilder kan bli kjøpt opp av TUJ1 farget NPCer og deretter disse bildene kan telles for andelen TUJ1 + neurites å sikre neuronal opprinnelsen til prosesser. I vår lab, har analyser av disse metodene gitt statistisk lignende resultater.

Den enkle utformingen og rask natur neurite analysen også tillater oss å teste effekten av developmentally relevante vekst faktorer cytokiner og peptider. For eksempel Figur 11 viser at neuropeptide hypofysen adenylate cyclase aktivere polypeptid (PACAP, 3 nM) øker neurite utvekst i NPCer. PACAP er en viktig utviklingsmessige faktor som har bredt uttrykk i CNS og har vist være viktig i hjernens utvikling. Gnager studier i vår lab og andre laboratorier har funnet at PACAP har utbredt scenen-avhengige utviklingsmessige effekter som regulerer neurite utvekst, overføring og spredning i begge de hindbrain og forebrain16,22, 29,30,31. Nyere studier av Ataman et al. (2016) ved hjelp av kultivert menneskelig fosterets kortikale celler indikerer at neuronal aktivitet induserer en 9-fold økning i PACAP genuttrykk, indikerer peptidene betydning i menneskelig neuronal utvikling32. Faktisk tabell 2 viser prosentandelen av neurites i kontroll og PACAP (3 nM) mellom mange linjer avledet fra upåvirket enkeltpersoner. Som vist i tabell 2, er det litt variasjon i prosenten av neurites i cellelinjer avledet fra forskjellige kloner fra samme individ og NPCer fra ulike individer. Men har disse upåvirket enkeltpersoner en økning i neurite utvekst svar på PACAP, som indikerer reproduserbarhet av analyser.

Som neurite utvekst er celle migrasjon en viktig utviklingsprosess som er avgjørende for riktig tilkobling, organisasjonen og ledningsnett i hjernen. Neurospheres tillater oss å studere NPC migrasjon i en typisk høy tetthet tilstand som opprettholder celle-celle kontakt blant NPCer (Figur 12). Utviklingsmessig relevante faktorer kan også testes på neurospheres å vurdere deres effekter på overføring. Figur 12 viser for eksempel som PACAP (10 nM) øker overføringen av NPCer.

Figure 1
Figur 1: NPCer på passering 3. NPCer på P3 express flere scenen-spesifikke indikatorer inkludert (A) pluripotent transkripsjon faktor, SOX2 (B) transkripsjon faktor spesielle for forebrain NPCer, PAX6, og NPC cellen cytoskjelett proteiner NESTIN. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk av S-fase adgang analysen. Tidslinje av S-fase adgang analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kvantifisere S-fase oppføring. (A) fase bildet viser fase-mørk lever celler (hvite piler), en fase-lyse døde celle (hvit stjerne) og en fase-lys levende celle (grønn pil). (B) fluorescerende DAPI flekken viser kondensert kjernen i en død celle (hvit stjerne) og store kjerner i en levende celle (hvite og grønne piler). (C) fluorescerende EdU bildet viser lyse EdU positiv kjerner (rød pil) og flekkete EdU positiv kjerner (røde stjerne). (D) fase og fluorescerende fletting av bilder 3A - 3 C.

Figure 4
Figur 4: identifisere neurites. Kontrast bilder av NPCer. (A) A-cellen med en prosess > 2 cellen legemer i lengde, og dermed møte kriterium for en neurite. (B) en celle med en prosess < 2 cellen legemer i lengde, og derfor ikke vurdert neurite-bærende. (C) representerer en celle med 2 prosesser-en lengre prosess er vurdert for neurite-kriteriet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: velge neurospheres for migrering analysen. (A) fase kontrast bildet av et representativt felt av neurospheres på 24 h. kuler er alle mindre enn 100 μm og dermed er ikke samlet for migrasjon analysen. (B) fase kontrast bilde av et representativt felt av neurospheres på 72 h. Alle områder er 100 μm ± 20 µm serien indikerer de er klar å bli samlet for migrasjon analysen.

Figure 6
Figur 6: kvantifisere migrasjon. (A) fase kontrast bilde av en representant neurosphere. (B) blå omriss viser spor for å måle totalt neurosphere området. Red viser konturen brukes til å måle området i indre cellen masse. Overføringen er definert som totalt neurosphere området-indre cellen masse området. Legg merke til at de hvite sirklene viser celler som ikke er i en sammenhengende teppet, som disse cellene utelates fra overføringen konturene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: vurdere DNA-syntese. Representant resultatene av kontroll versus FGF-behandlet NPCer. FGF (10 ng/mL) øker DNA-syntese i 48 timer (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 brønner/gruppe/eksperiment; 3 eksperimenter). Feilfelt representerer SEM.

Figure 8
Figur 8: andel av cellene inn S-fase. (A) fase kontrast bilder av NPC celler ruges kontroll versus FGF (10 ng/mL) behandlet media for 48 h. Insets representerer høyere forstørrelse bilder av celler farget for fluorescerende EdU markør i kontroll og 10 ng/mL FGF media. Røde piler indikerer celler som EdU positive og hvite piler indikerer celler EdU negative. (B) graf representant resultatene av kontroll versus FGF (10 ng/mL) behandlet NPCer. FGF øker S-fase oppføring på 48 timer (p ≤1 x 10-3). (n = 2-4 retter/gruppe/eksperiment; 3 eksperimenter). Feilfelt representerer SEM.

Figure 9
Figur 9: opplisting celler dager 2, 4 og 6. (A) fase kontrast bilder av celler i kontroll og FGF (10 ng/mL) behandlet media dager 2, 4 og 6. (B) graf representant resultater; Merk at FGF (10 ng/mL) øker alltid ikke cellen tallene på 2 dager, men på 4 og 6 dager øker er tilsynelatende (p ≤0.05). (n = 2-4 brønner/gruppe/eksperiment; 3 eksperimenter). Feilfelt representerer SEM.

Figure 10
Figur 10: karakterisering av NPCer i lav tetthet forhold. (A, C, E) Fase kontrast bilder av NPCer i lav forhold. (B) NPCer uttrykke stem/stamfar celle markører NESTIN (grønn), SOX2 (rød) og kjernefysiske markør DAPI (blå). (D) PAX6 (rød), DAPI (blå). (F) på lav tetthet, celler utvide neurites (hvit pil) også uttrykke umodne Nevron markør TUJ1 (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: Neurite utvekst. (A) fase kontrast bilde av NPCer. De svarte pilene peker til cellene med neurites. (B) tillegg av neuropeptide PACAP (3 nM) øker prosenten til celler med neurites (p ≤1 x 10-2). (C) kvantifisering av neurite utvekst i kontroll og 3 nM PACAP inneholder medier. (n = 2-4 retter/gruppe/eksperiment; 3 eksperimenter). Feilfelt representerer SEM.

Figure 12
Figur 12: Neurosphere overføring. (A) fase kontrast bilder av neurospheres. (B) tillegg av PACAP (10 nM) øker neurosphere celle migrasjon (≤10-for p-2) (C) kvantifisering av celle migrasjon. (n = 20 kuler/gruppe/eksperiment, 3 eksperimenter). Feilfelt representerer SEM.

Media
Pasient Klone # CTRL FGF
(10 ng/mL)
Pasient 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
Pasienten 2 1 7,664 14,060
2 16,573 30,087

Tabell 1: DNA-syntese. Et sammendrag av DNA syntese verdier (i CPMer) av NPCer avledet fra to iPSC kloner per to upåvirket enkeltpersoner.

Media
Pasient Klone # CTRL PACAP
(3 nM)
Pasient 1 1 13.60% 18.10%
2 16,50% 21.10%
Pasienten 2 1 8,90% 14.10%
2 14.20% 21.10%

Tabell 2: Prosentandel av celler med Neurites. Et sammendrag av prosentandelen av celler som bærer neurites i NPCer avledet fra to iPSC kloner per to upåvirket enkeltpersoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollene presenteres her illustrerer raske og enkle metoder for å studere grunnleggende neurodevelopmental prosesser og teste vekstfaktorer og narkotika bruker hiPSC-avledet neural precursor celler. hiPSC teknologi har revolusjonert studiet av patogenesen av neurodevelopmental sykdommer ved å gi oss tilgang til live neuronal menneskeceller fra berørte personer. Faktisk har det vært mange hiPSC studier av neurodevelopmental lidelser inkludert Retts syndrom, Timothy syndrom, Fragile-X syndrom, og schizofreni, som har avdekket sykdom-spesifikke avvik i dendrites, synapser, og nevrale funksjonen4,33,34,35,36. De fleste av disse studiene har primært fokusert på terminalt differensiert etter mitotisk nerveceller som, om betraktet som relativt funksjonelt umodne, utelukker studiet av tidligere neurodevelopmental behandler som spredning og overføring. Prosessene sistnevnte har vært tungt involvert i patogenesen av neurodevelopmental lidelser og garanterer videre studere8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. Bruk av NPCer tillater oss å studere disse viktige tidligere hendelser gir muligheten til å undersøke mer moden prosesser som evnen til cellene å utvide umodne axons/dendrites (neurites). Videre, noen av disse analyser kan også utvides for å studere andre parametere, for eksempel neurite lengde, antall, og forgrening eller lengst avstanden reist av en celle.

Noen nyere studier har brukt organoid modellsystemer for å studere tidligere utviklingsmessige hendelser i 3D "mini hjernen system"1,39,40. Likevel, selv i disse organoid systemer, proliferativ forløper celle befolkningen er begrenset og tidlig modning og migrasjon er vanskelig å studere15,39. I tillegg begrense studiet av tidligere utviklingsmessige fenomener, bruk av terminalt differensiert nerveceller eller organoids er ofte tidkrevende, kostbare, og begrenser antall variabler som kan vurderes i systemet. Dette er fordi gjør nevroner og organoids kan kreve viral induksjon protokoller, spesielle inkubatorer og utstyr, flere uker, og store mengder av media. I kontrast, med unntak av DNA syntese analysen (som er drøftet senere under), denne protokollen kan lett brukes til studiet av neurodevelopmental lidelser og krever ikke omfattende opplæring, kostbare verktøy og ressurser eller programvare. Den enkle og relativt lav kostnad med å legge til narkotika og vekstfaktorer disse analyser, gjør denne protokollen en nyttig høy gjennomstrømming teknologien å teste ulike mulige behandlinger for neurodevelopmental og nevropsykiatriske lidelser. Videre siden vekstfaktorer handle via definert mobilnettet signalveier, kan de også brukes som verktøy for å teste for potensielle signalering defekter i utvikle systemer. Til slutt, siden NPCer proliferativ selv fornyende innbyggere, store mengder celler kan produseres og cryopreserved tillater eksperimenter gjennomføres effektivt uten å gjøre NPCer fra iPSCs hver gang.

For å kunne bruke disse analyser, er det viktig å være oppmerksom på følgende viktige trinn. Denne protokollen plasserer NPCer i forskjellige forhold for vedlikehold og utvidelse versus eksperimentering. Spesielt mens NPCer hjulpet, redusere vokst, og passaged i medium som inneholder Neural induksjon Supplement (NIS), vår eksperimentelle forhold supplement med 70%, noe som plasserer cellene i et begrenset miljø, gir oss mulighet til å legge til og teste effekten av viktige vekstfaktorer. Dernest er det viktig å holde styr på passering av NPCer. I våre studier, har vi generelt begrenset passasje antall celle linjene fra P3 - P8. I avsnitt uttrykke tidligere enn P3 noen linjer ikke robust karakteristiske merkene. På høyere passasjer, mens noen linjer har veldig konsekvente vekst eller svar på vekstfaktorer, kan andre linjer ha dramatiske endringer i cellevekst eller svar. Men ikke rutinemessig rapportert, har vi, og mange andre opplevd dette dramatisk endring i proliferativ prisene høyere passasjer. Grunnen kan for dette er usikkert, men denne endringen kan gjenspeile en begrenset selvtillit fornyelse evne av NPCer. definere hvorfor og hvordan spredning priser endres utvidet passasjer gi innsikt i utvikling og sykdom patogenesen, men videre forskning må gjøres. Til slutt, kommersielle neural induksjon protokollen som vi bruker kan noen ganger gi dårlig kvalitet nevrale stamceller, spesielt hvis de starter iPSCs ikke av høy kvalitet (dvs., har skille celler på grensene til celle kolonier, Karyotype unormalt). I noen tilfeller celle morfologi er forvrengt og uttrykk for markører finnes ikke. Ikke bruk disse kulturene. I andre tilfeller vokse NPCer med flatere "forurensning" celler, som kan fjernes ved hjelp av differensial celle avdeling løsning behandling for å sikre nesten ren NPC bestander før bruk i eksperimenter. Å ha høy kvalitet NPCer er avgjørende for riktig resultat: se materiell og utstyr delen for en link til en Neural induksjon protokoll der bilder av høy og lav kvalitet NPCer kan bli funnet.

For hver av analyser presentert, er det viktig å være oppmerksom på følgende viktige trinn, potensielle feil og feilsøkingstips. For celle nummer, DNA-syntese og neurite analyser er det viktig å plate celler dissosiert enkeltceller og ikke som klumper, da dette kan forskyve DNA syntese tiltak, celletall og neurite virkemåte. For å sikre klumper av celler ikke er belagt, prøve en liten mengde celler med en P1000, plate på et lysbilde, og sjekk hvis det finnes celle klumper. Hvis klumper er kjent, Pipetter celler opp og ned for å manuelt bryte fra hverandre klumper før plating. DNA-syntese og celle tall analysen, er celler løftes enzymer for telling og analyse. Det er viktig å visuelt bekrefte celler har helt løftet fra kultur fartøyet å få nøyaktige teller og eventuelt lengre enzym inkubasjon perioder kan brukes. Ved lav celletall eller lav CPMer for DNA syntese analysen, celler kan være belagt på høyere første tettheter, radioaktivt tritiated [3H] - thymidine kan legges for dobbel tid (4 timer i stedet for 2) eller tritiated [3H] - thymidine konsentrasjon kan dobles. For neurite analysen, kan første plating tetthet dobles uten å risikere økt celle til celle kontakt. Ta hensyn til fordelingen av celler over en parabol og telle 1 cm rader slik at hver del av parabolen samples. Hvis neurite prosentandelen er for lavt i 48 timer, analysen kan utvides opptil 6 dager eller belegg substrat type eller konsentrasjon kan endres for å fremme større prosentandel av neurites. Det er imidlertid viktig å merke seg at belegg tider og metoder vi har presentert i protokollen ble valgt for optimal neurite utvekst og celle helse etter mange ulike underlag, substrat konsentrasjoner og belegg ganger. For neurosphere analysen, kan bruk av mindre pipettors (P20, P200) føre til klipping og brudd på større områder. Derfor er det viktig at pipettering gjøres forsiktig og med en P1000 eller en serologisk pipette. For pelleting av neurospheres, anbefales lavere hastigheter (100 x g i stedet for 300 x g) også å hindre neurosphere dissosiasjon. Under sfære plating, sikre at kuler er riktig avstand fra hverandre som sfære-til-sfæren kontakt kan påvirke overføringen. I tilfeller der overføringen er for fort eller for sakte, kan inkubasjonstiden være redusert eller økte henholdsvis. Belegg underlag kan også endres for å endre overføring priser.

Teknikken er rask, enkel og gjelder for studiet av neurodevelopmental lidelser, finnes det visse begrensninger. For mange av analysene presentert (celle nummer analysen, neurite analysen, overføring analysen) krever etterforskerne å gjøre subjektive beslutninger (f.eks, er dette en neurite? Er denne cellen død?) kan føre til etterforsker partiskhet og lavere reproduserbarhet. Imidlertid kan gjennomføre analyser blind og setter strenge standarder for hver avgjørelse i analysen, som illustrert i metoder, bøte disse biases. Tilsvarende krever disse analyser manuelle målinger og teller, som kan være tidkrevende og arbeidsintensiv. Men i laboratorier som har utstyr og tekniske ressurser, sped disse analyser med bruk av automatiserte celle tellere og programmer som kan utføre automatiserte målinger41,42. Hvis DNA syntese analysen, disse metodene er spesifikke for vår celle innhøsting og scintillation maskin (se materialer og utstyr); men finnes det andre tilgjengelige modeller og metoder som kan brukes til å få den samme informasjonen, for eksempel Omnifilter-95 celle innhøsting. Noen institusjoner, kan bruk av radioaktive kilder ikke være mulig. I dette tilfellet vil en alternativ metoden bruker en fluorescerende thymidine analog, for eksempel EdU, analysert på fluorescerende microplate leser, tillate for kjøp av den samme informasjonen på bulk analyse av DNA syntese44.

Lav kultur-systemet vårt skiller NPCer i enkeltceller eller små klumper, en tilstand som avviker fra tettpakkede naturen av NPCer i den utvikle medfødte. Likevel, NPCer er sunn og uttrykke riktig markører (figur 1, Figur 10). Videre våre tidligere studier av musen og rotten kortikale kulturer viser parallelle funn i i vitro kulturer, og i vivo tyder verktøyet og verdien av å bruke dette tilnærming16,17,18 , 19 , 24. i tillegg dette systemet gir en kraftig tilnærming for å forstå modning av celler og studere celle undergrupper. Immunohistochemistry kan for eksempel utføres på neurite analysen til å finne ut hvilken bestemt neuronal celle utvider en neurite. Til slutt, til tross for noen begrensninger, denne unike protokollen gir enkel, kraftig og rask metoder for å studere neurodevelopmental lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av New Jersey guvernørens Council for medisinsk forskning og behandling av autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerer familie Foundation, Mindworks føre stiftelse og jødiske samfunnet grunnlaget for større MetroWest NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9, (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20, (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60, (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320, (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66, (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94, (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155, (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171, (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474, (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155, (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33, (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139, (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21, (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29, (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72, (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26, (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66, (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90, (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5, (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33, (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39, (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10, (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47, (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539, (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23, (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20, (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45, (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15, (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22, (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1, (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5, (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics