Snelle detectie van neurologische fenotypen in menselijke neurale voorlopercellen (NPC)

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Neurologische processen zoals proliferatie, migratie en neurite uitvloeisel zijn vaak verstoord in neuropsychiatrische ziekten. Dus presenteren we protocollen om te snel en reproducibly beoordelen deze neurologische processen in menselijke iPSC afkomstige NPC's. Deze protocollen toestaan ook de beoordeling van de gevolgen van relevante factoren die de groei en therapeutics NPC ontwikkelingssamenwerking.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ontwikkeling van de menselijke hersenen verloopt door middel van een reeks van precies georkestreerde processen, met eerdere fasen onderscheiden door proliferatie, migratie en neurite de uitgroei; en latere stadia gekenmerkt door axon/dendriet uitgroei en synapse formatie. In neurologische aandoeningen, worden vaak één of meerdere van deze processen verstoord, wat leidt tot afwijkingen in de hersenen vorming en functie. Met de komst van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) technologie hebben de onderzoekers nu een overvloedig aanbod van menselijke cellen die kunnen worden onderscheiden in vrijwel elk celtype, met inbegrip van neuronen. Deze cellen kunnen worden gebruikt om te studeren zowel normale hersenontwikkeling en pathogenese van de ziekte. Een aantal protocollen met behulp van hiPSCs te modelleren neuropsychiatrische ziekte gebruik terminaal gedifferentieerde neuronen of gebruik 3D cultuur systemen organoids genoemd. Hoewel deze methoden hebben bewezen onschatbare waarde bij het bestuderen van de pathogenese van de ziekte bij de mens, zijn er sommige nadelen. Differentiatie van hiPSCs in neuronen en generatie van organoids zijn langdurige en kostbare processen die van invloed kunnen het aantal experimenten en variabelen die kunnen worden beoordeeld. Bovendien, terwijl na mitotische neuronen en organoids toestaan de studie van ziekte verband houdende processen, waaronder dendriet uitgroei en synaptogenese, zij weg dat de studie van eerdere processen zoals proliferatie en migratie. In neurologische aandoeningen, zoals autisme, blijkt overvloedige genetische en na het slachten gebreken in de vroege ontwikkelings processen. Neurale voorlopercellen (NPC), een zeer proliferatieve celpopulatie, mogelijk een geschikt model waarin vragen te stellen over de ontogenetische processen en tijdens het initiëren van de ziekte. We breiden nu methodologieën geleerd van het bestuderen van de ontwikkeling in muis en rat corticale culturen aan menselijke NPC's. Het gebruik van NPC's kan we ziekte verband houdende fenotypen onderzoeken en definiëren hoe verschillende variabelen (bijvoorbeeld, groeifactoren, drugs) effect developmental processen zoals proliferatie, migratie en differentiatie in slechts een paar dagen. Uiteindelijk, kan deze toolset reproduceerbaar en high-throughput wijze worden gebruikt om ziekte-specifieke mechanismen en fenotypen in neurologische aandoeningen te identificeren.

Introduction

Het gebruik van eenvoudiger organismen en Muismodellen heeft toegelicht de mechanismen van fundamentele hersenontwikkeling, alsmede de pathogenese van de ziekte. Ondanks deze vooruitgang blijft de etiologie van vele neuropsychiatrische aandoeningen ongrijpbaar omdat niet alle bevindingen in eenvoudiger organismen direct relevant voor complexe aspecten van ziekten bij de mens zijn. Verder, de grotere complexiteit van het menselijk brein vaak maakt het moeilijk om de menselijke ontwikkeling model en aandoeningen bij dieren. Met de evolutie en de vooruitgang van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) technologie, kunnen somatische cellen worden geherprogrammeerd tot stamcellen en vervolgens gedifferentieerd in neuronale cellen om te studeren ziekten bij de mens. Vooruitgang in de hiPSCs en "dienst" technologieën (transcriptomics, genomica, proteomica, metabolomica) beloven om een ommekeer teweeg op het begrip van de ontwikkeling van de menselijke hersenen. Deze technologieën nu maken mogelijk een "precisie geneeskunde"-benadering aan de karakterisatie van neuropsychiatrische ziekten op een case-by-case basis.

De huidige nietje in het veld hiPSC ziekte-modeling is om te onderscheiden van cellen in specifieke neuronale subtypen in een enkelgelaagde of gebruiken van een 3D-cultuur-systeem, genaamd een organoid om te recapituleren aspecten van hersenen ontwikkeling1,2, 3. Deze systemen zijn ongelooflijk waardevol in studeren en unieke aspecten van menselijke ontwikkeling en ziekte4,,5,,6,7blootleggen. Echter vereisen zowel neuronale culturen en organoids vaak overal van weken tot maanden in cultuur voordat ze klaar om te bestuderen zijn. De tijdrovende aard van deze protocollen en het bedrag van de middelen die nodig zijn om dat deze systemen cultuur vaak beperken het aantal experimenten die kunnen worden uitgevoerd en het aantal variabelen (zoals groeifactoren of drugs) die kan worden getest. Bovendien hebben vele studies met behulp van post mitotische neuronen en organoids gericht op processen zoals dendriet uitgroei of synaps formatie, die later in ontwikkeling te voorkomen. Terwijl deze processen zijn betrokken bij de pathologie van ontwikkelingsstoornissen zoals autisme en schizofrenie, zijn eerder developmental gebeurtenissen die voordat definitieve neuronale differentiatie plaatsvinden ook belangrijk voor de pathogenese van de ziekte8 ,9,10,11,12,13. Inderdaad, recente genomic studies tonen aan dat de medio-foetale periode, die uit de proliferatie, proces uitgroei en migratie bestaat, met name belangrijk in autisme pathogenese11,14 is. Het is dus belangrijk om te studeren van neurale stamcellen en progenitor cel populaties om deze eerdere processen beter te begrijpen. Organoid systemen, die beschouwd als beter recapituleren de ontwikkeling van de menselijke hersenen vanwege hun 3D natuur en overzichtelijke structuur weergegeven zijn, bevatten een voorvader zwembad dat is gebruikt om te bestuderen van enkele van deze eerdere gebeurtenissen. Echter de voorlopercellen bevolking in organoids is vaak schaars en meer als radiale gliacellen dan neurale stamcellen of voorlopercellen cellen5,-15. Dus, zou het zinvol zijn om een hoge doorvoersnelheid methode om te studeren van de vroege stadia van neurologische in een actief proliferatieve-celpopulatie.

In het lab, hebben we een protocol dat gebruikmaakt van hiPSC afkomstige neurale voorlopercellen (NPC), een gemengde bevolking van neurale stamcellen en voorlopercellen thats zeer proliferatieve, om neurologische processen zoals proliferatie, cel migratie, te bestuderen en eerste proces (neurite) met de extensie. Deze testen werden ontwikkeld op basis van gebruikte technieken in ons lab voor decennia met succes studeren neurologische in rat en muis corticale culturen16,17,18,19,,20, 21,22,23. Nog belangrijker is, werd ook aangetoond dat fenotypes en regelgevende signalen die zijn gedefinieerd in de rat en muis cultuur-systemen sterk voorspellende van mechanismen die actief in vivo zijn zijn, met vermelding van de waarde van deze technieken16, 17,18,19,24. Na aanvankelijke differentiatie van hiPSCs naar NPC's laten deze methoden om vitale ontwikkelings processen in een kwestie van dagen te bestuderen. Deze methoden hebben veel voordelen: (1) zij vereisen wat geavanceerde apparatuur en zijn eenvoudig te implementeren, (2) de vele experimentele replicatieonderzoeken kunnen worden uitgevoerd in een korte periode van tijd, waardoor voor snelle bevestiging van de reproduceerbaarheid van de resultaten, en (3) cultuur variabelen zoals coating matrices, effecten van groeifactoren en activiteit van drugs kunnen snel en kosteneffectief worden getest. Bovendien, we profiteren van de reeds lang gevestigde rol van extracellulaire groeifactoren als kritische regelgevers van uiteenlopende ontwikkelings processen. NPC's werden blootgesteld Schakel developmental signalen die direct stimuleren gebeurtenissen zoals proliferatie, neurite uitgroei en cel migratie, en vonden dat ze het vermogen om te identificeren van de gebreken die niet herkenbaar in controle voorwaarden19 , 25 , 26 , 27 , 28. ook het gemak van de beoordeling van geneesmiddelen biedt een krachtige Laan precisie geneeskunde technieken om te testen van de werkzaamheid van verschillende therapeutische interventies vast te stellen. Dus, dit protocol vergemakkelijkt een hoge doorvoer, reproduceerbaar, en eenvoudige methode om te studeren van de vroege ontwikkeling van de hersenen, pathogenese van de ziekte en de potentiële positieve effecten van groeifactoren en drugs op neurologische fenotypen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. de veiligheidsprocedures en bioveiligheid kabinet onderhoud

  1. Veiligheidsprocedures bioveiligheidsniveau-2 (BSL-2)
    1. Volg de richtlijnen van de instelling op het werken met BSL-2 materialen. Beschikken over BSL-2 materialen overeenkomstig de praktijken van de instelling. Geven aan vergaderruimten en apparatuur die worden gebruikt voor BSL-2 materialen. Alle persoonlijke beschermende uitrusting dragen (PPE), met inbegrip van laboratoriumjas en handschoenen.
  2. Bioveiligheid kabinet onderhoud
    1. Gebruik een kabinet van de bioveiligheid gecertificeerd voor gebruik van BSL-2 niveau materialen.
    2. Het UV-licht in het biosafety zet kabinet gedurende ten minste 15 minuten, en dan spuiten oppervlakken met 10% bleekwater oplossing. Laat de bleekwater oplossing te zitten voor 15 min, veeg neer het kabinet, en zet op de luchtstroom vóór gebruik.
  3. Radioactieve tritiumhoudend [3H]-thymidine (Tritium) veiligheidsprocedures
    Opmerking: Tritium is een radioactieve bron van rubriek 5, 'de meest onwaarschijnlijke gevaarlijk' categorie. Volg de richtlijnen van de instelling voor het werken met radioactiviteit. Sommige instellingen mogelijk certificeringen of toestaat om tritium.
    1. Opleiding ontvangen door de instelling over het correct verwerken en vervreemden van tritium. Verwijdering van radioactief afval in de juiste recipiënten, volgens het beleid van de instelling. Draag PPE bij het werken met tritium.

2. neurale inductie van iPSCs

Opmerking: Om NPC's, een enigszins gewijzigde versie van een protocol bij een commercieel beschikbare neurale inductie kit werd gevolgd. De kit bestaat uit Neurobasal (NB) media en een 50 x neurale inductie Supplement (NOS), die wordt gebruikt voor het maken van een 1 x neurale inductie Medium (NIM). NIS wordt ook gebruikt voor het maken van 100% uitbreiding Medium (zie punt 3.1). Een link naar het protocol komt voor in de materialen en uitrusting en referenties sectie43.

  1. Passage iPSCs wanneer ze 70-80% heuvels.
  2. Plaat 300.000 iPSCs in 1 goed van een hESC-gekwalificeerde extracellulaire matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) bekleed 6-well plaat met 2 mL van iPSC feeder-gratis medium met 5 μM van ROCK-remmer. Zie punt 3.2 voor instructies over het coating putjes met ECM-mimic gel.
  3. Een dag later, verwijder de iPSC medium + ROCK-remmer en wassen iPSCs een keer met 1 x PBS. Voeg 2 mL NIM toe aan de iPSCs.
    Opmerking: 50 mL NIM is gemaakt door toevoeging van 1 mL 50 x NIS en 250 µL (50 eenheden/mL, 5 μl/mL) van penicilline/streptomycine (P/S) 49 ml NB Media.
  4. Verandering media van de neurale inductie om de 2 dagen door zuigen doorgebracht middellange en vervangen met 2 mL NIM tot cellen worden confluente (ongeveer 4-5 dagen). Media dagelijks veranderen, zodra de cellen worden confluente.
  5. Passage cellen na 7 dagen in de NIM en plaat in een ECM-mimic gel gecoate 6-well plaat met 2 mL 100% uitbreiding Media en 5 μM ROCK-remmer. De cellen worden beschouwd als Passage 0 (P0) NPC's op dit punt. Zie sectie 3.1 hieronder voor instructies voor het maken van 100% uitbreiding Media.
  6. Passage cellen met behulp van de methoden beschreven in punt 3.4. Wacht tot cellen P2 hebben bereikt en confluente zijn voordat distantieert om de vlek voor NPC merkers en beplating voor experimenten (Figuur 1).

3. cultuurmedia, Coating en onderhoud van NPC 's

  1. De voorbereiding van de media voor onderhoud van NPC's (100% uitbreiding Media):
    1. Breng 50 mL 100% uitbreiding Media door het combineren van 24,5 mL van DMEM/F12 met 24,5 mL NB.
    2. Voeg 1 mL 50 x NIS op de DMEM/F12 + NB oplossing. 250 μL van P/S oplossing aan media toevoegen.
      Opmerking: Media kan worden gekoeld (4 ° C) en gebruikt voor maximaal 2 weken. Kleinere volumes van media kunnen worden gemaakt door het aanpassen van de hoeveelheid DMEM / F12 + NB + NIS met behulp van de dezelfde verhoudingen wat betreft het volume van 50 mL.
  2. Voorbereiding van ECM-mimic Gel gecoate cultuur platen voor NPC onderhoud
    1. Aliquot ECM-mimic gel op het volume die nodig is om 6 mL van de werkoplossing. Bereken het volume van de hoeveelheid door te kijken naar het certificaat van analyse blad aangezien ECM-mimic gel verdunningsfactor varieert van charges en veel te veel.
    2. Ontdooi een aliquoot deel van ECM-mimic, gel op ijs en ontbinden in 6 mL koude DMEM/F12 media.
    3. Voeg 1 mL ECM-mimic gel/DMEM/F12 oplossing aan elk putje van een 6 goed plaat. Incubeer de 6-well plaat met ECM-mimic gel-oplossing gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    4. ECM-mimic gel oplossing gecombineerd na 30 min van incubatie en vervangen door 100% uitbreiding Media of koelkast platen (4 ° C, maximaal 1 week) zonder zuigen ECM-mimic gel-oplossing.
  3. Onderhoud van NPC 's
    1. Plaat NPC's bij een dichtheid van 1,5 miljoen cellen in een ECM-mimic gel beklede putje met 2 mL 100% uitbreiding Media.
    2. NPC's incuberen bij 37 ° C in een vochtige omgeving met 5% CO2.
    3. Voeg 5 μM van ROCK-remmer tot de media voor NPC's op P3 of lager, of ontdooide NPC's, om te voorkomen dat buitensporige celdood. Media wijzigen na 24 h te verwijderen van de ROCK-remmer.
    4. Passage cellen elke 4-9 dagen, afhankelijk van wanneer ze worden confluente. Cellen worden confluente beschouwd wanneer ze een dichtbevolkte verpakt enkelgelaagde die betrekking hebben op de gehele onderkant van de schotel oppervlakte.
    5. Plaat van NPC's bij een dichtheid van 1 tot 1,5 miljoen cellen per één putje van de plaat van een 6-well (zie punt 3.4). Verbruikte media elke 48 uur te verwijderen en te vervangen met 2 mL 100% uitbreiding Media.
  4. Heffen, distantiëren en Pellet NPC's voor onderhoud en/of Plating voor experimentele omstandigheden
    1. Gemiddeld, wassen cellen één keer met 1 x PBS gecombineerd. PBS gecombineerd en voeg 500 l 1 x cell detachement oplossing in 1 goed van confluente NPCs. Incubate gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
    2. Voeg 500 l kamertemperatuur (RT) PBS en spoel het goed met behulp van een pipet P-1000 om verwijdering van cellen. De cellen + PBS oplossing in een conische buis 15 mL verzamelen. Wassen van de plaat weer met 1 mL PBS en vloeistof toe te voegen aan de buis.
    3. Draai de cellen naar beneden bij 300 x g gedurende 5 min naar pellet.
    4. Bovendrijvende vloeistof verwijderen uit de cel pellet en resuspendeer de cellen in 1-5 mL voorverwarmde DMEM/F12 media. Vul cellen met een dichtheid van 1 tot 4 miljoen cellen/mL van media. Kwantificeren van cellen met behulp van een hemocytometer.
    5. Plaat het vereiste aantal cellen, specifiek voor NPC onderhoud (punt 3.3) of de afzonderlijke test wordt uitgevoerd (Zie de volgende secties voor meer informatie).
    6. Cel schorsing volume met media zodanig aanpassen dat tussen 15 tot 100 μl van cellen worden gebruikt voor elke goed/schotel. Dit kleine plating volume zorgt ervoor dat er zelfs cel distributie en groeifactoren, drugs of substraten in het medium niet worden verdund.
    7. Incubeer de cellen bij 37 ° C. Media elke 48u voor NPC onderhoud wijzigen of de specifieke informatie voor individuele tests.
  5. Media voorbereiding voor experimentele omstandigheden (30% uitbreiding Media)
    1. De 100% uitbreiding Media verdunnen met 70% (30% genoemd expansie) door toevoeging van 1:1 DMEM/F12 + NB oplossing om media voor experimentele omstandigheden.
    2. 20 mL van 30% uitbreiding Media maken door toevoeging van 6 mL 100% uitbreiding Media en verdunnen met 7 mL NB en 7 mL van DMEM/F12 media. Voeg 5 µL/mL P/S oplossing.
      Opmerking: Als 100% media al P/S bevat, voegt u 5 μl/mL voor gecombineerd-DMEM / F12 + NB (14 mL) = x (5 μl/mL) = 70 μL van P/S in plaats van 100µL.
    3. Coating substraten en groeifactoren op gewenste concentraties tot de 30% uitbreiding Media toevoegen.

4. beoordeling van de DNA-herstelsynthese, S-fase invoer en cel nummers van NPC 's

  1. Voorbereiding voor DNA-synthese, vermelding van de S-fase en cel nummer Assay
    1. Maak een 1 mg/mL stockoplossing van poly-D-lysine (PDL) in dH2O en filter steriliseren. Verdunnen 1:10 in dH2O 300 μL toevoegen aan elk putje van een 24 goed plaat of 1 mL tot een 35-mm schotel te maken een 0,1 mg/mL PDL oplossing. Incubeer gedurende 20 min op RT.
    2. Was de putjes PDL 3 keer voor 5 min met dH2O. Aspirate dH2O en voeg 300 μl per putje of 1 mL/schotel van laminin (5 μg/mL) verdund in 1 x PBS. Dekking van de platen met parafilm en bewaar in een steriele, bioveiligheid kabinet 's nachts op RT (12 tot 24 h).
    3. Bereiden van 30% uitbreiding Media (zie punt 3.5) na 12 tot 24 h. toevoegen voertuigen, groeifactoren, of drugs van belang bij de gewenste concentratie in volumes die minder dan 10% van de totale oplossing om te voorkomen dat NIS in de 30% verdunnen uitbreiding Medium.
    4. Was goed van de 24-well plaat tweemaal met 1 x PBS (elke 5 min). 1 x PBS gecombineerd en voeg toe 450 μL van media (zonder of met drugs/groeifactoren). Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 15 minuten voordat plating cellen.
    5. Voor elk experiment, 2-3 putten of instellen gerechten per voorwaarde.
    6. Plaat NPC's (zie punt 3.4):
    7. NPC DNA synthese Assay: 100.000 cellen per putje in een 24 goed bord
    8. S-fase Entry: 500.000 cellen/35 mm schotel
    9. Cel nummer Assay: 50.000 cellen per putje in een 24-well-plate
  2. Neurale voorloper cel DNA synthese Assay
    1. Plaat van 100.000 cellen per putje in een 24-well-plate en beoordelen in drievoud/conditie.
    2. Voeg radioactieve, tritiumhoudend [3H]-thymidine aan het kweekmedium (1,5 aanbevolen/mL) in elk putje na 46 h in cultuur. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
      Opmerking: Bij het gebruik van radioactieve materialen, opleiding van uw instelling, volg radioactiviteit veiligheid protocollen en vervreemden van radioactieve stoffen in de passende aangewezen afval recipiënten ontvangen.
    3. Verwijderen en goed beschikken over radioactief media na 2 h. toevoegen 300 μL van vooraf opgewarmd 0,25% trypsine-EDTA (0.5 mM) aan elk putje en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
    4. Inschakelen van de cel rooier (Zie materialen en apparatuur sectie) en de pomp en ervoor te zorgen dat de pompdruk lager dan 200 PSI is. Filtreerpapier plaats door de ruimte in de cel rooier en scheuren uit de juiste hoek ter gelegenheid van de afdrukstand.
    5. MCB buizen van cel rooier plaats in een lege 'leeg' lade en druk op prewash te bevochtigen het koffiefilter. Plaats van MCB buizen in monster wells en uitvoeren (start).
    6. Wanneer de cel rooier klaar is met het verzamelen van monsters, til klem en advance filtreerpapier herhalen voor alle sample sets. Prewash altijd in een lege, "lege" plaat.
    7. Droog filterpapier onder een lichtbron en bijbehorende flesjes in een lade instellen. Punch out papier chads in flesjes en voeg 2 mL vloeibare scintillatietelling cocktail aan elke flacon. GLB en label flesjes.
    8. Incubeer flesjes in vloeibare scintillatietelling cocktail voor ten minste 1 uur vóór het lezen van de graven per minute (CPM's) op een machine van scintillatie.
  3. NPC S-fase Entry Assay
    1. Zie punt 3.4 voor stappen te heffen, distantiëren, pellet en resuspendeer de cellen.
    2. Plaat 500.000 cellen per schotel in de 35 mm gerechten bereid in punt 4.1, slechts 1 schotel/voorwaarde voor deze stap.
    3. Agitate gerechten heen en weer in alle richtingen om een gelijkmatige verdeling van de cellen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 46 h cellen.
    4. Bereiden drie 35 mm platen bedekt met PDL/Laminin per voorwaarde na 24 h. Bijvoorbeeld, als er een 35 mm schotel van 30% uitbreiding Media en een 35 mm schotel van 30% uitbreiding Media + FGF (10 ng/mL) vervolgens jas 6 PDL/Laminin platen voor gebruik op de volgende dag.
    5. Voeg 2 μL/mL 5 mM EdU aan culturen na 46 h. Incubate gedurende 2 uur.
    6. Distantiëren- and -pellet van de cellen (zie punt 3.4). Resuspendeer de pellet cel in 3 mL 30% uitbreiding Media of 3 mL van 30% uitbreiding Media + gewenste groeifactoren/drugs.
    7. Plaat 1 mL per schotel op vooraf gecoate PDL/Laminin gerechten. Agitate gerechten heen en weer in alle richtingen om een gelijkmatige verdeling van de cellen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur dat de cellen zich te houden aan de schotel. Zie Figuur 2 voor een vereenvoudigde tijdlijn.
  4. Analyse van de S-fase Entry
    1. Herstellen van gerechten met ijskoude 4% Paraformaldehyde (PFA in 1 x PBS) voor 20 min. Vervolgens de afwas 3 keer voor 5 min met 1 x PBS.
    2. Voeg 1 mL 1 x PBS met 0,05% natriumazide ter voorkoming van bacteriële en schimmelinfecties groei. Cellen kunnen bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden worden opgeslagen als gerechten (verzegeld met parafilm) worden gehouden in de PBS + natrium Azide oplossing, hoewel niet alle immunologische antigenen zijn goed bewaard gebleven na lange vertragingen in de analyse.
    3. Cellen met behulp van een commerciële EdU reactie assay kit (zie protocol van de fabrikant). Vlekken van cellen met behulp van de DAPI of een ander nucleair marker, en beeld met behulp van fluorescentie microscopie.
    4. Beoordeling van de evenredigheid van EdU positieve cellen over totale levende cellen (totale celaantal) blind in 10 systematisch willekeurige velden (10 x). Neem geen dode cellen in de analyse.
    5. Gebruik zowel afbeeldingen met fase contrast en fluorescerende afbeeldingen te bepalen positieve EdU kleuring en om na te gaan welke cellen zijn dood of levend (Figuur 3).
    6. Graaf alle cellen die hebben beide glad en zelfs celmembraan in fase contrast instellingen en de kern van een grote door fluorescerende DAPI nucleaire vlek, als deze cellen zijn leven (figuur 3A-B).
    7. Uitsluiten van alle cellen die fase helder zijn, hebben een gebroken ongelijke celmembraan en hebben een kleine, verkorte kern zoals gevisualiseerd door DAPI TL beeldvorming, zoals deze cellen dood zijn (figuur 3A-B). Levende cellen voor expressie van EdU beoordelen door het identificeren van de cellen moeten helder fluorescerend EdU vlek die betrekking hebben op de gehele kern of gespikkelde fluorescerende vlekken in de kern (Figuur 3 c).
  5. NPC cel nummer Assay
    1. Na 2 dagen in cultuur, label en bereiden van 1,5 mL microcentrifuge buizen en 0,5 mL microcentrifuge buizen. Voeg in elke 0,5 mL-buis, 5 l Trypan blauw.
    2. Aan elk putje van een 24 goed plaat, verwijderen van middellange en voeg 200 μL van 1 x cell detachement oplossing en plaats in de incubator voor 10 tot 15 min.
    3. Na de toegewezen tijd, zodra cellen hebt opgeheven, voeg de gewenste hoeveelheid 1 x PBS aan elk putje.
      Opmerking: Doorgaans op dag 2, 300 μL van 1 x PBS aan toevoegen de goed met cellen plus 200 μl van het detachement oplossing, voor een totaal volume van 500 μL. Met extra cultuur incubatietijd, cellen naarmate meer confluente, verhogen verdunningsvolume als dit nodig is. Bijvoorbeeld op dag 4, voeg 500 l 1 x PBS en op dag 6, voeg 800 l 1 x PBS. Totale volumes meer 700 μL en 1 mL, respectievelijk.
    4. Pipetteer met behulp van een pipet P-1000, op en neer in elk goed 4 tot 5 keer naar de cellen verwijderen. Onderzoeken van de plaat onder een microscoop om ervoor te zorgen dat alle cellen hebben losgemaakt. Cellen naar 1,5 mL buizen overbrengen.
    5. Omkeren 1,5 mL buisjes met verdunde cellen 2 tot 3 keer. Dan neem een 50 μl aliquoot van cellen uit het midden van de buis en Voeg 0,5 mL buizen met Trypan blauw (zie 4.5.1).
    6. Pipetteer cell oplossing op en neer 2 tot 3 keer. Cellen toevoegen aan de hemocytometer en onmiddellijk te analyseren. Wacht langer dan 10 min mag celdood of de aanwezigheid van cellen die hebben genomen Trypan blauw verhogen.
    7. Voeg voorzichtig 10 µL van cel + Trypan Blue mengsel aan iedere zijkant van hemocytometer om te repliceren graven voeren. Cellen tellen met behulp van de fasecontrastmicroscoop. Tellen niet dode cellen of de donker blauwe cellen die Trypan blauw hebben overgenomen.
    8. Te verkrijgen van de cel Totaal aantal, gebruik het gemiddelde celaantal gerekend vanaf de 4 hoeken van de hemocytometer en toepassing van de volgende vergelijking:
      Bedoel celaantal x media volume (mL) x 10,000 = cel Totaal aantal per putje
    9. Gecombineerd en herhaal de procedure voor de overige wells. Het wijzigen van de media op de cellen die niet worden meegeteld, elke 48 h. Repeat assay op dagen 4 & 6.

5. NPC Neurite Assay

  1. Bereiding van gerechten en Media voor Neurite Assay
    1. Maak een 1 mg/mL stockoplossing van poly-d-lysine (PDL) in dH2O en filter steriliseren. Verdunnen 1:10 in dH2O Maak een oplossing van de PDL 0,1 mg/mL en 1 mL aan elk 35-mm gerecht toevoegen. Incubeer gedurende 20 min op RT.
    2. In de tussentijd bereiden 30% uitbreiding Media (zie punt 3.5) en 5 μg/mL (5 µL/mL) van fibronectine oplossing (1 mg/mL stockoplossing) toevoegen aan de media.
    3. Zodra de media is voorbereid, voertuigen, groeifactoren of toevoegen drugs van belang bij de gewenste concentraties.
      Opmerking: Het is beste voertuig, groeifactoren, of drugs, bij volumes toevoegen < 10% van de totale oplossing om te voorkomen dat de verdunning van de fibronectine en andere onderdelen in het medium van de uitbreiding van de 30%.
    4. Na 20 min, afwas PDL 3 keer voor 5 min met dH2O te verwijderen overtollige PDL. Zorgen gerechten zijn droog alvorens toe te voegen media.
    5. 1 mL van media (met of zonder drugs/groeifactoren) + fibronectine oplossing in elk PDL gecoate schotel plaatsen.
    6. Incubeer gerechten bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór de cellen om te zorgen voor goede bevestiging van de fibronectine aan de PDL plating.
    7. Instellen voor elk experiment, 2-3 gerechten per voorwaarde (bijvoorbeeld, 3 voertuig-bevattende gerechten, 3 drug-bevattende gerechten).
  2. NPC's plating voor Neurite Assay
    1. Zie punt 3.4 voor stappen te heffen, distantiëren, pellet en resuspendeer de cellen.
    2. De cellen van de plaat 50.000 per schotel in de gerechten bereid in hoofdstuk 5.1. Agitate gerechten heen en weer in alle richtingen om een gelijkmatige verdeling van de cellen.
    3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 48 h cellen.
  3. Analyse van Neurites
    1. Na incubatie cellen voor 48 h, gecombineerd medium en herstellen van gerechten met ijs koud 4% PFA voor 20 min.
    2. Na 20 min, afwas 3 keer voor 5 min met 1 x PBS. Na de definitieve wash, voeg 1 mL 1 x PBS met 0,05% natriumazide.
    3. Analyseren gerechten blindelings op een fasecontrastmicroscoop op 32 X. Totaal aantal cellen en cellen met neurites in 3, 1 cm rijen, willekeurig gekozen maar reproduceerbare posities tellen. Een minimum van 150 cellen per schotel om passende bemonstering tellen.
      Opmerking: Een neurite is gedefinieerd als verlengstuk (proces) uit de cel lichaam thats > 2 cel lichaam diameters in lengte. Voor cellen met meerdere processen, wordt het langste proces overwogen voor het criterium. Cellen met processen die zijn < 2 cel lichaam diameters in lengte zijn niet inbegrepen (Figuur 4).
    4. Voeg samen het totale aantal cellen en het totale aantal cellen met neurites in elk gerecht. Bereken het % van de cellen met neurites. Het gemiddelde van het percentage cellen met neurites over repliceren gerechten. Vertrouwen in experimentele reproduceerbaarheid wordt ingesteld wanneer alle rijen binnen elk gerecht vergelijkbaar zijn, en gemiddelden onder gerechten zeer gelijkaardig, met de standaardfout van het gemiddelde (SEM zijn) < 10%.
    5. U kunt ook het analyseren van neurites door het uitvoeren van immunocytochemie voor markeringen zoals beta-III-tubuline (TUJ1) of MAP2. Na kleuring voor de markering van belang, nemen 10 systematisch willekeurige beelden op een fluorescente microscoop op 10 X Het imago van ten minste 200 cellen. In dit geval, verwerven de beelden niet te dicht aan de rand van de schotel. Analyseer het percentage cellen met TUJ1 of MAP2 + neurites (Zie Figuur 10 voor een voorbeeld).

6. NPC Neurosphere migratie Assay

  1. Neurosphere vorming
    1. Voeg 1 mL 100% uitbreiding Media in een 35-mm schotel met geen substraat coating. Incubeer gerechten gedurende ten minste 15 minuten bij 37 ° C voordat plating NPCs. voorbereiden 2-3 gerechten om ervoor te zorgen dat er voldoende neurospheres voor de cel migratie assay.
      Opmerking: De afwezigheid van een substraat coating zorgt ervoor dat NPCs blijft geschorst in de media, die essentieel is voor de vorming van de neurosphere. Coating gerechten voorkomt de vorming van de neurosphere.
    2. Zie punt 3.4 over stappen naar heffen, distantiëren en pellet cellen. Resuspendeer de pellet cel in 2-5 mL voorverwarmde 100% uitbreiding Media. Plaat 1 miljoen NPC's in elk 35-mm gerecht bereid in punt 6.1.1.
    3. NPC's incuberen bij 37 ° C gedurende 48 tot 96 uur zodat NPC's bij het aggregaat en het formulier neurospheres. Bol grootte met behulp van een levende liniaal op een fase contrast Microscoop te beoordelen. Wachten op de meeste terreinen te bereiken van een geschatte diameter van 100 µm (± 20 μm) (Figuur 5). Kleinere bollen zal volledig verspreiden en splitsen tijdens de migratie-bepaling.
  2. Voorbereiding van platen voor Neurosphere migratie Assay
    1. Los ECM-mimic gel aliquots (zie punt 3.2) in 6 mL 30% uitbreiding Media. Eenmaal ECM-mimic gel/30% uitbreiding Media oplossing is bereid, voertuigen, groeifactoren of drugs van belangen toevoegen op de gewenste concentraties.
      Opmerking: Voertuig-, drugs- en groeifactor concentraties moeten worden verhoogd tot de account voor de toevoeging van 200 µL van neurospheres in punt 6.3.
    2. Plaat 1 mL van de ECM-mimic gel /30% uitbreiding Media oplossing (± voertuigen, groeifactoren, of drugs) in één putje van de plaat van een 6-well. 2-3 wells per experimentele voorwaarde maken Als alternatief, 35-mm gerechten kunnen worden gebruikt. Incubeer de platen gedurende ten minste 30 minuten bij 37 ° C.
      Opmerking: De ECM-mimic gel/30% uitbreiding Media oplossing voor deze test niet gecombineerd. Plating bollen op een aanzuiging ECM-Mimic gel zal leiden tot snelle en overtollige omschakeling.
  3. Beplating Neurospheres
    1. Verzamelen neurospheres gevormd in punt 6.1 en plaats ze in een conische buis. Wassen van de 35 mm gerechten met 1 mL 1 x PBS om alle neurospheres worden verzameld. Spin down de verzamelde neurospheres bij 100 x g gedurende 5 min.
    2. Resuspendeer de neurospheres in 1-3 mL voorverwarmde 30% uitbreiding Media. Als 1 schotel van neurospheres wordt verzameld, wordt 1 mL van media gebruikt om resuspendeer sferen. Als 2 gerechten worden verzameld, 2 mL media worden toegevoegd aan resuspendeer bollen, etc. Pipetteer voorzichtig en gebruik alleen een P-1000 om de bollen zijn geen verbroken koppelingen.
    3. Plaat 200 μl van de geresuspendeerde neurospheres in de ECM-mimic gel/30% uitbreiding oplossing gemaakt in punt 6.2. Rock platen in alle richtingen gelijkmatig verdelen neurospheres. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37° C.
    4. ECM-mimic gel/30% uitbreiding Media oplossing verwijderen en herstellen van cellen in 4% PFA, wassen en houden cellen in 1 x PBS + 0,05% natriumazide.
  4. Analyse van Neurospheres
    1. Verwerven van beelden van hele neurospheres met fase contrast instellingen bij 10 X. Zorgen bollen elkaar niet raken. Gemiddelde migratie de ImageJ softwarematig te meten.
    2. De buitenomtrek van de neurosphere met het gereedschap vormlijn te traceren. De vormlijn kan worden geopend door met de rechtermuisknop op het pictogram "rechte" lijn. Handmatig traceren met behulp van een muis.
    3. Gebruik de functie voor het berekenen van de oppervlakte van het spoor. Zorg ervoor dat "ruimte" is geselecteerd als een uitlezing in het venster van de "Set metingen" te vinden onder het tabblad analyseren. Zie afbeelding 6 voor tracering van buitenomtrek in blauw.
    4. De innerlijke cel massa van de bol en maatregel gebied te traceren. Zie afbeelding 6 voor tracering van innerlijke contour in het rood. Gemiddelde migratie te kwantificeren door af te trekken van de massa van de innerlijke cel van het totale neurosphere-gebied.
    5. Maatregel neurospheres die een dichtbevolkte verpakt inner cell mass met cellen migreren vertonen uit als een aaneengesloten tapijt (Figuur 6).
    6. Neem geen cellen buiten het tapijt of los van de neurosphere voor het meten. Zie Figuur 6 voor voorbeelden van cellen (omcirkeld in wit) die worden uitgesloten van de buitenste tapijt-meting. Een minimum van 20 neurospheres voor elke voorwaarde te analyseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel van deze studies is om te definiëren van de proliferatieve activiteit van de NPC's, dat wil zeggen, een toename van de cel nummers. Dit wordt bereikt door het beoordelen van de synthese van DNA van de cel Totaal bevolking, een high-throughput aanpak die maatregelen voor de opneming van radioactieve tracer tritiumhoudend thymidine in cel extracten, en weerspiegelt alle cellen die zich bezighouden met de S-fase, of ze nu synthese voor 5 minuten of de hele twee uur. Deze tests kunnen bovendien de bepaling van het aantal cellen dat de S-fase en de cel totaal getallen, een meer arbeidsintensieve kwantitatieve analyse van enige cellen invoert. Cellen synthetiseren DNA in de S-fase, een stap die voorafgaat aan de mitose en celdeling, die plaatsvinden moet teneinde cel nummers. Aangezien deze processen enige tijd duren, kunnen veranderingen in DNA-herstelsynthese beoordeeld op 48 uur niet worden geassocieerd met veranderingen in cel nummers op dit tijdstip. Toch bleek dat veranderingen in DNA-herstelsynthese 48 uur betrouwbaar verhogingen van cel nummers dagen 4 en 6 voorspellen.

Bij de beoordeling van DNA-synthese, cellen zijn vergulde bij een dichtheid van 100.000 cellen (~ 50% heuvels) in een 24-well-plaat en zijn toegestaan om te groeien gedurende 48 uur alvorens metingen. Deze dichtheid zorgt ervoor dat de cellen lijken op hun enkelgelaagde omgeving, maar ook groeien niet zo snel in een periode van 48 uur die de media te zuur wordt. Media die te zuur is kan aanzienlijk beïnvloeden celmetabolisme en dus veranderen proliferatie resultaten. Als specifieke cellijnen zeer proliferatieve zijn, de onderzoeker moet overwegen celdichtheid, media volume, veranderen of media uitwisselen frequentie om te voorkomen dat zeer zure omstandigheden. Als voorwaarden worden gewijzigd, is het essentieel om consequent te zijn bij het vergelijken van verschillende cellijnen omdat cel-naar-cel contact afhankelijke zeker groeicijfers wijzigingen. Het eenvoudige ontwerp van deze tests kan wij testen verschillende groeifactoren. Zoals te zien in Figuur 7, de toevoeging van de fibroblast groeifactor (FGF, 10 ng/mL) voor verhoogt 48 uur DNA-synthese door ~ 40%. Bovendien, de DNA synthese assay is reproduceerbaar als alle klonen en individuen tonen een toename in de DNA-herstelsynthese na FGF stimulatie. Het potentieel voor de variabiliteit van de basislijn en FGF gestimuleerd DNA-herstelsynthese onder verschillende onaangetast individuen, evenals het potentieel voor klonen variabiliteit in dezelfde persoon wordt geïllustreerd in tabel 1. Als gevolg van deze variabiliteit is het belangrijk om te testen van meerdere iPSC klonen per individu, evenals het beoordelen van een minimum van 3 tot en met 5 NPC lijnen afgeleid van elke verschillende iPSC-kloon. Een minimum van 3 experimenten voor elke regel van de NPC werd uitgevoerd.

De DNA synthese assay laat ons toe om snel te beoordelen verschillende experimentele groepen in een high-throughput mode en de maatregel weerspiegelt de totale som van de DNA-herstelsynthese ongeacht de duur van de S-fase (5 minuten tot 2 uur). Als u wilt definiëren het aantal cellen die zich bezighouden met de S-fase, de S-fase vermelding assay werkte. Voor deze test, cellen worden gekweekt op de dezelfde dichtheid zoals eerder vermeld dat enkelgelaagde-achtige dynamics optreden, maar dan zijn ze losgekoppeld na 2 dagen en toegestaan te kort houden aan platen eencellige analyse uit te voeren. Cellen in een enkelgelaagde tellen kunnen moeilijk te wijten aan hoge cel-naar-cel contact en regionale variabiliteit in de plaat. Dit paradigma toelaat ons om de cellen als een enkelgelaagde model en dan het analyseren van hen als afzonderlijke cellen. Het fungeert ook als een methodologisch onafhankelijke bevestiging van gegevens die zijn verkregen in de DNA synthese assay. Zoals te zien in Figuur 8, verhoogt 48 uur van FGF (10 ng/mL) stimulatie het aantal cellen in de S-fase met ~ 25%.

Bij de beoordeling van cel nummers, wordt een lagere celdichtheid gebruikt dan in de eerder genoemde tests, met 50.000 cellen wordt verguld per putje van een 24 goed plaat. Nogmaals, deze dichtheid werd gekozen om ervoor te zorgen dat sneller cellijnen niet zo snel in de 6-daagse periode groeien dat de pH van het medium te zuur wordt en kleur omslaat naar geel. In Figuur 9, terwijl cel nummers mogelijk niet significant verschillend tussen controle en FGF (10 ng/mL) groepen op 2 dagen, de veranderingen in DNA-herstelsynthese in 48 h (Figuur 7) zijn voorspellende van veranderingen in cel nummers op 4 en 6 dagen.

Terwijl NPC's meestal bij hoge dichtheid gekweekt worden, wordt de neurite-test uitgevoerd bij een dichtheid van 50.000 cellen verguld in een 35-mm schotel ter beoordeling van de afzonderlijke cellen. Zelfs bij deze lage dichtheid, de NPC culturen uitdrukkelijke cytoskeletal eiwitten en transcriptiefactoren karakteristiek van NPC's zoals NESTIN, SOX2 en PAX6 (Figuur 10 A-D). Dit geeft aan dat een lage dichtheid culturing aanzienlijk niets cel lot in dit tijdsbestek verandert. Bovendien zijn vergelijkbare lage dichtheid omstandigheden gebruikt in de rat en muis cultuur systemen te detecteren fenotypen die uiteindelijk reproduceerbaar in vivo16,17,18,19waren, 20,21,22,23. Na 48 uur incubatie, een klein deel van NPC's beginnen uit te breiden van neurites, zoals te zien in Figuur 11 a en B, en gekwantificeerd in de grafiek in figuur 11C. Het aantal cellen dat uitbreiding van de neurites, de lengte van neurites en het aantal neurites/cel kan worden gemeten om te beoordelen van ontwikkelingsstoornissen parameters. Om nauwkeurig beoordelen het percentage cellen met neurite uitgroei, is het belangrijk dat de cellen zijn verguld als afzonderlijke cellen of clusters van < 5 cellen en niet zo grote aggregaten. Zoals te zien in Figuur 10 E-F, express ook rekening houdend met neurites (witte pijl) cellen onvolwassen neuronale marker bèta-III tubuline (TUJ1). Zoals vermeld in de methoden, fluorescerende beelden van TUJ1 NPC's gekleurd kunnen worden verkregen en vervolgens deze beelden kunnen worden geteld voor het aandeel van TUJ1 + neurites om neuronale oorsprong van processen. In ons lab hebben analyses van beide methoden statistisch soortgelijke resultaten opgeleverd.

Het eenvoudige ontwerp en de snelle aard van de neurite-bepaling ook laten te testen van de effecten van ontwikkelingsachterstand relevante groeifactoren en cytokines peptiden. Figuur 11 ziet u bijvoorbeeld dat de neuropeptide hypofyse adenylaat cyclase activeren polypeptide (PACAP, 3 nM) verhoogt neurite uitgroei in NPCs. PACAP is een belangrijke developmental factor die heeft brede expressie in het VNV en is aangetoond dat zijn belangrijk in de ontwikkeling van de hersenen. Knaagdier studies in ons lab en andere laboratoria hebben gevonden dat PACAP wijdverspreide fase-afhankelijke developmental effecten is zoals regulering van neurite uitgroei, migratie en proliferatie in zowel de hindbrain en reukkolf16,22, 29,30,31. Recente studies van Ataman et al. (2016) met behulp van gekweekte menselijke foetale cellen van de corticale wijzen erop dat Neuronale activiteit een 9-fold stijging van de PACAP genexpressie induceert, die de peptiden belang in de ontwikkeling van menselijk neuronale32aangeeft. Inderdaad, tabel 2 toont het percentage van de neurites in controle- en PACAP (3 nM) voorwaarden tussen talrijke lijnen onaangetast individuen ontleend. Zoals vermeld in tabel 2, is er sommige variabiliteit in het percentage van neurites uitgedrukt in cellijnen die zijn afgeleid van verschillende klonen van dezelfde persoon en van NPC's afgeleid van verschillende individuen. Deze onaangetast individuen hebben echter een toename in neurite uitgroei in reactie op PACAP, met vermelding van de reproduceerbaarheid van de tests.

Als uitvloeisel van de neurite is de cel migratie een belangrijk developmental proces essentieel voor de juiste verbinding, de organisatie en de bedrading van de hersenen. Neurospheres ons in staat stellen te bestuderen van NPC migratie in een typische high-density aandoening die contacten van de cel onder NPC's (Figuur 12 onderhoudt). Ontwikkelingsachterstand relevante factoren kunnen ook worden getest op neurospheres om te beoordelen van de gevolgen daarvan voor migratie. Bijvoorbeeld, Figuur 12 laat zien dat PACAP (10 nM) verhoogt de migratie van NPC's.

Figure 1
Figuur 1: NPC's bij passage 3. NPC's op P3 express meerdere fase-specifieke markeringen met inbegrip van (A) pluripotente transcriptiefactor, SOX2 (B) transcriptiefactor specifiek voor reukkolf NPC's, PAX6, en NPC cytoskeletal eiwit NESTIN. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: schematische van de S-fase vermelding assay. Tijdlijn van de S-fase Entry Assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: kwantificeren van de S-fase vermelding. (A) fase afbeelding weergegeven: fase-donker levende cellen (witte pijlen), een fase-heldere dode cel (witte ster) en een fase-helder-levende cellen (groene pijl). (B) TL DAPI vlek verkorte kern in een dode cel (witte ster) en grote kernen in een levende cel (witte en groene pijlen) tonen. (C) TL EdU afbeelding toont helder EdU positieve kernen (rode pijl) en gespikkelde EdU positieve kernen (rode ster). (D) fase en fluorescerende samenvoegen van afbeeldingen 3A - 3 C.

Figure 4
Figuur 4: identificeren neurites. Phase-contrast beelden van NPC. (A) A-cel met een proces > 2 cel organen in lengte, zo voldoen aan het criterium voor een neurite. (B) een cel met een proces < 2 cel organen in lengte, en daarom niet beschouwd als neurite-peiling. (C) geeft een cel met 2 processen-de langere proces wordt beoordeeld voor het criterium van de neurite. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: selecteren van neurospheres voor migratie assay. (A) fase contrast foto van een representatieve veld van neurospheres op 24 h. bollen zijn alle minder dan 100 μm en dus niet verzameld voor de bepaling van de migratie. (B) fase contrast afbeelding van een representatieve veld van neurospheres bij 72 h. Alle gebieden zijn gasgroep 100 μm ± 20 µm, die aangeeft dat ze zijn klaar om te worden verzameld voor de bepaling van de migratie.

Figure 6
Figuur 6: kwantificeren van de migratie. (A) fase contrast afbeelding van een representatieve neurosphere. (B) blauwe omtrek wordt weergegeven op het spoor voor het meten van de totale neurosphere gebied. Rode toont de contour gebruikt voor het meten van het gebied van de innerlijke cel massa. Migratie is gedefinieerd als totale neurosphere gebied-inner cell mass gebied. Opmerking, de witte cirkels wijzen naar cellen die zich niet in een aaneengesloten tapijt, zoals deze cellen zijn uitgesloten van de migratie contouren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: beoordeling van de DNA-herstelsynthese. Representatieve resultaten van besturingselement versus FGF-behandelde NPCs. FGF (10 ng/mL) verhogingen DNA-herstelsynthese in 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 putten/groep/experiment; 3 experimenten). Foutbalken vertegenwoordigen SEM.

Figure 8
Figuur 8: aantal cellen S-fase. (A) fase contrast beelden van NPC cellen geïncubeerd in control versus FGF (10 ng/mL) behandelde media voor 48 h. inzetstukken beelden met een hogere vergroting van cellen gekleurd voor fluorescerende EdU marker in controle en 10 ng/mL FGF media vertegenwoordigen. Rode pijlen wijzen cellen die EdU positieve en witte pijlen geven aan cellen EdU negatieve zijn. (B) grafiek van representatieve resultaten van besturingselement versus FGF (10 ng/mL) behandeld NPCs. FGF verhogingen S-fase vermelding bij 48 h (p ≤1 x 10-3). (n = 2-4 gerechten/groep/experiment; 3 experimenten). Foutbalken vertegenwoordigen SEM.

Figure 9
Figuur 9: opsommen van cellen op dagen 2, 4 en 6. (A) fase contrast beelden van cellen in controle en FGF (10 ng/mL) behandelde media dagen 2, 4 en 6. (B) grafiek van representatieve resultaten; Opmerking dat FGF (10 ng/mL) niet altijd cel nummers op 2 dagen toeneemt, maar op 4 en 6 dagen verhogingen zijn herkenbaar (p ≤0.05). (n = 2-4 putten/groep/experiment; 3 experimenten). Foutbalken vertegenwoordigen SEM.

Figure 10
Figuur 10: karakterisering van NPC's in lage dichtheid voorwaarden. (A, C, E) Fase contrast beelden van NPC's in lage dichtheid voorwaarden. (B) NPC's express stam/progenitor cel markeringen NESTIN (groen), SOX2 (rood) en nucleaire marker DAPI (blauw). (D) PAX6 (rood), DAPI (blauw). (F) bij lage dichtheid, cellen ook uitbreiding van de neurites (witte pijl) express onvolwassen neuron marker TUJ1 (groen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 11
Figuur 11: Neurite uitgroei. (A) fase contrast foto van NPC's. De zwarte pijlen wijzen naar de cellen met neurites. (B) toevoeging van neuropeptide PACAP (3 nM) verhoogt het percentage cellen met neurites (p ≤1 x 10-2). (C) kwantificering van neurite uitgroei in controle en 3 nM PACAP met media. (n = 2-4 gerechten/groep/experiment; 3 experimenten). Foutbalken vertegenwoordigen SEM.

Figure 12
Figuur 12: Neurosphere migratie. (A) fase contrast beelden van neurospheres. (B) toevoeging van PACAP (10 nM) verhoogt de neurosphere cel migratie (p ≤10-2) (C) kwantificering van cel migratie. (n = 20 bollen/groep/experiment, 3 experimenten). Foutbalken vertegenwoordigen SEM.

Media
Patiënt Kloon # CTRL FGF
(10 ng/mL)
Patiënt 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
Patiënt 2 1 7,664 14,060
2 16,573 30,087

Tabel 1: DNA-herstelsynthese. Een overzicht van de waarden van de DNA-synthese (in CPM's) van NPC's afgeleid van twee iPSC klonen per twee individuën die al onaangetast.

Media
Patiënt Kloon # CTRL PACAP
(3 nM)
Patiënt 1 1 13.60% 18.10%
2 16,50% 21,10%
Patiënt 2 1 8,90% 14.10%
2 14.20% 21,10%

Tabel 2: Percentage cellen met Neurites. Een samenvatting van het percentage cellen neurites indachtig het NPC's afgeleid van twee iPSC klonen per twee individuën die al onaangetast.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De protocollen die hier gepresenteerd illustreren snelle en eenvoudige methoden om te studeren fundamentele neurologische processen en groeifactoren en drugs met behulp van hiPSC-afgeleide neurale voorlopercellen testen. hiPSC technologie heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van de pathogenese van neurologische ziekten door het verstrekken van ons met ongekende toegang tot levende menselijke neuronale cellen van getroffen individuen. Inderdaad, zijn er talrijke hiPSC studies van neurologische aandoeningen, met inbegrip van Rett syndroom, Timothy syndroom, Fragile X syndroom, en schizofrenie, die ziekte-specifieke afwijkingen in dendrites hebben opgegraven, synapses, en neuronale functie4,33,34,35,,36. De meeste van deze studies zijn voornamelijk gericht op terminaal gedifferentieerd, post mitotische neuronen die, hoewel beschouwd als relatief functioneel onvolwassen, sluit de studie van eerdere neurologische processen zoals proliferatie en migratie. Deze laatste processen zijn sterk betrokken bij de pathogenese van neurologische stoornissen en warrant verder studeren8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. het gebruik van NPC's laat ons toe om het bestuderen van deze belangrijke eerdere gebeurtenissen waarbij ook de mogelijkheid te onderzoeken van de meer volwassen processen zoals de mogelijkheid van cellen uit te breiden van onrijpe axonen/dendrites (neurites). Sommige van deze tests kan verder ook worden uitgebreid tot het bestuderen van andere parameters, zoals de lengte van de neurite, nummer, en vertakking of de verste afstand reisde door een cel.

Sommige nieuwere studies hebben organoid modelsystemen gebruikt bij het bestuderen van eerder developmental gebeurtenissen in een 3-D "mini hersenen systeem"1,39,40. Toch, zelfs in deze organoid systemen, de voorloper van de proliferatieve-celpopulatie wordt beperkt en vroege rijping en migratie zijn moeilijk te bestuderen15,39. Naast het beperken van de studie van eerder developmental fenomenen, het gebruik van gedifferentieerde terminaal neuronen of organoids is vaak tijdrovend, duur en beperkt het aantal variabelen die in het systeem kan worden beoordeeld. Dit is omdat het maken van neuronen en organoids voorschrijven virale inductie protocollen, speciale voorbroeders en apparatuur, meerdere weken tijd, en grote hoeveelheden media. In tegenstelling, met uitzondering van de DNA synthese assay (die richt ik later hieronder), dit protocol gemakkelijk kan worden toegepast op de studie van neurologische aandoeningen en vereist geen uitgebreide training, kostbare hulpmiddelen en middelen of software. Het gemak en de relatief lage kosten van het toevoegen van drugs en factoren die de groei in deze tests, maken dit protocol een handig high-throughput-technologie voor het testen van verschillende mogelijke behandelingen voor neurologische en neuropsychiatrische ziekten. Bovendien, omdat gedefinieerd groeifactoren act via cellulaire signaalroutes, ze kunnen ook worden gebruikt als instrumenten om te testen voor potentiële signalering van gebreken bij de ontwikkeling van systemen. Ten slotte, omdat NPC's een proliferatieve zichzelf vernieuwende bevolking zijn, grote hoeveelheden cellen kunnen worden geproduceerd en cryopreserved waardoor experimenten te efficiënt worden uitgevoerd zonder te hoeven maken van NPC's uit iPSCs elke keer.

Om deze testen met succes in dienst, is het belangrijk op te merken de volgende kritische stappen. Dit protocol legt NPC's in uiteenlopende omstandigheden voor onderhoud en de uitbreiding ten opzichte van de experimenten. Specifiek, terwijl de NPC's heeft veroorzaakt, verminderen gegroeid, en gepasseerd in medium met neurale inductie aanvulling (NOS), onze proefomstandigheden het supplement met 70%, waardoor de cellen in een beperkende omgeving beschikbaar, zodat ons de mogelijkheid toe te voegen terug en test de gevolgen van belangrijke factoren die de groei. In de tweede plaats is het essentieel om de passage van de NPC's bij te houden. In onze studies, hebben we over het algemeen beperkt passage nummer van de cellijnen van P3 - P8. Bij passages eerder dan P3, sommige lijnen doen niet krachtig te uiten karakteristiek markeringen. Op de hogere passages, terwijl sommige cellijnen zeer consequent groeicijfers of reacties op factoren die de groei, kunnen andere cellijnen hebben dramatische veranderingen in de celgroei of reactie. Hoewel niet routinematig gerapporteerd, hebben wij, en vele anderen deze dramatische verandering in proliferatieve tarieven op de hogere passages ervaren. De reden kan voor dit onzeker is, maar deze wijziging een beperkte capaciteit van de zelf-vernieuwing van NPC weerspiegelen kan. definiëren van waarom en hoe de proliferatie tarieven uitgebreide passages overstappen inzicht verwerven in de ontwikkeling en pathogenese van de ziekte, maar verder onderzoek zal moeten worden gedaan. Tot slot, het commerciële neurale inductie-protocol die wij gebruiken kan soms opleveren slechte kwaliteit neurale stamcellen, met name als de startende iPSCs niet van hoge kwaliteit (dwz., hebben differentiatie van cellen aan de grenzen van de cel de kolonies, karyotype afwijkingen). In sommige gevallen vervormd is cel morfologie en expressie van markers is niet aanwezig. Gebruik niet deze culturen. In andere gevallen groeien NPC's met platter "verontreiniging" cellen, die kunnen worden verwijderd met behulp van een gedifferentieerde cel detachement oplossing behandeling om vrijwel zuivere NPC populaties voor gebruik in experimenten. Met kwalitatief hoogwaardige NPC's is essentieel voor goede resultaten: Zie de materialen en de apparatuur sectie voor een link naar een neurale inductie-Protocol waar beelden van hoge en lage kwaliteit NPC's kunnen worden gevonden.

Voor elk van de testen gepresenteerd, is het belangrijk op te merken de volgende kritische stappen, potentiële fouten en tips voor probleemoplossing. Voor het celaantal, DNA-synthese en neurite testen is het belangrijk naar plaat cellen als losgekoppeld van afzonderlijke cellen en niet als de bosjes, als dit kunnen laten uitvallen DNA synthese maatregelen, cellen en neurite gedrag. Om ervoor te zorgen dat klontjes van cellen zijn niet verguld, proef een klein volume van cellen met een P1000, plaat op een dia, en controleren of cel bosjes aanwezig zijn. Als klontjes zijn genoteerd, Pipetteer cellen op en neer om handmatig breken uit elkaar bosjes voordat plating. Voor de synthese van DNA en de cel nummer assay, worden cellen opgeheven met enzymen voor tellen en analyse. Het is cruciaal voor het visueel bevestigen cellen hebben volledig opgeheven van het vaartuig van de cultuur om nauwkeurige graven en indien nodig langere enzym incubatie periode kunnen worden gebruikt. In het geval van laag cellen of lage CPM's voor de DNA synthese assay, cellen kunnen worden uitplaten aan hogere initiële dichtheden, radioactieve tritiumhoudend [3H] - thymidine kan worden toegevoegd voor dubbele de tijd (4 uur in plaats van 2), of tritiumhoudend [3H] - thymidine concentratie kan worden verdubbeld. Voor de neurite assay, kan eerste plating dichtheid verdubbeld worden zonder het risico van verhoogde cel-naar-cel contact. Aandacht besteden aan de verdeling van de cellen in een schotel en 1 cm rijen tellen, zodanig dat elk deel van de schotel wordt bemonsterd. Als het neurite percentage te laag om 48 h is, de bepaling kan worden uitgebreid tot 6 dagen of het type coating substraat of concentratie kan worden gewijzigd om een groter percentage van neurites. Het is echter belangrijk op te merken dat de tijden van de coating en de methoden die we hebben ingediend in het protocol werden geselecteerd voor optimale neurite uitgroei en cell gezondheid na het testen van vele verschillende substraten, concentraties van het substraat en coating tijden. Voor de bepaling van de neurosphere, kan gebruik van kleinere pipettors (P20, P200) leiden tot de scheren en de breuk van grotere bollen. Het is dus noodzakelijk dat zachtjes en met een P1000 of een serologische pipet pipetteren gebeurt. Voor de neurospheres pillering, worden de lagere snelheden (100 x g in plaats van 300 x g) ook aanbevolen om te voorkomen dat neurosphere dissociatie. Tijdens de bol de beplating, waarborgen dat bollen uit elkaar op de juiste wijze worden verdeeld, zoals bol-aan-sfeer contact invloed op migratie uitoefenen kan. In gevallen waar migratie te snel of te langzaam is, kan incubatietijd worden verlaagd of verhoogd, respectievelijk. Coating substraten kunnen ook worden gewijzigd om de tarieven van de migratie gewijzigd.

Hoewel de gebruikte technieken snelle, eenvoudige en van toepassing op de studie van neurologische aandoeningen zijn, zijn er bepaalde beperkingen. Voor een, vereisen veel van de analyses gepresenteerd (cel nummer assay, neurite assay, migratie assay) onderzoekers subjectieve beslissingen te nemen (bijvoorbeeld, Is dit een neurite? Is deze cel dood?) mogelijk leidt tot onderzoeker bias en lagere reproduceerbaarheid. Echter het uitvoeren van analyses blind en de strikte normen van de instelling voor elke beslissing gemaakt binnen een assay, zoals geïllustreerd in de methoden, kan verbetering van deze vooroordelen. Ook vereisen deze tests handmatige metingen en tellingen, die tijdrovende en arbeid-intensieve worden kunnen. Echter in laboratoria die de apparatuur en de technische middelen, kunnen deze tests worden versneld met het gebruik van geautomatiseerde cel items en programma's die automatische metingen41,42kunnen uitvoeren. In het geval van de DNA synthese assay, deze methoden zijn specifiek voor onze cel harvester en scintillatie machine (Zie materialen en apparatuur); Er zijn echter andere beschikbare modellen en methoden die kunnen worden gebruikt om te krijgen dezelfde informatie, zoals de Omnifilter-95 cel rooier. Voor sommige instellingen, kan het gebruik van radioactieve bronnen niet haalbaar zijn. In dit geval zal een alternatieve methode met behulp van een fluorescerende thymidine analoog, zoals EdU, geanalyseerd op een fluorescerende microplate-lezer, zorgen voor de verwerving van de dezelfde informatie over bulk analyse van DNA synthese44.

Onze lage dichtheid cultuur systeem scheidt NPC's in afzonderlijke cellen of kleine bosjes, een aandoening die van de dichtbevolkte verpakt aard van NPC's in de ontwikkeling van de neurale buis verschilt. Toch, de NPC's zijn gezond en uitdrukkelijke passende markeringen (Figuur 1, , Figuur 10). Bovendien, onze voorafgaande studies van muis en rat corticale culturen waaruit parallel bevindingen in in vitro culturen en in vivo modellen geven het nut en de waarde van het gebruik van deze aanpak16,17,18 , 19 , 24. Bovendien, dit systeem biedt een krachtige aanpak te begrijpen van de rijping van cellen en bestuderen van de subpopulatie cel. Immunohistochemistry kan bijvoorbeeld plaatsvinden op de bepaling van de neurite om te bepalen welk type van bepaalde neuronale cel is een neurite uit te breiden. Uiteindelijk, ondanks enkele beperkingen, dit unieke protocol biedt eenvoudige, krachtige en snelle methoden om te bestuderen van neurologische stoornissen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door van de gouverneur van de New Jersey Raad voor medisch onderzoek en behandeling van autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markeert familie Stichting, Mindworks charitatieve Lead vertrouwen en de Stichting van de Joodse Gemeenschap van grotere Arizona NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9, (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20, (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60, (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320, (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66, (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94, (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155, (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171, (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474, (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155, (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33, (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139, (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21, (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29, (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72, (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26, (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66, (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90, (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5, (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33, (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39, (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10, (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47, (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539, (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23, (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20, (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45, (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15, (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22, (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1, (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5, (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics