신생아 마우스에서 내가 유전자 납품을 위한 후부 반원의 운하 접근

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

이 연구에서 우리 신생아 쥐에 있는 내가 유전자 납품에 대 한 신뢰할 수 있는 방법으로 후부 반원의 운하 접근 방식을 설명합니다. 우리 후부 반원의 운하를 통해 유전자 배달 전체 내가 perfuse 수 보여줍니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isgrig, K., Chien, W. W. Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse. J. Vis. Exp. (133), e56648, doi:10.3791/56648 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

내가 유전자 치료는 난청과 현기증에 대 한 잠재적인 치료로 큰 약속을 제공합니다. 내가 유전자 치료의 성공의 중요 한 결정 요인의 한 청력 손실을 최소화 하면서 타겟된 세포 유형의 일관 변환 효율 귀착되는 전달 방법을 찾는 것입니다. 이 연구에서 우리 신생아 쥐에 내가 유전자 납품을 위한 실행 가능한 방법으로 후부 반원의 운하 접근 방식을 설명합니다. 우리 후부 반원의 운하를 통해 유전자 배달 전체 내가 perfuse 수 보여줍니다. 후부 반원의 운하의 쉬운 해부학 식별 뿐만 아니라 필요한 측 뼈의 최소한의 조작, 게가 외과 접근 내가 유전자 납품을 위한 매력적인 선택권.

Introduction

내가 유전자 치료의 급속 하 게 발전 분야 이다. 그것은 다양 한 동물 모델에서 전투 ototoxicity, 소음 외상, 그리고 유전 청력 손실1에 적용 되었습니다. 여러 최근 연구의 청각과 균형 기능 기능 복구 돌연변이 생쥐에서 내가 유전자 치료 배달2,3,,45,6,7. 핵심 중 하나는 내가 유전자 치료의 성공을 내가 액세스 하는 데 사용 하는 외과 접근은 결정 요인. 이상적으로, 외과 접근은 실행 하기 쉬운 것, 해부학 랜드마크 일관 되 고 쉽게 식별, 것 및 타겟된 세포 유형의 결과 변환 높은 것입니다.

최근 연구에서 우리는 바이러스 성 유전자 치료는 whirler 돌연변이 마우스 (청력 손실과 vestibular 부전의 모델)의 후부 반원의 운하를 통해 주입 했다 때 감각 머리 세포의 효율적인 변환 보였다는 vestibular에 보였다 달팽이 관5에서 기관 뿐만 아니라. 감각 머리 세포 변환의 높은 효율 결과 이러한 돌연변이 생쥐에서 청각과 vestibular 기능 개선.

이 문서에서는, 우리가 자세히 설명 신생아 마우스 내가 액세스 하려면 후부 반원의 운하 접근.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

모든 동물 절차 동물 관리 및 사용 위원회 귀 먹음과 다른 커뮤니케이션 무질서 (NIDCD ASP1378-15)에 국가 학회에 의해 승인 되었다.

1. 절차 설치 및 준비

  1. 모든 악기는 실험의 시작 부분에서 에틸렌 산화에 의해 소독. 동물, 사이 악기 비드 살 균을 사용 하 여 청소.
  2. 마이크로-인젝터에 micropipette에 바이러스 성 유전자 치료를 포함 하는 솔루션을 로드 합니다. 이 연구에 사용 되는 바이러스 성 벡터는 AAV2/8-whirlin (1 x 10 밀리 리터, 당13 게놈 사본 자료의 표 참조).
    참고: 일반적으로, 1.1 µ L 총 볼륨은 micropipette에 로드 됩니다.

2입니다. 마 취

참고:이 연구에 사용 된 마우스 스트레인은 whirler 마우스. Homozygous 돌연변이 (Whrnwi/wi)와 heterozygous littermates (Whrn+ wi) 사용 되었다.

  1. 장소 (쓰레기 별도) 별도 새 장에 어머니.
  2. 쥐를 따뜻하게 유지 하는 반복 열 패드 (37.5 ° C에서 집합)에 쓰레기 (P0-P5 새끼)를 포함 하는 홈 케이지를 놓습니다.
  3. 라텍스 장갑의 손가락 부분을 잘라내어 그것에 강아지를 놓습니다.
  4. ~ 2 분 동안 얼음 양동이에 라텍스 장갑 엄지에 강아지를 놓습니다.
  5. 강아지와 팩의 표면 사이 4 "x4" 거 즈로 큰 광장 상업 플라스틱 고정 팩에 마 취 강아지를 놓습니다.
  6. 짓 눌린 얼음, 중장비 라텍스 장갑을 강아지 주위 얼음 장갑 장소.
  7. 강아지 (를 포함 하 여 회사 발가락 핀치) 다양 한 자극에 응답의 완전 한 부족에 의해 적절 하 게 취 경우 확인 합니다. 수술 (대략 5-10 분) 동안 얼음 팩에 강아지를 둡니다.
    참고: 수술 하는 동안 더 이상 15 분 동안 얼음 팩에 새끼를 떠나는 것이 좋습니다.

3. 수술 방법 (그림 1)

  1. 일단 동물 마 취는 요오드 지우기와 알코올 닦아 귀 뒤 피부를 청소.
  2. Postauricular 절 개 마이크로-가 위를 사용 하 여 뒤에 ~ 2 mm를 만들고 마이크로 위 sternocleidomastoid 근육을 나눕니다.
  3. 안 면 신경와는 물집 식별 합니다. 물집 및 반투명 연골이 나이에 이며 그것은 거짓말 안 면 신경에 중간. Stapedial 동맥 유용한 랜드마크이 나이에 물집을 통해 볼 수 있습니다.
  4. 머리 뒤로 안 면 신경에 따라 후부 반원의 운하 (PSCC)을 찾을. 근육 섬유와 부드러운 조직 overlying 후부 반원의 운하 마이크로-가 위를 사용 하 여 제거 합니다.
    참고:에서 PSCC는이 나이에 연골.
  5. PSCC 유리 제 micropipette (~ 10 μ m 직경에서)를 사용 하 여 마이크로-인젝터에 침투.
  6. 내가 바이러스 성 유전자 치료 주사.
    참고: 일반적으로, 49의 20 주사의 총 유전자 치료의 nL는 배달 후부 반원의 운하 ~ 40에 s (전체 볼륨 ~ 1 µ L). 사용 하는 바이러스 titer mL 당 1 x 1013 게놈 복사본을 했다.
  7. 5-0 polyglactin 봉합 사를 사용 하 여 피부 절 개를 닫습니다.

4. 수술 후 관리

  1. 정상 체온으로 지속적인 수동 자극/낀된 인간의 손가락으로 마 취에서 복구 하는 동안 복원 하 온난 패드에 강아지를 두십시오.
  2. 일단 강아지 깨어, 가정 그것의 감 금에 다시 놓습니다.
  3. 홈 케이지 침구에 노출은 면봉으로 각 강아지를 애 무.
    참고:이 목적으로 그들은 다시 그녀의 쓰레기 후 수술을 수락 하는 어머니의 가능성을 증가, 수술 전에 냄새 쥐를 것입니다. 만약에 가능 하다 면, 어머니 로부터 소변 수집 하 고 거부의 가능성을 더 감소를 면봉을 사용 하 여 강아지에 문질러 서 될 수 있습니다.
  4. 그녀의8, 감도를 어머니의 코에 광 유를 적용 하 고 집으로 어머니를 다시.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

주입 후부 반원의 운하를 통해 신생아 whirler 쥐로 AAV8 whirlin 유전자 치료의 결과 utricular 세포 (그림 2)에서 식 (그린) whirlin 53.1%의 전반적인 감염 효율 (SD 38.1, n = 28)5 . 머리 세포 transduced stereocilia (레드) contralateral 비 주입 귀에서 머리 세포에 비해 길쭉한 했다 (3.20 ± 0.34 µ m와 5.35 ± 2.11 µ m 각각)5.

AAV8 whirlin의 후부 반원의 운하 주사도 whirler 쥐 (그림 3)에 있는 달팽이 관 세포의 변환 결과. 평균 내 면 머리 세포 감염 효율성은 77.1% (SD 12.7, n = 8)5. 머리 세포 transduced stereocilia 팁 whirlin (녹색) 표현과 stereocilia (레드) contralateral 비 주입 귀에서 머리 세포에 비해 길쭉한 했다 (5.04 ± 0.72 µ m 인공 정점에 1.01 ± 0.08 µ m 대 각각)5.

Figure 1
그림 1 : 자가 이미지.
자가 이미지 P0 마우스에 수술에 대 한 액세스 후부 반원의 운하 (PSCC)을 보여주는. 왼쪽된 귀에 표시 됩니다. PSCC 검정 파선 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Vestibular 세포 PSCC 유전자 납품을 사용 하 여 불리고 있다.
PSCC 통해 전달 AAV8 whirlin 접근 utricular 머리 세포 감염의 높은 수준의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 인공 세포 PSCC 유전자 납품을 사용 하 여 불리고 있다.
PSCC 통해 전달 AAV8 whirlin 접근 달팽이 머리 세포 감염의 높은 수준의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

몇 가지 수술 방법은 설치류 내 귀에 액세스 하려면 설명 있다. Cochleostomy 및 둥근 창 접근 가장 일반적으로 사용 됩니다 달팽이 관에 액세스 하려면 반면 후부 반원의 운하 endolymphatic sac 접근은 일반적으로 사용 되는 및 vestibular 장기1에 액세스 하. 최근 연구에서 우리는 바이러스 성 유전자 치료의 고효율 vestibular 기관과 달팽이 관5에 머리 세포 변환의 결과 후부 반원의 운하를 보였다. 사실, 달팽이 머리 세포 변환 때 후부 반원의 운하 주사를 통해 더 높은 유전 청력 손실과 vestibular 부전5,9같은 마우스 모델에서 둥근 창 주사와 비교. 둥근 창과 달팽이 관 사이 해부학 근접을 감안할 때, 그것은 역설적 둥근 창 주사 후부 반원의 운하 주사에 비해 낮은 달팽이 머리 세포 변환 발생할 수 있습니다 보인다. 이 둥근 창 인공 수로 인접해 있다는 사실에 의해 설명 될 수 있습니다. 따라서, 바이러스 성 유전자 치료 라운드 창을 통해 주입 때 인공 수로10에서 오는 중추에 의해 그것의 농도 희석 수 있습니다.

찾는 후부 반원의 운하 주입 인공 와우 및 vestibular 머리 세포 변환 귀착되는 또한12다른 연구11,의해 보고 되었습니다. 오카다 외에의해 연구, AAV GFP 달팽이 관 및 vestibular 머리 셀의 변환으로 알려졌다. 그러나, 숫자 정량화는 수행 되지 않습니다. 스즈키 외.에 의해 연구 보고는 AAV-Anc80-GFP 성인 쥐에 후부 반원의 운하 접근을 사용 하 여 달팽이 관 및 vestibular 머리 세포 변환의 높은 수준. 성인 생쥐, 작은 카 테 터와 후부 반원의 운하 cannulation이 바람직합니다, 후부 반원의 운하 뼈 덮 음 이기 때문에 완전히 굳어진12. 성인 쥐에 후부 반원의 운하 catheterization 변환 효율성을 줄일 수 주입 역류를 최소화 시킬 수 있습니다. 이 단계 이후 후부 반원의 운하 뼈 덮 음 그 나이에 여전히 연골 신생아 쥐에 필요 하지 않습니다.

후부 반원의 운하 주사의 단점 중 하나는 하나 확신할 수 없습니다 perilymph 또는 endolymph에 주입 된 유전자 치료를 전달 하는 여부 사실 이다. 이 결손에도 불구 하 고 후부 반원의 운하 해부학 쉽게 찾을 고의 식별에 대 한 측의 최소한의 조작 필요 합니다. 이 수술 외상으로 인 한 내가 손상의 기회를 줄인다. 후부 반원의 운하 주입 내가 유전자 치료 납품을 위한 매력적인 옵션입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자 아무 관련 공개 수 있도록 있다.

Acknowledgments

이 작품은 고급 이미징 코어는 NIDCD 사단의 교내 연구 /NIH (DC000082-02 W.W.C.,) 뿐만 아니라 DC000081에서에서 기금에 의해 지원 되었다. 우리는 동물에 대 한 배려를 위한 NIDCD 동물 시설 직원에 대 한 감사입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating microscope Zeiss OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts Fine Science Tools 11251-10, 11295-51 #5 and #55 Dumont
Micro-scissors Fine Science Tools 15002-08
Nanoliter2000 microinjector World Precision Instruments
Heating pad Mastex Model 500/600
5-0 vicryl sutures Ethicon
AAV8-whirlin Vector Biolabs
Glass pipette Sutter Instruments B100-75-10 Borosilicate glass

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics