Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

Medicine

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Summary

In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo affidabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno.

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Isgrig, K., Chien, W. W. Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse. J. Vis. Exp. (133), e56648, doi:10.3791/56648 (2018).

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Abstract

Terapia genica dell'orecchio interno offre grande promessa come un potenziale trattamento per la perdita dell'udito e vertigini. Uno dei fattori critici del successo della terapia genica dell'orecchio interno è quello di trovare un metodo di consegna che si traduce in efficienza di trasduzione coerente di tipi cellulari mirate, riducendo al minimo la perdita dell'udito. In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo praticabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno. La facile individuazione anatomica del canale semicircolare posteriore, così come manipolazione minima dell'osso temporale richiesto, rendono questo chirurgico approccio un'opzione attraente per consegna del gene dell'orecchio interno.

Introduction

Terapia genica dell'orecchio interno è un settore in rapida evoluzione dell'indagine. È stato applicato in vari modelli animali di combattimento ototossicità, il trauma di rumore e di perdita dell'udito ereditario1. Parecchi studi recenti hanno dimostrato il recupero funzionale dell'udito e funzioni della bilancia in topi mutanti dopo orecchio interno gene terapia consegna2,3,4,5,6, 7. uno dei principali fattori nel determinare il successo della terapia genica dell'orecchio interno è il metodo chirurgico utilizzato per accedere l'orecchio interno. Idealmente, l'approccio chirurgico sarebbe facile da eseguire, i limiti anatomici sarebbe coerente e facile da identificare, e la trasduzione risultante di tipi cellulari mirata sarebbe elevata.

In un recente studio, abbiamo dimostrato che quando la terapia genica virale è stata iniettata attraverso il canale semicircolare posteriore del mouse mutante whirler (un modello di perdita dell'udito e disfunzione vestibolare), trasduzione efficiente di cellule ciliate sensoriali è stato visto nella vestibolare organi, così come la coclea5. L'alta efficienza di trasduzione sensoriale della cellula ciliata ha provocato il miglioramento delle funzioni uditive e vestibolari in questi topi mutanti.

In questo articolo, descriviamo in dettaglio l'approccio del canale semicircolare posteriore per accedere l'orecchio interno neonatale del mouse.

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Protocol

Tutte le procedure di animali sono state approvate dal comitato di utilizzo presso il National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD ASP1378-15) e cura degli animali.

1. procedura installazione e preparazione

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti di ossido di etilene all'inizio dell'esperimento. Tra gli animali, pulire gli strumenti utilizzando la sterilizzazione della perla.
  2. Caricare la soluzione contenente la terapia genica virale in una micropipetta su micro-iniettore. Il vettore virale utilizzato in questo studio è stato AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoma copie per millilitro, vedere la tabella dei materiali).
    Nota: In genere, il volume totale di 1,1 µ l viene caricato nella micropipetta.

2. anestesia

Nota: Il ceppo del mouse utilizzato in questo studio è il mouse whirler. Entrambi omozigoti mutanti (Whrnwi/wi) e littermates eterozigoti (Whrn+ wi) sono stati usati.

  1. Posto la madre in una gabbia separata (separata dalla lettiera).
  2. Posto dalla gabbia contenente la lettiera (P0 - P5 cuccioli) su un pad termico a ricircolo (insieme a 37,5 ° C) per mantenere caldi i topi.
  3. Tagliare la parte di pollice di un guanto di lattice e inserire un cucciolo in esso.
  4. Collocare il cucciolo nel guanto di lattice pollice in un secchio di ghiaccio per ~ 2 min.
  5. Posizionare il pup anestetizzato su una confezione di grande gelata di plastica quadrato commerciale con una garza 4 "x 4" tra il cucciolo e superficie del pack.
  6. Riempire un guanto di lattice per impieghi gravosi con ghiaccio tritato e il guanto di ghiaccio intorno il pup.
  7. Controllare per vedere se il cucciolo è adeguatamente anestetizzato dalla completa mancanza di qualsiasi risposta a vari stimoli (tra cui un pizzico di punta costante). Lasciare il cucciolo sull'impacco di ghiaccio per tutta la durata dell'intervento chirurgico (circa 5-10 min).
    Nota: Si consiglia di lasciare i cuccioli sull'impacco di ghiaccio per non più di 15 min durante l'intervento chirurgico.

3. chirurgico approccio (Figura 1)

  1. Una volta che l'animale è anestetizzato, pulire la pelle dietro l'orecchio con un batuffolo imbevuto di iodio e un batuffolo imbevuto di alcool.
  2. Fare un'incisione postauricular ~ 2 mm dietro l'orecchio utilizzando micro-forbici e dividere il muscolo sternocleidomastoid con micro-forbici.
  3. Identificare il nervo facciale e la bulla. La bulla è cartilaginoso e semi-trasparente a questa età e si trova mediale al nervo facciale. L'arteria stapediali può essere visto attraverso la bulla a questa età, che è un utile punto di riferimento.
  4. Seguire il nervo facciale superiormente e posteriormente per individuare il canale semicircolare posteriore (PSCC). Rimuovere le fibre muscolari e del tessuto molle che ricopre il canale semicircolare posteriore utilizzando micro-forbici.
    Nota: Il PSCC è cartilaginoso a questa età.
  5. Penetrare il PSCC utilizzando una micropipetta di vetro (~ 10 μm di diametro) su micro-iniettore.
  6. Iniettare la terapia genica virale nell'orecchio interno.
    Nota: In genere, un totale di 20 iniezioni di 49 nL della terapia genica sono consegnati nel canale semicircolare posteriore oltre 40 ~ s (volume totale ~ 1 µ l). Il titolo virale utilizzato era 1 x 1013 genoma copie / mL.
  7. Chiudere l'incisione della pelle utilizzando una sutura in polyglactin 5-0.

4. postoperatoria

  1. Posto il cucciolo su un tappetino riscaldante per ripristinare una normale temperatura corporea durante il recupero dall'anestesia con costante manuale stimolazione/rolling con le dita guantate umane.
  2. Una volta che il cucciolo è sveglio, posizionarlo nella sua gabbia a casa.
  3. Accarezzano ogni cucciolo con un tampone di cotone che è stato esposto per la biancheria da letto di gabbia a casa.
    Nota: Lo scopo di questo è di avere i topi odore come hanno fatto prima dell'intervento, che aumenta la probabilità della madre ri-accettando la sua post-chirurgia cucciolata. Se possibile, urina dalla madre possa essere raccolti e strofinato sui cuccioli con un batuffolo di cotone per ridurre ulteriormente il rischio di rigetto.
  4. Applicare olio minerale al naso della madre per desensibilizzare la sua8e reintrodurre la madre dalla gabbia.

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Representative Results

Iniezione di AAV8-whirlin terapia genica nei topi whirler neonatale attraverso il canale semicircolare posteriore ha provocato whirlin espressione (verde) in cellule ciliate utricular (Figura 2), con l'efficienza di infezione generale di 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Cellule trasdotte capelli aveva allungato stereocilia (rosso) rispetto alle cellule ciliate dalle orecchie non iniettato controlaterale (5,35 µm ± 2.11 vs 3.20 ± 0.34 µm, rispettivamente)5.

Iniezione del canale semicircolare posteriore di AAV8-whirlin inoltre ha provocato trasduzione di cellule ciliate cocleari nei topi whirler (Figura 3). L'efficienza di infezione della cellula ciliata interna media era 77,1% (SD 12,7, n = 8)5. Cellule trasdotte capelli espresso whirlin (verde) alle punte delle stereocilia e aveva allungato stereocilia (rosso) rispetto alle cellule ciliate dalle orecchie non iniettato controlaterale (5,04 ± 0.72 µm vs 1,01 ± 0,08 µm all'apice cocleare, rispettivamente)5.

Figure 1
Figura 1 : Immagini intraoperative.
Immagini intraoperatorie di accesso chirurgico per il canale semicircolare posteriore (PSCC) a un mouse di P0. L'orecchio di sinistra è mostrato. Il PSCC è delineato nelle linee nere tratteggiate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Cellule cigliate vestibolari vengono trasdotti mediante consegna del gene PSCC.
AAV8-whirlin tramito il PSCC approccio ha provocato livelli elevati di infezione utricular della cellula ciliata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Cellule ciliate cocleari vengono trasdotti mediante consegna del gene PSCC.
AAV8-whirlin tramito il PSCC approccio ha provocato livelli elevati di infezione cocleare della cellula ciliata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Diversi approcci chirurgici sono stati descritti per accedere roditore orecchi interni. Cochleostomy e finestra rotonda approcci sono più comunemente utilizzati per accedere alla coclea, mentre il canale semicircolare posteriore e il sacco endolinfatico approcci vengono in genere utilizzati per accedere gli organi vestibolari1. In uno studio recente, abbiamo mostrato quel canale semicircolare posteriore iniezioni di terapia genica virale ha provocate ad alta efficienza di trasduzione delle cellule cigliate in entrambi gli organi vestibolari e la coclea5. Infatti, trasduzione cocleare della cellula ciliata era più alta attraverso le iniezioni del canale semicircolare posteriore, se confrontato con le iniezioni di finestra rotonda nello stesso modello del mouse di ipoacusia ereditaria e disfunzione vestibolare5,9. Data la vicinanza anatomica tra la finestra rotonda e la coclea, sembra paradossale che finestra rotonda iniezioni possono portare a bassa trasduzione cocleare della cellula ciliata rispetto alle iniezioni del canale semicircolare posteriore. Questo risultato può essere spiegato dal fatto che la finestra rotonda si trova vicino l'acquedotto coclea. Pertanto, quando la terapia genica virale viene iniettata attraverso la finestra rotonda, la sua concentrazione può essere diluita dal fluido cerebrospinale provenienti acquedotto cocleare10.

La constatazione che il canale semicircolare posteriore iniezione risultati nella trasduzione delle cellule cigliate cocleari e vestibolari è stata segnalata anche da altri studi11,12. Nello studio di Okada et al., la trasduzione delle cellule ciliate cocleare e vestibolari di AAV-GFP è stato segnalato. Tuttavia, non è stata eseguita la quantificazione numerica. Lo studio di Suzuki et al., rilevati alti livelli di trasduzione delle cellule cigliate cocleari e vestibolari con l'AAV-Anc80-GFP utilizzando l'approccio del canale semicircolare posteriore in topi adulti. In topi adulti, inserimento di una canula del canale semicircolare posteriore con un piccolo catetere è preferibile, poiché la copertura ossuta del canale semicircolare posteriore è completamente ossificata12. Cateterizzazione del canale semicircolare posteriore in topi adulti può contribuire a minimizzare il riflusso di iniezione, che può diminuire l'efficienza di trasduzione. Questo passaggio non è necessario in topi neonatali, poiché la copertura ossuta del canale semicircolare posteriore è ancora cartilaginosa a quell'età.

Uno degli svantaggi dell'iniezione canale semicircolare posteriore è il fatto che non si può essere certi se la terapia genica iniettato è consegnata nella perilinfa o endolinfa. Nonostante questa carenza, il canale semicircolare posteriore è anatomicamente facile da individuare e richiede minima manipolazione dell'osso temporale per la sua identificazione. Questo riduce la possibilità di danno dell'orecchio interno causata tramite il trauma chirurgico. L'iniezione del canale semicircolare posteriore è un'opzione attraente per la consegna di terapia genica dell'orecchio interno.

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Disclosures

Gli autori non hanno nessun pertinenti informazioni integrative per fare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIDCD divisione di intramurale ricerca /NIH (DC000082-02 al W.W.C.), così come DC000081 al nucleo di imaging avanzata. Siamo grati per il personale della struttura animale NIDCD per la cura per i nostri animali.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating microscope Zeiss OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts Fine Science Tools 11251-10, 11295-51 #5 and #55 Dumont
Micro-scissors Fine Science Tools 15002-08
Nanoliter2000 microinjector World Precision Instruments
Heating pad Mastex Model 500/600
5-0 vicryl sutures Ethicon
AAV8-whirlin Vector Biolabs
Glass pipette Sutter Instruments B100-75-10 Borosilicate glass

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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