Bageste halvrunde kanalen tilgang til indre øre gen levering i Neonatal mus

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

I denne undersøgelse beskriver vi bageste halvrunde kanalen som en pålidelig metode til indre øre gen levering i neonatal mus. Vi viser, at genet levering gennem den bageste halvrunde kanalen er stand til at perfuse det hele indre øre.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isgrig, K., Chien, W. W. Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse. J. Vis. Exp. (133), e56648, doi:10.3791/56648 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Indre øre genterapi tilbyder meget lovende som en potentiel behandling af høretab og svimmelhed. En af de kritiske faktorer for succes af indre øre genterapi er at finde en leveringsmetode, hvilket resulterer i konsekvent transduktion effektiviteten af målrettede celletyper og minimere tab af hørelse. I denne undersøgelse beskriver vi bageste halvrunde kanalen som en levedygtig metode for indre øre gen levering i neonatal mus. Vi viser, at genet levering gennem den bageste halvrunde kanalen er stand til at perfuse det hele indre øre. Nem anatomiske identifikation af den bageste halvrunde kanalen, samt minimal manipulation af den tidsmæssige knoglen kræves, gør denne kirurgiske tilgang en attraktiv mulighed for indre øre gen levering.

Introduction

Indre øre genterapi er en rivende udvikling inden for undersøgelse. Det har været anvendt i forskellige dyr modeller til at bekæmpe ototoksicitet, støj traumer og arvelige hearing tab1. Flere nyere undersøgelser har vist funktionel genopretning af hørelse og balance funktioner i mutant-mus efter indre øre gen terapi levering2,3,4,5,6, 7. et af vigtigste faktorer ved afgørelsen af succesen af indre øre genterapi er den kirurgiske metode bruges til at få adgang til det indre øre. Ideelt, den kirurgiske tilgang ville være let at udføre, de anatomiske landemærker ville være konsekvent og let at identificere, og den resulterende transduktion af målrettede celletyper ville være høj.

I en nylig undersøgelse viste vi, at når viral genterapi var injiceres gennem den bageste halvrunde kanalen whirler mutant musen (en model af høretab og vestibulær dysfunktion), effektiv transduktion af sensoriske hår celler blev set i den vestibulære organer så godt som i cochlea5. Den høje effektivitet af sensoriske hår celle transduktion resulteret i forbedring af auditive og vestibulære funktioner i disse muterede mus.

I denne artikel beskriver vi i detaljer den bageste halvrunde kanal tilgang til at få adgang til neonatal mus indre øre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr procedurer blev godkendt af Animal Care og brug Udvalget på National Institute on døvhed og anden kommunikation lidelser (NIDCD ASP1378-15).

1. procedure Setup og forberedelse

  1. Sterilisere alle instrumenter af ethylenoxid i begyndelsen af eksperimentet. Mellem dyrene, rense instrumenter ved hjælp af perle sterilisation.
  2. Indlæse den løsning, der indeholder viral genterapi i en mikropipette på mikro-injektor. Den virale vektor, der anvendes i denne undersøgelse var AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genom kopier pr. milliliter, se tabel over materialer).
    Bemærk: Typisk, 1,1 µL samlede volumen er indlæst i mikropipette.

2. anæstesi

Bemærk: Mus stamme anvendes i denne undersøgelse er whirler musen. Både homozygot mutanter (Whrntrådløs/wi) og heterozygous littermates (Whrn/ wi) blev brugt.

  1. Placer moderen i en selvstændig bur (separat fra kuldet).
  2. Placer burene indeholdende kuld (P0 - P5 pups) på en recirkulerende varme pad (sæt på 37,5 ° C) for at holde mus varme.
  3. Skåret ud tommelfinger del af en latex handske, og placere en hvalp i det.
  4. Placer pup i latex handske tommelfinger ind i en spand med is til ~ 2 min.
  5. Placer den bedøvede pup på en stor firkantet kommercielle plast fryse pack med en 4 "x 4" gaze mellem pup og pack's overflade.
  6. Fyld en heavy-duty latex handske med knust is, og placere is handske omkring pup.
  7. Kontrollere Hvis hvalpen er tilstrækkeligt bedøvede af den fuldstændige mangel på nogen respons på forskellige stimuli (herunder en fast tå knivspids). Forlade pup på ice pack for varigheden af kirurgi (ca 5-10 min).
    Bemærk: Vi anbefaler forlader hvalpene på ispose for ikke mere end 15 min under operationen.

3. kirurgisk tilgang (figur 1)

  1. Ren hud bag øret med en jod tørre og en alkohol-serviet, når dyret er bedøvede.
  2. Gøre en postauricular snit ~ 2 mm bag øret ved hjælp af mikro-saks, og opdele sternocleidomastoideus musklen med mikro-saks.
  3. Identificere facial nerve og bulla. Bulla er bruskspidserne og semi-transparente i denne alder og det ligger medialt til facial nerve. Den stapedial arterie kan ses gennem bulla i denne alder, som er en nyttig vartegn.
  4. Følg facial nerve overlegent og posteriort til at lokalisere den bageste halvrunde kanalen (PSCC). Fjerne muskelfibre og blødt væv overliggende den bageste halvrunde kanalen ved hjælp af mikro-saks.
    Bemærk: PSCC er bruskspidserne i denne alder.
  5. Trænge ind i PSCC ved hjælp af et glas mikropipette (~ 10 μm i diameter) på mikro-injektor.
  6. Indsprøjtes viral genterapi i det indre øre.
    Bemærk: Typisk, ialt 20 injektioner af 49 nL gene Therapy er leveret i den bageste halvrunde kanalen over ~ 40 s (samlede volumen ~ 1 µL). Viral titer anvendes var 1 x 1013 genom kopier pr. mL.
  7. Luk den hud indsnit ved hjælp af en 5-0 polyglactin sutur.

4. postoperativ pleje

  1. Placer pup på en opvarmning pad til at genoprette en normal kropstemperatur under genoprettelse fra anæstesi med konstant manuel stimulation/rullende med behandskede menneskelige fingre.
  2. Når hvalpen er vågen, læg det tilbage i sit hjem bur.
  3. Kærtegne hver hvalp med en vatpind, der har været udsat for hjem bur sengetøj.
    Bemærk: Formålet med dette er at har de mus lugter som de gjorde før kirurgi, hvilket øger sandsynligheden for, at moderen igen at acceptere hendes kuld efter operationen. Hvis det er muligt, kan urin fra moderen indsamlet og gned på de pups ved hjælp af en vatpind til yderligere fald sandsynligheden for afvisning.
  4. Anvende mineralsk olie til moderens næse at desensitize hendes8, og genindføre moderen i burene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injektion af AAV8-whirlin genterapi til neonatal whirler mus gennem den bageste halvrunde kanalen resulterede i whirlin udtryk (grøn) i utricular hårceller (figur 2), med den samlede infektion effektivitet på 53,1% (SD 38.1, n = 28)5 . Transduced hårceller havde aflange stereocilia (red) i forhold til hår celler fra kontralaterale ikke injiceres ører (5,35 ± 2.11 µm vs 3,20 ± 0,34 µm, henholdsvis)5.

Bageste halvrunde kanalen injektion af AAV8-whirlin også resulteret i transduktion af cochlear hårcellerne i whirler mus (figur 3). Den gennemsnitlige indre hår celle infektion effektivitet var 77,1% (SD 12,7, n = 8)5. Transduced hårceller udtrykt whirlin (grøn) på stereocilia tips og havde aflange stereocilia (red) i forhold til hår celler fra kontralaterale ikke injiceres ører (5,04 ± 0.72 µm vs 1,01 ± 0,08 µm på cochlear apex, henholdsvis)5.

Figure 1
Figur 1 : Intraoperativ billeder.
Intraoperativ billeder viser kirurgisk adgang til den bageste halvrunde kanalen (PSCC) i en P0 mus. Den venstre øre er vist. PSCC er skitseret i stiplede sorte streger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Vestibulære hårceller er transduced ved hjælp af PSCC gen levering.
AAV8-whirlin leveret via PSCC tilgang resulterede i høje niveauer af utricular hår celle infektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Cochlear hårcellerne er transduced ved hjælp af PSCC gen levering.
AAV8-whirlin leveret via PSCC tilgang resulterede i høje niveauer af cochlear hår celle infektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere kirurgiske metoder er blevet beskrevet for at få adgang til gnaver indre ører. Cochleostomy og runde vindue tilgange er oftest bruges til at få adgang til cochlea, bageste halvrunde kanalen og endolymphatic sac tilgange anvendes typisk til at få adgang til de vestibulære organer1. I en nylig undersøgelse viste vi, at bageste halvrunde kanalen injektioner af viral genterapi resulterede i høj effektivitet af hår celle signaltransduktion i både de vestibulære organer og cochlea5. Cochlear hår celle transduktion var faktisk højere gennem bageste halvrunde kanalen injektioner, sammenlignet med runde vindue injektioner i den samme musemodel af arvelige høretab og vestibulær dysfunktion5,9. I betragtning af de anatomiske nærhed mellem det runde vindue og cochlea, synes det paradoksalt at runde vindue injektioner kan medføre lavere cochlear hår celle transduktion i forhold til posterior halvrunde kanalen injektioner. Denne konstatering kan forklares ved, at det runde vindue er placeret tæt på cochlear akvædukten. Derfor, når viral genterapi er injiceres gennem det runde vindue, dets koncentration kan være fortyndet af cerebrospinalvæsken fra cochlear akvædukt10.

Konstateres, at bageste halvrunde kanalen injektion resulterer i cochlear og vestibulære hår celle transduktion er også blevet rapporteret af andre undersøgelser11,12. I undersøgelsen af Okada et al., var transduktion af cochlear og vestibulære hårceller af AAV-normal god landbrugspraksis rapporteret. Dog blev numeriske kvantificering ikke udført. Undersøgelse af Suzuki et al., rapporterede høje niveauer af cochlear og vestibulære hår celle transduktion med AAV-Anc80-NGL benytter metoden bageste halvrunde kanalen i voksen mus. I voksne mus er cannulation af den bageste halvrunde kanalen med en lille kateter at foretrække, da knoklet dækningen af den bageste halvrunde kanalen er helt forbenet12. Kateterisation af den bageste halvrunde kanalen i voksen mus kan bidrage til at minimere injektion tilbagestrømning, hvilket kan mindske transduktion effektivitet. Dette trin er ikke påkrævet i neonatal mus, da knoklet dækningen af den bageste halvrunde kanalen er stadig bruskspidserne i alderen.

En af ulemperne ved den bageste halvrunde kanalen injektion er, at man ikke kan være sikker på om den injicerede genterapi er leveret i perilymph eller endolymph. Trods denne mangel, den bageste halvrunde kanalen er anatomisk let at lokalisere og kræver minimal manipulation af den tidsmæssige knoglen til dets identifikation. Dette mindsker risikoen for indre øre skader forårsaget af kirurgisk traume. Den bageste halvrunde kanalen injektion er en attraktiv mulighed for indre øre gen terapi levering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har nogen relevante oplysninger at gøre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra den NIDCD Division af murene forskning /NIH (DC000082-02 til W.W.C.), samt DC000081 til avanceret billedbehandling kerne. Vi er taknemmelige for NIDCD Dyrefacilitet personale til pasning af vores dyr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating microscope Zeiss OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts Fine Science Tools 11251-10, 11295-51 #5 and #55 Dumont
Micro-scissors Fine Science Tools 15002-08
Nanoliter2000 microinjector World Precision Instruments
Heating pad Mastex Model 500/600
5-0 vicryl sutures Ethicon
AAV8-whirlin Vector Biolabs
Glass pipette Sutter Instruments B100-75-10 Borosilicate glass

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics