Bakre halvsirkelformet kanalen tilnærming for indre øret gen levering i Neonatal musen

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

I denne studien beskriver vi den bakre halvsirkelformet kanal tilnærmingen som en pålitelig metode for indre øret gen levering i neonatal mus. Vi viser at gen levering gjennom bakre halvsirkelformet kanalen kunne perfuse det hele indre øret.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isgrig, K., Chien, W. W. Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse. J. Vis. Exp. (133), e56648, doi:10.3791/56648 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Indre øret genterapi tilbyr store løftet som potensielle behandling for hørselstap og svimmelhet. En av de kritiske determinantene av suksess for indre øret genterapi er å finne en leveringsmetode som fører til konsekvent signaltransduksjon effektiviteten av målrettet celletyper samtidig minimere hørselstap. I denne studien beskriver vi den bakre halvsirkelformet kanal tilnærmingen som en levedyktig metode for indre øret gen levering i neonatal mus. Vi viser at gen levering gjennom bakre halvsirkelformet kanalen kunne perfuse det hele indre øret. Lett anatomiske identifikasjon av bakre halvsirkelformet kanalen og minimal manipulering av temporal benet kreves, gjør dette kirurgisk tilnærming et attraktivt alternativ for indre øret gen levering.

Introduction

Indre øret genterapi er en rask utvikling av etterforskning. Det har vært brukt i ulike dyr modeller å bekjempe ototoksisitet, støy traumer og arvelige høring tap1. Flere studier har vist funksjonelle utvinning av hørsel og balanse funksjoner i mutant mus etter indre øret gene terapi levering2,3,4,5,6, 7. en av viktigste faktorene i å bestemme suksessen til indre øret genterapi er kirurgisk tilnærming for tilgang til det indre øret. Ideelt sett kirurgisk tilnærming ville være enkel å utføre, anatomisk landemerkene ville være konsekvent og lett å identifisere og den resulterende signaltransduksjon målrettet celletyper ville være høy.

I en fersk studie viste vi at når viral genterapi ble injisert gjennom bakre halvsirkelformet kanalen whirler mutant museklikk (en modell av hørselstap og vestibular dysfunksjon), effektiv Albin på sensoriske hårcellene ble sett i den vestibular organer så vel som i sneglehuset5. Høy virkningsgrad av sensoriske hår celle signaltransduksjon resulterte i forbedring av auditiv og vestibular funksjoner i disse mutant mus.

I denne artikkelen beskrive vi i detalj den bakre halvsirkelformet kanal tilnærmingen til det neonatal mus indre øret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen på National Institute on døvhet og andre kommunikasjons lidelser (NIDCD ASP1378-15).

1. prosedyren oppsett og forberedelse

  1. Sterilisere alle instrumenter av etylenoksid i begynnelsen av eksperimentet. Mellom dyr, rengjør instrumenter med perle sterilisering.
  2. Laste løsningen som inneholder viral genterapi i brønnene på mikro-injektoren. Viral vektoren brukt i denne studien var AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genomet eksemplarer per milliliter, se tabellen materialer).
    Merk: Vanligvis 1.1 µL totale volumet er lastet inn av brønnene.

2. anestesi

Merk: Mus belastningen brukt i denne studien er whirler musen. Både homozygous mutanter (Whrnwi/wi) og heterozygote littermates (Whrn/ wi) ble brukt.

  1. Plass mor i separate bur (atskilt fra søppel).
  2. Plass hjem byrået som inneholder søppel (P0 - P5 pups) på en resirkulerende heten pute (sett på 37,5 ° C) for å holde musene varm.
  3. Kutte ut den tommel delen av en latex hansker, og Plasser en valp i den.
  4. Plass pup i latex hansker tommelen i en bøtte med is ~ 2 min.
  5. Plass bedøvet pup på en stor firkantet kommersielle plast fryse pakke med en 4 "x 4" gasbind mellom valp og pakkens overflaten.
  6. Fylle en kraftig latex hanske med knust is, og plasser is hansken rundt pup.
  7. Kontroller hvis pup er tilstrekkelig anesthetized av fullstendig mangel på noen respons på ulike stimuli (inkludert fast tå knipe). La pup på is pakke for varigheten av operasjonen (ca 5-10 min).
    Merk: Vi anbefaler at valpene på isen pack i mer enn 15 min under operasjonen.

3. kirurgisk tilnærming (figur 1)

  1. Rengjør huden bak øret med en jod tørke og en alkohol tørke når dyret er anesthetized.
  2. Gjør et postauricular snitt ~ 2 mm bak øret bruker micro-saks, og dele sternocleidomastoid-muskelen med mikro-saks.
  3. Identifisere ansikts nerve og bulla. Bulla er cartilaginous og halvgjennomsiktige i denne alderen, og det ligger mediale til ansikts nerve. Arteria stapedial kan ses gjennom bulla i denne alderen, som er et nyttig landemerke.
  4. Følg ansikts nerve overlegent og posteriorly å finne bakre halvsirkelformet kanalen (PSCC). Fjern muskel fiber og bløtvev overliggende bakre halvsirkelformet kanalen med mikro-saks.
    NOTE PSCC er cartilaginous i denne alderen.
  5. Trenge PSCC bruker glass brønnene (~ 10 μm i diameter) på mikro-injektoren.
  6. Injisere viral genterapi i det indre øret.
    Merk: Vanligvis totalt 20 injeksjoner av 49 nL av genterapi leveres til bakre halvsirkelformet kanalen over ~ 40 s (totalt volum ~ 1 µL). Viral titer brukt var 1 x 1013 genomet eksemplarer per mL.
  7. Lukk den hud snittet med en 5-0 polyglactin Sutur.

4. postoperativ pleie

  1. Plass pup på en oppvarming pad å gjenopprette en normal kroppstemperatur under gjenoppretting etter anestesi med konstant manuell stimulering/ruller med hansker menneskelige fingre.
  2. En gang pup er våken, Legg den tilbake i buret sitt hjem.
  3. Caress hver pup med en bomullspinne som har vært utsatt for hjem bur sengetøy.
    Merk: Hensikten med dette er å ha mus lukter som de gjorde før kirurgi, som øker sannsynligheten for mor å akseptere henne søppel etter operasjonen. Hvis mulig, kan urin fra mor samles og gned på valpene med en bomullspinne ytterligere redusere sannsynligheten for avvisning.
  4. Bruke mineralolje til mors nese å desensitize hennes8og gjeninnføre mor til hjem buret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injeksjon av AAV8-whirlin genterapi i neonatale whirler mus gjennom bakre halvsirkelformet kanalen resulterte i whirlin uttrykk (grønn) i utricular hårcellene (figur 2), med infeksjon virkningsgraden på 53.1% (SD oppe i 38,1, n = 28)5 . Transduced hårcellene hadde langstrakte stereocilia (rød) sammenlignet hårcellene fra kontralateral ikke-injisert ører (5.35 ± 2.11 µm vs 3,20 ± 0,34 µm, henholdsvis)5.

Bakre halvsirkelformet kanalen injeksjon av AAV8-whirlin også resultert i signaltransduksjon av cochlea hårcellene i whirler mus (Figur 3). Gjennomsnittlig indre håret celle infeksjon effektiviteten var 77.1% (SD 12.7, n = 8)5. Transduced hårcellene uttrykt whirlin (grønn) på stereocilia tips og hadde langstrakte stereocilia (rød) sammenlignet hårcellene fra kontralateral ikke-injisert ører (ca 5,04 ± 0.72 µm vs 1.01 ± 0,08 µm på cochlea toppen, henholdsvis)5.

Figure 1
Figur 1 : Intraoperativ bilder.
Intraoperativ bilder viser kirurgisk tilgang til bakre halvsirkelformet kanalen (PSCC) i en P0 mus. Venstre øre vises. PSCC er skissert i stiplet svarte linjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Vestibular hårcellene er transduced bruker PSCC gen levering.
AAV8-whirlin leveres via PSCC tilnærming resulterte i høye nivåer av utricular hår celle infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Cochlear hårcellene er transduced bruker PSCC gen levering.
AAV8-whirlin leveres via PSCC tilnærming resulterte i høye nivåer av cochlea hår celle infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere kirurgiske metoder har blitt beskrevet til gnager indre ører. Cochleostomy og runde vinduet tilnærminger brukes vanligvis til sneglehuset, mens den bakre halvsirkelformet kanalen og endolymphatic sac tilnærminger brukes vanligvis til vestibular organer1. I en fersk studie viste vi den bakre halvsirkelformet kanalen injeksjoner av viral genterapi resulterte i høy virkningsgrad på håret celle signaltransduksjon både vestibular organer og sneglehuset5. Cochlea hår celle signaltransduksjon var faktisk høyere gjennom de bakre halvsirkelformet kanalen injeksjoner, sammenlignet med runde vinduet injeksjoner i samme musemodell av arvelige hørselstap og vestibular dysfunksjon5,9. Gitt anatomiske nærhet mellom runde vinduet og sneglehuset, synes det paradoksalt at runde vinduet injeksjoner kan føre til lavere cochlea hår celle signaltransduksjon forhold til bakre halvsirkelformet kanalen injeksjoner. Dette funnet kan forklares med at vinduet runde er nær cochlea akvedukten. Derfor når viral genterapi injiseres gjennom vinduet runde, kan konsentrasjonen bli utvannet av cerebrospinalvesken kommer fra på cochlea akvedukten10.

Finne at bakre halvsirkelformet kanalen injeksjon resulterer i cochlea og vestibular hår celle signaltransduksjon har også rapportert andre studier11,12. I studien av Okada et al., ble Albin på cochlea og vestibular hårcellene av AAV-GFP rapportert. Imidlertid ble numeriske kvantifisering ikke utført. Studiet av Suzuki et al., rapporterte høye nivåer av cochlea og vestibular hår celle signaltransduksjon med AAV-Anc80-GFP ved hjelp av bakre halvsirkelformet kanalen tilnærming i voksen mus. I voksen mus er cannulation av bakre halvsirkelformet kanalen med en liten kateter å foretrekke, siden en benete beskyttelse av bakre halvsirkelformet kanalen er helt sekretariat12. Catheterization av bakre halvsirkelformet kanalen i voksen mus kan hjelpe for å minimere injeksjon tilbakestrømming, noe som kan redusere signaltransduksjon effektivitet. Dette trinnet er ikke nødvendig i neonatal mus, siden en benete beskyttelse av bakre halvsirkelformet kanalen er fortsatt cartilaginous i den alderen.

En av ulempene med bakre halvsirkelformet kanalen injeksjon er det faktum at en ikke kan være sikker på om den injiserte genterapi leveres i perilymph eller endolymph. Til tross for dette brist, bakre halvsirkelformet kanalen anatomisk lett å finne og krever minimal manipulering av temporal benet for sitt identifikasjonsnummer. Dette reduserer sjansen for indre øret skade forårsaket av kirurgiske traumer. Bakre halvsirkelformet kanalen injeksjon er et attraktivt alternativ for indre øret gene terapi levering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen relevante opplysninger å gjøre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra den NIDCD divisjon av Intramural forskning /NIH (DC000082-02 til W.W.C.) og DC000081 til avansert bildebehandling kjerne. Vi er takknemlige for NIDCD dyr anlegget ansatte for omsorg for dyr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating microscope Zeiss OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts Fine Science Tools 11251-10, 11295-51 #5 and #55 Dumont
Micro-scissors Fine Science Tools 15002-08
Nanoliter2000 microinjector World Precision Instruments
Heating pad Mastex Model 500/600
5-0 vicryl sutures Ethicon
AAV8-whirlin Vector Biolabs
Glass pipette Sutter Instruments B100-75-10 Borosilicate glass

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics