وسم المناعية-فلوري Microtubules والبروتينات سينتروسومال في 3D في المختبر أورجانويدس الأمعاء والأنسجة المعوية السابقين فيفو

Developmental Biology
 

Summary

نقدم البروتوكولات لعزل المعوية هياكل ثلاثية الأبعاد من الأنسجة في الجسم الحي والمضمنة في المختبر مصفوفة الطابق السفلي أورجانويدس، والتثبيت المختلفة بالتفصيل وتلطيخ البروتوكولات الأمثل لوسم المناعية من ميكروتوبولي، البروتينات سينتروسومال، وهالة كذلك خلية علامات بما في ذلك الخلايا الجذعية البروتين Lgr5.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Goldspink, D. A., Matthews, Z. J., Lund, E. K., Wileman, T., Mogensen, M. M. Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56662, doi:10.3791/56662 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ظهور ثلاثية الأبعاد في المختبر أورجانويدس التي تحاكي في فيفو هندسة الأنسجة و morphogenesis متقدمة إلى حد كبير القدرة على دراسة المسائل البيولوجية الرئيسية في الخلية وعلم الأحياء التنموي. وباﻹضافة إلى ذلك، وعود أورجانويدس جنبا إلى جنب مع التقدم التقني المحرز مؤخرا في تحرير الجينات والمورثات الفيروسية التسليم للنهوض بالبحوث الطبية واستحداث أدوية جديدة لعلاج الأمراض. أورجانويدس تزرع في المختبر في الطابق السفلي مصفوفة توفير نظم نموذجية قوية لدراسة السلوك ووظيفة البروتينات المختلفة، وهي مناسبة تماما للعيش-التصوير للبروتينات الفلورية ذات العلامات. ومع ذلك، إنشاء التعبير والترجمة من البروتينات الذاتية في أنسجة الجسم الحي السابقين و في المختبر أورجانويدس هامة للتحقق من سلوك البروتينات المعلمة. وتحقيقا لهذه الغاية علينا المتقدمة وتعديل عزل الأنسجة، وتثبيت، وبروتوكولات وسم المناعية للتعريب microtubules، سينتروسومال، وما يرتبط بها البروتينات في الأنسجة المعوية فيفو السابقين و في المختبر أورجانويدس المعوية. وكان الهدف لمثبت للحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد من أورجانويدس/الأنسجة الوقت أيضا الحفاظ على جسم أنتيجينيسيتي وتمكن من اختراق جيد وإزالة مثبت والأجسام المضادة. التعرض للبرد ديبوليميريزيس جميع ولكن ميكروتوبوليس مستقرة، وكان هذا عاملاً أساسيا عند تعديل البروتوكولات المختلفة. ووجدنا أن زيادة التركيز (يدتا) حمض الذي الإيثيلين من 3 مم إلى 30 مم أعطى مفرزة فعالة من الزوائد والاقبية في الأمعاء بينما كان كافياً للأقبية colonic يدتا 3 مم. وأعطى البروتوكول التثبيت المتقدمة فورمالدهايد/الميثانول الحفاظ على هيكلية جيدة جداً مع أيضا الحفاظ على أنتيجينيسيتي لوسم فعالة microtubules، أكتين، والبروتينات (EB) نهاية الملزمة. كما أنها عملت نينين البروتين سينتروسومال على الرغم من أن البروتوكول الميثانول عملت أكثر باستمرار. وأنشأنا كذلك أنه يمكن تحقيق التثبيت ووضع العلامات المناعية ميكروتوبوليس والبروتينات المرتبطة بها مع أورجانويدس المعزولة من أو البقاء داخل المصفوفة الطابق السفلي.

Introduction

تشكيل epithelia مع الأقطاب أبيكو القاعدية هو عملية أساسية في عملية التنمية، وينطوي على إعادة تنظيم هائلة microtubules والبروتينات سينتروسومال. مجموعة microtubule شعاعي النابعة من ميكروتوبولي سينتروسومال بموقع مركزي تنظيم مركز (بعد) بارز في العديد من الخلايا الحيوانية وهذا مناسب تماما لخلايا مسطحة نسبيا. على النقيض من ذلك، تجميع عمودي من الخلايا الظهارية، مثل تلك التي الأمعاء، صفائف microtubule ترانسسيلولار شعاعي غير أن دعم أفضل شكل ومهام متخصصة لهذه الخلايا. عملية إعادة التنظيم هذه مثيرة ميكروتوبوليس ويتحقق من خلال سينتروسومي الانتقال إلى ذروة وغير سينتروسومال متوكس قمي (n-متوكس) تشكيل، الذي يصبح مسؤولاً لرسو السفن من1،ميكروتوبوليس ترانسسيلولار2 , 3 , 4 , 5.

الكثير من معرفتنا بالتمايز الظهارية، وإعادة تنظيم microtubule المرتبطة بها قد تأتي من التحقيقات في 2D في المختبر طبقات الخلايا التي لا يتم عرض بنية الأنسجة في الجسم الحي . ويمثل التطور 3D في المختبر الثقافات أورجانويد، بادرت كليفيرس وزملاء العمل6، تقدم التكنولوجي رئيسية كما أنها تحاكي في فيفو العمارة والتنمية. التسلسل هرمي للتمايز الظهارية يتجلى في الأمعاء؛ الخلايا الجذعية في الجزء السفلي من أقبية تؤدي إلى عبور غير ناضجة تضخيم الخلايا التي تتكاثر وتفرق تدريجيا عندما تهاجر حتى سرداب على زغابة معوية صغيرة أو على سطح colonic، حيث أنها أصبحت متباينة تماما قبل أن تسلط في التجويف7. الأهم من ذلك، وهذا يتكرر في أورجانويدس المعوية حيث تتكاثر الخلايا من الخلايا الجذعية المتخصصة تشكل الخراجات التي تولد براعم سرداب الشبيهة بالخلايا الجذعية في القاع والتمايز تتقدم تدريجيا نحو منطقة كيسه، في وقت لاحق يصبح مثل الزوائد8. أورجانويد المعوية وبالتالي يمثل نموذجا قويا لدراسة ليس فقط من ميكروتوبولي وإعادة تنظيم سينتروسومال خلال التمايز الظهارية لكن العديد من البروتينات الأخرى، فضلا عن توفير منصة مثالية لفحص الأدوية والأغذية مركبات إمكانات العلاجية فوائد9،10.

أورجانويدس هي مناسبة تماما للعيش-التصوير للبروتينات الفلورية معلم وكلاهما تدق والمغلوب أورجانويدس يمكن إنشاؤها باستخدام الجينات كريسبر/Cas9 تحرير11،12. إنشاء تعبير والتعريب من البروتينات الذاتية دراستها غير هامة، خاصة للتحقق من سلوك البروتينات المعلمة. أورجانويدس 3D وسم المناعية نمت في مصفوفة الطابق السفلي أو السابقين فيفو عزل الأنسجة أكثر تعقيداً من الخلايا التي نمت في أطباق الثقافة في 2D. تثبيت البروتوكول يحتاج إلى الحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد الدقيقة أورجانويدس مع المحافظة على جسم أنتيجينيسيتي (أي، [ابيتوبس] لربط الأجسام المضادة). على سبيل المثال، بارافورمالدهيد 4% (PFA) يستخدم عادة كمثبِّت ولكن رغم أنه مثبت النيابة سريع نسبيا ويعطي جيدة الحفاظ على الخصائص المورفولوجية، في تجربتنا أنه كثيرا ما يؤدي إلى فقدان أنتيجينيسيتي وليست مناسبة للعديد الأجسام المضادة سينتروسومال. وينبغي أيضا النظر في مثبت وأجسام مضادة قادرة على اختراق هياكل ثلاثية الأبعاد والأنسجة. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن قد عدلت والبروتوكولات المتقدمة لعزل الأنسجة ووسم المناعية غير المباشرة أورجانويدس 3D في المختبر و السابقين فيفو عزل الأنسجة المعوية. ونحن تصف كيفية عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة والزوائد والأنسجة colonic، وتشمل بروتوكول لعزل أورجانويدس ثلاثي الأبعاد كبديل لتحديد ووسم المناعية داخل المصفوفة الطابق السفلي. نحن نقدم ثلاثة بروتوكولات تثبيت البديلة لوسم المناعية microtubules والبروتينات سينتروسومال، مثل نينين، والبروتينات تتبع زائد-نهاية ميكروتوبولي (+ نصائح)، مثل البروتينات EB ومقطع-170 (انظر أيضا المراجع8، 13). كما نناقش إيجابيات وسلبيات المقترنة مع كل بروتوكول.

Protocol

وأجريت جميع الأساليب الموصوفة هنا طبقاً لإرشادات الترخيص المؤسسي جامعة شرق أنغليا.

1-عزل الأنسجة المعوية

  1. عزل الأقبية colonic لوسم المناعية (انظر الشكل 1، التخطيطي)
    1. Euthanize الماوس (باستخدام الخنق2 CO) وإزالة القولون (بدءاً الأعور واستخراج كودالي) مع تشريح مقص وملاقط14.
    2. مسح محتويات القولون مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام ماصة زجاجية مع لمبة المطاط. برنامج تلفزيوني: كلوريد الصوديوم (8.0 من غرام/لتر) وكلوريد البوتاسيوم (0.2 جرام/لتر) وثنائي فوسفات هيدروجين (1.15 غرام/لتر) والبوتاسيوم فوسفات هيدروجين (0.2 غرام/لتر)، على درجة الحموضة 7.3.
    3. استخدام قضيب معدني (2.4 مم) أو نهاية ماصة زجاجية، عقد واحدة من نهاية الأنبوب colonic بينما ينزلق الأنسجة بلطف فوق القضيب/ماصة افيرتينج الأنسجة colonic وهكذا حتى أن ظهارة الآن في الخارج.
      ملاحظة: إذا لم يكن هذا ممكناً ثم فتح القولون مع المقص وشريحة إلى قطع 5 ملم.
    4. نقل افيرتيد القولون أو القطع إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 40 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. قلب الأنبوبة عدة مرات لمواصلة إزالة محتويات الأمعاء والمخاط، إلخ
    6. نقل القولون/القطع إلى 40 مل من 3 مم يدتا في برنامج تلفزيوني واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يؤدي إلى تمييع 0.5 م يدتا pH 8.0 الأسهم مع برنامج تلفزيوني.
    7. اهتز لإزالة المخاط ونقل القولون/القطع إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 40 مل الطازجة 3 مم يدتا في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 35 دقيقة في الرايت
    8. نقل القولون/القطع إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل مخروطية واهتز بشدة لمدة 30 ثانية لإطلاق سراح الأقبية (سرداب الكسر).
    9. إزالة القولون/قطعة من الأنبوب والعودة إلى 3 مم يدتا في حالة زيادة العزلة المطلوبة. الطرد المركزي في كسر سرداب المتبقية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
    10. إزالة 5 مل من المادة طافية وريسوسبيند بيليه سرداب في حجم 5 مل المتبقية.
    11. مراقبة تحت ستيريوميكروسكوبي مع التكبير (تكبير X 50-100) للتحقق من وجود أقبية colonic.
      ملاحظة: إذا كان هناك لا أقبية الحالي ثم احتضان القولون/القطع في 3 مم يدتا في برنامج تلفزيوني لآخر 30 دقيقة وثم كرر الخطوات 1.1.8-1.1.11.
    12. الطرد المركزي في كسر سرداب في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
    13. قم بإزالة جميع المادة طافية للحصول على بيليه سرداب والشروع فورا في التثبيت (الفرع 3).
  2. عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة والزوائد لوسم المناعية (الشكل 2)
    1. Euthanize الماوس (باستخدام الخنق2 CO) وإزالة الأمعاء الدقيقة (العفج الدانية إلى المحطة الطرفية الدقاق) مع تشريح مقص وملاقط14.
      ملاحظة: لعرض مختلف أقسام من الأمعاء ثم في هذه المرحلة فصل وتعامل بشكل منفصل. انظر الشكل 1 و الجدول 1 لرسم تخطيطي لتدفق والتوقيتات.
    2. مسح محتويات الأمعاء الدقيقة مع برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة زجاجية مع لمبة المطاط.
    3. قص فتح الأمعاء الدقيقة مع مقص تشريح ومكان في 15 مل برنامج تلفزيوني في طبق بتري.
    4. تغسل الأمعاء بلطف في برنامج تلفزيوني لإزالة المحتوى لومينال بينما لا يضر على سطح الغشاء المخاطي. نقل الأنسجة إلى طبق بتري طازجة وتكرار الغسيل PBS.
    5. قطع الأمعاء إلى قطع 3-5 مم ونقل إلى 100 مم طبق بتري يحتوي على 15 مل من عيار 30 ملم يدتا في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق في "الرايت بدلاً من ذلك" احتضانها في يدتا 3 مم في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.
    6. جزء 1 (الزوائد العزلة): نقل القطع المعوية إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل المخروطية، واهتز بشدة عن 10 ق، وصب إلى 100 مم طبق بيتري. تحقق من الكسر للزوائد معزولة تحت ستيريوميكروسكوبي. في هذه المرحلة، معظمهم من الزوائد يجب أن تكون موجودة ولكن هذا يمكن أن تختلف بين العزلة.
      ملاحظة: لمنع عزل الزوائد/الأقبية العالقة بالبلاستيك وأطباق بيتري وأنابيب جمع ينبغي أن تكون مغلفة مسبقاً مع المصل البقري الجنين (FBS). صب FBS في الأطباق و/أو أنابيب وإزالته فورا. انظر الجدول 1 للحصول على أدلة توقيت لكل جزء.
    7. نقل القطع المعوية مرة أخرى إلى 30 ملم يدتا في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق. خلال هذه الحضانة، جمع 1 جزء في أنبوب 15 مل المخروطية (بريكواتيد مع FBS) وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    8. جزء 2: نقل القطع المعوية إلى أنبوب 50 مل مخروطية التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني، اهتز بشدة عن 20 s، ومن ثم أجل إلى 100 مم طبق بيتري. تحقق الكسر تحت المجهر. عادة، في هذه المرحلة ثقافة مختلطة من الزوائد والاقبية هي الحالية (الشكل 2A).
    9. نقل قطع الأمعاء مرة أخرى إلى 30 ملم يدتا في برنامج تلفزيوني واحتضانها لمدة 5 دقائق إضافية. خلال هذه الحضانة، بيليه 2 جزء في أنبوب مخروطي 15 مل (بريكواتيد مع FBS) في ز 300 x 5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية من الكسور 1 و 2 دون الإخلال بيليه، والشروع فورا في التثبيت (الخطوة 3).
    10. جزء 3 (سرداب العزلة): نقل القطع المعوية إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل، اهتز 20 s، وصب إلى 100 مم طبق بيتري. تحقق من جزء تحت المجهر. وفي هذه المرحلة، سيتضمن الكسر الغالب الأقبية (الشكل 2).
    11. جزء 4: نقل القطع المعوية إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني، اهتز 20 s، وصب إلى 100 مم طبق بيتري. تحقق من جزء تحت المجهر. في هذه المرحلة ينبغي أن يكون فقط من أقبية الحالية.
    12. جزء 5: نقل القطع المعوية إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني، اهتز 20 s، وصب إلى 100 مم طبق بيتري. تحقق من جزء تحت المجهر. عادة، في هذه المرحلة، يتم استخراج الخبايا قليلة جداً. إذا كان يتم استخراج أكثر من بضعة الأقبية، ثم تابع مع كسرال 6.
      ملاحظة: إذا كان عدد سكان سرداب نقي هو المطلوب (على سبيل المثال، لتوليد أورجانويد)، ثم استخدم 70 ميكرومتر خلية مصفاة لإزالة أي الزوائد سليمة من الكسر سرداب أثري.
    13. جمع الكسور 3-5 في أنابيب مخروطية الشكل منفصلة 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في ز 300 x لمدة 5 دقائق.
    14. فحص الكريات من الكسور 3-5 وإزالة سوبيرناتانتس دون إزعاج الكريات، والشروع فورا في التثبيت (الفرع 3).

2.عزل أورجانويدس المعوية من الطابق السفلي مصفوفة القباب في لوحات 24-جيدا

ملاحظة: تم تشكيل أورجانويدس في الطابق السفلي مصفوفة القباب الوارد وصفها في أماكن أخرى من12.

  1. معطف الآبار مع بدروم مصفوفة قبة طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
  2. آبار المياه والصرف الصحي الطابق السفلي يحتوي على مصفوفة القباب مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة ميليلتر 250 الباردة من الخلية حل الاسترداد (4 درجة مئوية) لكل بئر (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: سيتم حل الاسترداد خلية الباردة ديبوليميريزي microtubules جميعا ولكن مستقرة.
  4. كشط القباب مصفوفة الطابق السفلي باستخدام ميكروبيبيتي P1000 عناية "الماصة؛" صعودا وهبوطاً في جميع أنحاء البئر لتفكك وإزالة المصفوفة الطابق السفلي من البلاستيك.
  5. جمع المادة طافية في أنابيب ميكروسينتريفوجي ملزمة منخفضة 1.5 مل.
  6. عكس أنبوب ملزمة منخفضة 1.5 مل عدة مرات والاختيار تحت المجهر سواء أورجانويدس وقد تم عزل وحرية الانتقال وليس في كتل. عقد الأنبوب تحت ستيريوميكروسكوبي وعرض إطار التكبير المنخفض (50 س).
  7. بيليه أورجانويدس بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق في الرايت
  8. إزالة الكاشف الانتعاش والشروع فورا في التثبيت (الخطوة 3).

3-تثبيت الأنسجة المعوية المعزولة وأورجانويدس

  1. تثبيت الميثانول
    1. ريسوسبيند الكسر سرداب/زغابة معوية معزولة في 10 مل وأورجانويدس في 1 مل ميثانول في-20 درجة مئوية.
    2. احتضان الأقبية/الزوائد/أورجانويدس في-20 درجة مئوية في ثلاجة لمدة 15 دقيقة، وعكس tube(s) كل 5 دقائق.
    3. بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق.
    4. إزالة الميثانول وإضافة الحل الغسيل (1 مل أورجانويدس و 10 مل لسرداب/زغابة معزولة الكسور). أما الحل الغسيل قد تتكون من برنامج تلفزيوني مع 1% مصل أو برنامج تلفزيوني مع المصل المنظفات و 1% 0.1%.
      ملاحظة: استخدام مصل الدم من نفس الفصيلة للأجسام المضادة الثانوية. على سبيل المثال، إذا تم توليد الأجسام المضادة الثانوية في الماعز ثم استخدام مصل الماعز.
    5. وعلى الفور، الطرد المركزي في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق بيليه.
    6. إزالة الحل الغسيل وريسوسبيند في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس في الحل الغسيل الطازجة.
    7. مكان على المدورة أنبوب بسرعة تعيين إلى 20 لفة في الدقيقة. تغسل الخلايا لإجمالي ح 1، التكوير الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي (غ س 1,000 لمدة 5 دقائق) كل 15 دقيقة، واستبدال الحل الغسيل.
      ملاحظة: إذا لم يكن متوفراً دوار أنبوب ثم عكس الأنابيب يدوياً كل 5 دقائق ريسوسبيند ثقافات منعزلة.
  2. تثبيت فورمالدهايد/ميثانول
    ملاحظة: التعامل مع المصفف ووالفورمالديهايد في غطاء دخان.
    1. ريسوسبيند الخبايا/الزوائد معزولة في 10 مل أو أورجانويدس في 1 مل حل مثبت-20 درجة مئوية (9.2 مل ميثانول مع 800 ميليلتر من حل فورمالدهايد).
    2. إصلاح الأقبية/الزوائد/أورجانويدس في-20 درجة مئوية في ثلاجة لمدة 15 دقيقة، وعكس أنبوب كل 5 دقائق.
    3. بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق.
    4. إزالة الفورمالديهايد/الميثانول وإضافة الحل الغسيل (1 مل أورجانويدس أو 10 مل للكسور عزل الأقبية/زغابة). أما الحل الغسيل قد تتكون من برنامج تلفزيوني مع 1% عنزة المصل أو برنامج تلفزيوني مع المصل المنظفات و 1% 0.1%.
    5. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس.
    6. إزالة الحل الغسيل وريسوسبيند في الحل الغسيل الطازجة.
    7. مكان على المدورة أنبوب بسرعة تعيين إلى 20 لفة في الدقيقة. تغسل الخلايا لإجمالي ح 1، التكوير الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي (غ س 1,000 لمدة 5 دقائق) كل 15 دقيقة، واستبدال الحل الغسيل.
  3. تثبيت منهاج عمل بيجين
    تنبيه: ينبغي معالجة مسحوق منهاج العمل والحلول في غطاء دخان.
    ملاحظة: يتم استخدام منهاج عمل بيجين في برنامج تلفزيوني في معظم الحالات 4% ولكن تبعاً للحفاظ على جسم أنتيجينيسيتي، يمكن استخدام تركيزات أقل.
    1. ريسوسبيند الأعلاف عزل الأقبية/الزوائد في 10 مل 4% منهاج عمل بيجين واحتضان في الرايت ح 1، والقريبون معزولة أورجانويدس في 1 مل 4% منهاج عمل بيجين واحتضان لمدة 30 دقيقة. وفي كلتا الحالتين عكس tube(s) كل 10 دقيقة.
    2. بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق.
    3. إزالة منهاج عمل بيجين وإضافة الحل الغسيل (1 مل أورجانويدس و 10 مل لعزل الأقبية/الزوائد). الحل الغسيل يتكون من برنامج تلفزيوني مع المصل المنظفات و 1% 0.1%.
    4. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق بيليه الأقبية/الزوائد/أورجانويدس.
    5. إزالة الحل الغسيل وريسوسبيند في الحل الغسيل الطازجة.
    6. مكان على المدورة أنبوب بسرعة تعيين إلى 20 لفة في الدقيقة. تغسل الخلايا لإجمالي ح 1، التكوير الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي (غ س 1,000 لمدة 5 دقائق) كل 15 دقيقة، واستبدال الحل الغسيل.
      ملاحظة: إذا لم يكن متوفراً دوار أنبوب ثم عكس أنابيب يدوياً كل 5 دقائق ريسوسبيند ثقافات منعزلة.
    7. مستضد استرجاعها (خطوة اختيارية وأوصت لتثبيت منهاج عمل بيجين)
      1. بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
      2. إضافة 1-10 مل من 10 ملم سترات الصوديوم pH 6.0 (قبل ارتفعت درجة حرارة 80 درجة مئوية) واحتضان عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      3. بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
      4. إضافة 1-10 مل من جديد 10 ملم سترات الصوديوم pH 6.0 (قبل ارتفعت درجة حرارة 80 درجة مئوية) واحتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
      5. بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
      6. تغسل في 1-10 مل برنامج تلفزيوني مع 1% مصل وكرر زيادة 3 مرات التكوير الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي (غ س 1,000 لمدة 5 دقائق) قبل إضافة حل المياه العذبة والصرف الصحي.

4-عرقلة الخطوة

  1. جعل الحل حظر: إضافة 10% جسم الثانوي أنواع المصل في برنامج تلفزيوني (اختياري: إضافة المنظفات 0.1%).
  2. بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس بالطرد المركزي (غ س 1,000 لمدة 5 دقائق) وإزالة المادة طافية.
  3. أضف 5-10 مل من عرقلة الحل تبعاً لعدد العينات المطلوبة (انظر الملاحظة أدناه). في هذه المرحلة، تقسيم الحل الأقبية/الزوائد/أورجانويدس إلى أنابيب فردية (أنابيب ميكروسينتريفوجي ملزمة منخفضة 1.5 مل مع كل أنبوبة تحتوي على 0.2-1 مل) لتلطيخ مع الأجسام المضادة المختلفة.
    ملاحظة: سوف تعطي كل جزء معزول الأقبية/الزوائد بين 5-10 العينات التي يمكن استخدامها لمجموعات التوسيم مختلفة تبعاً للحجم من بيليه. ومن الناحية المثالية، مطلوب بحجم بيليه بين 2-4 ملم لكل عينة.
ويمكن الجمع بين الكسور المختلفة في هذه المرحلة الأقبية والزوائد ويمكن بسهولة تحديد (الشكل 2).
  • احتضان في عرقلة الحل في RT على المدورة أنبوب ح 1.
  • 5-الابتدائي جسم الحضانة

    1. تمييع الأجسام المضادة الأولية (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10% 0.1% والمصل المنظفات. بين 100 إلى 200 ميليلتر مطلوب الحل الأساسي جسم كل عينة أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    2. إزالة الحل حظر بالطرد المركزي (غ س 1,000 لمدة 5 دقائق).
    3. ريسوسبيند بيليه الأقبية/الزوائد/أورجانويد في حل جسم الأولية واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها باستخدام أنبوب المدورة (20 لفة في الدقيقة) للحفاظ الأقبية/الزوائد/أورجانويدس في التعليق.
    4. وفي اليوم التالي: جلب العينات إلى RT ح 1 في أنبوب المدورة (20 لفة في الدقيقة).
    5. بيليه العينة بالطرد المركزي (غ س 1,000 لمدة 5 دقائق) وإزالة الحل جسم الأولية.
    6. أضف 1 مل من الغسيل الحل والكريات سرداب/زغابة/أورجانويد ريسوسبيند.
    7. إزالة الحل فورا بالطرد المركزي (غ س 1,000 لمدة 5 دقائق).
    8. أضف 1 مل أغسل الطازجة الحل وتدور الخلايا في أنبوب المدورة (20 لفة في الدقيقة) لمدة ساعتين. تغيير الحل أغسل بالطرد المركزي كل 30 دقيقة كما هو الحال في الخطوة 5، 7.

    6-الثانوية جسم الحضانة

    1. تمييع الثانوي الأجسام المضادة (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني مع المنظفات المصل و 0.1% 10%. مطلوب ميليلتر حوالي 200 من جسم الثانوي حل كل عينة أنبوب ميكروسينتريفوجي.
      ملاحظة: يجب استخدام الأجسام المضادة عالية عبر استيعابها للحد من مفاعليه من الأجسام المضادة الثانوية في الماوس سرداب/زغابة/أورجانويد.
    2. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق بيليه الأقبية/الزوائد/أورجانويدس وريسوسبيند الكريات في 200 ميليلتر من جسم الثانوية الحل.
    3. وتدور هذه الأنابيب في أنبوب المدورة (20 لفة في الدقيقة) في الرايت ح 1.
    4. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس وإزالة سوبيرناتانتس (الأجسام المضادة الثانوية غير محدد).
    5. ريسوسبيند بيليه في محلول الغسيل والطرد المركزي فورا في غ س 1,000 لمدة 5 دقائق بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس.
    6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من محلول المياه العذبة والصرف الصحي.
    7. تدور في أنبوب المدورة (20 لفة في الدقيقة) على RT ح 1، 5-2، تغيير الحل أغسل كل 20-30 دقيقة كما هو موضح مسبقاً في الخطوات 6.3-6.6.

    7-النووية وصمة عار

    1. تمييع وصمة عار النووية في حل المياه والصرف الصحي (وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة)، مثل DAPI أو هويشت. فعلى سبيل المثال: حل DAPI الأسهم (20 ملغ/مل) المخفف 01:10، 000. يمكن أن يوضع حل الأسهم في مختبرين في-20 درجة مئوية.
    2. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس وإزالة الحل الغسيل.
    3. ريسوسبيند بيليه في حل كونتيرستاين النووية.
    4. تدور حول أنبوب المدورة (20 لفة في الدقيقة) في RT لمدة 10 دقائق.
    5. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس وإزالة الحل النووي وصمة عار ريسوسبيند بيليه في الحل أغسل.
    6. تدور حول أنبوب المدورة (20 لفة في الدقيقة) في الرايت مدة 30-60 دقيقة، تغيير الحل أغسل كل 10 دقيقة.

    8-تركيب عزل الأقبية والزوائد أورجانويدس

    1. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق بيليه في الأقبية/الزوائد/أورجانويدس، وإزالة جميع الحل أغسل.
      ملاحظة: إذا كان تسارع شرط بيليه، ثم الطرد المركزي مرة أخرى.
    2. 2 إضافة قطرات من الصعب إعداد تركيب وسائط مع عامل أنتيفادي إلى بيليه.
    3. قطع نهاية ميكروبيبيتي P200 وعناية ريسوسبيند بيليه في وسائل الإعلام المتزايدة. تجنب توليد الفقاعات.
      ملاحظة: ثقافات منعزلة أورجانويد لزجة جداً؛ تأكد من ريسوسبيند تماما.
    4. استخدم في ميكروبيبيتي لنقل الخليط من أقبية/الزوائد/أورجانويدس في الحل تركيب وسائل الإعلام، والاستغناء عن خط على طول وسط شريحة المجهر.
      ملاحظة: ينبغي أن لا يكون الخط أطول من الزجاج الغطاء يمكن استخدامه. تحقق من استخدام ستيريوميكروسكوبي سواء الأقبية/الزوائد/أورجانويدس انتشار جيدا على الشريحة ولا تجمعت.
    5. بعناية بوضع غطاء زجاجة عبر الجزء العلوي؛ تجنب توليد الفقاعات.
    6. ضع الشريحة الزجاجية في كتاب الشريحة ومخزن في ثلاجة بين عشية وضحاها لوسائل الإعلام المتزايدة لتعيين قبل تحليل في مجهر [كنفوكل].
      ملاحظة: لجسم الماوس تلطيخ الأنسجة الماوس، في استخدام الفلورة التجاري كيت (انظر الجدول للمواد). استبدال كتلة 10 دقيقة مع البروتين حل حظر متبوعاً حضانة ح 1 مع كاشف الحظر الذي يأتي مع عدة خطوة حظر (القسم 4). ثم في الخطوة 5، 8 (في وسط الغسيل) إضافة حضانة ح 1 مع الأسفار إشارة محسن الكاشف. ثم استخدم كاشف الطقم في نيون ديلوتانت (الأجسام المضادة الثانوية الأخرى يمكن أيضا استخدامها في تركيبة مع هذا الكاشف). احتضان كما هو مذكور أعلاه، وننطلق من الخطوة 6 مع بقية البروتوكول.

    9-التثبيت ووضع العلامات المناعية من أورجانويدس داخل مصفوفة الطابق السفلي

    ملاحظة: أورجانويدس متجهة إلى التثبيت، ووسم المناعية بينما تبقى داخل المصفوفة الطابق السفلي تم إنشاؤها في الطابق السفلي مصفوفة القباب على رأس كوفيرسليبس الزجاج جولة في صفيحة 24-جيدا (قبة واحدة كل بئر). تم تجهيز القباب مصفوفة الطابق السفلي أورجانويد داخل لوحة 24-جيدا قبل إضافة وإزالة مختلف الحلول.

    1. إزالة المتوسطة من الآبار وإضافة مثبت؛ إجازة ح 1.
    2. إزالة مثبت وتغسل في برنامج تلفزيوني تتضمن المنظفات المصل و 0.1% 1% ح 2، وتغيير كل 30 دقيقة.
    3. إزالة الحل الغسيل وكتلة في برنامج تلفزيوني مع المنظفات 10% 0.1% والمصل ح 1.
    4. تمييع الأضداد في برنامج تلفزيوني مع 1% مصل أو برنامج تلفزيوني مع المنظفات المصل و 0.1% 1%.
    5. إزالة الحل حظر وإضافة 100-200 ميكروليتر جسم الأولية (انظر الجدول للمواد) إلى حل لكل بئر.
      ملاحظة: من المهم إزالة جميع الحل حظر حتى لا يؤدي إلى تمييع أجسام أخرى.
    6. ضع لوحة في الثلاجة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية
    7. ثم ترك على RT ح 1-2.
    8. إزالة الحل جسم والغسيل ح 2-3 تغيير الحل أغسل كل 20 دقيقة.
    9. إزالة جميع يغسل الحل وإضافة 100-200 ميكروليتر الأجسام المضادة الثانوية المخفف (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني مع المصل 1%؛ احتضانها ح 1 في الرايت
    10. إزالة الحل جسم الثانوية والغسيل ح 2، تغيير كل 20 دقيقة.
    11. إزالة الحل الغسيل وإضافة حل DAPI؛ يغادر 10 دقيقة في حل الأسهم DAPI استخدام الرايت (20 ملغ/مل) المخفف في 01:10، 000.
    يمكن أن يوضع حل الأسهم في مختبرين في-20 درجة مئوية.
  • إزالة الحل DAPI وتغسل مدة 40 دقيقة، تغيير كل 10 دقيقة.
  • استخدام الملقط، إزالة ساترة زجاجية مع قبة مصفوفة الطابق السفلي ووضعه على شريحة مع قبة مصفوفة الطابق السفلي التي تواجه صعودا؛ إضافة بضع قطرات من تركيب وسائط ومن ثم وضع ساترة زجاجية في الأعلى.
  • ضع الشريحة الزجاجية في كتاب شريحة وتترك في الثلاجة بين عشية وضحاها لوسائل الإعلام المتزايدة لتعيين.
  • Representative Results

    عزل الأنسجة المعوية لوسم المناعية
    كانت الأمثل البروتوكولات عزل الأنسجة وصف للقولون والأمعاء الدقيقة للحفاظ عليها، ووضع العلامات المناعية ميكروتوبوليس والبروتينات المرتبطة بها، ولكن ليس لبقاء الخلايا الجذعية وجيل أورجانويد (الشكل 1 و الجدول 1 ). وكان الهدف توليد سرداب والزوائد الفصائل التي كانت نظيفة (خالية من المخاط والأنسجة الأخرى) قدر الإمكان، مع التقليل من التعرض إلى يدتا والباردة للحفاظ على هيكل ومنع ديبوليميريزيشن ميكروتوبوليس مع حلول البرد الجليد، مما يدفع ديبوليميريزيشن ميكروتوبوليس جميعا ولكن مستقرة. ويبين الشكل 2 أمثلة للصور من الكسور 2 و 3 من أنسجة الأمعاء الصغيرة المعزولة، مع جزء 2 التي تحتوي على خليط من الزوائد والاقبية (الشكل 2 أ، ب)، بينما 3 جزء يحتوي على أساسا الأقبية (الشكل 2 ، د).

    التثبيت ووضع العلامات المناعية الأنسجة المعوية المعزولة
    ثم جهزت كسور منفردة أو مجتمعة للتثبيت والمناعية المسمى من خلال سلسلة من الخطوات بما في ذلك التثبيت، المنظفات، ومنع، وجسم، والغسيل الحلول، قبل إعادة تعليق نهائي الزوائد/الأقبية بيليه في تركيب وسائل الإعلام، نقل إلى شرائح، وتغطي بالزجاج كوفيرسليبس. ثم تم تصويرها في أقبية والزوائد في مجهر [كنفوكل].

    كان تحقيق الحفاظ عليها جيدا ووسم microtubules واكتين في الزوائد والاقبية بما يلي: مزيج من التثبيت فورمالدهايد/الميثانول في-20 درجة مئوية، تكرار الغسيل في برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل المنظفات و 1% 0.1% وعرقلة في برنامج تلفزيوني مع 0.1% مصل المنظفات و 10 في المائة، تليها الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الأجسام الأولية، ومن ثم ح 2 في الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة (الشكل 3). تثبيت فورمالدهايد/الميثانول أيضا عملت جيدا لوسم + نصائح مثل الحديدية ومقطع-170 في أقبية معزولة والزوائد (الشكل 4). تراكمات EB3 بالإضافة إلى نهاية ميكروتوبوليس (المعروفة باسم المذنبات) كانت واضحة في أقبية (الشكل 4 أ)، بينما يمكن رؤية رابطة على طول شعرية microtubules مستقرة في عينات الزوائد (الشكل 4). الترجمة متميزة CLIP-170 و p150جلود (وحدة فرعية ديناكتين) كان جليا في قمي ن-متوكس في الزوائد معزولة (الشكل 4 باء). التثبيت مع البروتوكول فورمالدهايد/الميثانول لم تنجح دائماً للتعريب نينين في الأنسجة المعوية المعزولة استخدام لدينا جسم Pep3 ضد نينين الماوس. ومع ذلك، التثبيت الميثانول في-20 درجة مئوية تليها غسل نفس وعرقلة الحلول أما فورمالدهايد/الميثانول أعطى الترجمة جيدة جداً من نينين داخل أقبية معزولة والزوائد (الشكل 5؛ المرجع8). من المثير للاهتمام، بينما تتركز في سينتروسوميس قمي نينين بعض تراكم في قاعدة الخلية وكان واضحا في بعض الخلايا داخل أقبية معزولة (الشكل 5). ما إذا كان هذا سبب التسمية غير محددة أو نتيجة لتأخير إجراءات العزل التثبيت (ومما يؤثر في الحفاظ على) سوف تحتاج إلى مزيد من التحقيق. بيد أن أقسام كريوستات الميثانول--ثابت (-20 درجة مئوية) من الزوائد (انظر الشكل 3bi في8) كشفت أيضا نينين في الخلية الأساسية في بعض الخلايا مما يوحي بأن نينين قد أيضا إقران عدد سكانها القاعدية microtubules.

    التثبيت ووضع العلامات المناعية من أورجانويدس المعزولة من مصفوفة الطابق السفلي
    أورجانويدس المعوية الصغيرة ولدت ونمت في مصفوفة الطابق السفلي لمدة ثلاثة أسابيع أو أكثر (الشكل 6A؛ المرجع6،15). باردة (4 درجة مئوية) حل الاسترداد خلية تم استخدامه لعزل أورجانويدس من المصفوفة الطابق السفلي. نقلت إلى أنابيب الحل مصفوفة الطابق السفلي ديبوليميريزيد مع أورجانويدس وطرد قبل التثبيت ووضع العلامات المناعية. وهذا أنتج التحضير نظيفة جداً ويسمح بالوصول بسهولة إلى أورجانويدس لمختلف الحلول. تحتوي الخلايا المتمايزة ضمن المجالات زغابة أورجانويد microtubules أبيكو القاعدية مستقرة؛ هذه المسمى أيضا في معظم الحالات (الشكل 6 باء، وجيم) و EB1 يمكن أن ينظر إليه أيضا على طول شعرية microtubule (6E الشكل؛ المرجع13). بيد حل الاسترداد خلية الباردة قد ينتج ديبوليميريزيشن ميكروتوبوليس الحيوي، الذي كان واضحا في بعض العينات بالافتقار إلى المذنبات EB1 (الذي ربط زائد-نهاية microtubules المتزايد) ضمن المجالات سرداب القاعدية (6F الشكل ). في العينات الأخرى، تم الحفاظ على نجمي microtubules (ديناميكية) (الشكل 6). عزلة أورجانويد قبل التثبيت، ووسم المناعية عملت أيضا للبروتينات هالة، نينين ومقطع-170 وعلامات خلية، مثل الميوسين لقدح الخلايا وتشروموجرانين أ للخلايا انتيروندوكريني.

    التثبيت ووضع العلامات المناعية من أورجانويدس داخل مصفوفة الطابق السفلي
    7 الرقم
    يظهر أورجانويد في مرحلة كيسه (Aج) وفي مرحلة مبكرة من التنمية سرداب (د)، ثابتة في فورمالدهايد/الميثانول والمناعية المسمى microtubules ونينين. المحافظة على ميكروتوبولي جيدة ووسم فضلا عن وضع العلامات نينين في متوكس ن قمي كانت واضحة. يبين الشكل 8 أ، ب مجال سرداب داخل يوم 6 أورجانويد الثابتة مع البروتوكول الميثانول والمسمى ميكروتوبوليس و EB1. المحافظة على حسن ميكروتوبوليس والمذنبات EB1 كان واضحا مما يشير إلى الحفاظ على ديناميكية microtubules.

    وكانت أورجانويدس أيضا ثابتة والمناعية المسمى بينما تبقى داخل المصفوفة الطابق السفلي. قد يكون ضعف تغلغل مثبت والملائمة للأجسام المضادة داخل المصفوفة الطابق السفلي (الشكل 8B)، على الرغم من أن في كلتا الحالتين أقل كثيرا عند المنظفات 0.1% أدرج في مثبت مساوئ هذا الإجراء و/أو تغسل الحلول. وباﻹضافة إلى ذلك، 4% منهاج العمل لم يكن حكرا على المصفوفة الطابق السفلي جيدا لكن سبب ذلك حل، على الرغم من أن هذا كان أقل من ذلك مع 1% منهاج عمل بيجين.من ناحية أخرى، فعل التثبيت الميثانول، أحياناً انهيار أورجانويد.

    وضع العلامات مع بعض مثل أضداد الخلايا الجذعية علامة Lgr5 وبانته علامة خلية CD24 باءت بالفشل مع البروتوكولات منهاج العمل أو الميثانول الميثانول فورمالدهايد/4%. بيد تحديد أورجانويدس داخل المصفوفة الطابق السفلي مع 1% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني مع المنظفات 0.1% في درجة حرارة الغرفة يؤدي وضع العلامات لكل من Lgr5 و CD24 (الشكل 9).

    Figure 1
    رقم 1: عزل الزوائد المعوية الصغيرة والاقبية. رسم تخطيطي لسير الخطوات الرئيسية في زغابة معوية صغيرة وعزل سرداب قبل التثبيت ووضع العلامات المناعية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    رقم 2: عزل الزوائد والاقبية من الماوس الأمعاء. برايتفيلد صور المجهر الكسور المعوية تظهر الزوائد (الأسهم الكبيرة) والاقبية (الأسهم الصغيرة). (أ وب) جزء 2 يحتوي على خليط من الزوائد والاقبية، والحفاظ على مورفولوجية على الزوائد وسرداب يتجلى في ب. (ج، د) يظهر جزء 3 عزل الأقبية وغياب الزوائد والاقبية سليمة بما في ذلك سرداب سيوصف في ج. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر (أ، ج)؛ 100 ميكرومتر (ب، د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3: عزل زغابة معوية صغيرة وسرداب الثابتة في فورمالدهايد/الميثانول والمناعية المسمى microtubules واكتين- (أ) التخطيطي ظهارة زغابة وسرداب مع أنواع مختلفة من الخلية وأشارت إلى. تشير المربعات المميزة إلى المناطق تمثيلاً تصويرها في ب وج. (ب، ج) [كنفوكل] المقاطع البصرية من خلال جزء من الزوائد (ب) وسرداب القاعدية (ج) معزولة من الأمعاء الدقيقة استخدام 30 ملم يدتا وثابتة في فورمالدهايد/الميثانول، غسلها في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% عنزة المنظفات المصل و 0.1 في المائة، وسدت في برنامج تلفزيوني التي تحتوي على مصل الماعز 10% و 0.1% مواد التنظيف، والمسمى ميكروتوبوليس مع الفئران [مونوكلونل] tubulin المضادة الأجسام المضادة (الأخضر) والاكتين مع أرنب [بولكلونل] مكافحة-β-أكتين جسم (أحمر). كذلك الحفاظ على أبيكو القاعدية حزم ميكروتوبولي وتتضح في خلايا الزوائد وسرداب، ويمكن رؤية أكتين تتركز في منطقة قمي تواجه التجويف (السهم). تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 4
    الشكل 4: عزل سرداب الأمعاء الصغيرة والزوائد الثابتة في فورمالدهايد/الميثانول والمناعية المسمى microtubules EB3، p150جلودومقطع-170- أقسام الضوئية [كنفوكل] مناطق سرداب والزوائد معزولة من الأمعاء الدقيقة باستخدام 30 مم يدتا وثابتة في فورمالدهايد/الميثانول، غسلها في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10% مصل الماعز والمنظفات 0.1%، سدت في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10% مصل الماعز والمنظفات 0.1%، و المناعية المسمى. (أ) سرداب المسمى مع أرنب [بولكلونل] α-tubulin جسم (أحمر) والفئران [مونوكلونل] جسم مضاد EB3KT36 (الأخضر) والملون للحمض النووي مع DAPI (أزرق) عرض microtubules أبيكو القاعدية والمذنبات EB3. الصورة مقلوبة قناة واحدة يبين بوضوح المذنبات EB3 في جميع أنحاء الخلايا القاعدية سرداب اقتراح جيد الحفاظ على الدينامية كذلك microtubules مستقرة. الزوائد (ب) الخلايا الظهارية المسمى مع جسم 170 مقطع [بولكلونل] أرنب (أحمر، انظر أيضا مرجع16) والفأرجلويد p150 [مونوكلونل] جسم (الأخضر) عرض قمي التعريب المشارك. الصور المقلوبة قناة واحدة هي كما يلي: (ج) خلايا الزوائد المسمى مع أرنب [بولكلونل] α-tubulin جسم (أحمر) والفئران [مونوكلونل] جسم مضاد EB3-KT36 (الأخضر) والملون للحمض النووي مع DAPI (أزرق) عرض microtubules أبيكو القاعدية مع EB3 على طول شعرية. سلطت الضوء على الرابطة شعرية EB3 في الصورة الموسع بينما تقترح الصورة مقلوبة قناة واحدة EB3 المذنبات ورابطة شعرية. تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 5
    الرقم 5: معزولة القولون سرداب ثابتة في الميثانول، المناعية المسمى نينين وهاء-كادهيرين، والملون مع DAPI. قسم البصري [كنفوكل] القاعدية وتضخيم عبور المنطقة من سرداب المعزولة من القولون باستخدام 3 مم يدتا وثابتة في الميثانول وغسلها في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% عنزة المصل والمنظفات 0.1%، وسدت في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10% الماعز المنظفات المصل و 0.1 في المائة. وصفت السرداب مع الأرنب نينين [بولكلونل] أجسام (Pep3، انظر أيضا المرجع8، أحمر) والفأر [مونوكلونل] جسم ه-كادهيرين (الأخضر) والملون مع DAPI (أزرق). وتوضح الصورة مقلوبة قناة واحدة نينين فقط. وتوضح الصورة سرداب الحفاظ عليها جيدا مع ه-كادهيرين الكشف عن الخطوط العريضة لخلايا فردية وتتركز في سينتروسوميس قمي نينين. أنها تشير إلى تغلغل جيد مثبت والأجسام المضادة، والحفاظ على أنتيجينيسيتي. شريط المقياس = 5 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 6
    رقم 6: تنمية أورجانويد والتثبيت، ووسم المناعية لعزل أورجانويدس. وشكلت المرحلة (أ) التباين الصور تظهر المراحل المختلفة للتنمية أورجانويد من المجاميع خلية للكيس مع الشروع في مهدها والكامل أورجانويدس مع المجالات سرداب والزوائد.(بو) [كنفوكل] المقاطع البصرية من خلال أورجانويدس المعزولة من مصفوفة الطابق السفلي باستخدام حل الاسترداد الخلية عند 4 درجة مئوية (10 دقيقة) متبوعاً بالتثبيت فورمالدهايد/الميثانول، الغسيل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10% مصل الماعز والمنظفات 0.1%، عرقلة في برنامج تلفزيوني يتضمن الماعز 10% 0.1% مسحوق الغسيل، ووضع العلامات المناعية ميكروتوبوليس، وبيتا-كاتينين، و EB1 والمصل. (ب) كيسه أورجانويد المسمى ميكروتوبوليس (الأزرق) وبيتا-كاتينين (أحمر) يكشف عن الحفاظ على ميكروتوبولي جيدة ووضع العلامات في معظم الخلايا. وتتضح في هذه الخلايا الظهارية الموسع من كيسه أورجانويد microtubules أبيكو القاعدية متميزة (ج). (د) تقسيم الخلايا المسماة ل microtubules عرض مغزل بما في ذلك ميكروتوبوليس (ديناميكية) نجمي (السهم). (ه، و) زغابة المجال () والمجال (F) سرداب أورجانويد المناطق التي تظهر بعض العلامات EB1 على طول شعرية microtubules مستقرة، لا سيما في زغابة، في حين تعتبر قليلة جداً EB1 المذنبات حتى داخل سرداب القاعدية مما يوحي بأن دينامية لم تم الحفاظ على ميكروتوبوليس. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر (A)؛ 2 ميكرومتر (د)؛ 5 ميكرومترات (ب، ج، E-F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 7
    رقم 7: أورجانويدس الثابتة داخل المصفوفة الطابق السفلي في فورمالدهايد/الميثانول والمناعية المسمى microtubules ونينين. [كنفوكل] أقسام أورجانويدس الضوئية ثابتة في فورمالدهايد/الميثانول، وغسلها وحظرها في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10% مصل الماعز والمنظفات 0.1%، والمسمى بينما تبقى في مصفوفة الطابق السفلي. (أج) كيسه أورجانويد المسمى ميكروتوبولي (الأخضر) ونينين (Pep3؛ المرجع8، الأحمر) والملون مع DAPI (الأزرق) عرض الصورة المدمجة في ألف والمقلوب صور قناة وحيدة ل microtubules (ب) و (ج) نينين. وتظهر الصور microtubules أبيكو القاعدية والتعريب نينين قمي، مما يوحي بالحفاظ على هيكلية جيدة جداً أورجانويد واختراق الأجسام المضادة، فضلا عن إزالة الأجسام المضادة غير منضم. (د، ه) أورجانويد مع تطوير سرداب ثابتة والمسمى كما هو مذكور أعلاه والحفاظ على هيكلية ممتازة تظهر مرة أخرى ووضع العلامات وإزالة الأجسام المضادة. متميزة ميكروتوبوليس أبيكو القاعدية وبعد ن قمي التعريب نينين الواضحة والمميزة في صورة موسعة (ه) منطقة محاصر في د. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرومترات (أ-د)؛ 5 ميكرومترات (ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 8
    الشكل 8: أورجانويدس الثابتة داخل المصفوفة الطابق السفلي في الميثانول والمناعية المسمى microtubules و EB1. [كنفوكل] أقسام أورجانويدس الضوئية الثابتة في الميثانول وغسلها وحظرها في برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل الماعز 10% والمنظفات 0.1% والمسمى، بينما تبقى في مصفوفة الطابق السفلي. كيسه (A) المسمى المجال من أورجانويد نمواً كاملا مع أرنب [بولكلونل] α-tubulin (أحمر) والفأر [مونوكلونل] أجسام EB1 (الأخضر) عرض microtubules أبيكو القاعدية، مغزل (سهم) في اثنين من تقسيم الخلايا ومتميزة EB1 المذنبات. ويتضح محاصرة بعض الأجسام المضادة EB1 غير منضم. ومع ذلك، لوحظ الحفاظ على الهيكلية الجيدة والعلامات microtubules و EB1. وجود المذنبات EB1 يوحي بأنه تم الحفاظ على ديناميكية microtubules (، عكس). (ب) صورة مقلوب أورجانويد كيسه منطقة عرض α-tubulin جسم وسم مع الأجسام المضادة كبيرة محاصرين داخل المصفوفة الطابق السفلي المحيطة بها (السهم). تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 9
    الشكل 9: أورجانويدس ثابتة داخل المصفوفة الطابق السفلي في 1% منهاج عمل بيجين والمناعية المسمى Lgr5 و CD24. [كنفوكل] أقسام بصري أورجانويدس ثابتة داخل المصفوفة الطابق السفلي في 1% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% المنظفات، غسلها في برنامج تلفزيوني مع 1% عنزة المصل والمنظفات 0.1%، والمسمى بأجسام مضادة ضد Lgr5 و CD24. (أ وب) الخلية الجذعية المتخصصة ضمن مجال سرداب عرض خلايا بانيث الإيجابية ل CD24 (أحمر). تم دمج الصور [كنفوكل] ومرحلة التباين في A. ب إظهار العلامات قناة واحدة من CD24. (ج) الخلايا الجذعية المنطقة ضمن مجال سرداب عرض خلية جذعية إيجابية Lrg5. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Table 1
    1 الجدول: الجدول الزمني لعزل القبو والزوائد المعوية الصغيرة والتثبيت- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Discussion

    عزل الأنسجة المعوية
    عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة والزوائد والاقبية colonic ينطوي على تعريض سطح المخاطية، المعاملة مع الحل أدتا تخفيف الاتصالات المحمولة وتجزئة (الهز) والطرد المركزي. تم تعديل البروتوكول العزلة الزوائد المعوية قدم/سرداب من بيلشاو et al. ووايتهيد et al. 17 , 18

    تعريض سطح المخاطية
    ونحن قد جربت عددا من النهج لفضح السطح المخاطي للامعاء في وضع هذا الإجراء. نهج كلاسيكي إيفرت (إيقاف الداخل إلى الخارج) الأنبوب، عادة في مقاطع طويلة، حوالي 100 مم استخدام قضيب معدني يتم التقاطها في إضعاف النسيج في نهاية واحدة والانبوب المتبقي ثم انزلق عبر أنبوب19. للماوس الأنسجة، مثالي قضيب معدني (2.4 مم) ذات نهايات مستدير الزوايا. وهذا النهج قد يعود بالنفع لتوسيع سطح المخاطية مما يتيح إمكانية الوصول إلى برنامج تلفزيوني ويدتا. ونحن في البداية يستخدم هذا النهج لكنها انتقلت إلى قطع الأنبوبة إلى أطوال قصيرة (حوالي 5 سم) وفتح كل مقطع بتشريح مقص كما أثبت هذا أسهل. وهذا النهج مناسبة إلا إذا كان مطلوبة من عدد قليل من الأمعاء؛ ولكن إذا كانت الحيوانات أكثر أن تستخدم في تجربة ثم بنيت لهذا الغرض جهاز لقطع فتح الأنبوب طوليا، كما وصفها Yoneda et al. 14 سيكون أكثر كفاءة.

    مفرزة من الزوائد والاقبية من طبقة العضلات
    في البداية استخدمنا 3 مم يدتا في برنامج تلفزيوني وفترات حضانة طويلة نسبيا تصل إلى 60 دقيقة لتخفيف سطح المخاطية من17،الأنسجة الكامنة وراء18. في هذا التركز يدتا وجدنا وقت حضانة من 30 دقيقة كانت كافية لتخفيف الأقبية من القولون الماوس. ومع ذلك، لعزل سرداب/زغابة الأمعاء حاولنا استخدام يدتا أكثر تركيزاً لفترة أقصر، التي ثبت أن اتباع نهج فعالة. وأجرى جميع الأعمال اللاحقة مع الأنسجة المستخرجة باستخدام تقنية يدتا 30 ملم توليد الكسور ذات الصلة للزوائد أو الأقبية. للأقبية، نحن عادة تجميع الكسور 3-5 قبل إصلاح لكن من المهم للتحقق من ما إذا كانت هذه هي الكسور المناسبة حسب التوقيت يعتمد على عدد من العوامل مثل موقف على طول القناة المعوية، وعمر الماوس، التهاب، والنظام الغذائي السابق ، إلخ وعلى نحو مماثل، قد يختلف طول الوقت الأنسجة يحتاج إلى أن تهتز بعد العلاج أدتا أن تكون فعالة تحت ظروف مختلفة. والنتيجة كسور الأنسجة المعزولة التي تحتوي على خليط من الزوائد والاقبية أو أساسا أما الزوائد أو الأقبية (الشكل 2). كما أن هناك لا الزوائد في القولون، استخراج سرداب قد يكون ممكن التحقيق في خطوة واحدة بالهز الأنسجة في أنبوب لمدة 30 ثانية. يمكن إصلاح هذه الكسور والمجهزة لوسم المناعية.

    عزل أورجانويدس المعوية من مصفوفة الطابق السفلي
    يمكن عزل أورجانويدس من الطابق السفلي القباب مصفوفة باستخدام حل الاسترداد الخلية. يعمل الحل عن طريق ديبوليميريزينج المصفوفة تبلور الطابق السفلي ولكن يلزم درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. الحذر من أن ميكروتوبوليس الحيوية قد لا يتم الاحتفاظ. وهكذا، لوسم المناعية لدينامية microtubules و + نصائح مثل الخلية الحديدية، لا يوصي بالانتعاش من مصفوفة الطابق السفلي قبل التثبيت. ومع ذلك، معظم microtubules في تمييز الخلايا أورجانويد مستقرة نسبيا وكانت هذه المحافظة (الشكل 6). كما أنها عملت جيدا للعلامات المناعية لبروتينات سينتروسومال وهالة، فضلا عن علامات خلية.

    تثبيت البروتوكولات
    فورمالدهايد (طازجة من منهاج عمل بيجين) كروسلينكس مثبت التصرف السريع نسبيا التي تشكل عكسها ونسبة 4 في المائة منهاج العمل يعمل جيدا على سبيل المثال، في وسم المناعية microtubules وغاما-tubulin وخيوط أكتين المصبوغة مع فالويدين. أكثر تمييع حلول منهاج العمل مثل 1% عملت جيدا بالنسبة وسم المناعية على سبيل المثال، مع علامات Lgr5 وبانيث الخلايا الجذعية علامة خلية CD24 داخل سرداب الخلايا الجذعية المتخصصة، في حين لم تنجح تركيزات أعلى من منهاج عمل بيجين.

    إضافة glutaraldehyde يعطي أفضل الحفاظ على ميكروتوبوليس وما يسمى فيمو تثبيت البرنامج الذي يتكون من خليط من 3.7% منهاج عمل بيجين، جلوتارالديهيدي 0.05% والمنظفات 0.5% في فيمو المخزن المؤقت (أنابيب 68 مم، 25 مم هيبيس، 15 اجتا و 3 ملم MgCl2)2 يعطي المحافظة ممتازة من ميكروتوبوليس دون المساس أنتيجينيسيتي. كما أنها تعمل جيدا لوسم المناعية غاما-tubulin وبيتا-كاتينين، وهاء-كادهيرين وخيوط أكتين المصبوغة مع فالويدين. ومع ذلك، في أنسجة ثلاثية الأبعاد والثقافات أورجانويد، تثبيت فيمو تنتج نتائج غير متناسقة ولذلك لم يستخدم.

    من الميثانول مثبت تخثر يعطي اختراق جيدة نسبيا، ويميل إلى الحفاظ على أنتيجينيسيتي. التثبيت مع 100 ٪ الميثانول (-20 درجة مئوية) يقدم بعض الانكماش ويتيح الحفاظ على مورفولوجيا معتدلة ويعمل microtubules، + نصائح، والعديد من الأجسام المضادة سينتروسومال بما في ذلك نينين في 2D خلية الثقافات. ومع ذلك، انهارت بعض أورجانويدس عند استخدام أسلوب التثبيت هذا. وباﻹضافة إلى ذلك، الاختراق من الأجسام المضادة من خلال أسرة الأقبية أو الزوائد أو أورجانويدس كان في البداية مشكلة ولكن إضافة المنظفات 0.1% إلى الحل الغسيل والغسيل طويلة حققت نتائج أفضل.

    مزيج من الفورمالدهايد والميثانول كان يستخدمها سابقا روجرز et al. 20 إلى EB1 المناعية-التسمية في المورفولوجية. تثبيت بروتوكول يستند إلى مزيج فورمالدهايد والميثانول لذلك بوضع الأنسجة المعوية وأورجانويدس استناداً إلى 3% فورمالدهايد و 97 ٪ الميثانول مبردة إلى-20 درجة مئوية، ولكن إهمال كربونات الصوديوم 5 مم من الخليط التي تم استخدامها بواسطة روجرز وآخرون. كانت عينات 20 بالإضافة إلى ذلك، ثابتة في الثلاجة عند-20 درجة مئوية. هذا عملت لا سيما جيدا للعلامات المناعية + نصائح، مثل القصاصة-170 والحديدية، ولكن ثبت أيضا ممتازة لتحديد ووسم المناعية microtubules واكتين داخل الأنسجة و 3D أورجانويدس. الحفاظ على هيكلية جيدة جداً وكان واضحا والمحافظة على أنتيجينيسيتي لعدة بروتينات cytoskeletal والمرتبطة بها، فضلا عن البروتينات سينتروسومال مثل غاما-tubulin ونينين، على الرغم من أن وضع العلامات نينين عمل أكثر اتساقا مع الميثانول التثبيت.

    Disclosures

    الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

    Acknowledgments

    يشكر المؤلفون بول توماس مجهر المشورة والمساعدة. أيد هذا العمل تشارك هنا بسرك (منحة لا. BB/J009040/1 M.M.M. و T.W.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537-500ML washing and PFA
    Cell Recovery Solution Corning 354253 isolate organoids
    lobind microcentrifuge tubes Eppendorf 30108116 prevent cells sticking
    0.5 M EDTA solution, pH 8.0 Sigma 03690-100ML Crypt isolation
    70 μm cell strainer Fisher Scientific 11517532 Isolate crypts from villi
    Triton X-100 Sigma T8787 detergent
    goat serum Sigma G6767 blocking agent
    Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma used as non-stick agent
    Paraformaldehyde, 4% in PBS Alfa Aesar J61899 fixative
    Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) Sigma F8775 used as fixative
    Methanol 99.9% Analytical grade Fisher M/4000/17 used as fixative
    MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit Maxvision
    Biosciences
    MF01-S commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling
    Rotator SB2 or SB3 Stuart microcentrifuge tube rotator
    Sodium citrate antigen retrieval
    Hydromount National Diagnostics HS-106 mountant
    DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802 anti-fade agent
    Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges Clarity N/C366 slides
    Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm Clarity NQS13/2250 coverslips
    Matrigel Corning 356231 Basement matrix for 3D organoid culture
    50 mL conical tubes Sarstedt 62.547.254 for processing tissue/organoids
    15 mL conical tubes Sarstedt 62.554.502 for processing tissue/organoids
    1.5 mL LoBind tubes Eppendorf 30108051 for isolated organoids
    Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181 primary antibody 1:500
    Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody Abcam ab6160 primary antibody 1:100
    Rabbit alpha-tubulin antibody Abcam ab15246 primary antibody 1:100
    Rabbit anti-beta-actin antibody Abcam ab8227 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal anti-p150Glued antibody BD Bioscience 610473/4 primary antibody 1:100
    Rat monoclonal EB3KT36 antibody Abcam ab53360 primary antibody 1:200
    Mouse monoclonal EB1 antibody BD Bioscience 610535 primary antibody 1:200
    Rabbit anti-Lgr5 antibody Abgent AP2745d primary antibody 1:100
    Dylight anti-rat 488 Jackson 112545167 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-mouse 488 Jackson ST115545166 seconday antibody 1:400
    Dylight anti-rabbit 647 Jackson 111605144 seconday antibody 1:400

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109, (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
    2. Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66, (10), 893-908 (2009).
    3. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157, (6), 1041-1048 (2002).
    4. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila. J Cell Biol. 108, (4), 1445-1452 (1989).
    5. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Curr Opin Cell Biol. (2016).
    6. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
    7. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
    8. Goldspink, D. A., et al. Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres. Open Biol. 7, (2), (2017).
    9. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife. 5, (2016).
    10. Young, M., Reed, K. R. Organoids as a Model for Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12, (5), 281-287 (2016).
    11. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods. 14, (3), 287-289 (2017).
    12. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13, (6), 653-658 (2013).
    13. Goldspink, D. A., et al. The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation. Journal of Cell Science. 126, (17), 4000-4014 (2013).
    14. Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J Vis Exp. (105), e53042 (2015).
    15. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
    16. Coquelle, F. M., et al. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol. 22, (9), 3089-3102 (2002).
    17. Belshaw, N. J., et al. Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa. Carcinogenesis. 31, (6), 1158-1163 (2010).
    18. Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, (2), 587-591 (1993).
    19. Hamilton, K. L., Butt, A. G. Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice. Adv Physiol Educ. 37, (4), 415-426 (2013).
    20. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, (5), 873-884 (2002).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics