大人の雄のマウスに経尿道的注入手順

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Immunology and Infection

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Summary

経尿道的注入が困難なプロシージャであり、文献にも記載されていません。本稿の目的は、大人の男性マウスの前立腺や膀胱に活性物質と液体の膀胱配信するためカテーテルの尿道挿入の技術を記述するためです。

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Lee, S., Carrasco Jr., A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse. J. Vis. Exp. (129), e56663, doi:10.3791/56663 (2017).

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Abstract

尿道注入を使用する膀胱膀胱の病態モデル動物を誘導するかを評価するにローカル有効成分 (例えば薬剤、化学物質、細菌、およびウイルス) とさまざまなソリューションを提供することができます、膀胱内注入治療効果。下部尿路 (LUT) 病態の最も齧歯動物モデルは、女性の尿道を介して物質の膀胱内注入を容易にするため雌マウスに誘導されます。しかし、女性と男性の LUT で解剖学的な違いがあるため男性マウスに経尿道的注入は非常に挑戦的なプロシージャとみなされている、以前記載されていません。本稿では、雄マウスの尿道にその後挿入するためポリエチレン (PE) 管を準備する方法の詳細な説明を提供します。また、接種の目的のサイトによって使用される PE チューブの理想的な種類をについて説明します。さらに、ポイント ポイントで尿道の損傷を回避し、目的の場所へのソリューションの配信に成功した経尿道的投与の動物を準備する方法について述べる.手順は、包皮、尿道口の開口部を公開する亀頭の取り消しによって開始されます。次に、亀頭は、陰茎と PE チューブを安定させるために鈍的非破砕, 鉗子で把持です。PE チューブが尿道口動物の体に平行に挿入し、尿道の自然の曲率を次にそれを操縦するカテーテルを傾けることによって角度を調整します。この手法は、誘導膀胱病態モデルマウスを使用したり、男性マウスの膀胱内注入治療の有効性を評価します。

Introduction

経尿道的注入アプローチ前の研究で膀胱の病態1,2,3,4の齧歯動物モデルを作成する方法の 1 つとして使用されています、評価に使用することができます、マウスでローカルに配送された治療法の有効性動物モデルできない人間の病理を要約して完全に、動物研究の基になるメカニズムの同定は、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群、神経因性など人間の LUT 疾患の理解を深める膀胱炎、自己免疫性の膀胱炎と前立腺の炎症5

大人の雄マウスに経尿道的注入術は大人の雌マウス6の膀胱内注入よりももっと技術的に挑戦的です。その小径と一緒に男性の尿道の自然に湾曲した解剖学は、尿道へのカテーテル挿入を達成するが技術的に難しくなっています。したがって、する詳しい手順を経尿道的誘導マウス尿路感染症6と LUT 炎症7,8,9,10,11,12,13,14,前述の雌マウスだけの膀胱に挿入されたカテーテルを介して15だった。この原稿は、雄マウスのビデオ クリップ、画像、イラストなどの物質の経尿道的注入の技術の段階的な説明を提供するために目指しています。経尿道的注入変数を持つ大人の男性マウスの手順を実行できますが類似する以前の筋電図記録などの追加のテクニックを吸収合併し、雌マウス7に記載されている再接種します。観た応答 (VMR)16

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Protocol

方法と術後のケアと同様に、麻酔科の期間を含む動物のすべてのプロシージャが獣医に相談し、制度的ケアおよび使用委員会 (IACUC)、によって承認された、所属機関。本稿では、すべての手順を行った 15 週齢の c57bl/6 男性マウスに 8 とプロトコル コロラド大学で IACUC によって承認されたアニマル ・ ケアのガイドラインに従います

1 チューブ準備

注: 接種を植え付ける、針はポリエチレン (PE) 管 ( 図 1 a) または小さなゲージに接続されている (< 24 G) 血管カテーテルは使用される (をすることができます。 図 1)。血管カテーテルの使用には、70% エタノール (エタノール) と殺菌以外の準備は不要です。接種が尿路に注入/注射/堆積物質です。これは細菌、ウイルス、または化学物質が含まれているソリューションをすることができます。これは、前の時間と研究プロトコルごとに用意しています。たとえば、研究は下部尿路の 大腸菌 感染の影響を評価することを目的、研究者が接種/下部尿路に注入することができます細菌を含む接種材料を準備する必要が

  1. PE チューブに取り付けられた針の作製は簡単で、次の構成: 標的臓器と動物の年齢に基づいて PE チューブのサイズを選択します。12 週間より若い動物用 PE 10 チューブ (外径 0.024 インチ、内径 0.011 インチ)。PE 10 チューブが接種前前立腺がん (AP) と精嚢 (SV) の (1) のプライマリ シードまたは 12 週齢より若い動物の膀胱で菌の (2) の主なシードのため適切であると示唆されました。サイズ (外径 0.038 インチまでと 0.023 インチ最大内径) PE 50 はより古い動物の膀胱で菌の主なシードに使用されることができますまでの大径 PE チューブ
  2. PE チューブの約 2.5 インチをカットします
  3. 使用する選択した PE 径を合わせて針を選択します。27 G 針が PE 10 チューブの内腔に合うことができるし、22 G 針に適合 PE 50 チューブの内腔
    1. 市販油石針の鋭いエッジをこすることによって PE チューブ挿入前に針の準備 ( 図 1A -B) 鈍い、または市販の鈍を使用針します
  4. PE チューブの内腔に鈍い針 ( 図 1) をご紹介します。内腔の中心部に針のままを確保することによって内腔または偽腔への参入の損傷を防ぐ。( 図 1 -E)。鈍い針の挿入時に PE チューブが破損した場合破損した端をカットし、プロセスを再起動します
  5. は、70 %etoh の手順については、使用するまで滅菌針添付 PE 管を配置します。フラッシュは EtOH 針 PE チューブを通じて内腔を消毒し、ことを確認はありませんから PE チューブから 70% 損傷針挿入の過程です。漏れ、針 PE チューブを破棄されます
    。 注: PE チューブの先端は、カテーテル挿入前に滑らかなする必要があります。尿道に PE 管を導入することで問題を回避するには、は、カテーテル検査 ( 図 1 f) の直前に PE チューブの先端をカットすることをお勧めします。PE 管の推奨される最小の長さは 1.5 インチ、針の周辺部分が含まれている

2。カテーテル検査手順

  1. 麻酔導入、前にマウスの膀胱を空にします
    1. 穏やかな圧力を適用し、マウスの下腹部にマッサージします。これらの演習は、通常自発的な排尿に します。任意の浸透させた菌希釈または即時漏れのフル膀胱があります
      。 注: マウスの空膀胱を確保するための追加オプションは尿道注入のプロシージャの開始前に少なくとも 1 時間は水の動物を奪うため。水の剥奪は、動物のプロトコルの一部として機関によって承認されるべき
  2. 麻酔器イソフルレン フロー (2%) を使用して麻酔
    1. 動物に麻酔がかかる、一度暖かい毛布の上に置き、継続的な麻酔の維持のためノーズ内鼻と青いパッドでそれをカバーします
    2. ペダル反射 (つま先ピンチ) をチェックすることによって動物が麻酔下であることを確認します
  3. ペダル反射が存在しないと、包皮を後退して続行します
    1. プレス片手の人差し指や親指に陰部 ( 図 2 a 2 b)、親指と他の手 (人差し指を使用して腺、陰茎を抜くと 図 2)。これが正しくできる、包皮、陰茎亀頭および陰茎体が露出したまま。( 図 2 D および 図 2 f)。これは組織の損傷になると腺ペニスを抜く鉗子を使用しないでください
  4. カテーテルとカテーテルの挿入前に滅菌外科潤滑油を亀頭の先端に注油します。PE チューブの挿入を簡単になります
    。 注: 1 つの大規模な管ではなく、手術の潤滑剤の個別包装された正方形は無菌状態を維持するために各の使用に適しています
  5. 鈍い鉗子を使用して、陰茎の先端を優しく保持し、そっと開く尿道口を引き起こす亀頭を絞る
  6. 注射器針添付 PE チューブまたは PE チューブ自体を保持して尿道口から PE チューブを挿入します
    。 メモ: 注射器針添付 PE 管または管の親指、人差し指と中指を使用して PE の三脚グリップは安定性のため勧めします
    。 注: カテーテルのパスは、 図 3A および 図 3 b に示すように、陰茎亀頭と陰茎成人男性マウス体内に囲まれた尿道の自然の曲率による湾曲する必要があります。カテーテルの PE 管カテーテル挿入中に抵抗を満たすことができる、標的臓器にさらに PE チューブ上下ヘルプ事前にチューブを傾けることによって角度を調整するため、お勧め。必要な場合、PE 管は尿道の様々 なシャープなターンを操縦するように少し回転できます。あまり抵抗がある、チューブは引き戻されている必要があり、最小限の圧力を再び進めます。PE チューブを引っ張って完全より潤滑を使用してがあります
  7. 一度 PE チューブ (5-200 μ L のボリュームをお勧めします) 接種の望ましいボリュームを浸透させる針プランジャーを押すことで目的の臓器に達している接種の注入を実行します。 、膀胱に、菌の注入を進める PE チューブの約 0.75 インチまで PE チューブのための
    1. が挿入されます ( 図 3 a).
      注: の AP と SV は、一般的に、回で接種の注入前方の前立腺に開口部のポイントに達すれば、e 挿入チューブは抵抗を満たしています。上下にチューブを傾けることによって角度を調整して、PE チューブを進めるさらに PE チューブの約 1 インチまで ( 図 3 b) を挿入します

3。生体内で下部尿路と腎臓のイメージング

注: 生体内 イメージング本稿の目的はある: 接種; の空間定位を確認するには (1) と (2) に接種の逆流の発生率を評価するために、腎臓。この目的のため麻酔下または安楽死させたマウスのいずれかを使用できます

  1. 成人男性マウスの下部尿路を視覚化する膀胱、前立腺、精嚢を公開するより低い腹部正中開腹を行う
    1. はさみを使用して剣状突起の真下に恥骨から正中の皮膚を切開します
    2. 皮下組織から皮膚を昇格します
    3. 正中線に位置する alba 無血管リネアを識別し、すべての臓器が腹膜腔を入力して切開します
    4. ブルーの染料または別の適切な追跡エージェントの可視化による空間定位を確認します

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Representative Results

PE 50 チューブを介して青色色素の経尿道的注入はそれぞれ膀胱 (図 4 a) と SV と AP (図 4 b) のカラリゼーションにおける PE 10 チューブを介して色素の注入で起因しました。行う経尿道的教養を高める腎臓へ菌のインスタント逆流を発生は、またはないかどうかを評価するため、腎臓と尿管青い染料・蛍光染料 (図 4 aB) 100 μ l 注入に続いてみ。PE 管と 2 つの異なる色素の 2 種類のサイズを使用して注入のプロシージャのどれもは、尿管や腎臓の色付けで起因しませんでした。

Figure 1
図 1:22 G 針チューブ 50 ポリエチレン (PE) に挿入するための準備。鋭い針 (A) は、鈍い鋭いエッジ (C) 研削油砥石 (B) に対して。針が鈍いと、針が PE チューブ (D) の内腔に挿入され微細鉗子 (E) で針を高度な。チューブは約 1.5 インチ (F) に、カットされます。24 G angiocath (G) も使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:雄マウス包皮が亀頭をカバーして、亀頭が、包皮のわずかなトラクションと尿道口 (A)、(B) を公開され、全体の包皮と亀頭 (C) のわずかなトラクションはすることができます (D) をこのように撤回尿道口、尿道への簡単なアクセスを可能にします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:下部尿路臓器のイラスト膀胱、前立腺、精嚢 (SV) それぞれ SV/前方前立腺、膀胱の主播栽培 PE 50 管 (A) と PE 10 チューブ (B) を用いた経尿道的注入を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:上部と下部尿路臓器の画像腎臓、膀胱、前立腺、精嚢 (SV) PE 50 管 (A) と PE 10 チューブ (B) を使用して経尿道的注入後。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

この原稿は、大人の男性マウスに経尿道的注入法を詳しく説明します。差分のプライマリ シード領域は、異径 PE 管を使用してアクセスできます。PE 50 PE 10 を使用して AP と SV (図 3 aB) に到達する大径ながら、膀胱内腔に正常に到達するため勧めします。PE チューブと接種の標的臓器のサイズの選択に加えて植え付け接種材料の量など、他の要因はまた終了位置とソリューションの分布の役割を果たします。私たちの実験を行い, その経尿道的青の 100 μ L 注入か PE 10 を使用して染料や PE 50 腎臓に染料のインスタントの逆流は発生しません。しかし、腎臓への尿の逆流後注入期間中に起こる可能性があります、以前成熟雌マウス8に示したとおり、腎臓の感染症があります。したがって、腎臓の組織所見は経尿道的注入から腎臓の間接汚染の有無を確認する勧めします。

接種の成功した経尿道的注入を実行するいくつかの重要なキーの手順があります。まず、PE 管は十分な長さのする必要があります-少なくとも 2.5 インチ。これによりチューブ長さの調整のため、必要に応じてチューブの準備プロセス中または尿道注入手順。複数の試行と手順 9 ではこのプロトコルの障害体液によって PE チューブの挿入された端の閉塞を引き起こします。このような状況 PE チューブの先端は後続の試行のための明確なヒントを持っているをカットする必要があります。PE チューブの先端をカットすると、一度外科潤滑油を再度適用する必要があります。第二に、注射器または PE チューブ自体の適切なグリップは成功率を高めます。第三に、PE 管の十分な長さを挿入して、包皮、陰茎亀頭および陰茎体並ぶべきである剛手のグリップなしカテーテル検査の過程。それ以外の場合、シリンジのプランジャーを押すと、接種の逆流が起こることがあります。

経尿道的注入のプロシージャのより良い成果はプロシージャの間に尿道とターゲット器官の損傷を回避することによって伴う練習の結果をすることができます。成果は、接種の主なローカリゼーションと腎臓へ逆流の兆候を確認する手順と色の染料や蛍光染料を使用して検証できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者には、任意の受信確認がありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 BD Medical 63019-004
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 BD Medical 63019-048
BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath BD Medical 311411
Ethanol (EtOH) Fisher Scientific BP2818500
BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch Becton Dickson 205155
BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch Becton Dickson 305129
Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS22
Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS27
6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone Norton 40204034
Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac Surgilube 281020543
Isoflurane Fluriso 13985-528-60
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Dissecting Forceps, Curved vwr 82027-392
BD 1 ml Syringe BD Medical 309626
India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer Alfa Aesar J61007
8~12 weeks old male C57B/6 Mice Jackson Lab #000664

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References

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