Undersøgelse af In Vivo glukosemetabolismen i høj-fedt kost-fed mus bruger Oral glukose Tolerance Test (OGTT) og Insulin Tolerance Test (ITT)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Den nuværende artikel beskriver generation og metaboliske karakterisering af højt fedtindhold kost-fed mus som en model af kost-induceret insulinresistens og fedme. Det har yderligere detaljerede protokoller for at udføre oral glukose tolerance test og insulin tolerance test, overvågning hele kroppen ændringer af glukose stofskifte i vivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). J. Vis. Exp. (131), e56672, doi:10.3791/56672 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fedme repræsenterer den vigtigste enkelte risikofaktor i patogenesen af type 2 diabetes, en sygdom, som er karakteriseret ved en resistens over for insulin-stimuleret glukoseoptagelse og en grov dekompensation af systemisk glukosemetabolismen. Trods betydelige fremskridt i forståelsen af glukose metabolisme forbliver de molekylære mekanismer i sin forordning i sundhed og sygdom, under-undersøgt, mens nye strategier til forebyggelse og behandling af diabetes er behov for. Kost afledte glukose stimulerer bugspytkirtlen udskillelsen af insulin, som tjener som den vigtigste regulator af cellulære anabolske processer i løbet af fodret tilstand og dermed saldi blodglucose niveauer til at opretholde status som systemisk energi. Kronisk overfeeding udløser meta-betændelse, hvilket fører til ændringer i perifer insulin receptor-associerede signalering og dermed reducerer følsomheden over for insulin-medieret glukose bortskaffelse. Disse begivenheder i sidste ende resultere i forhøjet fastende glukose og insulin niveauer samt en reduktion i glukosetolerance, som igen tjener som vigtige indikatorer for insulinresistens. Vi præsenterer her, en protokol til generation og metaboliske karakterisering af højt fedtindhold kost (HFD)-fodret mus som hyppigt anvendte model af kost-induceret insulinresistens. Vi illustrere detaljeret oral glukose tolerance test (OGTT), som overvåger den perifere bortskaffelse af et oralt administreret glukose belastning og insulin udskillelsen over tid. Derudover præsenterer vi en protokol for insulin tolerance test (ITT) til at overvåge hele kroppen insulin handling. Sammen, repræsenterer disse metoder og deres downstream programmer kraftfulde værktøjer til at karakterisere generelle metabolisk fænotype af mus samt specifikt vurdere ændringer i glukosemetabolismen. De kan være særligt nyttigt i feltet bred forskning af insulinresistens, diabetes og fedme at tilvejebringe en bedre risikoforståelse patogenese samt at teste effekten af terapeutiske indgreb.

Introduction

I den udviklede verden nået fedme og diabetes epidemiske dimensioner på grund af fysisk inaktivitet og overskydende forbrug af forarbejdede fødevarer, effekter, der er drevet af hurtige urbanisering, industrialisering samt globalisering. Selv om forskning på insulinresistens og det er co-morbiditet, såsom hyperlipidæmi og åreforkalkning, har fået fremtrædende plads i de sidste årtier, de komplekse biologiske mekanismer, der regulerer stofskiftet i sundhed og sygdom forblive ufuldstændigt forstået og der er stadig et presserende behov for nye behandlingsmodaliteter at forebygge og behandle disse sygdomme1.

Insulin, og det er counter-regulatory hormonet glukagon tjene som de vigtigste regulatorer af cellulære energi forsyning og makronæringsstoffer balance, således også opretholde ordentlig systemisk blod glucose koncentrationer2. Glukose, selv fungerer som en af de vigtigste stimulatorer af insulinsekretion af pancreas β-celler, mens andre makronæringsstoffer, humorale faktorer samt neurale input yderligere redigere responset. Insulin udløser derfor tilstanden fodret anabolske processer ved at lette udbredelsen af overskydende blodglukose i muskel, og fedtceller og yderligere aktivering glykolyse samt protein- eller fedtsyresyntese, henholdsvis. Derudover undertrykker insulin nedsat glukose output ved at hæmme glukoneogenese. Kronisk overskydende energiforbrug og meta-betændelse fører til hyperinsulinemia og perifer insulinresistens på grund af ned-reguleringen af insulin receptor udtryk samt ændringer i downstream signaling veje, hvilket resulterer i nedsat følsomhed over for insulin-medieret glukose bortskaffelse samt utilstrækkelig hæmning af hepatisk glucose produktion3,4,5,6.

En lang række dyremodeller med genetiske, ernæringsmæssige eller eksperimenterende induktion af sygdommen har vist sig for at være fremragende værktøjer til at studere de molekylære mekanismer af insulinresistens og forskellige former for diabetes samt dets ledsagende sygdomme7 . Et godt eksempel er den udbredte og veletablerede HFD-induceret musen model, som er karakteriseret ved hurtig vægtøgning på grund af øget indtagelse i kombination med reduceret metaboliske effektivitet, hvilket resulterer i insulin resistens8, 9. både i dyremodeller og mennesker, en opstemthed i fastende glukose og insulin i blodet, samt en nedsat tolerance for glucose administration er hyppigt anvendte indikatorer for insulinresistens og andre systemiske ændringer af glucose metabolisme. Overvågning glukose og insulin i blodet til basal tilstand eller efter stimulation er derfor lettilgængelige udlæsninger.

Denne protokol beskriver generation af HFD-fed mus samt to ofte anvendte metoder, oral glukose tolerance test (OGTT) og insulin resistens test (ITT), som er nyttige at karakterisere metabolisk fænotype og undersøge ændringer i glukosemetabolismen. Vi beskriver OGTT i detaljer, som vurderer bortskaffelse af et oralt administreret glukose belastning og insulin udskillelsen over tid. Yderligere, vi give anvisninger på hvordan man fører ITT for at undersøge hele kroppen insulin-indsats ved at overvåge blod glukose koncentration som svar på en bolus insulin. De protokoller, der er beskrevet i denne artikel er veletableret og har været brugt i flere studier10,11,12. Ud over mindre ændringer, som kan bidrage til at øge succes, leverer vi retningslinjer for eksperimenterende design og dataanalyse såvel som nyttige hints undgå potentielle faldgruber. De protokoller, der er beskrevet heri kan være meget effektive værktøjer til at undersøge genetiske, farmakologiske, kosten og andre miljømæssige faktorer indflydelse på hele kroppen glukosemetabolismen og dens tilknyttede lidelser såsom insulinresistens. Ud over stimulation med glukose eller insulin, kan en række andre forbindelser anvendes til stimulation afhængigt af formålet med individuelle forskning. Selv om uden for anvendelsesområdet for dette manuskript, kan mange andre downstream applikationer udføres på de tegnede blodprøver, som analysen af blodværdier end glukose og insulin (fx, lipid og lipoprotein profiler) samt detaljerede analyse af metaboliske markører (f.eks.ved kvantitative realtid Polymerase Chain Reaction (PCR), Western blot analyse og Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Yderligere flow flowcytometri og fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) kan anvendes til at undersøge effekter i forskellige enkelt cellepopulationer, mens transkriptom, proteom og metabolomic tilgange kan også udnyttes for målrettede analyse.

Samlet set, vi leverer en enkel protokol for at generere en HFD-induceret musemodel, mens yderligere beskriver to kraftfulde tilgange til at undersøge hele kroppen stofskifteforandringer, OGTT og ITT, som kan være nyttige værktøjer til at studere sygdomme patogenese og udvikle nye behandlingsformer, især med hensyn til metabolisme-associerede sygdomme som insulinresistens og diabetes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug Udvalget af det medicinske universitet i Wien og udført ifølge den Føderation af europæiske laboratorium animalsk videnskab foreninger (FELASA). Venligst udføres Bemærk at alle procedurerne i denne protokol bør kun efter institutionel og statslig godkendelse samt personale, der er teknisk dygtige.

1. HFD-fed mus

Bemærk: Fastholde alle C57BL/6J mus på en 12-h lys/mørke cyklus med fri adgang til mad og vand.

  1. Henne ved 6 ugens i alder, placere mus i 8-12 uger på en HFD (40-60% fedt kalorier) til at fremkalde fedme, mens fodring lean kontrolgruppen en fedtfattig kost (LFD) (10% fedt kalorier).
  2. Bestemme kropsvægt af mus på en ugentlig basis. Vægt kurver skal vise lignende mønstre i begge grupper, med en større hældning i gruppen HFD-fed.

2. OGTT

Bemærk: Hvis blodet prøveudtagningssteder tid er valgt under OGTT hver 15 min, eksperimentet skal udføres med et maksimum på 15 mus parallelt, for at få mindst 1 min ndtering-tid pr. mus.

  1. Præparater på dagen før OGTT
    1. Overføre mus i et bur med frisk sengetøj og hurtig dem natten over før testning (14 h), samtidig med at mus har adgang til drikkevand (fx, fjerne maden kl 6:00 for et starttidspunkt på den næste morgen kl 8:00).
      Bemærk: Fastende mus natten er standardmetoden, men en kortere hurtig (5-6 h) er mere fysiologisk for mus (Se diskussion for detaljer).
  2. Præparater på dagen af forsøget (men før eksperimentet)
    1. Forberede 10 mL 20% glucose opløsning (opløses D-(+)-Glucose i destilleret vand).
      Bemærk: Alle reagenser, der administreres til dyr skal være farmakologiske klasse og sterilt.
    2. Forberede en 96-brønd plade til plasma samling, ved at udfylde et godt for hver gang prøveudtagningsstedet og hver mus, med 5 µL NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8,0 i 0,9% NaCl, opbevaring på RT). Under eksperimentet, skal du gemme denne plade på is.
      Bemærk: Se tillægs figur 1 for en detaljeret checkliste.
  3. Måle kropsvægt af alle mus og markere deres haler med en permanent markør for at gøre de mus let identificerbar (fx, musen 1 = 1 dash, musen 2 = 2 streger, osv.).
  4. Glukose måling og udtagning af blodprøve (figur 2)
    1. Skær forsigtigt ud 1-2 mm af halespidsen bruger skarpe saks ("Variant A i figur 2). Altid aftørre den første dråbe blod at undgå hæmolyse eller kontaminering med vævsvæske før du tager nye blodprøver til bestemmelse af blod glukose. Tegne en lille blodprøve (~ 3 µL) til måling af basale blod glukose niveau (= tidspunkt 0) med glucometer.
      Forsigtig: Kontrollere og justere debiteringsnummer af teststrimler på en glucometer.
      Bemærk: Som en alternativ blod stikprøvemetode, nick laterale hale venen på en mus med en skarp skalpel klinge ("Variant B i figur 2). Den laterale hale vene er normalt adgang til ca. en tredjedel langs længden af halen fra halespids, for flere prøver på vej mod bunden af halen. Anbefales at anvende en lokalbedøvende creme. Stop blodgennemstrømning ved at anvende fingertryk på den bløde væv til mindst 30 s før dyret er vendt tilbage til sit bur.
    2. Indsamle en blodprøve (ca. 30 µL) ved hjælp af en frisk kapillarrør (holde kapillarrør vandret). Tømme kapillarrør ved hjælp af en pipette ved at sætte pipette spids på toppen af kapillarrør slutningen og forsigtigt skubbe det indsamlede blod i en brønd af 96-brønd plade, samtidig undgå luftbobler. Gentag denne procedure for alle mus - et ad gangen.
      Bemærk: Som et alternativ til blod samling via et kapillarrør, bruge en pipette, justeret til den korrekte mængde (fx, 30 µL) at indsamle blod, eller indsamle en dråbe blod fra halen på paraffin film, og med pipette overfoeres det EDTA-oploesningen. Strengt undgå kontakt vaseline med blod eller glucometer teststrimler, da det kan påvirke efterfølgende glukose og insulin målinger.
      Forsigtig: OGTT er meget stressende for mus: lean mus kan mister omkring 15% af deres kropsvægt i en overnatning hurtigt. Derudover fører blod prøveudtagning på forskellige tidspunkter til et betydeligt tab af blod. For lettere udtagning af blodprøve er det muligt at forsigtigt massere mouse-tail med vaseline.
      Bemærk: Institutionelle retningslinjer kan begrænse den tilladte mængde blod indsamlet inden for en fastsat periode. Prøveudtagning diskenheder og timepoints bør tilpasses for at ikke overstiger de tilladte maksimum. Kropsvægt af musene skal bruges til at beregne samlet blod tilbagetrækning tilladt.
  5. Beregn den nødvendige mængden af glucose opløsning kropsvægt (1 g glukose/kg kropsvægt, dette kan øges op til 3 g/kg) forvaltes af mundtlige sonde til hver mus. For eksempel, ville en mus med en kropsvægt på 30 g skal 150 µL af en 20% glukose løsning til at administrere 30 mg af glukose.
    Bemærk: For at basere dosis af glucose på vægten af musen er standardproceduren. Hvis krop sammensætningsdata er tilgængelige, dosis af glukose for OGTT bør beregnes baseret på lean body mass (Se diskussion for detaljer).
  6. Glukose administration
    1. Forberede everythingthat er nødvendige under hele eksperimentet på forhånd (timer, eksperiment diagramark, glukose skærm og strimler, kapillærer, sprøjter, glucose løsning, 96-brønd plade, skalpel, regnemaskine, balance, permanent markør, bænk papirer, en afpipetteres med en spids og handsker).
    2. For glucose ansøgning, dy musen af fast greb det af harmoniske. Anvende nok fasthed til huden omkring halsen forhindre musen vride ud af at begrænse og korrekt vippe hovedet tilbage. Også sørge for at musen kan trække vejret ordentligt.
      Bemærk: Når glukose administration er startet, god tid forvaltning er meget vigtigt.
    3. Omhyggeligt administrere glukose løsning (baseret på trin 2,5) direkte ind i maven ved hjælp af en fodring nål. Forsigtigt direkte fodring nålen gennem munden mod spiserøret. Tillad musen til at sluge nål: nålen helt synker i den nederste spiserøret/maven af musen. Derefter indsprøjtes glukose løsning (figur 3a).
      1. Hvis nogen modstand er opfyldt, eller hvis dyret kæmper straks, hæve nålen og flytte det. Start timeren umiddelbart efter den første sonde og administrere glukose til alle andre mus i 1 min. intervaller.
        Bemærk: Det kan være nyttigt at anvende en dråbe af glucose opløsning direkte fra fodring nålen til mundingen af musen, som vil stimulere slikke og synke, således at lette lettere indsættelse af fodring nålen. Gælde ikke pres, når du indsætter fodring nålen som dette kan alvorligt skade dyret.
  7. Efter 15 min, måle blod glucose niveauer hos glucometer og desuden tage blodprøver (~ 30 µL) (som beskrevet i detaljer i trin 2.4) af hver mus i samme rækkefølge, som de blev injiceret.
    NOTE: Tid forvaltning er meget vigtig. Følg så tæt som muligt ved hjælp af de samme tidsintervaller for sonde. Lad de mus bevæge sig så frit som muligt og begrænse fastholdende til et minimum under hele proceduren at reducere stress, som kan ændre resultaterne. Mælk hale med den ene hånd og indsamle blod med den anden.
  8. Gentag trin 2.7 på valgte tidspunkter afhængigt af de forventede resultater (f.eks.på 30, 45, 60, 90, 120, 150 og 180 min. efter glukose administration). Hvis de valgte tidspunkter er længere end 120 min, sikre, at mus har adgang til drikkevand. Sikre, at mus har altid adgang til drikkevand. Når du er færdig med eksperimentet, returnere mus til deres hjem bure udstyret med mad og vand.
    Forsigtig: OGTT er meget anstrengende for mus. Derfor vente mindst 1 uge før du udfører det næste metaboliske test, såsom en ITT.
  9. Efter forsøget, centrifugeres blodprøver på 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Overføre supernatanten (plasma) for at tømme brøndene af plade og opbevar den ved-20 ° C indtil analyse.
    1. Optage hæmolyse af prøver, hvis de findes (Se afsnit 3).
  10. Bestemme plasma insulin niveauer ved hjælp af en kommercielt tilgængelig ELISA kit (Se Tabel af materialer) følge producentens vejledning af kit.
    Bemærk: Afhængigt af de fastende tilstand samt om metabolismen af de undersøgte mus vanskeligheder under dette assay kan forekomme: overnight fastende insulin niveauer (tidspunkt 0) er meget lavt og derfor tæt på detektionsgrænsen. For at undgå dette problem skal fordoble mængden af anbefalede plasma volumen og således halvere resultatet af ELISA assay. På den anden side, hvis mus når insulin toppen under OGTT, især i HFD-fed mus, insulin niveauer kan overstiger detektionsgrænsen: fortyndes prøven (f.eks.10-fold med 0,9% NaCl) og Gentag ELISA assay. Hæmolyse i plasmaprøver kan føre til nedbrydning af insulin, hvilket resulterer i et fald af udlæsning værdierne. Nedbrydningen afhænger af tid, temperatur og hæmoglobin koncentrationen i prøven. Altid holde hemolyzed prøver koldt eller på is til at reducere insulin nedbrydning.

3. ITT

Bemærk: De samme forholdsregler beskrevet for OGTT (håndtering af mus, blod, glucometer og vaseline brug) har også skal anvendes, når du udfører ITT. For eksempel, bør alle injektioner der foretages inden for 15 min i 1 min. intervaller hvis 15 mus er testet i parallel. For ITT er efterfølgende indsamling af blodprøver med kapillarrør valgfri.

  1. Forberedelser før forsøget
    1. Hurtig mus for mindst 2 h før injektion af insulin, samtidig med at mus har adgang til drikkevand (f.eks.fjerne mad kl 8:00, teste mus 2-5 h senere).
    2. Fortynd insulin 1:1,000 i 0,9% NaCl (Stock: 100 U/mL insulin; arbejder koncentration 0,1 U/mL) og forberede 20% glukose (D-(+)-Glucose opløsning opløses i destilleret vand) skal indgives, hvis musene bliver hypoglykæmiske.
      Bemærk: ITT er typisk udføres efter en kort hurtig til at undgå hypoglykæmi, som ellers kan opstå i løbet af natten fastede dyr. Alle reagenser, der administreres til dyr skal være farmakologiske klasse og sterilt.
  2. Måle legemsvægt af mus, markere hale, skære halespidsen bruger skarpe saks og måle basal blod glucose niveauer, som tidligere beskrevet for OGTT i trin 2.4.
  3. Insulin injektion
    1. At injicere insulin intraperitoneal (0,75 U insulin/kg kropsvægt, beregnet på forhånd), begrænse musen af metoden lurvet.
    2. Bruge en frisk, sterile 27 eller 30 gauge kanyle til hvert dyr at undgå ubehag og risikoen for eventuelle injektionsstedet infektion.
      Bemærk: Sterilisation af huden kan forlænge varigheden af insulin administration, og dermed kan forårsage yderligere forstyrrelser til dyret. Derfor er det ikke anbefales.
    3. Vippe musen hovedet ned i en lille vinkel til at udsætte den ventrale side af dyret. Placer den steril kanyle med facet op og på en vinkel på 30 ° i den nederste højre kvadrant af dyrets maven (figur 3b). Start timeren, umiddelbart efter den første mus sprøjtes.
      Bemærk: Lav-dosis enkeltstarter (0,1 U/kg) kan udføres for at vurdere specielt nedsat insulinfølsomhed. Hvad angår OGTT, beregning af Injektionsvolumen kropsvægt er den normale procedure, mens basere dosis på lean body mass foretrækkes, hvis krop sammensætningsdata er tilgængelige.
  4. Måle blodsukker på valgte tidspunkter (f.eks.efter 15, 30, 45, 60 og 90 min).
    Bemærk: Som insulin har en kort halvleg af ~ 10 min i mus13, sent forskelle efter insulin administration (f.eks.efter 2 h) kan ikke afspejle en direkte virkning af insulin handling. Administrere 20% glukose løsning i tilfælde af en mus bliver hypoglykæmiske (blod glucose niveauer under 35 mg/dL) og er i risiko for at dø.
  5. Efter sidste gang peger, placere mus tilbage til deres hjem bure tilberedt med masser af mad og vand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser et skematisk tidsplan for metaboliske fænotyper af mus på kost. I en alder af ca. 6 uger, mus, skal placeres på en HFD, mens en LFD-gruppen kan tjene som kontrolgruppen. Vigtigere, bør legemsvægt bestemmes ugentligt at observere, hvis der er en forventet stigning i kropsvægt. Enhver form for stress (fx, støj eller aggressive mandlige adfærd) kan forstyrre kroppens vægtøgning og bør fjernes straks. Hver kohorte af mus til kost eksperimenter skal bestå af mindst 10 mus, fordi disse kost-eksperimenter er tidskrævende, og outliers er hyppige (f.eks.mus ikke vinder vægt eller mus med unormale glucose eller insulin niveauer). Efter den valgte periode (afhængig af hypotesen om undersøgelse og tidspunkt af forventede ændringer), kan OGTT og ITT udføres for evaluering af glucose tolerance og insulin handling. I dette papir, blev sene tidspunkter for den metaboliske test valgt.

Vigtigere, bør der være en restitutionstid på mindst 1 uge mellem OGTT og ITT som disse forsøg føre til betydelige blodtab og er dermed meget stressende for mus. Hvis blod samling diskenheder er nedsat (f.eks.hvis udfører et ITT uden yderligere blod samling først), kan dette opsving periode også være forkortet eller udelades, i overensstemmelse med retningslinjerne for flere blod trækker i dyr14, 15,16,17.

I denne store undersøgelse med 60 C57BL/6J mus i alt, blev halvdelen af musene sat på HFD eller LFD i en alder af 6 uger (n = 30-gruppen) og kroppen vægtøgning blev overvåget i 16 uger på kost. Forbruget af HFD resulterede i en betydelig stigning i kropsvægt som vist i figur 4. Henne ved 6 ugens i alder var kropsvægt 20.2 g i begge grupper. Mens mus på LFD viste en konsekvent, lidt øget kropsvægt (31,2 g ± 2.7) i perioden observerede mus på HFD steg deres kropsvægt hurtigt, især i de første uger og nåede deres krop vægt maksimum efter 16 uger på diæt. Selv om vægten-kurverne viste en lignende mønster under eksperimentet, mus af HFD-gruppen nåede en 1,5 til 2 gange højere kropsvægt (44,4 g ± 4.0) i forhold til de LFD-fed mus.

For at undersøge de to kohorter metabolisk fænotype, blev der udført en OGTT (figur 5) og ITT (figur 6). Da blodvolumen er begrænset i små gnavere, blev et punkt af pleje (POC) assay for diabetisk mennesker (glucometer) brugt til at overvåge blodsukkerniveauet under disse metaboliske fænotyper eksperimenter. Som vist i figur 2, blod glucose skærme er nemme at bruge, behøver kun en lille dråbe blod, og vise blodsukkerniveauet inden for sekunder for dokumentation. Figur 5 præsenterer tidsforløb absolutte glukose (figur 5a-b) og absolut insulin (figur 5 c) niveauer under OGTT. Generelt, en sund mus med normal glukosetolerance viser en karakteristisk hurtige stigning i blod glucose, nåede sit højdepunkt 15-30 min efter glukose udfordring.

Efterfølgende glukoseoptagelse, primært udført af muskel, fedt-væv og leveren væv fører til en gradvis nedsættelse af blod glukose koncentration. I alle eksperimenter, LFD-fed musene fungerede som glukose fejltolerante gruppe og derfor opfyldt den forventede metaboliske profil: toppen af blod glucose niveauer af ~ 240 mg/dL var nået ca 15 min efter glukose administration, straks efterfulgt af et fald nå basal niveauer ca 60 min. efter glukose udfordring, med angivelse af korrekt glukose afskaffelse. I skarp kontrast, HFD-mus toppede ca ~ 320 mg/dL glukose og viste næsten ingen bortskaffelse af glucose, der angiver glukose modstand. Når blodsukkerniveauet mellem to grupper allerede afviger i fastende tilstand (som i eksemplet repræsentant), skal en beregning af arealet under kurven (AUC) over baseline glukose udføres for at validere resultater (figur 5a- b).

Derudover blev cirkulerende blod insulin niveauer bestemt ved hjælp af en insulin-ELISA test (figur 5 c) for at få flere oplysninger om den underliggende Patofysiologi i denne model. Insulin niveauer var næsten uændret i kontrolgruppen, viste mus fodret en HFD 16-fold forhøjet fastende niveauer i forhold til kontrolgruppen, såvel som en stærkt øget insulin reaktion, der angiver HFD-induceret kompenserende hyperinsulinemia som et forsøg på at opveje nedsat glukose eliminering kapacitet, som kan være forårsaget af insulinresistens. Dog være opmærksom på ikke at over fortolke resultaterne af OGTT, som denne test evalueres ikke direkte insulin action og bør ikke bruges til at afslutte udsagn om insulinresistens.

For at måle insulinfølsomhed i HFD-fed mus, var et ITT udføres 1 uge efter OGTT (figur 6a). I denne analyse repræsenterer graden som blod glucose koncentrationer falder efter indgift af insulin effektiviteten af hele kroppen insulin handling. HFD-fed mus viste en nedsat reduktion af glukose i blodet i forhold til kontrolgruppen LFD-fed på alle tidspunkter under ITT, hvilket tyder på insulinresistens. ITT resultaterne præsenteres normalt som tidsforløb af glucose niveauer, men derudover også inverse AUC under baseline glucose kan blive vist som vist i fig. 6b. Hvis de grupper, der sammenlignes har lignende fastende blod glucose niveauer, (hvilket ikke er tilfældet i dette eksperiment), kan blodsukkerniveauer under ITT også blive præsenteret som procentdelen af basal glukose. Som i mus, en counter-regulatory svar på insulin aktiveres hvis blodsukkerniveauet falder under ~ 80 mg/dL18: defekter i dette counter-regulatory svar i en bestemt musemodel kan mistolkes som en stigning i insulinfølsomhed. Under HFDs og efterfølgende metabolisk fænotype eksperimenter, kan outliers ofte forekomme. Mus, som ikke får vægt på HFD, eller dem, der viser unormal fastende glukose og/eller insulin niveauer bør udelukkes fra analysen. For de sidstnævnte to, en outlier test kan udføres for hver eksperimentelle gruppe separat (fxGrubbs test)

I denne undersøgelse, som et eksempel vi viste fortolket data af metaboliske eksperimenter i vivo, udført på mus med kost-induceret fedme, glucose intolerance, og insulinresistens og sammenlignet dem med en kontrolgruppe med normal kropsvægt. Som forventet, var der nedsat glukosetolerance og hyperinsulinemia hos overvægtige mus overensstemmelse med insulinresistens i forhold til alder-matchede kontrol mus; Dette blev afdækket ved hjælp af veletablerede, pålidelige, tid - og budget-venlige metoder, som er relativt let at udføre. Forskelle i glukosetolerance, insulin niveauer så godt som i insulinfølsomhed, som er alle fremstillet af de præsenterede metoder til OGTT og ITT, kan ofte bidrage til at planlægge de næste trin i en undersøgelse, som kan omfatte mere sofistikerede eksperimenter som hyperglykæmisk eller hyperinsulinemic klemmer, samt forsøg med isoleret i bugspytkirtlen Holme.

Figure 1
Figur 1. Skematisk tidsplan for et foreslået kost regime og metaboliske eksperimenter i vivo. For at undersøge de metaboliske effekter af HFD i mus, dyr af den eksperimentelle gruppe er placeret på HFD på ca 6 ugens i alder, mens kontrolgruppen modtager en LFD. Kropsvægt af mus bør fastlægges på en ugentlig basis at vurdere korrekt vægtøgning. Efter ca 12 uger på kost (eller en valgte tidspunkt afhængigt af forskning hypotese), er metabolisk fænotype af musene evalueret af en OGTT, efterfulgt af 1 uge af recovery-tid og efterfølgende et ITT. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Metoder til udtagning af blodprøve under metaboliske eksperimenter. For OGTT såvel som for ITT, hvor gentagne blod prøveudtagning er påkrævet, anbefaler vi, udgyde blod via forsigtigt skære en 1-2 mm stykke halespids med skarpe saks (Variant A), efterfulgt af bestemmelse af glukose i blodet med en glucometer og yderligere samling af blod med en kapillær at bestemme insulin niveauer og andre relevante blodværdier. Blod kan alternativt også smages via hale vene (Variant B) eller af arteriel kateterisation (ikke vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Mundtlige sonde af glukose (et) og intraperitoneal insulin injektion (b). Repræsentative billeder af oral glukose administration ved hjælp af en fodring nål under OGTT (en) og intraperitoneal injektion af insulin under ITT (b). Se protokol for en detaljeret beskrivelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Body vægtøgning på HFD-fed og LFD-fed C57BL/6J mus. C57BL/6J mus var enten sæt på 60% HFD, eller 10% LFD til at tjene som et kontrolelement for en periode på 20 uger. Mens mus på HFD viste en forventet stigning i kropsvægt, især i de første uger på kost, LFD-fed mus viste næsten konstant kropsvægt observerede i perioden. Resultaterne er gennemsnit ± SEM. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. n = 30 pr. gruppe. ANOVA og Tukey's post hoc test blev anvendt til at teste for forskelle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. OGTT udføres i HFD-fed og LFD-fed C57BL/6J dyr. (en) Glucose niveauer under OGTT. Efter en overnatning hurtigt, blev blodsukkerniveauet (mg/dL) målt i fastende tilstand og 15, 30, 45 og 60 min. efter administration af glucose opløsning mundtligt via sonde (1 g glukose/kg). Glucose niveauer i gruppen HFD blev forhøjet i fastende tilstand og efter glukose udfordring. Stigningen nåede sit højdepunkt efter 15 min. efterfulgt af en forsinket og langsomme falde. Resultaterne er gennemsnit ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 pr. gruppe. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af ANOVA og Tukey's post hoc test. (b) Glucose arealet under kurven (AUC) under OGTT. For at beregne baseline korrigeret AUC, basal glucose niveauer (tidspunkt 0) blev fratrukket alle senere fået blod glucose niveauer for hver mus individuelt, efterfulgt af beregningen af de enkelte AUCs. AUC over baseline glukose illustrerer glucose modstanden i HFD-fed mus. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af ANOVA og Tukey's post hoc test (glucose niveauer) eller Students to tailed t-test (AUC). (c) Insulin niveauer under OGTT. Insulinniveau (ng/mL) blev målt efter en fastende periode på 4 timer og 15, 30 og 60 min. efter administration af glucose opløsning mundtligt via sonde (1 g glukose/kg). HFD-fed mus ikke kun kompensation for glucose injektion med en højere stigning i blod insulin niveauer, de også startede og sluttede OGTT med forhøjet insulinniveau i forhold til kontrolgruppen. Resultaterne er gennemsnit ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 pr. gruppe. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af ANOVA og Tukey's post hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Enkeltstarter udført i HFD-fed og LFD-fed C57BL/6J dyr. (en) Glucose niveauer under ITT. Blodsukkerniveauet (mg/dL) blev målt i fastende tilstand og 15, 30, 45 og 60 min efter injektion af insulin intraperitoneal (0,75 U insulin/kg). Under ITT, HFD-fed mus viste forhøjede glucose niveauer. Blodsukkerniveauet var ikke tilstrækkeligt sænkes i HFD-fed mus efter insulin injektion. Resultaterne er gennemsnit ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 pr. gruppe. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af ANOVA og Tukey's post hoc test. (b) Glucose arealet under kurven (AUC) under ITT. For at beregne baseline korrigeret inverse AUC, basal glucose niveauer (tidspunkt 0) blev fratrukket alle senere fremkomne blod glucose niveauer for hver mus individuelt. Værdierne var omvendte (multiplikation med -1), efterfulgt af beregningen af de enkelte AUCs. Som følge af det højere niveau i HFD-fed mus under OGTT korrigeret grundlinjen inverse AUC var lavere i HFD-fed mus i forhold til kontrol mus, som yderligere foreslås nedsat insulinfølsomhed. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af ANOVA og Tukey's post hoc test (glucose niveauer) eller Students to tailed t-test (inverse AUC). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tillægs figur 1. Tjekliste for eksperiment forberedelse. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Tillægs figur 2. Insulin niveauer under enkeltstarter. Plasma insulin niveauer under ITT i LFD-fed versus HFD-fed grupper viste lignende dynamics i plasma insulin niveauer efter insulin injektion i begge grupper. Som forventet, udstillet HFD mus stærkt forøget basal insulin niveauer i forhold til kontrolgruppen. Yderligere, stigning i insulin niveauer i HFD-fed mus blev stærkere, som kan delvist forårsaget af overvurdering af lean body mass, hvis mængden af injiceret insulin beregnes baseret på hele kroppen massen (den konventionelle normalisering tilgang) som udføres i dette eksperiment. Men insulin reaktion var nedsat i gruppen HFD-fed (utilstrækkelig reduktion af plasma glucose niveauer), dermed yderligere understreger den insulin resistente stat i disse dyr. Resultaterne er gennemsnit ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af ANOVA og Tukey's post hoc test. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med den høje forekomst af diabetes og tilknyttede sygdomme i verdens befolkning er der et stærkt krav om forskning, der tager den molekylære mekanisme, forebyggelse og behandling af sygdom19. Den præsenterede protokol beskriver veletablerede metoder for generation af HFD mus, en robust dyremodel bruges til metaboliske forskning samt overledning af OGTT og ITT, som er potent værktøj til vurdering af hele kroppen stofskifteforandringer såsom insulinresistens. De metoder, der præsenteres i dette dokument kan være nyttige at studere rollen af formodede gener, miljøfaktorer og farmakologiske, kost, fysisk eller genetiske behandlinger på hele kroppen glukosemetabolismen9,10. Mens glukose fungerer som det primære incitament for insulinsekretion i en OGTT, præsenteres protokollen kan ændres ved (co-) anvende andre stoffer som andre makronæringsstoffer og hormoner, som er kendt for at ændre insulin reaktion2. Ligeledes kan ITT protokollen ændres ved (co-) anvendelsen af andre stoffer (fx, glucagon eller katekolaminer) Ifølge den enkelte problemformulering. De vigtigste udlæsninger af de beskrevne OGTT og ITT protokoller er blod glukose og insulin koncentrationer; måling af andre blodparametre såsom glukagon, fedtsyre og lipoprotein niveauer, samt i forskellige metaboliske markører på mRNA og protein niveau kan dog også være nyttigt afhængigt af formålet med undersøgelsen.

Efterforskere bør være klar over, at de neuroendokrine svar til hypoglykæmi, insulinsekretion, insulin action samt den samlede metabolisk fænotype kraftigt afhænger den genetiske baggrund for mus10. Her, udnyttede vi mus inden for C57BL/6J genetiske baggrund som en HFD-induceret model af diabetes, som har en delvis værdiforringelse i glucose-medieret insulinsekretion på grund af et naturligt forekommende sletning i nicotinamid nukleotid transhydrogenase gen 20, hvilket gør dem en passende model til at studere fedme forbundet insulin resistens8,9. Protokollerne, der beskrives her kan dog også udnyttes til at metabolisk karakterisere alternative musemodeller af insulinresistens og diabetes, hvilket er normalt baseret på monogene sygdomme eller kemisk destruktion af β-celler21, 22 , 23. sikkerhedsforanstaltninger under eksperimentelle design omfatter test alder-matchede mus, som insulin følsomhed falder med alder24, og videre til udføre eksperimenter i mus fra samme køn. Da genetiske mutationer og behandlinger kan resultere i forskellige fænotyper afhængig af sex25,26, kan det også være tilrådeligt at undersøge begge kønnene adskilt fra hinanden.

Blod stikprøvemetoden beskrives i denne protokol kræver ikke bedøvelse, som kan påvirke hjertefrekvens, blodgennemstrømning og glukose metabolisme, giver ikke-fysiologiske resultater10. Alternativt, en arteriel kateter kan implanteres, som tillader vaskulære prøvetagning uden håndtering af stress under eksperimentet, men også tilføjer indsats samt omkostninger og risiko for dyrs tab til eksperimentet. For OGTT, mus er typisk fastede overnatning (14-18 h), som provokerer en kataboliske stat i mus, stærkt nedbryder leveren glykogen butikker. Selvom dette reducerer variabilitet i baseline blod glucose niveauer, langvarig fast nedsætter stofskiftet og forbedrer glukose udnyttelse i mus, som står i kontrast til situationen i mennesker10,27. Som de fodring mønstre i mus også ikke efterligne menneskelig adfærd, kan det således mere fysiologisk til at udføre en OGTT efter en kort hurtig. Døgnrytmen har en stærk effekt på systemisk glukose stofskifte28, er det vigtigt at overveje, på hvilket tidspunkt af dagen eksperimenter beskrevet her er udført. For at undersøge metaboliseringen af mus i deres aktive periode (den mørke fase), kan en omvendt lys-mørke cyklus være værdifuldt at generere flere fysiologiske resultater.

Beskrevet indgiftsmåde kan også varieres afhængigt af den specifikke hypotese ved at blive testet. Oral indgift af glukose under en glukose tolerance test fører til mere variabel insulinsekretion, gastrisk tømning, gastrointestinale motilitet, hormoner (incretins) og neurale input ændre og forlænge insulin reaktion2, 10. under godt beskrevet "incretin effekt", absorptionen af glucose fra tarmen fører til frigivelse af gastrointestinale hormoner som GLP1, som potentiates oral glukose-leveret insulin release29. For at omgå disse virkninger, en glucose bolus kan også gives intravenøst (IVGTT) eller intraperitoneal (IPGTT). Både glukose og insulin udflugter varierer betydeligt afhængigt af de valgte leveringsbetingelser rute. I forhold til OGTT, fører intraperitoneal indgift af glukose til en øget og langvarig peak i plasma glucose niveauer, mens plasma insulin niveauet stiger i en forsinket, men mere vedvarende mode30. På samme måde, intravenøs glukose administration er karakteriseret ved en forsinket insulin reaktion31. De skarpe stigninger i insulin niveauer samt mere robust AUC-insulin data indhentet under OGTT tyder på, at oral levering af glucose kan være mere følsomme til at registrere ændringer i glukose stofskifte i chow-fed versus HFD-fed mus30, 31. gastrisk og intraperitoneal levering er ens med hensyn til sværhedsgraden for de dyr og tekniske vanskeligheder, mens intravenøs administration er normalt sværere samt mere stressende for mus32. Oral administration yderligere eliminerer 10-20%-sats af fejl under intraperitoneal injektioner i intestinal lumen eller maven, hvilket kan påvirke hastigheden af glucose levering og omfordeling33,34.

Selv om det er den mest fysiologiske rute af glucose levering, er OGTT begrænset regnskab for kun glukose absorption, mens et helt måltid også indeholder proteiner, komplekse kulhydrater, fedt, fibre og mikronæringsstoffer. Den normale metode under OGTT er at basere glukose dosis på kropsvægt af musen, mens normalt 1-3 g glucose/kg kropsvægt er administreret35,36. I visse tilfælde kan en højere glukose lastning end 1g/kg være nødvendigt at afsløre et nedsat glukose tolerance30. Mange musemodeller af fedme og diabetes er karakteriseret ved ændringer i kropssammensætning, navnlig en voldsom stigning i fedtmasse, mens muskelmassen (muskler, hjerne og lever), som er den vigtigste del af glucose bortskaffelse ikke ændrer proportionalt. Konventionelle normalisering tilgang til kropsvægt vil således medføre et uforholdsmæssigt højere dosis af glukose, magert væv i en overvægtige mus udsættes i forhold til den ikke-overvægtige mus. Denne bias stiger med en højere glukose dosis30. Derfor skal optimalt dosis af glukose (OGTT) samt insulin (ITT) beregnes baseret på muskelmassen, hvis krop sammensætningsdata er tilgængelige37. Hvis vurderingen af kroppens sammensætning ikke er mulig på grund af tekniske begrænsninger, bør den dosering udføres efter kropsvægt (supplerende figur 2), mens anvender en fast dosis, som i en menneskelig OGTT bør være den sidste udvej, hvis udføre disse tests i mus10,35,36. I præsenteret protokollen, blev en håndholdt fuldblod skærm brugt til at måle blod glucose niveauer, hvilket er en fordel i tests såsom OGTT og ITT, der kræver flere udsnit af små blod diskenheder. Disse enheder er dog beregnet til humant blod, har en begrænset dynamikområde. Alternativt, glucose niveauer kan måles i de indsamlede plasmaprøver, fxved fuldt automatiseret kemi analysatorer i rutinemæssige laboratorier. Ud over insulin, kan C-peptid måles i protokollerne beskrevet som et mere direkte indikator for β-celle sekretoriske funktion, som ikke udvindes i leveren i modsætning til insulin38,39. Hvis glukoneogenese skal vurderes, blive pyruvat tolerance test (TOT) anvendt, hvilket er en anden variant af de her beskrevne protokoller, overvågning glykæmisk udflugter efter indgift af en pyruvat bolus40.

De her beskrevne tilgange af OGTT og ITT kan ofte forklare observerede forskelle i glucose tolerance og kan yderligere tjene til at foreslå, hvilken senere, mere avancerede eksperimenter foretages næste (fx, hyperglykæmisk klemmer eller undersøgelser på isolerede øer). I sammendrag, vi præsenterer en enkel protokol for generation af en HFD-induceret musemodel og yderligere at beskrive OGTT og ITT, som er effektive værktøjer til at vurdere ændringer af metabolisk fænotype i vivo og kan være nyttige at studere metabolisme-associerede sygdomsmekanismer samt nye behandlingsformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgements

Denne forskning blev støttet af den medicinske videnskabelige Fund af borgmesteren i byen Wien og Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer Roche 6870228 OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips Roche 6454038 OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 OGTT
Actrapid - Insulin Novo Nordisk 417642 ITT
Reusable Feeding Needles Fine Science Tools #18061-22 OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes Braun 9161406V OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) Braun 304000 ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)   Braun 4657705 ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible Braintree Scientific, Inc. SP0016 OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit Crystam Chem 90080 OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat Research Diets Inc D12492 mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat. Research Diets Inc D12450B mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary Sigma-Aldrich BR749321 OGTT/ITT
Vaseline - creme Riviera P1768677 OGTT/ITT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21, (12), 1443-1455 (2007).
  2. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26, (2), 19-39 (2005).
  3. Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75, (3), 473-486 (1995).
  4. Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92, (5), 593-596 (1998).
  5. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
  6. Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339, (6116), 172-177 (2013).
  7. Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125, (3), 451-472 (2007).
  8. Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37, (9), 1163-1167 (1988).
  9. Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).
  10. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3, (9-10), 525-534 (2010).
  11. Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158, (1), 25-40 (2014).
  12. Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151, (2), 414-426 (2012).
  13. Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27, (1), 7-15 (1977).
  14. First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27, (1), 1-22 (1993).
  15. McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31, (4), 5-18 (1989).
  16. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29, (10), 47-53 (2000).
  17. NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf (2017).
  18. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, (4), E678-E684 (2006).
  19. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103, (2), 137-149 (2014).
  20. Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55, (7), 2153-2156 (2006).
  21. Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269, (5223), 540-543 (1995).
  22. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84, (3), 491-495 (1996).
  23. Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26, (12), 1120-1124 (1977).
  24. Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31, (3), 238-246 (1982).
  25. Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, (3), E630-E639 (2008).
  26. Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81, (2), 243-248 (2004).
  27. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46, (3), 582-588 (2005).
  28. Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18, (1), 4-11 (2007).
  29. Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62, (10), 3316-3323 (2013).
  30. Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295, (6), E1323-E1332 (2008).
  31. Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197, (1), 181-187 (2008).
  32. Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222, (3), G13-G25 (2014).
  33. Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19, (4), 704-705 (1970).
  34. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, (2), 250-251 (1969).
  35. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. Chapter 29 Unit 29B 23 (2007).
  36. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, (1), E15-E26 (2008).
  37. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, (4), E849-E855 (2009).
  38. Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
  39. Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33, (5), 486-494 (1984).
  40. Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25, (9-10), 522-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics