Author Produced

הזרקת Intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית ואספקה תא בדגם פרה גדולה

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אסטרטגיות טיפוליות הרומן של רפואה רגנרטיבית הלב דורשים מקיף ומפורט הלימודים במודלים של בעלי חיים פרה גדולה לפני שהם יכולים להיחשב לשימוש בבני אדם. כאן, נדגים שיטה הזרקת intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית בארנבים, וזה יקר עבור בדיקת יעילותם של טיפולים חדשניים כאלה השערות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תא טיפול גנטי מרגש, אסטרטגיות מבטיח לצורך התחדשות לב בהגדרה של אי ספיקת לב עם הקטינה שבריר פליטה (HFrEF). לפני שהם יכולים להיות נחשב לשימוש, מיושמת אצל בני אדם, מחקרים מקיפים פרה נדרשים במודלים של בעלי חיים גדולים כדי להעריך את הבטיחות היעילות, גורל injectate (למשל, תאי גזע) נמסר פעם לתוך שריר הלב. מודלים מכרסם קטן להציע יתרונות (למשל, עלות יעילות, amenability עבור הנדסה גנטית); עם זאת, בהתחשב במגבלות הטבועה של מודלים אלה, הממצאים הללו לעיתים רחוקות לתרגם למרפאה. לעומת זאת, מודלים בעלי חיים גדולים כגון ארנבות, יש יתרונות (למשל, דומה אלקטרופיזיולוגיה לב לעומת בני אדם וחיות גדולות אחרות), תוך שמירה על איזון טוב חסכונית. . הנה, נדגים כיצד לבצע טכניקה הזרקה (ממ י) intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה מלעורית ניגודיות, אשר פולשנית, בטוח, נסבלת היטב, ויעיל מאוד בהעברת injectates, כולל תאים, יישוב לתוך מספר מיקומים בתוך שריר הלב של דגם ארנב. לביצוע ויישום טכניקה זו, גם לקחנו יתרון של מערכת אקוקרדיוגרפיה קליני נרחב זמין. לאחר הצבת בפועל את הפרוטוקול המתואר כאן, חוקר עם אולטרסאונד הבסיסיות ידע יהפוך המוסמכת. הביצועים של טכניקה זו תכליתי ולא פולשנית לשימוש שגרתי בניסויים, מכוון לבדיקת השערות יכולות של הלב הרפוי משובי במודל ארנב. ברגע כשירות מושגת, ניתן לבצע את כל התהליך בתוך 25 דקות לאחר anaesthetizing את הארנב.

Introduction

טיפולים אלטרנטיביים תא ג'ין מרגש, אי לפתח אסטרטגיות עבור התחדשות/תיקון של שריר הלב נפגע ב- HFrEF. מעט מחקרים משווים את יעילות המסלולים שונים המסירה תאים, אשר הדגימו באופן עקבי העליונות של ממ י על מסלולים intracoronary או תוך ורידי1,2 (למשל, תא שימור שיעור) , 3 , 4 , 5. לפיכך, אין זה מפתיע כי אחוז גדול של מחקרים על מודלים translational של טיפול בתאי גזע של שריר הלב הפצוע, לספק את injectate באמצעות ממ י תחת נוף ישיר החזה נוהל6,7 . עם זאת, גישה זו יש מספר מגבלות, כולל העיקרון החודרני של ההליך, אשר נושאת את הסיכון לתמותה פרי-נוהלי (לעתים קרובות לפי דיווח)8. בנוסף, אימי תחת תצוגה ישירה לא לשלול את האפשרות להזרקה בהיסח הדעת לתוך חלל חדרית. בפרקטיקה הקלינית אימי במהלך ניתוח החזה פתוח יכול להיות שיטה המתאימה עבור משלוח תא טיפולית, למשל, במהלך עורקים מעקפים שתל (CABG); עם זאת, גישה זו יתכן המתאים למסירה תא שריר הלב העולמית ממוצא שאינו-איסכמי (למשל, HFrEF משני בהשפעה anthracycline של שריר הלב (AICM)).

אין כל ספק כי מחלת לב איסכמית (IHD) הוא הגורם הנפוץ ביותר של HFrEF (~ 66%)9,10; עם זאת, שריר הלב-איסכמי, כולל AICM, עדיין משפיע שיעור משמעותי של חולים עם HFrEF (33%)9 . אכן, התפתחויות אחרונות לאונקולוגיה קלינית גרמו יותר מ-10 מיליון ניצולי סרטן בארה ב לבד11, עם הערכות של מספר דומה באירופה, בקנה אחד עם המגמה הכללית לקראת שיפור ההישרדות של חולי סרטן12 ,13. לפיכך, חקר את היתרונות של טיפולים חדשניים כגון השתלת תא גזע-איסכמי של שריר הלב, כמו גם את trialing של מסלול יעילה ולא פולשנית של תאי גזע משלוח הוא בעל חשיבות עליונה, בהתחשב הגדלת מספר מטופלים מושפע cardiotoxicity משני תרופות נגד סרטן.

ראוי לציין, בדיקת מחקרים באמצעות טיפול בתאי גזע שמטרתה תיקון/להתחדש שריר הלב נפגעים לעתים קרובות השערות כרוכה בשימוש של מכרסם קטן (למשל, עכברים וחולדות). מודלים אלה לעיתים קרובות דורשים מערכות סאונד בתדירות גבוהה יקר עבור הערכה של תפקוד שריר הלב, מצוידים בדרך כלל מתמרים ליניארי מערך אשר יש כמה מגבלות המשויך הטבועה (למשל, ההד)14. עם זאת, מודלים אחרים כגון ארנבות, המייצג דגם פרה גדול, יש כמה יתרונות עבור בדיקת השערות של תאי גזע טיפולים ב- HFrEF. לפיכך, בניגוד חולדות ועכברים, ארנבים לשמור על מערכת התחבורה+2 Ca ואלקטרופיזיולוגיה הסלולר הדומה לזה של בני אדם אחרים חיות גדולות (למשל, כלבים וחזירים)15,16,17 18, ,19. יתרון נוסף, הוא amenability שלהם עבור הלב אולטראסאונד הדמיה באמצעות זול יחסית אקוקרדיוגרפיה קליני נרחב זמין מערכות מצויד עם מערך שלב מתמרים יחסית בתדירות גבוהה, למשל, 12 מגה הרץ, כגון אלה נעשה שימוש תכוף בקרדיולוגיה neonatal, רפואת ילדים. מערכות אלו מאפשרות הדמיה echocardiographic מעולה עם טכנולוגיה משוכללת, הם מנצלים העליונות של הרמוני הדמיה20. יתר על כן, בדיקת השערות נרחב של הפוטנציאל של טיפולים משובי הלב (למשל, טיפול בתאי גזע), שלהם בטיחות, יעילות, cardiomyogenic הפוטנציאל, כמו גם הערכה על גורלם של injectate פעם העבירה שריר הלב, הוא חובה לפני שהם יכולים להיחשב לשימוש בבני אדם, הם דורשים השימוש במודלים בבעלי חיים פרה גדולה, כמו ארנב17,19. כאן, אנו מתארים טכניקה פולשנית עבור תא משלוח באמצעות ממ י מלעורית חדות-אקוקרדיוגרפיה מודרכים באמצעות מערכת אקוקרדיוגרפיה קלינית, אשר מיועדת בטיפול המבוסס על השתלת תאי גזע של שריר הלב-איסכמי20 . גם אנו מתארים את היתרונות של דיות (InI, הידוע גם בשם סין דיו) כמו אולטרסאונד ניגודיות סוכנת וגם בחיי עיר מעקב של injectate בלב ארנב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים המתוארים בזאת אושרו על-ידי ועדת מחקר האתית של אוניברסיטת מורסיה, ספרד, ולא בוצעו על פי הוראה 2010/63/האיחוד האירופי של הנציבות האירופית. השלבים המתוארים בוצעו תחת פרוטוקולים סטנדרטיים ההפעלה היו חלק מתכנית העבודה, לא בוצעו אך ורק למטרת לצלם את הוידאו המלווה את הנייר הזה.

1. הכנת התאים ואת הביטוי בתרבית של וקטור

הערה: הנה, אנחנו תאר בקצרה פרוטוקול הכנה, תרביות תאים של קו תא (עובריים כליה אנושית 293 (HEK-293)); עם זאת, תאים מתאים פרוטוקולים ספציפיים עבור סוג התא עניין צריך להיות ממוטבת (למשל, תאי גזע).

  1. לשמור על תאים HEK-293 גלוקוז גבוהות Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר (DMEM) בתוספת 10% עגל עוברית סרום (FCS) 1% נתרן פירובט, 2 מ מ גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2 . ברגע תאים הם תת confluent, לפצל ביחס של 1:3.
  2. להתחיל פיצול התאים על-ידי כ רפה בעברית התקשורת, ולאחר מכן לשטוף פעם עם פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS), להסיר את עודף PBS ולאחר מכן דגירה עם 2.5 מ של 0.5 x טריפסין-Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (5 דקות, 37 ° C).
    1. הוסף אמצעי אחסון אחד של DMEM מדיה (בתוספת כמתואר לעיל) כדי לעצור את התגובה ולאחר מכן לנתק את התאים על ידי לאט ובעדינות כ רפה בעברית למעלה ולמטה עם פיפטה אלקטרונית.
  3. אז, העברת התליה תא לגורם המתאים (למשל, צינור חרוטי צנטריפוגה 15-50 מ"ל). צנטריפוגה בדלי סווינג (100 x g), למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את גלולה פעמיים עם PBS סטרילי.
  4. Resuspend בגדר בזרע-צפיפות תאים מתאים (למשל, עונה 1 פרק 106 תאים בקבוקון2 75 ס מ) ומדיה DMEM טריים טריים תרבות מבחנות או מנות גדולות על פי שיטות מעבדה מקומיים.
    1. החלף קיימת מדיה media טריים כל יומיים.
      הערה: וקטור הביטוי היה נגזר pIRES1hyg, נעשה בהתאם להוראות היצרן כפי שתואר לעיל21. p(EGFP) IRES1hyg נוצר על ידי subcloning EGFP cDNA כמו BamHI + NotI הכניסו אל BamHI pEGFP-N1 + NotI מתעכל pIRES1hyg21.
  5. יום אחד לפני תרביות תאים, זרע HEK-293 תאים-צפיפות של 0.5 x 10 תאים/ס מ5 2 ב 12 או 24-ובכן תרביות רקמה צלחות.
  6. ביום של תרביות תאים, להכין את ה-DNA-השומנים תרביות תאים ריאגנט מתחמי mL 1.5 נפרד microcentrifuge צינורות (צינור 1/טוב).
    1. התחל בהוספת 250 µL של מדיום מופחת סרום לתוך כל שפופרת, ולאחר מכן להוסיף 4 µg דנ א (לערבב בעדינות).
    2. לאחר מכן, להוסיף 250 µL מן תערובת מוכנה בעבר של 10 µL השומנים תרביות תאים ריאגנט µL 250 של מדיום מופחת סרום, כל שפופרת (לערבב שוב בעדינות).
    3. לבסוף, המשך עם transfections, על ידי המקננת HEK-293 תאים עם ה-DNA השומנים תרביות תאים ריאגנט קומפלקסים 4h, להחליף בינוני DMEM בתוספת כמתואר לעיל (שלב 1.1), ואת תקופת דגירה של ה 48 עוד סמים לבצע מבחר יציבה transfectants עם µg/mL 100 hygromycin B.
  7. ניתוק HEK-293 תאים עם טריפסין כמתואר לעיל (שלב 1.2). לאחר שטיפת התאים ב- PBS סטרילי, resuspend בתוך כלי רכב מתאים (למשל, 10% v/v InI ב- PBS), כדי להשיג ריכוז תא הסופי של 5 x 106/mL.

2. הכנת הארנב

הערה: המיקום של הארנב, המתמר עבור ממ י אינה אופטימלית להערכת המורפולוגיה ותפקוד הלב של החיה. לכן, מומלץ לבצע בדיקה echocardiographic מלאה20 לפני ממ י (ראו להלן), בנקודות זמן הבאים כפי שהוגדרו על ידי הנבחנים. זה במטרה להעריך בסיסית אנטומי פונקציונלי המאפיינים של הלב החיה כי לקבל זריקה, ואת גם להעריך את ההשפעות, של אימי בפונקציה של הלב.

  1. לבצע בדיקה זו באופן עיוור ובעקבות להנחיות הועדה אקוקרדיוגרפיה של המכללה האמריקאית של רפואה וטרינרית פנימית של החברה של אקו/אירופה האגודה האמריקאית הדמיה לב וכלי דם 22 , 23 , 24.
  2. לקבל עקיבה 1-עופרת סימולטני רל (א) לאורך כל תקופת המחקר echocardiographic לגמרי.
  3. עזים ומתנגד הארנבת עם קטמין 10 מ"ג/ק"ג, בשילוב עם medetomidine 200 µg/kg, זריקה תוך שרירית (I.M.).
  4. ודא הרמה של הרדמה לאחר 10-20 דקות בעקבות ניהול של הרדמה.
  5. שימוש שיער clipper להסיר את שיער החזה נרחב (למשל, מתחת לצוואר באזור תת xiphoid) (איור 1 א').
  6. לגלח אזורים נוספים של 1-2 ס מ2 בפנים פנימי של forelimb נכון (אזור mediocubital) ושל שני הגפיים האחוריות (אזור mediotibial) (איור 1B).
  7. במקום אלקטרודות א דבק על האזורים מגולח של הגפיים לנטר את קצב הלב באופן סינכרוני במהלך ההליך (איור 1C).
  8. מקום החיה במצב פרקדן כסאות גלגלים על שמיכה תרמית, עם הגפיים מתוחות באמצעות הדבקה מצורף לטבלה (איור 1C).
    1. ודא שהאוזניים הם מכופפות לאחור מאחורי הראש/הגב של הארנב, במיקום זה נמוך יותר forelimbs שלה, מאז זה מסייע לשמור על מיקום נכון של בית החזה של החיה לאורך כל ההליך.
  9. לאפשר את החיה לנשום באופן ספונטני תוך מתן חמצן על ידי מסכת פנים לאורך כל התהליך (100%, 2-3 L/min).

Figure 1
איור 1. הכנה של הארנב ממ י. (א) קליפ שיער של בית החזה; (B) קליפ שערה גפיים; (ג) לצרף אלקטרודות ומקם את הארנב עם רגליים פרושות לפנים על שמיכה תרמית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. מלעורית ניגודיות מונחה אקוקרדיוגרפיה ממ י טכניקה הארנב

  1. לנקות ולחטא את העור של בית החזה עם פתרון chlorhexidine מבוסס.
    1. השתמש של הטכניקה aseptic לאורך כל התהליך, לפי מומלצת הנוכחי.
    2. במידת האפשר, אם מעשית סבירה, לבצע הליך סטרילי לחלוטין, לרבות אך ללא הגבלה, השימוש בחומר סטרילי כגון שמלות, כפפות, פעירת, וילונות סטרילי הלביש חומר עבור הטבלה, כמו גם של אולטרסאונד סטרילי כיסוי מתמר ואולטרסאונד סטרילי ג'ל. זה יהיה להפחית עד למינימום את הסיכון של היכרות עם פתוגנים לחיה קבלת תעש, הוא יאושם בהגדרה קלינית (למשל, במהלך חדירה הלב).
      הערה: מומלץ להמשיך תמיד בקנה אחד עם תקנות מקומיים וארציים של מחקר בבעלי חיים החלים על המוסד המקומי ואת ארץ בפועל.
  2. חלות ג'ל שידור אולטרסאונד בחזה ו/או המתמר, ועל עם חוט מתמר מסביב לצוואר של הנסיין, לבצע סריקה מהירה חלון של הלב של בעל החיים, אשר לעיתים קרובות שימושי כדי להמחיש אנטומיה וכדי לתכנן ממ י.
  3. למקם את המתמר באופן ידני 4ה-6th לחלל הבין-צלעי, 2-3 ס מ מקו מתחת נכון עם שכיחות של זווית של ~ 90 ° ביחס בצד הימני של הקיר בית החזה (איור 2 א).
  4. להתאים את המיקום של המתמר ביחס לחלל הבין-צלעי את וכן שלה anteroposterior, זווית dorsoventral כדי למטב את נוף ששונה ציר קצר ברמה של השרירים papillary. לזהות בתצוגה זו את החדר הימני (RV), החדר השמאלי (LV), interventricular מחצה (עירויים), קיר אחורי (PW), וכן anterolateral (אי אל) posteromedial (PM) השרירים papillary (איור 2B).
    1. יש שדה ראייה רחב על ידי הגדלת באופן משמעותי את עומק באמצעות הפקד המתאים במערכת (למשל, כפתור, החיוג).
    2. תשומת לב מיוחדת להשגת תמונה סימטרית תצוגה זו, כמו גם בידול המתאים של קווי endocardial, epicardial, במידת הצורך, התאם באמצעות פקדי מיטוב תמונה (למשל, רווח).
  5. לאחר התצוגה echocardiographic אופטימלית מתקבל (איור 2B), לשמור על עמדה זו במהלך המשך ההליך, בזמן אופרטור השני מבצע ממ י (ראו להלן).
    1. בעודכם מחזיקים המתמר, להימנע להסתיר את סימן התמצאות מתמר, אשר צריך תמיד להיות פונה קדימה, ובכך מאפשר יישור שלה עם המחט בצעדים העוקבים (איור 2 א, ג).
  6. עם מחט 24-G המצורפת מזרק 1 מ"ל, למקם את המחט קרוב לעור של hemithorax השמאלי במיקום שיקוף סימטרי ביחס המתמר. לאחר מכן, ידנית ליישר את המחט עם סימון התמצאות מתמר בזווית של ~ 90° (איור 2C), ולהתקדם לאט את המחט דרך העור, לתוך הפתח שבחזה.
    הערה: הכניסה מלעורית המחט נמצא במצב הזה כיוון מקלה על הפריט החזותי של המחט במישור של קרן אולטרסאונד (איור דו-ממדי, E), ובכך מאפשר ניטור בזמן אמת, ובמקרה הצורך, התאמת מיקום המחט יחסית לאזור היעד של שריר הלב (איור 2 G, H).
  7. עם הטיפ במיקום היעד, לאט לספק את injectate (עד 0.25 mL לכל ההזרקה) בתוך 10-30 s (איור 2E), בעוד לאט ובעדינות פותחים את המחט במהלך ההזרקה כדי להגדיל את היקף שריר הלב מטופלים.
    1. השתמש InI 10% (v/v) מדולל ב- PBS התקינה של הטכניקה, וכן מעקב בחיי עיר בזמן רכישת כשירות, כמו גם באשר לאשר מיקוד מוצלחת של כל האתרים ממ י ארבע בתוך שריר הלב על ידי פתולוגיה ברוטו ו- histopathology (ראה נציג תוצאות). ברגע כשירות מושגת, InI יכול להיות מוחלף על ידי סוכן ניגודיות אולטרסאונד מסחרי מתאים במקרה הצורך.
      הערה: משלוח של 10% (v/v) InI מדולל ב- PBS עם או בלי תאים התוצאות שריר הלב ב hyperechogenicity transmural (כלומר, מראה בהיר אקו) באתר היעד של הזרקה (איור 2E, F). ההאטה ארעי או האצה של קצב הלב, הקשורים התכווצויות חדרית מוקדמת (למשל, מבודד, זוגות מחורזים, שלישיות) הם נצפו לעתים קרובות אפילו מן המגע הראשון של המחט עם epicardium כמו גם במהלך ו/או זמן קצר לאחר ממ י. עם זאת, אין הפרעות קצב מסכנות חיים מפותחים, תופעות לוואי חריפה הן נדירות באמצעות עד 0.25 mL (1.25 x 106 תאים) של injectate לכל תעש ההזרקה (ראה נציג תוצאות ודיון.).
  8. לבצע שינויים עדינים בשכיחות של זווית של המחט לפי הצורך כדי להשלים זריקות של 0.25 mL לכל אחד מן האתרים תעש היעד ארבע (שלוש לפנות שמאלה חדרית חינם קיר (LVFW) ואחד עירויים).
  9. לאחר השלמת ההליך ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש, להעריך את קצב הלב (למשל, באמצעות טורי אק ג מעקב ו/או 24 שעות Holter אק ג) ולבצע סריקות echocardiographic טורי החלון כדי לוודא העדר סיבוכים, עד החיה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה, רק אז העברה לחדר מחזור אור.
    1. כאן, אנו משתמשים 24 שעות Holter אק ג כדי לנטר את ההשפעות של תעש עם ה-InI על קצב הלב במשך 24 שעות ביממה. בשביל זה, השווינו קבוצת ארנבים 6 עם פנוטיפ נורמלי (קבוצה רגילה) וקבוצה של ארנבים 6 קיבל עירוי לוריד של דוקסורוביצין (cardiotoxic anthracycline סם, משמש בדרך כלל לטיפול בסרטן; קבוצת DOX) במינון של 2 mg/kg/קיבל בשבוע 8 שבועות ולאחר מכן שני גדודים תעש עם ה-InI.

Figure 2
איור 2 . ניגודיות percutaneous הזרקה intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ב הארנב. (א) הצבת המתמר ב hemithorax נכון בזווית של ~ 90 °. (B) תמונת הנציגה של תצוגת ציר קצר מתחת (PSSX) של הלב ברמה של שרירי papillary הארנב. (ג) יישור של המחט בזווית של ~ 90 ° ביחס הסימן התמצאות מתמר. (ד) מיקום המחט באתר היעד בתצוגת PSSX של הלב (שים לב כי המחט הוא מדמיין בקלות במישור של קרן אולטרסאונד). (E ו- F) הפגנה של hyperechogenicity באתר היעד על intramyocardial הזרקת דיו הודו (ראשי חץ להדגיש את hyperechogenicity transmural). מיקום המחט בבית הבליעה LV מקרית (G) (ראשי חץ לסמן הפיר מחט). Repositioning (H) של המחט אל הקיר חינם LV (ראשי חץ לסמן הפיר מחט). RV = הימני; LV = החדר השמאלי; עירויים = מחצה interventricular; PW = הקיר האחורי; AL = שריר papillary anterolateral; PM = שריר papillary posteromedial. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. פוסט אימי ניתוחים

  1. לבצע ניתוח histopathological של דגימות רקמות הלב של ארנבים.
    1. לתקן רקמת במשך 24 שעות ביממה ב- 10% פורמלדהיד, ואחריו התייבשות עם הגדלת ריכוזי אתנול כדלקמן:
      • 1 x ב- 70% (60 דקות)
      • 1 x ב- 95% ethanol/5% מתנול (60 דקות)
      • 1 x 100% (60 דקות)
      • 1 x 100% (90 דקות)
      • 1 x 100% (120 דקות)
      הערה: כל incubations לעיל מתנהלים בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, תחליף פעמיים עם 100% קסילן (1h, RT), ולבסוף להטביע פרפין שני צעדים (60 דקות, 58 ° C)25.
    2. לבצע 4-5 מיקרומטר רקמות פרקים מיקרוטום25. הר מקטעים בשקופיות.
    3. לבצע צביעת ועם hematoxylin-אאוזין מאסון שיטות trichrome25,26,27.
  2. בסעיפים רקמות של לבבות המושתלים, לבצע אימונוהיסטוכימיה לזהות תאים EGFP(+) HEK-293 (למשל, באמצעות השיטה (ABC) מורכבים אבידין-ביוטין), בקצרה:
    1. מבטל את השעווה הלב בעובי 4-5 מיקרומטר ובסעיף קסילן 100% (10 דקות, ב- RT). נוזלים ברקמות בשטיפה עם הפחתת אתנול ריכוז פתרונות (2 x 100% (2 דקות) 2 x ב- 95% (2 דקות) ב 70% (2 דקות)-x 1; 1 x ב- 50% (2 דקות); 1 x ב- 30% (2 דקות); 1 x ddH2O (2 דקות)) ב- RT.
    2. לבצע peroxidase אנדוגני עיכוב על ידי מכסה את החלקים עם 100 µL 3% H2O2 מעורבבת עם מתנול (מוכנים עם 5 מ של תמיסת מניות 30% H-2-O-2, מתנול הוספת את הנפח הכולל של 50 מ ל) ( דגירה 30 דקות, RT), ולאחר מכן תשטוף על ידי טבילה בתמיסת טריס buffered (TBS; pH 7.6).
    3. לבצע אנטיגן חשיפת פרצופו האמיתי באמצעות טיפול אנזימטי, על ידי כיסוי הסעיפים עם 100 µL של 0.1% Pronase (המוכנים 0.01 גרם Pronase מעורבבת עם 10 מ"ל TBS) (דגירה 12 דקות, RT), ואז לשטוף עם TBS (5 דקות, RT).
    4. דגירה בחסימה פתרון (עז נורמלית בסרום ב-10% ב- TBS) משתמש µL 100 לכל שקופית (30 דקות, RT) ולאחר לשטוף עם TBS (5 דקות, RT).
    5. דגירה עם חלבון נמכרות עוף אנטי-ירוק (GFP) כמו נוגדן ראשוני (שבערך ב- TBS) (1h, 30 מעלות צלזיוס), לשטוף עם TBS (5 דקות, RT).
    6. דגירה עם נוגדן משני biotinylated עז-נגד-עוף IgG (1:250 ב TBS) (1h, 30 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן לשטוף עם TBS (5 דקות, RT).
    7. דגירה עם מתחם אבידין-ביוטין (20 דקות, 30 מעלות צלזיוס) ולאחר מכן צור תווית באמצעות 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 דקות).
    8. לבסוף, מייבשים על ידי שטיפה בהגדלת ריכוזי אתנול (ב 30% (2 דקות)-1 x 1 x ב- 50% (2 דקות); 1 x ב- 70% (2 דקות); 2 x ב- 95% (2 דקות); 2 x 100% (2 דקות)) ב- RT, סעיפים counterstain באמצעות שיטת hematoxylin-אאוזין25ולאחר מכן לטעון כיסוי שקופיות. כוללים חיובי, שלילי כמו גם שולטת isotype.
      הערה: פרוטוקול קצר המתואר לעיל אינו מיועד לשימוש כללי אימונוהיסטוכימיה; אופטימיזציה עבור הרקמה של הריבית ותנאי הכרחי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש עם ה-InI:

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, ולא פעם המיקום האופטימלי של קצה המחט אושר ע י אקו ואת הזריקה יזם, transmural hyperechogenicity נצפתה במהלך מסירת InI (10% v/v ב- PBS) (איור 2E) , כמו גם כמה זמן קצר לאחר ממ י לאזור היעד (2F איור). כאשר אימי היה ומיד אחריו המתת חסד והסיר הלב, פיקדונות InI היו גלויים בקלות לאחר בדיקה חיצוני של הלב (איור 3 א). בנוסף, הלב רקמות מקטעים, למשל, סעיף קצר ציר ברמה של השרירים papillary (איור 3B), חשף transmural פיקדונות InI צבע במקום ההזרקה, ובכך הוכחת מסירה מוצלחת ויעילה של injectate לתוך שריר הלב בעזרת טכניקה זו. ראוי לציין, ציין hyperechogenicity transmural ויוו במהלך תעש (איור 2E, F), בקורלציה עם משקעי transmural של ה-InI דגימות vivo לשעבר (איור 3 א, ב'). זה הראו בבירור כי InI יש תכונות כפול בסביבה של ממ י: סוכן ניגודיות אולטרסאונד ויוו , וכן מעקב vivoin באתרו לשעבר . שני מאפיינים אלה להפוך InI סוכן ניגודיות סאונד מאוד תכליתי ולא יקר, במיוחד עבור הכשרה במהלך רכישת כשירות בטכניקה זו. לפיכך, המאפיינים echogenic של ה-InI לעזור כדי לפקח על ממ י למשל, לקבוע תעש מוצלחת לעומת אינטרה-הקאמרית בשוגג או הזרקת סביב הלב, כשצריך, בהתחשב בזמן אמת היכולות הדמיה של סאונד, כדי להפוך תיקונים של המחט לעקוב בזמן אמת (איור 2G, H). מצד שני, יכולות האיתור בחיי עיר של ה-InI הם בעלי ערך כדי לאתר את injectate של ex-vivo דגימות של שריר הלב היעד.

ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש עם תאים HEK-293 InI ו- EGFP(+):

לפני ממ י, תרביות תאים מוצלחת של תאים EGFP(+) HEK-293 אושר על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ במהלך in vitro לקשרי תרבות תנאים (איור 3C). שילוח מוצלח של תאים EGFP(+) HEK-293 לתוך שריר הלב הודגם באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימיה סעיפים רקמת הלב שבו נצפו InI פיקדונות. לפיכך, שימוש בשיטת מורכבים אבידין-ביוטין (ראה שלב 4.2), תאים EGFP(+) HEK-293 שופע זוהו בתוך שריר הלב בשריקות InI פיקדונות (דמות תלת-ממד). פיקדונות InI עדיין נצפו 24 שעות לאחר ממ י דגימות רקמות שריר הלב החל הארנבונים שקיבלו InI בשילוב עם תאים EGFP(+) HEK-293 (איור 3E) או InI לבד (איור 3F). ראוי לציין, לתגובה דלקתית חריפה נצפתה בנקודה זו בזמן, עם לחדור neutrophilic הדומיננטית, דגימות מבעלי קבלת תאים EGFP(+) HEK-293 (איור 3E), שהציעה דחייה תאית חריפה. מצד שני, מקרופאגים נצפו בחיות קבלת InI לבד (איור 3F).

Figure 3
איור 3 . בחיי עיר העקיבה של injectate והערכת מאקרוסקופית, histopathological. (א) הפגנה נוכחות של injectate על בדיקה חיצוני לב נכרת בעקבות תעש עם ה-InI (ראשי חץ לסמן את האתרים של הזרקת). (B) הפגנה של חלוקת transmural injectate בעקבות תעש עם ה-InI במקטע רוחבי של הלב ברמה של השרירים papillary (חץ כחול להדגיש את transmural. InI הפיקדון; חץ לבן מדגיש פיקדון גלוי של InI ב עירויים). (ג) Autofluorescence במבחנה של תאים EGFP(+) HEK-293 באמצעות מיקרוסקופ זריחה. (נד) ניתוח histopathological של אתרים מוזרק. EGFP(+) תאים הן בעליל בשריקות InI פיקדונות בתוך שריר הלב-הו (D) ורשום 24 שעות (E) ממ י (ראשי חץ כחול לסמן התאים EGFP(+); חצים אדומים לסמן הנוכחות של נויטרופילים). פיקדונות InI וביניהם בתוך שריר הלב-24 שעות (F) בעקבות תעש עם InI לבד (חיצים כחולים לסמן הנוכחות של מקרופאגים). RV = הימני; LV = החדר השמאלי; עירויים = מחצה interventricular; ממ י = הזרקת Intramyocardial; InI = אינדיה אינק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לאחר שבוצעה מעל 60 ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש הליכים עד כה, אנו מאמינים כי עם תשומת-לב רבה לפרטים, טוב לטיפול בבעלי חיים וטיפול, ההליך הוא בדרך כלל נסבל היטב, חריפה סיבוכים נדירים מאוד בדרך כלל קלה. באופן כללי, אצל בעלי חיים עוברים תעש, התצפית בתדירות הגבוהה ביותר במהלך ולאחר זמן קצר לאחר ההליך היא האצת ארעי או ההאטה של קצב הלב, המשויכים מבודד מתחמי חדרית מוקדמת (PVC) (איור 4A). לפיכך, 24 שעות אק ג Holter לניטור של חיות שקיבלו InI לבד באמצעות ממ י, חשף כי ההפרעה בתדירות הגבוהה ביותר שזוהו (הכולל מספר פרקים בתוך 24 שעות ביממה) היה מבודד PVC, אף-על-פי מספר גבוה יותר של פרקים התגלו אצל בעלי חיים שהיו בעבר לטפל בעזרת DOX במשך 8 שבועות (איור 5A). PVC זוגות מחורזים, שלישיות להיראות בתדירות נמוכה יותר (איור 4B, C ו- איור 5B, C), אף-על-פי שלישיות הן באופן משמעותי פחות תכופים ב DOX שטופלו מאשר ללא טיפול בארנבים נורמלי (איור 5C). מצד שני, ללא התנגדות-. מתקבלת טכיקרדיה חדרית (NSVT) נצפתה בתדירות גבוהה יותר אצל בעלי חיים נורמליים (איור 4D , דמות 5D). באופן משמעותי, בעוד קצב הלב אומר לא היה שונה בין DOX לקבוצות נורמלי לאחר קבלת תעש עם ה-InI לבד (איור 5E) סטיית התקן של R-R רגיל מרווח (SDNN), פחתו משמעותית (< 100 ms) ב (קבוצה DOX איור 5F). SDNN אי-לינארית מידה של מצב בריאות הלב, לכן תוצאה זו עולה כי הקבוצה DOX יש שינויים גלובלית במצב פיזיולוגי הלב שלה.

Figure 4
איור 4- להפרעה ציין במהלך 24 שעות Holter לניטור בארנבים שקיבלה תעש עם ה-InI. הדימויים המוצגים הם צילומי מסך המתקבל tachograms אק ג Holter המוצג על המסך במהלך ניתוח במצב לא מקוון, להמחיש דוגמאות מייצגות של הסוגים הנפוצים ביותר של הפרעות קצב במהלך 24 שעות של ניטור. (א) מבודד PVC. PVC (B) בזוגות מחורזים. (ג) PVC ברחם. NSVT (D). PVC = התכווצויות חדרית מוקדמת; NSVT = ללא התנגדות-. מתקבלת טכיקרדיה חדרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . הפרעות לב אירועים שזוהו על ידי 24 שעות אק ג Holter לניטור בעקבות תעש עם ה-InI בארנבים. המספר הכולל של PVC מבודד (A), PVC, זוגות מחורזים (B), PVC, שלישייה, (ג) ו- NSVT (D), ללא טיפול בארנבים (רגיל + ממ י) לעומת שטופלו דוקסורוביצין (3 מ"ג/ק"ג/בשבוע במשך 6 שבועות) ארנבים (DOX + ממ י), לאחר תעש עם ה-InI. כלומר קצב הלב (E) ועל SDNN (F), בארנבים מ רגיל + ממ י ו DOX + ממ י קבוצות לאחר תעש עם ה-InI. נתונים מבוטא זאת אומרת ± ב- SEM * מציין p < 0.05; ומציין # p < 0.01, השוואת רגיל + ממ י לעומת DOX + ממ י קבוצות על ידי t-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרה העיקרית הייתה לפתח טכניקה מינימלית פולשנית שיכול לשמש למסירה של תאי גזע לתוך שריר הלב של ארנבים (בגודל פרה חיה דגם גדול)17,18, תוך ניצול השימוש זול יחסית זמינים רבים קליניים מערכת הדמיה מחקר מרכזי. כאן, אנו מראים, באמצעות מערכת אקוקרדיוגרפיה קליני, שנעזר InI, סוכן הנפוצה, הן בחיי עיר עקיבה יכולות ומאפיינים echogenic, מוצלחת ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש הוא יעיל מאוד בתחום אספקת injectate לאזורי היעד של הארנב הלב. עד כמה שידוע לנו, זה התיאור הראשון של ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש ותא משלוח במודל בעלי חיים גדולים כמו הארנב18,19. בעוד ה-InI השתמשו בעבר במחקרים בחיי עיר לוקליזציה של injectate בתוך רקמות7,28, זה לידע שלנו, התיאור הראשון של מאפייני הסוכן כפול כמו של ויוו אולטרסאונד ניגודיות הסוכן וכן של מעקב בבאתרו של injectate ex-vivo. אכן, תערובות מורכבים של סוכנים בניגוד, בחיי עיר מתווים חומרים בעבר תוארו במחקרים מאתר מכוון ומספק injectates לתוך שריר הלב29. עם זאת, לאור המאפיינים echogenic של ה-InI והיכולות שלו בחיי עיר עקיבה, חומר זה עשוי להיות שימושי ביותר במהלך רכישת מיומנות בזמן ההכשרה בטכניקה זו.

אישור מסירה של injectate המכילה שני InI גם לזה שבתאים HEK EGFP(+)-293 באמצעות אימונוהיסטוכימיה מדגים את הישימות של טכניקה זו פרה במחקרים שמטרתם טיפול בתאי גזע. אימי InI בשיתוף עם EGFP(+) HEK-293 הביא לתגובה דלקתית חריפה עם לחדור neutrophilic, השולט רומז תגובה של דחייה תאית חריפה (תוך 24 שעות) על התאים xenogeneic. תגובה זו כנראה אינה מפתיעה בחיה immunocompetent. מצד שני, אימי עם InI לבד גם elicited לתגובה דלקתית חריפה (תוך 24 שעות) בתוך רקמת שריר הלב מטופלים, אשר הציג לחדור מקרופאג הדומיננטית. זה עולה בקנה אחד עם התצפית של דלקת חריפה מתואר במחקרים קודמים בעקבות תעש תחת תצוגה ישירה החזה הליך4,30,31,32,33. דלקת חריפה גם נצפתה על הזרקה של תמיסת מלח או פתרונות PBS לתוך שריר הלב34,35, אפילו לתוך שרירי הסובך עכברוש36, ולכן תגובה זו כבר מיוחס לפגיעה ישירה רקמות, ולא את injectate כשלעצמה. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 . ואכן, האגודה הבינלאומית עבור המחקר Translational לב וכלי דם מאשר במופע הנפוץ של דלקת בסביבה של ממ י, אך קיימת הסכמה כללית כי אם או לא מודד כדי להפחית את התהליך הזה במהלך פרי-נוהלי הזמן הם שימושיים (למשל, קורטיקוסטרואידים (עירוי) תוך ורידי)37. אף-על-פי דלקת במחקר זה יכול גם להיות ייחסה לביים פציעה ברקמות, התוצאות גם להציע כי InI כאשר גוף זר חייב למלא גם תפקיד בתהליך זה, סיפק מספר של מקרופאגים מופיעים כדי להיות phagocytizing. InI (איור 3F). ניתוח מעמיק של ההשפעות פונקציונלי של דלקת חריפה זו משני תעש בתוך הלב, או באם אלה יכולים להשתפר באמצעות הנהלת מניעתי תרופות כגון סטרואידים מעבר להיקף של כתב היד הזה. למרות זאת, חדות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש ארבעה אזורים היעד של שריר הלב, עם נפח של injectate של עד 0.25 mL (1.25 x 106 תאים) לכל אתר ממ י, היה נסבל היטב ב הארנב.

עם יותר מ- 60 ההליכים שבוצעו עד כה, ואחרי כשירות הושג, תמותת משני ההליך היה נמוך מאוד. לדוגמה, מותם לא אירעה שני גדודים שמתואר בשלב 3.9 (רגיל וקבוצות DOX) לאחר ממ י. ואכן, עד כה אחרי 67 נהלי תעש שבוצעו במסגרת תוכנית מחקר שוטף, רק היו לנו שני מקרי מוות הקשורים ישירות ההליך (2.9% תמותה). אחד מאלה, הנוכחות של hemopericardium הודגם בבדיקה לאחר המוות , בעוד השני פיתח סימנים נוירולוגיים קליניים, בקנה אחד עם חריפה קליפתית משני אירוע cardioembolic, וכך מצריכים מובילים הומאני. שיעור התמותה זה (2.9%) הוא נמוך באופן משמעותי מזה שדווח על ידי Lu. et al. (11%)8 ו מו et al. (27%)38, בארנבים שקיבלה תעש תחת תצוגה ישירה שגרת החזה. לפיכך, אנו רואים את ההליך המתואר במחקר הנוכחי כדי להיות בטוחים, אנו משתמשים בטכניקה זו במחקרים מתמשך להערכת טיפול מבוססי תאי גזע במודל של הארנב של AICM עם תוצאות מבטיחות39,40.

ישנן מספר נקודות קריטיות עבור מוצלחת מלעורית ניגודיות תעש מונחה אקוקרדיוגרפיה. תחילה, ודא כי מתחת ציר קצר תצוגה ברמה של השרירים papillary מתקבל עם סימון ברור של קווי המתאר endocardial ו- epicardial. לאחר מכן, ודא כי קצה המחט בתוך שדה הראייה בכל עת ברגע זה נכנס בחלל החזה, שריר הלב כדי למנוע מסירה בטעות לתוך סביב הלב או LV קאמרית. לאחר מכן, ודא לשמור עד למינימום את מספר מעברים דרך הפתח שבחזה, ועל לתוך קרום הלב, שריר הלב, מאז זה יכול להגביר את הסבירות של טראומה מקומית (למשל, חתך) מבנים אלה, ואת הסיכון המשויכים hemopericardium. בשביל זה, תוך שמירה על המחט בחלל החזה (וגם כמה אתרי היעד, בנקודת באותו ערך הכפורת הקרביים (למשל, קיר ותקרה)), בזהירות לבצע שינויים עדינים בשכיחות של זווית של המחט. בסופו של דבר, תמיד להשתמש מחט כי יש מעבר קלה וברורה דרך העור לתוך הפתח שבחזה, וכך להימנע משופעות המחט בוטה של הזנת שריר הלב ולגרום נזק משמעותי.

ההליך המתואר במסמך זה, לא רק מאפשר משלוח אמין ומוצלח של injectate מספר אתרי היעד בתוך שריר הלב, אך הוא מאפשר גם תיקון של המסלול מחט בזמן אמת, ובכך למנוע (משלוח intrachamber מקרית איור 2G, H). בעוד סגור נהלי תעש החזה שתוארו קודם לכן בעכברים, ישנן מספר מגבלות הטבועות מודל זה בעל חיים קטן. מגבלות אלה כוללים את מספר היעד מחוזות לבצע טיפול שריר הלב, ואת נפח/המספר הנמוך של תאים, כי יכול להיות מוזרק לכל יעד האתר29,41. בנוסף, מסירה מדויקת של injectate היא לעיתים קרובות דאגה, עם שיעור הצלחה קרוב 60-70%42, ולכן השימוש במערכות סאונד בתדירות גבוהה פחות נרחב זמין בדרך כלל נדרש29,41, 42. מערכות אלו מצוידים מתמרים ליניארי מערך גם בעלי מגבלות ההדמיה הטבועה (למשל, ההד הוא חפץ תכופים)14. מגבלה נוספת של דגמים קטנים מכרסמים כגון עכברים וחולדות, היא שלהם הבדלים מהותיים במערכת התחבורה+2 Ca, אלקטרופיזיולוגיה הסלולר, השונה מזו של בני אדם ומודלים גדולים בגודל בעלי חיים כגון כלבים, חזירים, ארנבים 1516,,43. כל מגבלות אלה לעיתים קרובות ליצור קשיים בתרגום הממצאים במודלים אלה למרפאה ללא אישור מראש במודל בעלי חיים גדולים.

פיקוח קפדני על החיה בתקופה פרי-נוהלי הוא חובה על פי הנחיות עכשווי לטיפול של חיות מעבדה. כפי שמוצג כאן, זה יכול להיעשות על ידי טורי אקוקרדיוגרפיה חלון סריקות לשרטוטים אק ג, לפחות עד החיה היא ערה מן ההרדמה. ההשפעות חריפה של ממ י על קצב הלב גם ניתן לנטר מאת h 24 Holter אק ג והוא מנהג שלנו. ראוי לציין, הפרעות קצב בתדירות הגבוהה ביותר היו מבודדים PVC, אשר הם שפירים יחסית בטבע, אשר היו נפוצים יותר אצל בעלי חיים אשר טופלו עם דוקסורוביצין לפני תעש עם ה-InI (ראה איור 4A ו- 5A איור). הפרעות קצב אחרים שהיו יחסית בתדירות נמוכה יותר כוללים: PVC ב זוגות מחורזים; PVC ברחם; כמו גם NSVT (ראה איור 4BD ו- 5B איורD). עם זאת, אין הפרעות קצב מאיים כמו טכיקרדיה חדרית מתמשכת חיים נצפו. ראוי לציין, מצאנו גם כי כמה ביטויים cardiotoxic בקבוצה DOX יכול יזוהו על-ידי א Holter לניטור, שימוש במשתנים התדר זמן של השתנות קצב הלב (HRV) כגון SDNN. לפיכך, SDNN מופחת (איור 5E, F), הלא-לינארית מידה של מצב בריאות הלב, נצפתה בקבוצה DOX לעומת הקבוצה רגיל. זה לדו ח HRV מופחתת, כפי שמתואר על ידי SDNN מופחת, בהקשר של ארנב מודל של AICM, אשר עולה בקנה אחד עם התצפית כי מופחת SDNN היא מנבא חזק עצמאית של מוות לבבי בחולים עם HFrEF44 ,45,46. השינויים ב- SDNN בקבוצה DOX כנראה שאינן קשורות לההליך ממ י עצמו; עם זאת, אישור על ממצאים אלה בארנבים קבלת דוקסורוביצין, כמו גם בעלי חיים נורמלי, כי אינם מקבלים תעש, נדרש. אם SDNN מופחת ב- HFrEF יכול להיות גם שיפור, ולכן משמש מדד הפונדקאית של היתרון של טיפול בתאי גזע מבוסס, נותרת להערכה, יהיה המוקד למחקר עתידי.

נחקרו מספר נתבים משלוח של תאים לתוך הלב, כולל תוך ורידית, intracoronary, ו intramyocardial מסירה; עם זאת, המסלול intramyocardial משמש בזאת, הראו באופן עקבי רמת הגדול ביותר של תאי השמירה המחירים1,2,3,4,5,37. אנחנו לא להעריך תא שימור שיעור במחקרים שהוצגו כאן, המתודולוגיה בשימוש אינה ברורה מספיק. כדי quantitate ויוו או זו שמחוץ, זו מגבלה של מחקר זה ועמיד. במקום זאת, השתמשנו תאים EGFP(+) HEK-293 שמאפייניה פנוטיפי אפשרה לנו בקלות להפלות הנוכחות של תאים אלה בתוך שריר הלב, שמעיד מסירה מוצלחת intramyocardial. עם זאת, המטרה העיקרית הייתה לפתח טכניקה פולשנית לפיה שיכולנו לבצע משלוח תעש ותא לתוך שריר הלב של דגם בגודל, פרה גדולה של שריר הלב-איסכמי. כפי שמתואר באיור 2 , איור 3, זו הושגה בפעם הראשונה על ידי מלעורית ניגודיות תעש מונחה אקוקרדיוגרפיה. מחקרים נוספים נדרשים להעריך תא שימור שיעור, כמו גם פוטנציאל ההשפעות המיטיבות של תאי גזע מועברת לתוך שריר הלב באמצעות ההליך המתואר במסמך זה; מחקרים אלה נמצאים כעת בעיצומו. אנחנו מתקשרים לאחרונה תוצאות מבטיחות לגבי תופעות פונקציונלי39,40.

בהשוואה תעש שגרת החזה פתוח, ניגוד מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה ממ י בדגם פרה גדול כמו שמתואר במחקר זה, הוא משמעותית פחות פולשני בטבע עם התאוששות מהירה של החיה בעקבות ההליך, וכפי שהוזכר לעיל, לו גם8,שיעור תמותה נמוך38. גישה אחרת כדי תעש היא ממ י ספירליים, אשר גם נבדק במודלים פרה של מספר ניסויים קליניים קטנים (לסקירה, ראה שנג. et al.) 47. עם גישה זו, קטטר זה מתקדם לתוך חלל LV וממוקמים ואז באתרי היעד בתוך endocardium. היעד אתרים אלה הם שגם מזוהה לפני ההליך, למשל, באמצעות הניגוד דימות תהודה מגנטית לב (CMR)48, או במהלך ההליך, למשלעל ידי מיפוי endocardial אלקטרו-מכאניים (EEM), כדי בבירור להבדיל קיימא שריר הלב לפני הזרקת49. שכרגע הצגנו הוא פחות פולשנית בהשוואה לפתיחת החזה תעש תחת תצוגה ישירה, יתרון ברור. בנוסף, מאז IHD בבני אדם יש התפלגות אחידה, EEM עוזר לכוון את הטיפול באופן ספציפי לאתרים קיימא של שריר הלב, אשר חשוב במיוחד בסביבה של IHD. אולם חיסרון גדול הוא אינדוקציה של להפרעה, אשר תכונה נפוצה של כל הגישות ממ י. חסרונות אחרים כוללים הפעם פרוצדורלי ממושך, מתן ש-EEM הוא טכניקה מאוד תובעני המחייב הכשרה נרחבת, סיכון המשויך של ניקוב הלב. לעומת זאת, חדות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש כפי שמתואר במחקר זה, טכנית פחות תובענית יותר ממ י ספירליים, ברגע כשירות מושגת, וניתן לבצעה בבטחה בתוך 25 דקות לאחר הרדמה. באופן דומה, שכן רק חלק קצר המחט מתקדמת לתוך שריר הלב, יש סיכון נמוך יותר של ניקוב הלב, אך הלב חתך אפשרי עדיין.

לסיכום, ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה ממ י הטכניקה המתוארים במחקר זה במודל בעלי חיים גדולים, כגון16,' ארנבת '43, היא בטוחה, נסבלת היטב ויעיל בתחום אספקת את injectate לתוך הלב. לכן, היא מהווה אסטרטגיה מבטיח בדיקת השערות פרה של ההשפעות של הלב הרפוי משובי באיסכמי קרדיומיופתיה (למשל, AICM), לרבות, אך לא מוגבל, המבוססים על תאי גזע טיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים Monfort שילה, ברנדה מרטינס, קרלוס Micó, אלברטו מוניוס, מנואל מולינה על תמיכה מצוינת הניתנים במהלך איסוף של נתונים, קרלוס בואנו למתן את התאים EGFP(+) HEK-293. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי: Fundación Séneca, Agencia דה Ciencia y Tecnología, מוקדי דה מורסיה, ספרד (JT) (מענק מספר: 11935/פאי/09); אדום de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, דה PN השישי אני + D + אני 2008-2011 (מענק. לא. RD12/0019/0001) (JMM), שיתוף מימנה עם מבני מימון של האיחוד האירופי (פדר) (JMM); מאוניברסיטת רדינג, ארצות הברית (AG, ג'יגה-בתים) (מימון מרכזי). התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. e51566 (2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics