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Injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique et livraison de cellule dans un modèle préclinique grand

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Summary

Nouvelles stratégies thérapeutiques en médecine régénérative cardiaque nécessitent des études étendues et détaillées dans des modèles animaux précliniques grands avant ils peuvent être considérés pour une utilisation chez l’homme. Ici, nous démontrons une technique d’injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique chez le lapin, qui est précieux pour l’efficacité de ces traitements novateurs des tests d’hypothèses.

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Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

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Abstract

Thérapie cellulaire et génique sont passionnants et des stratégies prometteuses dans le but de la régénération cardiaque dans le cadre de l’insuffisance cardiaque avec réduit la fraction d’éjection (HFrEF). Avant de pouvoir être considérées comme devant servir et mis en œuvre chez l’humain, des études précliniques sont tenus dans des modèles animaux grands pour évaluer l’innocuité, l’efficacité et sort de l’injection de co-Set (par exemple, les cellules souches) livrée une fois dans le myocarde. Petits rongeurs modèles offrent des avantages (p. ex., rapport coût/efficacité, susceptibilité manipulations génétiques) ; Cependant, compte tenu des limitations inhérentes à ces modèles, les résultats dans ces traduisent rarement à l’infirmerie. À l’inverse, grands modèles animaux comme les lapins, ont des avantages (p. ex., électrophysiologie cardiaque similaire, par rapport aux humains et autres animaux de grande taille), tout en conservant un bon équilibre économique. Ici, nous démontrons comment réaliser une technique d’injection (IMI) de guidée par échocardiographie intramyocardique contraste percutanée, qui est peu invasive, sûr, bien toléré et très efficace dans la prestation ciblée d’injectates, y compris les cellules, dans plusieurs localités dans le myocarde d’un modèle de lapin. Pour la mise en œuvre de cette technique, nous avons également pris avantage d’un système d’échocardiographie clinique largement disponibles. Après avoir mis en pratique le protocole décrit ici, un chercheur ayant connaissance de base d’échographie va devenir compétent dans l’exercice de cette technique polyvalente et mini-invasive pour utilisation en routine dans les expériences, visant à la vérification des hypothèses de la capacités de cardiaque thérapeutique régénératrice dans le modèle de lapin. Une fois que la compétence est atteint, l’ensemble de la procédure peut être réalisée au sein de 25 min après anesthésier le lapin.

Introduction

Thérapies cellulaires et géniques sont passionnant et jamais développer des stratégies pour régénérer/réparer le myocarde blessé dans HFrEF. Quelques études ont comparé l’efficacité (p. ex., taux de rétention cellulaire) des différentes routes de livraison de la cellule, qui ont constamment démontré la supériorité de l’IMI sur routes intracoronaire ou intraveineuse1,2 , 3 , 4 , 5. il n’est donc pas surprenant qu’une grande partie des études sur des modèles translationnelles de la thérapie de cellules souches du myocarde blessé, livrer l’injection co-Set via IMI réalisée sous vision directe dans un thorax ouvert procédure6,7 . Toutefois, cette approche présente plusieurs limites, y compris le caractère invasif de la procédure, qui comporte le risque de mortalité de peri-procédure (souvent sous-déclarée)8. En outre, un IMI sous vision directe n’élimine pas la possibilité pour une injection accidentelle dans la cavité ventriculaire. Dans la pratique clinique un IMI au cours de la chirurgie du thorax ouvert pourrait être une méthode appropriée pour la livraison de cellules thérapeutiques, par exemple, au cours de l’artère coronaire pontage coronarien (CABG) ; de la greffe Toutefois, cette approche peut ne pas convenir à livraison de cellule cardiomyopathie global d’origine non ischémique (p. ex., HFrEF secondaire à une cardiomyopathie induite par l’anthracycline (AICM)).

Il ne fait aucun doute que cardiopathie ischémique (IHD) est la cause la plus fréquente de HFrEF (~ 66 %)9,10; Toutefois, cardiomyopathie non ischémique, y compris AICM, touche encore une proportion importante de patients atteints de HFrEF (33 %)9 . En effet, les récents progrès en oncologie clinique ont donné lieu à plus de 10 millions de survivants du cancer dans les seuls Etats-Unis11, avec un nombre similaire en Europe, une tendance générale vers l’amélioration de la survie des patients atteints de cancer12 ,,13. Ainsi, explorer les avantages de nouveaux traitements tels que la greffe de cellules souches pour une cardiomyopathie non ischémique, ainsi que l’essai d’un itinéraire efficace et peu invasif de la livraison de cellules souches est d’une importance capitale, étant donné le nombre croissant de patients touchés par la cardiotoxicité secondaire aux médicaments anticancéreux.

À noter, des études utilisant la thérapie de cellules souches visant à la réparation/régénérer le myocarde blessé fréquemment des tests d’hypothèses implique l’utilisation de petits rongeurs (par exemple, les souris et rats). Ces modèles nécessitent souvent des systèmes à ultrasons cher haute fréquence pour l’évaluation de la fonction myocardique, généralement équipée de transducteurs de rangée linéaire qui ont certaines limites inhérentes aux associés (p. ex., réverbération)14. Toutefois, autres modèles tels que les lapins, ce qui représente un grand modèle préclinique, ont certains avantages pour les tests d’hypothèse des traitements de cellules souches chez HFrEF. Ainsi, contrairement à des rats et des souris, lapins maintiennent un système de transport+ 2 Ca et électrophysiologie cellulaire qui ressemble à celle des humains et autres animaux de grande taille (par exemple, les chiens et les porcs)15,16,17 ,18,19. Un autre avantage, c’est leur susceptibilité pour échographie cardiaque d’imagerie utilisant relativement peu coûteux et de systèmes d’échocardiographie clinique largement disponible équipés relativement transducteurs phase array haute fréquence, par exemple, 12 MHz, telles que ceux fréquemment utilisés en cardiologie néonatale et pédiatrique. Ces systèmes permettent l’imagerie échocardiographique excellent avec la pointe de la technologie, et ils profitent de la supériorité de harmonic imaging20. Par ailleurs, des tests d’hypothèse étendue du potentiel des thérapies régénératives cardiaques (par exemple, la thérapie de cellules souches), de leur sécurité, efficacité, cardiomyogénique potentiel, ainsi que d’évaluation du devenir de l’injection de co-Set une fois délivrées dans le myocarde, est obligatoire avant elles peuvent être considérées comme à usage humain, et ils nécessitent l’utilisation de grands modèles animaux précliniques, tels que le lapin17,19. Ici, nous décrivons une technique mini-invasive pour la livraison de la cellule via IMI contraste-échocardiographie percutanée guidée en utilisant un système clinique échocardiographie, qui vise à la thérapie à base de greffe de cellules souches non ischémique cardiomyopathie20 . Nous décrivons aussi les avantages de l’encre de Chine (InI, encre de Chine, également connu sous le nom) comme un traceur échographie de contraste agent et in situ de l’injection de co-Set dans le coeur de lapin.

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Protocol

Les expériences décrites dans les présentes ont été approuvées par le Comité éthique de la recherche de l’Université de Murcia, Espagne et ont été effectuées conformément à la Directive 2010/63/UE de la Commission européenne. Les étapes décrites ont été effectuées dans le cadre des protocoles d’exploitation standards qui faisaient partie du plan de travail et n’ont pas été effectuées uniquement dans le but de filmer la vidéo ci-jointe au présent document.

1. préparation des cellules et le vecteur d’Expression chez les mammifères

NOTE : Ici, nous décrivons brièvement un protocole pour la préparation et la transfection d’une lignée cellulaire (rein embryonnaire humain 293 (HEK-293)) ; Toutefois, les protocoles spécifiques de cellule appropriée pour le type de cellule d’intérêt devraient être optimisée (par exemple, les cellules souches).

  1. Maintenir les cellules HEK-293 en hyperglycémie Dulbecco de l’aigle modifié (DMEM) additionné de sérum de veau foetal de 10 % (FCS), 2 mM de Glutamine, pyruvate de sodium 1 %, 1 % pénicilline/streptomycine et incubés à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % CO2 . Une fois que les cellules sont Sub confluentes, divisé selon un ratio de 1:3.
  2. Commencer à diviser les cellules en aspirant les médias, puis lavage une fois avec le phosphate stérile solution saline tamponnée (PBS), enlever l’excès PBS et puis incuber avec 2,5 mL de 0,5 x acide de trypsine-tétraacétique (EDTA) (5 min, 37 ° C).
    1. Ajouter un volume de médias DMEM (complété comme décrit ci-dessus) pour arrêter la réaction, puis détacher les cellules en lentement et doucement aspirant de haut en bas avec une pipette électronique.
  3. Ensuite, transférer la suspension cellulaire à un conteneur approprié (par exemple, tube à centrifuger conique 15-50 mL). Centrifuger dans un seau de swing (x 100 g), éliminer le surnageant et laver le culot deux fois avec du PBS stérile.
  4. Resuspendre le culot dans les médias DMEM fraîches et graines à une densité de cellule appropriée (par exemple, 1 x 106 cellules dans une fiole de2 75 cm) en flacons de culture fraîche ou des grands plats selon les pratiques de laboratoire local.
    1. Remplacer les médias existants avec les supports neufs tous les 2 jours.
      Remarque : Le vecteur d’expression a été dérivé de pIRES1hyg et utilisé selon les instructions du fabricant comme décrites précédemment21. p(EGFP) IRES1hyg a été généré par subcloning EGFP ARNC comme un BamHI + NotI Insérez pEGFP-N1 dans le BamHI + NotI digéré pIRES1hyg21.
  5. 1 jour avant la transfection, les cellules de semences HEK-293 à une densité de 0,5 x 105 cellules/cm2 en plaques de culture de tissu de 12 ou 24 puits.
  6. Le jour de la transfection, préparer des ADN-lipides transfection réactif complexes dans des tubes de microcentrifuge séparée 1,5 mL (1 tube/puits).
    1. Commencez par ajouter 250 µL de milieu de sérum réduit dans chaque tube et puis ajoutez 4 µg ADN (mélanger délicatement).
    2. Par la suite, ajouter 250 µL du mélange préalablement préparé de 10 µL de réactif de transfection lipidique et 250 µL de milieu de sérum réduit, dans chaque tube (mélanger à nouveau doucement).
    3. Enfin, poursuivez transfections, en incubant les cellules HEK-293 avec complexes de réactif de transfection ADN lipides pendant 4 h, puis remplacer par milieu DMEM tel que décrit ci-dessus (étape 1.1) et incuber pendant une autre 48 h a. sélection de médicaments Perform Ecurie transfectants avec 100 µg/mL hygromycine B.
  7. Détacher les cellules HEK-293 avec la trypsine tel que décrit ci-dessus (étape 1.2). Après avoir lavé les cellules dans du PBS stérile, remettre en suspension dans un véhicule approprié (par exemple, 10 % v/v InI dans du PBS), d’obtenir une concentration finale de cellule de 5 x 106/ml.

2. préparation du lapin

NOTE : Le positionnement du lapin et le transducteur pour IMI n’est pas optimal pour évaluer la morphologie et le fonctionnement du cœur de l’animal. Ainsi, il est conseillé d’effectuer un examen échocardiographique complet20 avant l’IMI (voir ci-dessous) et aux périodes ultérieures telles que définies par le protocole expérimental. Cela aura pour but d’évaluer anatomique et fonctionnel caractéristiques de référence du coeur chez l’animal qui recevront une injection et également évaluer les effets, de l’IMI dans le fonctionnement du cœur.

  1. Effectuer cet examen de façon aveugle et suivant les directives du Comité de l’American College of Veterinary Internal Medicine et la American Society of Echocardiography/European Association échocardiographie d’imagerie cardiovasculaire 22 , 23 , 24.
  2. Obtenir un suivi simultané 1-plomb électrocardiogramme (ECG) tout au long de l’étude échocardiographique ensemble.
  3. Anesthésier le lapin avec la kétamine 10 mg/kg, combiné avec la médétomidine 200 µg/kg, intramusculaire (I.M.).
  4. Vérifier le niveau de l’anesthésie après 10-20 min après l’administration de l’anesthésie.
  5. À l’aide d’une tondeuse à cheveux enlever les poils de la poitrine largement (par exemple, au-dessous du cou dans la région sub xiphoid) (Figure 1 a).
  6. Rasage des régions supplémentaires de 1 à 2 cm2 sur la face interne de la patte avant droite (région mediocubital) et de deux membres postérieurs (région mediotibial) (Figure 1 b).
  7. Placer les électrodes ECG auto-adhésives sur les régions rasées des membres de façon synchrone de surveiller le rythme cardiaque au cours de la procédure (Figure 1).
  8. Placez l’animal en position couchée sur une couverture thermique, décubitus avec les membres tendus à l’aide de ruban chirurgical, attaché à la table (Figure 1).
    1. Veillez à ce que les oreilles sont fléchis vers l’arrière, derrière la tête/dos du lapin et à une position qui est plus faible que ses pattes avant, car cela aide à maintenir un positionnement correct du thorax de l’animal tout au long de la procédure.
  9. Permettre à l’animal de respirer spontanément alors qu’administrer de l’oxygène par masque facial dans l’ensemble de la procédure dans son ensemble (100 %, 2 à 3 L/min).

Figure 1
Figure 1. Préparation du lapin pour IMI. (A) pince à cheveux du thorax ; (B) pince à cheveux de membres ; (C) fixer des électrodes et de positionner le lapin avec les jambes tendues sur une couverture thermique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. Technique de IMI guidée par échocardiographie de contraste percutanée chez le lapin

  1. Nettoyez et désinfectez la peau du thorax avec une solution de chlorhexidine.
    1. Utilisez une technique aseptique tout au long de l’ensemble de la procédure, selon les meilleures pratiques actuelles.
    2. Chaque fois que possible et si possible, effectuer une procédure totalement stérile, y compris, mais non limité à, l’utilisation de matériel stérile tels que robes, gants, chirurgicales enroulés tentures, pansements stériles pour la table, comme une échographie stérile gaine-housse et gel ultrasonique stérile. Cela permettra de réduire au minimum le risque d’introduction d’agents pathogènes à l’IMI de réception des animaux et est une pratique courante en milieu clinique (p. ex., au cours de la ponction cardiaque).
      Remarque : Il est recommandé de toujours procéder conformément aux réglementations locales et nationales de recherche animale applicable à l’institution locale et pays de la pratique.
  2. Appliquez du gel de transmission ultrasonique à la poitrine et/ou au transducteur, avec son câble transducteur autour de cou de l’expérimentateur, effectuer un balayage rapide de fenêtre du cœur de l’animal, qui est souvent utile de visualiser l’anatomie et de planifier l’IMI.
  3. Placer le transducteur manuellement au 4ème-6ème espace intercostal, 2-3 cm de la ligne parasternale droite avec un angle d’incidence de ~ 90 ° en ce qui concerne le côté droit de la paroi thoracique (Figure 2 a).
  4. Régler la position de la sonde par rapport à l’espace intercostal ainsi que ses antéro-postérieure et dorsoventral angle pour optimiser une vue axe court modifiés au niveau des muscles papillaires. Identifier dans ce point de vue, le ventricule droit (RV), ventricule gauche (VG), septum interventriculaire (IVS), paroi postérieure (PW), ainsi qu’antérolatérale (AL) et les muscles papillaires périostite (PM) (Figure 2 b).
    1. Avoir un large champ de vision en augmentant significativement la profondeur en utilisant le contrôle approprié sur le système (p. ex., bouton, cadran).
    2. Une attention particulière à l’obtention d’une image symétrique dans cette vue, mais aussi une différenciation appropriée des contours endocardiques et épicardiques et, si nécessaire, régler au moyen de contrôles d’optimisation image (par exemple, gain).
  5. Une fois la vue échocardiographique optimale est obtenue (Figure 2 b), maintenir cette position pendant tout le reste de la procédure, alors qu’un deuxième opérateur effectue l’IMI (voir ci-dessous).
    1. Tout en tenant le transducteur, évitez de cacher la marque orientation transducteur, qui doit toujours être dirigé vers l’avant, permettant ainsi à son alignement avec l’aiguille dans les étapes suivantes (Figure 2 a, C).
  6. Avec une aiguille 24-G attachée à une seringue de 1 mL, placer l’aiguille près du cuir chevelu de l’hémithorax gauche en position de mise en miroir symétrique en ce qui concerne le transducteur. Ensuite, aligner manuellement l’aiguille avec la marque de l’orientation de transducteur à un angle de ~ 90° (Figure 2) et avancer lentement l’aiguille à travers la peau et dans la cavité thoracique.
    Remarque : L’insertion de l’aiguille percutanée dans cette position et l’orientation facilite la visualisation de l’aiguille dans le plan du faisceau ultrasonore (Figure 2D, E), permettant ainsi la surveillance en temps réel et, si nécessaire, adaptation des l’emplacement de l’aiguille par rapport à la région cible du myocarde (Figure 2 G, H).
  7. Avec la pointe à l’emplacement cible, lentement livrer l’injection de co-Set (à 0,25 mL par site d’injection) au sein de 10-30 s (Figure 2E), tandis que lentement et doucement se rétracter l’aiguille pendant l’injection pour augmenter l’étendue du myocarde traités.
    1. Utilisez InI 10 % (v/v) dilué dans du PBS de normalisation de la technique et comme un traceur sur place tout en acquérant des compétences, aussi bien quant à confirmer le succès ciblant tous les quatre sites de IMI dans le myocarde de la pathologie et l’histopathologie (voir Représentant des résultats). Lorsqu’on atteint les compétences, InI pourrait être remplacé par un agent de contraste ultrasonore commercial adapté si vous le souhaitez.
      NOTE : Remise de 10 % (v/v) InI dilué dans du PBS avec ou sans cellules dans la donne myocarde transmural hyperechogenicity (c.-à-d., écho aspect brillant) sur le site de cible d’injection (Figure 2E, F). Transitoire décélération ou accélération du rythme cardiaque, associé à des contractions ventriculaires prématurées (p. ex., isolé, distiques et les triplés) sont fréquemment observés dès le premier contact de l’aiguille avec l’épicarde ainsi que pendant ou peu après l’IMI. Toutefois, aucune arythmie mortelle n’est élaborées et des effets indésirables aigus sont rarement observés en utilisant jusqu'à 0,25 mL (1,25 x 106 cellules) d’injection co-Set par site d’injection IMI (voir Représentant résultats et Discussion).
  8. Effectuer des changements subtils dans l’angle d’incidence de l’aiguille comme nécessaire pour terminer les injections de 0,25 mL pour chacun des sites de IMI quatre cible (trois dans la ventricule gauche libre mur (LVFW) et celui de l’IVS).
  9. À l’issue de la procédure d’IMI guidée par échocardiographie de contraste percutanée, évaluer le rythme cardiaque (par exemple, par le biais de série ECG trace et/ou 24h Holter ECG) et effectuer des analyses échocardiographiques fenêtre pour vérifier l’absence de complications, jusqu'à ce que l’animal est complètement remis de l’anesthésie et seulement puis transfert à un cycle de lumière ambiante.
    1. Ici, nous utilisons 24h Holter ECG pour surveiller les effets de l’IMI avec InI sur le rythme cardiaque pendant 24 h. Pour ce faire, nous avons comparé un groupe de 6 lapins avec phénotype normal (groupe Normal) et un groupe de 6 lapins ayant reçu l’administration intraveineuse de la doxorubicine (cardiotoxiques anthracycline médicament a, couramment utilisé pour le traitement du cancer ; Groupe DOX) à une dose de 2 mg/kg/semaine pendant 8 semaines et ensuite les deux cohortes reçu IMI avec InI.

Figure 2
Figure 2 . Injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique chez le lapin. (A) mise en place de la sonde dans l’hémithorax droite selon un angle de ~ 90 °. (B) image représentative d’une vue d’axe court parasternale (PSSX) du cœur au niveau des muscles papillaires chez le lapin. (C) l’alignement de l’aiguille à un angle de ~ 90 ° par rapport à la marque de l’orientation du transducteur. (D) emplacement de l’aiguille sur le site de cible dans une vue PSSX du cœur (à noter que l’aiguille est facilement visualisée dans le plan du faisceau ultrasonore). (E et F) démonstration de hyperechogenicity sur le site cible sur intramyocardique injection avec l’encre de Chine (pointes de flèches en surbrillance la hyperechogenicity transmurale). Situation accidentelle (G) l’aiguille dans la chambre de LV (pointes de flèches en surbrillance le puits d’aiguille). (H) de repositionnement de l’aiguille de la paroi libre du LV (pointes de flèches en surbrillance le puits d’aiguille). RV = ventricule droit ; LV = ventricule gauche ; IVS = septum interventriculaire ; PW = paroi postérieure ; AL = antérolatérale muscle papillaire ; PM = périostite muscle papillaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. publier des Analyses IMI

  1. Effectuer une analyse histopathologique des échantillons de tissu cardiaque de lapins.
    1. Fixer le tissu pendant 24 h dans 10 % de formaldéhyde, puis par déshydratation avec l’augmentation des concentrations d’éthanol comme suit :
      • 1 x à 70 % (60 min)
      • 1 x dans le 95 % ethanol/5% méthanol (60 min)
      • 1 x à 100 % (60 min)
      • 1 x à 100 % (90 min)
      • 1 x à 100 % (120 min)
      Remarque : Tous les incubations ci-dessus sont effectuées à température ambiante (RT). Puis, remplacer par deux fois avec 100 % de xylène (1 h, RT) et enfin incorporez à la paraffine en deux étapes (60 min, 58 ° C)25.
    2. Effectuer des coupes de tissu de 4 à 5 µm avec un microtome25. Monter les sections sur les diapositives.
    3. Effectuer la coloration à l’hématoxyline-éosine et méthodes trichrome de Masson25,26,27.
  2. Dans des sections de tissu des coeurs transplantés, exécutez immunohistochemistry pour détecter les cellules EGFP(+) HEK-293 (p. ex., en utilisant la méthode de (ABC) complexe avidine-biotine), brièvement :
    1. La cire coupes de coeur épais de 4 à 5 µm à 100 % de xylène (10 min, à ta). Réhydrater les tissus en le lavant avec une diminution de solutions éthanoliques concentration (x 2 à 100 % (2 min) 2 x dans 95 % (2 min) 1 x à 70 % (2 min) ; 1 x à 50 % (2 min) ; 1 x dans 30 % (2 min) ; 1 x ddH2O (2 min)) à température ambiante.
    2. Effectuer l’inhibition peroxydase endogène en couvrant les sections avec 100 µL de 3 % H2O2 dilué dans du méthanol (préparé avec 5 mL de solution mère de 30 % de H2O2et ajout de méthanol vers le haut pour un volume total de 50 mL) ( incuber 30 min, RT) et ensuite lavage par immersion avec une solution saline tamponnée de Tris (SCT ; pH 7,6).
    3. Effectuer l’antigène mise à nu par traitement enzymatique, en couvrant les sections avec 100 µL de 0,1 % la Pronase (préparée avec 0,01 g la Pronase diluée dans 10 mL TBS) (12 min, RT d’incubation), puis laver avec le SCT (5 min, RT).
    4. Incuber en bloquant la solution (sérum de chèvre normal à 10 % au SCT) à l’aide de 100 µL par glisser (30 min, RT) et le laver avec le SCT (5 min, RT).
    5. Incubez avec protéines fluorescentes poulet anti-verte (GFP) comme anticorps primaire (1/500 au SCT) (1 h, 30 ° C) et laver avec le SCT (5 min, RT).
    6. Incubation avec l’anticorps secondaire biotinylé chèvre-anti-poulet IgG (1/250 au SCT) (1 h, 30 ° C) et laver ensuite avec le SCT (5 min, RT).
    7. Incubez avec complexe avidine-biotine (20 min, 30 ° C) et alors l’étiquette à l’aide de tétrahydrochlorure 3,30-diaminobenzidine (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Enfin, déshydrater par lavage dans l’augmentation des concentrations d’éthanol (1 x à 30 % (2 min) ; 1 x à 50 % (2 min) ; 1 x à 70 % (2 min) ; 2 x dans 95 % (2 min) x 2 à 100 % (2 min)) à ta, contre-colorant sections à l’aide de la méthode de l’hématoxyline-éosine25et puis monter les lames de la couverture. Inclure le positif, négatif, ainsi que de l’isotype contrôles.
      Remarque : Le protocole bref décrit ci-dessus n’est pas prévu pour usage général immunohistochimie ; optimisation pour les tissus d’intérêt et conditions est nécessaire.

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Representative Results

IMI du contraste percutanée guidée par échographie avec InI :

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, et une fois le positionnement optimal de la pointe de l’aiguille a été confirmé par échocardiographie et l’injection initié, transmurale hyperechogenicity a été observée lors de la livraison de l’InI (10 % v/v dans du PBS) (Figure 2E) , aussi bien que peu de temps après l’IMI à la région de cible (Figure 2F). Alors IMI a été immédiatement suivie de l’euthanasie et le coeur enlevé, dépôts de InI sont facilement visibles lors d’un examen externe du cœur (Figure 3 a). En outre, cœur des sections de tissu, par exemple, l’article axe court au niveau des muscles papillaires (Figure 3 b), a révélé transmurale dépôts de InI colorant au site d’injection, ce qui prouve la livraison efficace des injection de co-Set dans le myocarde en utilisant cette technique. De note, la hyperechogenicity transmurale observée in vivo au cours de l’IMI (Figure 2E, F), corrélé avec dépôts transmurale de InI spécimens ex vivo (Figure 3 a, B). Ceci a clairement démontré que InI a deux propriétés dans le cadre de l’IMI : comme un agent de contraste en vivo échographie, mais aussi un traceur ex-situ de vivoin . Ces deux propriétés font InI, un agent de contraste ultrasonore très polyvalent et peu coûteux, en particulier pour la formation au cours de l’acquisition de compétences dans cette technique. Ainsi, les propriétés d’échogène de InI permettent de surveiller les IMI par exemple, déterminer le succès IMI versus intra-chambre accidentelle ou l’injection de l’espace péricardique et, lorsque cela est nécessaire, étant donné les capacités d’imagerie en temps réel des ultrasons, de faire corrections de l’aiguille le suivi en temps réel (Figure 2, H). En revanche, les capacités de suivi in situ de InI sont de valeur pour localiser l’injection co-Set ex vivo des spécimens du myocarde cible.

IMI du contraste percutanée guidée par échographie avec cellules HEK-293 InI et EGFP(+) :

Avant IMI, transfection réussie des cellules EGFP(+) HEK-293 a été confirmée par la microscopie en fluorescence lors de conditions de culture in vitro (Figure 3). La réalisation des cellules EGFP(+) HEK-293 dans le myocarde a été démontrée par l’analyse immunohistochimique des sections de tissu cardiaque où InI dépôts ont été observés. Ainsi, à l’aide de la méthode complexe avidine-biotine (Voir l’étape 4.2), abondante EGFP(+) HEK-293 cellules ont été identifiées dans le myocarde entrecoupé de dépôts InI (Figure 3D). Dépôts de InI étaient toujours observés 24h après IMI dans des échantillons de tissu myocardique de lapins ayant reçu InI en combinaison avec des cellules EGFP(+) HEK-293 (Figure 3E), ou InI seul (Figure 3F). À noter, une réaction inflammatoire aiguë a été observée à ce point dans le temps avec un infiltrat de neutrophile prédominant, dans des échantillons provenant d’animaux ayant reçu des cellules EGFP(+) HEK-293 (Figure 3E), ce qui suggère un rejet cellulaire aigu. En revanche, les macrophages ont été observés chez les animaux recevant InI seul (Figure 3F).

Figure 3
Figure 3 . In situ evaluation macroscopique et histopathologique et traçage d’injection co-Set. (A) la démonstration de la présence d’injection co-Set examen externe d’un cœur excisé suivant IMI avec InI (pointes de flèches en dégager les points d’injection). (B) démonstration de distribution transmurale d’injection co-Set suite IMI avec InI dans une coupe transversale du cœur au niveau des muscles papillaires (pointes de flèche bleues mettez en surbrillance le transmurale InI dépôt ; flèche blanche met en évidence un dépôt visible de InI à l’IVS). (C) Autofluorescence in vitro des cellules EGFP(+) HEK-293 microscopie de fluorescence. (DF) Analyse histopathologique des sites injectées. Les cellules EGFP(+) sont visiblement entrecoupés de InI des dépôts dans le myocarde à 0 h (D) et 24 h (E) poste IMI (pointes de flèche bleues mettre en évidence les cellules EGFP(+) ; flèches rouges soulignent la présence de polynucléaires neutrophiles). Dépôts de InI intercalés dans le myocarde après 24 h (F) suite IMI avec InI seul (flèches bleues mettre en évidence la présence de macrophages). RV = ventricule droit ; LV = ventricule gauche ; IVS = septum interventriculaire ; IMI = intramyocardique injection ; InI = l’encre de Chine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Après avoir effectué plus de 60 contraste percutanée guidée par échocardiographie IMI procédures à ce jour, nous croyons qu’avec une attention particulière aux détails et bonne maniabilité animale et soins, la procédure est généralement bien tolérée, et complications aiguës sont très rares et généralement bénins. En général, chez les animaux qui subissent IMI, l’observation plus fréquente pendant et peu après que la procédure est transitoire accélération ou décélération du rythme cardiaque, associé à complexes ventriculaires prématurés isolés (PVC) (Figure 4 a). Ainsi, 24h Holter ECG de surveillance des animaux ayant reçu uniquement par l’intermédiaire de IMI, InI a révélé que l’arythmie plus souvent détectée (nombre total d’épisodes dans les 24 heures) a été isolé en PVC, même si un nombre plus élevé d’épisodes ont été détecté chez les animaux qui ont été précédemment traités par DOX pendant 8 semaines (Figure 5 a). PVC dans les couplets et les triplés semblent être moins fréquentes (Figure 4 b, C et Figure 5 b, C), même si les triplés sont beaucoup moins fréquents dans DOX-traités que chez les lapins normaux non traitées (Figure 5). En revanche, la tachycardie ventriculaire non soutenue (NSVT) a été plus fréquemment observée chez les animaux normaux (Figure 4 et Figure 5). Significativement, alors que la fréquence cardiaque moyenne n’était pas différente entre DOX et groupes Normal après avoir reçu les IMI avec InI seul (Figure 5E), l’écart de l’intervalle R-R normal (données), a été significativement réduite (< 100 ms) dans le (groupe DOX Figure 5F). Les données sont une mesure non linéaire de l’état de santé cardiaque, et donc ce résultat indique que le groupe DOX a globales altérations dans son état physiologique cardiaque.

Figure 4
La figure 4. Des arythmies ventriculaires observées durant 24h Holter suivi chez les lapins ayant reçu IMI avec InI. Les images montrées sont les captures d’écran provenant de Holter ECG tachograms affichent sur l’écran lors de l’analyse hors ligne et illustrent des exemples représentatifs des types plus courants des arythmies trouvés durant 24 h de surveillance. (A) isolée PVC. (B) PVC dans les Couplets. (C) PVC en triolets. NSVT (D). PVC = contractions ventriculaires prématurées ; NSVT = tachycardie ventriculaire non soutenue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Arythmiques événements détectés par 24h Holter ECG de surveillance suite à IMI avec InI chez le lapin. Nombre total de PVC isolé (A), PVC dans les couplets (B), PVC en triolets, (C) et NSVT (D), chez des lapins non traitées (Normal + IMI) par rapport aux traités à la doxorubicine (3 mg/kg/semaine pendant 6 semaines) lapins (DOX + IMI), après IMI avec InI. Moyenne de fréquence cardiaque (E) et données (F), chez les lapins de Normal + IMI et DOX IMI groupes après IMI avec InI. Données sont exprimées en moyenne ± SEM. * indique p < 0,05 ; et # indique p < 0,01, comparant Normal + IMI contre le DOX + IMI groupes par t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’objectif principal était de développer une technique mini-invasive qui pourrait être utilisée pour la livraison des cellules souches dans le myocarde de lapins (un grand taille animal modèle préclinique)17,18, tout en profitant de l’utilisation d’un relativement peu coûteux d’imagerie système facilement disponible dans de nombreuses cliniques et centres de recherche. Ici, nous montrons que, en utilisant un système d’échocardiographie clinique, et aidé par l’InI, un agent largement disponible, avec les capacités de suivi in situ et échogène propriétés, succès contraste percutanée guidée par échocardiographie IMI est très efficace dans la prestation injection co-Set de régions cibles du lapin coeur. Pour autant que nous savons, c’est la première description d’un contraste percutanée guidée par échocardiographie IMI et cellule livraison dans un modèle animal grand comme le lapin18,19. Tandis que InI a été utilisé précédemment dans des études in situ la localisation d’injection co-Set intérieur tissus7,28, c’est à notre connaissance, la première description des propriétés de cet agent doubles comme un en vivo agent de contraste ultrasonore et comme un traceur in situ d’injection co-Set ex vivo. En effet, des mélanges complexes d’agents de contraste et in situ remonter les substances précédemment ont été décrites dans murins études visant à fournir des injectates dans le myocarde29. Toutefois, étant donné les propriétés échogène de l’InI et ses capacités de suivi in situ , cette substance pourrait être très utile lors de l’acquisition de compétence tout en suivant une formation avec cette technique.

Confirmation de livraison de l’injection de co-Set contenant les deux InI aussi bien que les cellules EGFP(+) HEK-293 par immunohistochimie démontre l’applicabilité de cette technique à la recherche préclinique vise à la thérapie de cellules souches. Un IMI de InI en conjonction avec EGFP(+) HEK-293 a entraîné une réaction inflammatoire aiguë avec un infiltrat de neutrophile prédominant, suggérant une réponse de rejet cellulaire aigu (moins de 24 h) aux cellules xénogéniques. Cette réponse n’est probablement pas surprenante chez un animal immunocompétent. En revanche, un IMI avec InI seul a également suscité une réaction inflammatoire aiguë (dans les 24h) dans le tissu myocardique traité, qui présentaient une infiltration de macrophages prédominant. Ceci est conforme à l’observation d’une inflammation aiguë décrit dans des études précédentes suite IMI sous vision directe dans un thorax ouvert procédure4,30,31,32,33. Inflammation aiguë a également été observée après injection de sérum physiologique ou des solutions de PBS dans le myocarde34,35et même dans les muscles gastrocnémiens du rat36, et par conséquent cette réponse a été attribué à la lésion tissulaire directe plutôt qu’à l’injection co-Set en soi. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 en effet, la société internationale pour la recherche translationnelle cardiovasculaire reconnaît la présence commune de l’inflammation dans le cadre de l’IMI, mais il n’y a pas de consensus quant à l’opportunité ou non mesures visant à réduire ce processus au cours de la PERI-procédure temps sont utiles (par exemple, les corticostéroïdes par voie intraveineuse (I.V.))37. Même si l’inflammation dans la présente étude sont imputables également pour diriger la lésion tissulaire, les résultats suggèrent aussi que InI comme un corps étranger doit également jouer un rôle dans ce processus, a fourni un certain nombre de macrophages semblent être phagocytose InI (Figure 3F). Une analyse approfondie des effets fonctionnels de cette inflammation aiguë secondaire à l’IMI dans le cœur, ou si oui ou non ces peuvent être améliorés par l’intermédiaire de l’administration de médicaments prophylactiques tels que les corticostéroïdes déborde le cadre de ce manuscrit. Néanmoins, les contraste percutanée guidée par échocardiographie IMI à quatre régions cibles du myocarde, avec un volume d’injection co-Set allant jusqu'à 0,25 ml (1,25 x 106 cellules) par site IMI, a été très bien toléré chez le lapin.

Avec plus de 60 interventions effectuées à ce jour, et après que la compétence a été atteint, la mortalité secondaire par rapport à la procédure était très faible. Par exemple, aucun décès n’est survenu dans les deux cohortes décrits à l’étape 3.9 (groupes Normal et DOX) après IMI. En effet, à ce jour après que 67 IMI procédures effectuées dans le cadre d’un programme de recherche, nous avons eu seulement deux décès directement liés à la procédure (2,9 % de mortalité). Dans l’un d'entre eux, la présence d’un hemopericardium a été démontrée lors de l’examen post-mortem , tandis que l’autre développé des signes cliniques neurologiques, compatibles avec une ischémie cérébrale aiguë secondaire à un événement cardioembolic, ce qui nécessite une point final sans cruauté. Ce taux de mortalité (2,9 %) est significativement plus faible que celui rapporté par Lu et al. (11 %)8 et Mu et coll. (27 %)38, chez les lapins ayant reçu IMI sous vision directe dans une procédure à thorax ouvert. Ainsi, nous considérons la procédure décrite dans la présente étude pour être sûr, et nous utilisons cette technique dans les études en cours pour évaluer la thérapie à base de cellules souches dans un modèle de lapin de l’AICM avec résultats prometteurs39,40.

Il y a plusieurs haltes pour un succès percutanées IMI guidée par échocardiographie de contraste. Tout d’abord, veiller à ce que vue parasternale axe court au niveau des muscles papillaires est obtenue avec une délimitation claire des contours endocardiques et épicardiques. Ensuite, assurez-vous que la pointe de l’aiguille est dans le champ de vision à tout moment une fois que cela est entré dans la cage thoracique et le myocarde à empêcher la remise accidentelle dans l’espace péricardique ou chambre de LV. Puis, assurez-vous de maintenir au minimum le nombre de passages à travers la cage thoracique et dans le péricarde et le myocarde, puisque le risque de traumatismes locaux (p. ex., lacération) pourrait porter à ces structures et le risque associé de hemopericardium. Pour ce faire, tout en maintenant l’aiguille dans la cavité thoracique (et pour certains sites cibles, au même point d’entrée dans le péricarde viscéral (p. ex., paroi latérale)), soigneusement effectuer des changements subtils dans l’angle d’incidence de l’aiguille. Enfin, utilisez toujours une aiguille qui possède un passage clair et facile à travers la peau dans la cavité thoracique, évitant ainsi les biseaux aiguille émoussée d’entrer dans le myocarde et causant des dommages importants.

La procédure décrite ci-après, permet non seulement la livraison fiable et performant d’injection co-Set à plusieurs sites de cible dans le myocarde, mais elle permet également la correction de la trajectoire de l’aiguille en temps réel, empêchant ainsi (livraison) intrachamber accidentelle La figure 2, H). Tandis que fermé procédures IMI poitrine ont été décrites précédemment chez la souris, il y a plusieurs limites inhérentes à ce petit modèle animal. Ces limites incluent le nombre de régions cibles du myocarde se prêtent à la thérapie et le faible volume/nombre de cellules qui peuvent être injectés par cible site29,41. En outre, livraison précise de l’injection de co-Set est souvent une préoccupation, avec un taux de réussite proche de 60-70 %42, et par conséquent l’utilisation de systèmes à ultrasons moins largement disponibles haute fréquence est habituellement exigé29,41, 42. Ces systèmes sont équipés de transducteurs de rangée linéaire qui possèdent également des limitations inhérentes d’imagerie (p. ex., réverbération est un artefact fréquent)14. Une autre limitation des petits modèles de rongeurs comme les souris et les rats, est leurs différences intrinsèques au système de transport Ca+ 2 et de l’électrophysiologie cellulaire, qui diffère de celle des humains et de grandes tailles modèles animaux comme les chiens, les porcs et les lapins 15,16,43. Toutes ces limitations créent souvent des difficultés à traduire les conclusions de ces modèles à l’infirmerie sans confirmation préalable dans un modèle animal grand.

Un suivi attentif de l’animal dans la période péri-procédure est obligatoire selon les orientations contemporaines pour le soin des animaux de laboratoire. Comme indiqué ici, cela pourrait se faire par échocardiographie série fenêtre scans et tracés ECG, au moins jusqu'à ce que l’animal est réveillé de l’anesthésie. Les effets aigus de l’IMI sur le rythme cardiaque aussi peuvent être surveillés par 24h Holter ECG et notre pratique courante. À noter, les arythmies plus fréquents ont été isolés en PVC, qui sont relativement bénignes dans la nature, et qui ont été plus fréquents chez les animaux qui ont été traités avec la doxorubicine avant IMI avec InI (voir Figure 4 a et Figure 5 a). Autres arythmies qui étaient relativement moins fréquents comprennent : PVC en distiques ; PVC en triolets ; ainsi que NSVT (voir Figure 4 bD etDde la Figure 5 b). Toutefois, aucun arythmies menaçant la vie tels que la tachycardie ventriculaire soutenue ont été observés. À noter, nous avons également constaté que certaines manifestations cardiotoxiques dans le groupe DOX pouvaient être détectées par Holter ECG de surveillance, à l’aide de variables fréquentiel temps de variabilité du rythme cardiaque (VRC) comme données. Ainsi, une réduction données (Figure 5E, F), une mesure linéaire de l’état de santé cardiaque, a été observée dans le groupe DOX comparé au groupe Normal. Il s’agit du premier rapport du VRC réduite, comme en témoigne une données réduite, dans le contexte d’un lapin, modèle de l’AICM, qui est conforme à l’observation qui réduit les données est un puissant prédicteur indépendant de mortalité cardiaque chez les patients atteints HFrEF44 ,45,46. Les altérations de données dans le groupe DOX ne sont probablement pas liées à la procédure IMI lui-même ; Néanmoins, la confirmation de ces résultats chez les lapins recevant la doxorubicine, ainsi que les animaux normaux qui ne reçoivent pas de IMI, est nécessaire. Si des données réduite en HFrEF pourraient également être améliorée et donc utilisé comme une mesure de substitution de l’avantage de la thérapie de cellules souches basé, il reste à évaluer, et fera l’objet de la recherche future.

Plusieurs itinéraires de livraison des cellules dans le cœur ont été explorées, y compris par voie intraveineuse, intracoronaire et intramyocardique livraison ; Toutefois, le trajet intramyocardique tels qu’utilisés ci-après, il apparaît constamment le plus haut niveau de la cellule rétention tarifs1,2,3,4,5,37. On n’a pas évalué les taux de rétention cellulaire dans les études présentées ici, car la méthode utilisée n’est pas robuste et assez précis pour quantifier cette in vivo ou ex vivo, qui est une limitation de cette étude. Au lieu de cela, nous avons utilisé EGFP(+) HEK-293 cellules dont les caractéristiques phénotypiques nous a permis de distinguer facilement la présence de ces cellules dans le myocarde, indiquant ainsi la livraison intramyocardique réussie. Toutefois, l’objectif principal était de développer une technique mini-invasive par lequel nous pourrions effectuer livraison IMI et cellulaire dans le myocarde d’un grand taille modèle préclinique de cardiomyopathie non ischémique. Comme le montre la Figure 2 et Figure 3, cela a été accompli pour la première fois par percutanée IMI guidée par échocardiographie de contraste. D’autres études sont nécessaires pour évaluer les taux de rétention cellulaire mais aussi aucun risque les effets bénéfiques des cellules souches livrés dans le myocarde en utilisant la procédure décrite dans les présentes ; Ces études sont actuellement en cours. Récemment, nous avons communiqué des résultats prometteurs en ce qui concerne les effets fonctionnels39,40.

Par rapport à l’IMI dans une procédure à thorax ouvert, un contraste percutané guidée par échocardiographie IMI dans un modèle préclinique grand comme décrit dans cette étude, est nettement moins invasif dans la nature avec un rétablissement rapide de l’animal suivant la procédure et, comme mentionnées ci-dessus, est également plus faible mortalité taux8,38. Une autre approche à l’IMI est axée sur le cathéter IMI, qui a également été testé dans des modèles précliniques et plusieurs petits essais cliniques (pour une revue, voir Sheng et al.) 47. avec cette approche, un cathéter est avancé dans la cavité de LV et puis placé à sites cibles au sein de l’endocarde. Ces sites cibles doivent que soit identifiée avant l’intervention, par exemple, à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique cardiaque (CMR) contraste48, ou au cours de la procédure, par exemple, par cartographie endocardique électromécanique (EEM), clairement différencier le myocarde viable avant injection49. Cette dernière approche est moins invasive par rapport pour ouvrir la poitrine IMI sous vision directe, qui est un avantage évident. Aussi, puisque l’IHD chez l’être humain a une répartition inégale, ESEE contribue à diriger la thérapie spécifiquement aux sites viables du myocarde, qui est particulièrement important dans le cadre de l’IHD. Cependant, un inconvénient majeur est l’induction des arythmies ventriculaires, qui sont une caractéristique commune à toutes les approches de l’IMI. Autres inconvénients incluent l’heure de procédure longue, fournissant des QU'ESEE est une technique très exigeante qui nécessite une formation approfondie et un risque de perforation cardiaque. En revanche, contraste percutanée guidée par échocardiographie IMI comme décrit dans cette étude, est techniquement moins exigeant que IMI axée sur le cathéter, et, une fois que la compétence est atteint, elle peut être réalisée en toute sécurité au sein de 25 min après l’anesthésie. De même, étant donné qu’une courte partie de l’aiguille est avancée dans le myocarde, il est un plus faible risque de perforation cardiaque, si lacération cardiaque est toujours possible.

En conclusion, la technique percutanée contraste guidée par échocardiographie IMI décrite dans cette étude dans un modèle animal grand, comme le lapin16,43, est sûr, bien toléré et efficace dans la réalisation de l’injection de co-Set dans la coeur. Par conséquent, elle constitue une stratégie prometteuse pour des tests d’hypothèse préclinique des effets cardiaques Therapeutics régénératrice dans la cardiomyopathie non ischémique (p. ex., AICM), y compris, mais sans s’y limiter, sur les cellules souches de la thérapie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz et Manuel Molina excellent soutien apporté lors de la collecte des données et Carlos Bueno pour fournir les cellules EGFP(+) HEK-293. Ce travail a été soutenu en partie par : Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Espagne (JT) (numéro de licence : 11935/PI/09) ; Rouge de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, de VI PN j’ai + D + I 2008-2011 (subvention no. RD12/0019/0001) (JMM), cofinancé par les fonds structurels de l’Union européenne (FEDER) (JMM) ; et, de l’Université de Reading, Royaume-Uni (AG, GB) (financement Central). Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

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