Author Produced

PCI kontrast Echocardiography-guidede Intramyocardial injeksjon og celle levering i en stor prekliniske modell

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Romanen strategier i cardiac regenerativ medisin krever omfattende og detaljerte studier i store prekliniske dyremodeller før de kan bli vurdert for bruk i mennesker. Her viser vi en PCI kontrast echocardiography-guidede intramyocardial injeksjon teknikk i kaniner, som er nyttig for hypotesetesting effekten av slike romanen terapi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Celle- og gene terapi er spennende og lovende strategier for cardiac regenerering i innstillingen av hjertesvikt med redusert utstøting brøkdel (HFrEF). Før de kan bli vurdert for bruk og implementert i mennesker, trengs omfattende prekliniske studier i store dyr modeller for å vurdere sikkerhet, effekt, og skjebnen til injectate (f.eks, stamceller) en gang levert i myokard. Liten gnager modeller har fordeler (f.eks, kostnadseffektivitet, amenability for genetisk manipulasjon); imidlertid oversette gitt iboende begrensninger av disse modellene, funnene i dette sjelden til klinikken. Omvendt, stor dyr modeller som kaniner, har fordeler (f.eks, lignende cardiac elektrofysiologi sammenlignet med mennesker og andre store dyr) samtidig som det beholder en god kostnadseffektivt balanse. Her viser vi hvordan du utfører en PCI kontrast echocardiography-guidede intramyocardial injeksjon (IMI) teknikk, som er minimal invasiv, sikker, godt tolerert og svært effektiv målrettet levering av injectates, inkludert celler, i flere steder i myokard en kanin modell. For gjennomføringen av denne teknikken, har vi også tatt nytte av en utbredt klinisk echocardiography system. Etter å sette i praksis protokollen beskrevet her, en forsker med grunnleggende ultralyd kunnskap vil bli kompetent i utførelsen av denne allsidige og minimal invasiv teknikken for rutinemessig bruk i eksperimenter, rettet mot hypotesetesting av den funksjoner av cardiac regenerativ therapeutics i kanin modellen. Når kompetanse er oppnådd, kan hele prosedyren utføres innen 25 min etter anaesthetizing kaninen.

Introduction

Celle-og genet er spennende og stadig utvikle strategier for å regenerere/reparere skadet myokard i HFrEF. Noen studier har sammenlignet effekten (f.eks, celle oppbevaring rate) av de ulike rutene celle leveringsdatoen, som har konsekvent vist IMI overlegenhet over intracoronary eller intravenøs ruter1,2 , 3 , 4 , 5. dermed, er det ikke overraskende at en stor andel av studier av translasjonsforskning modeller av stilk cellen terapi for skadde myokard, leverer injectate via IMI utført under direkte visning i en åpen kiste prosedyren6,7 . Denne tilnærmingen har imidlertid flere begrensninger, inkludert invasiv art på prosedyren, som bærer risikoen for peri-prosedyremessige dødelighet (ofte underrapportert)8. I tillegg en IMI under direkte utsikt ikke eliminere muligheten for utilsiktet injeksjon i ventrikkel hulrom. I praksis kan en IMI under åpne bryst kirurgi være en hensiktsmessig metode for terapeutisk celle levering, f.eks, under Koronar bypass graft operasjon (CABG); men kanskje denne tilnærmingen ikke passer for cellen levering i globale kardiomyopati ikke-iskemiske opprinnelse (f.eksHFrEF sekundært til anthracycline-indusert kardiomyopati (AICM)).

Det er ingen tvil om at iskemisk hjertesykdom (IHD) er den vanligste årsaken til HFrEF (~ 66%)9,10; ikke-iskemiske kardiomyopati, inkludert AICM, påvirker imidlertid fortsatt et betydelig antall pasienter med HFrEF (33%)9 . Faktisk har nylige fremskritt i clinical oncology resultert i mer enn 10 millioner overlevende av kreft i USA alene11, med anslag over like mange i Europa, samsvar med en generell trend mot bedre overlevelse av pasienter12 ,13. Dermed gitt exploring fordelene av romanen terapi som stilk cellen transplantasjon for ikke-iskemiske kardiomyopati, samt trialing en effektiv og minimal invasiv rute stamcelleforskningen leveringsdatoen er av største betydning, økende antall pasienter påvirket av Kardiotoksisitet sekundær anticancer narkotika.

Av notatet innebærer hypotesetesting studier med stilk cellen terapi å reparer/regenerere skadet myokard ofte bruk av gnagere liten (f.eks, mus og rotter). Disse modellene krever ofte dyre høyfrekvent ultralyd systemer for evaluering av hjerteinfarkt funksjon, som regel utstyrt med lineær array transdusere som har noen iboende tilhørende begrensninger (f.eks, gjenklang)14. Men har andre modeller som kaniner, som representerer en stor prekliniske modell, noen fordeler for hypotesetesting av stilk cellen terapi i HFrEF. Således, i motsetning til rotter og mus, kanin opprettholde en Ca2 transportsystemet og mobilnettet elektrofysiologi som ligner mennesker og andre store dyr (f.eks, hunder og griser)15,16,17 ,18,19. En annen fordel, er deres amenability for cardiac ultralyd imaging bruker relativt billig og tilgjengelig klinisk echocardiography-systemer som er utstyrt med relativt høy frekvens fase matrise transduktorer, f.eks, 12 MHz, som de brukte i neonatal og pediatric kardiologi. Disse systemene tillater utmerket echocardiographic bildebehandling med toppmoderne teknologi, og de tar nytte av overlegenhet harmoniske imaging20. Videre omfattende hypotesetesting av potensialet i cardiac regenerativ Therapy (f.eks, stilk cellen terapi), deres sikkerhet, effekt, cardiomyogenic potensial, samt evaluering av skjebnen til injectate en gang levert til de myokard, er obligatorisk før de kan bli vurdert for menneskelig bruk, og de krever bruk av store prekliniske dyr modeller, for eksempel kanin17,19. Her beskriver vi en minimal invasiv teknikk for cellen levering via PCI kontrast-echocardiography guidet IMI bruker en klinisk echocardiography system, som er rettet mot stilk cellen transplantasjon-basert terapi for ikke-iskemiske kardiomyopati20 . Vi har også beskriver fordelene med blekk (InI, også kjent som Kina blekk) som en ultralyd kontrast agent og i situ tracer av injectate i kanin hjertet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter beskrevet her ble godkjent av etiske forskning for universitetet i Murcia, Spania, og ble utført i samsvar med direktiv 2010/63/EU til Europakommisjonen. Trinnene beskrevet ble utført under drift standardprotokoller som var en del av planen for arbeid og ikke utført utelukkende for å filme på videoen til dette dokumentet.

1. forberedelse av celler og pattedyr uttrykk vektor

Merk: Her, vi kort beskrive en protokoll for utarbeidelse og hva en celle linje (menneskelige embryonale nyre 293 (HEK-293)); men bør aktuelle cellen bestemte protokoller for celle type interesse være optimalisert (f.eksstamceller).

  1. Opprettholde HEK-293 celler i høy glukose Dulbecco modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 10% fosterets kalv serum (FCS), 1% natrium pyruvate, 2 mM glutamin, 1% penicillin/streptomycin, og inkubert på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 . Når cellene er sub confluent, delt i forholdet 1:3.
  2. Start dele cellene av aspirating media, så vask en gang med sterilt fosfat bufret saltvann (PBS), fjerne overflødig PBS og deretter ruge med 2,5 mL 0.5 x Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (5 min, 37 ° C).
    1. Legge ett volum av DMEM media (supplert som beskrevet ovenfor) å stoppe reaksjonen, og deretter koble cellene av sakte og forsiktig aspirating opp og ned med en elektronisk pipette.
  3. Deretter overføre celle suspensjon til en egnet beholder (f.eks, 15 til 50 mL konisk sentrifuge rør). Virvel i en swing bøtte (100 x g), forkaste nedbryting og vask pellet to ganger med sterilt PBS.
  4. Resuspend pellets i frisk DMEM media og frø på en aktuelle cellen tetthet (f.eks, 1 x 106 celler i en 75 cm2 kolbe) i frisk kultur flasker eller store retter etter lokale laboratorium praksis.
    1. Erstatte eksisterende media med fersk media hver 2 dager.
      Merk: Uttrykket vektoren var avledet fra pIRES1hyg og brukes i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere21. p(EGFP) IRES1hyg ble generert av subcloning EGFP cDNA som en BamHI + NotI sett fra pEGFP-N1 inn i BamHI + NotI fordøyd pIRES1hyg21.
  5. 1 dag før transfection, cellene frø HEK-293 på en tetthet på 0,5 x 105 celler/cm2 i 12 - eller 24-godt vev kultur plater.
  6. Ved transfection, forberede DNA-lipid transfection reagens komplekser i separate 1,5 mL microcentrifuge rør (1 rør/vel).
    1. Begynn med å legge 250 µL av redusert serum medium i hver retning, og deretter legge 4 µg DNA (bland forsiktig).
    2. Deretter legge til 250 µL fra en tidligere utarbeidet blanding av 10 µL lipid transfection reagens og 250 µL av redusert serum medium, til hver tube (bland igjen forsiktig).
    3. Til slutt, fortsette med transfections, av rugende HEK-293 celler med DNA lipid transfection reagens komplekser 4 h, deretter erstatte med DMEM medium supplert som beskrevet ovenfor (trinn 1.1) og ruge for en annen 48 h. utføre stoff utvalg av stabil transfectants med 100 µg/mL hygromycin B.
  7. Løsne HEK-293 celler med trypsin som beskrevet ovenfor (trinn 1.2). Etter vask cellene i sterilt PBS, resuspend i en passende redskap (f.eks10% v/v InI i PBS), å oppnå en siste celle konsentrasjon av 5 x 106/mL.

2. utarbeidelse av kanin

Merk: Plasseringen av kaninen og svingeren for IMI er ikke optimal evaluere morfologi og funksjon av hjertet av dyret. Dermed er det tilrådelig å utføre en fullstendig echocardiographic eksamen20 før IMI (se nedenfor), og senere tidspunkt som definert av eksperimentell design. Dette mål å vurdere planlagt anatomiske og funksjonelle kjennetegnene hjertet i dyret som mottar en injeksjon, og også evaluere effekten, av IMI i funksjon av hjertet.

  1. Utføre denne undersøkelsen i en blendet mote og følge retningslinjene for Echocardiography komiteen av American College of Veterinary indremedisin og American Society for Echocardiography/europeisk Association for hjerte Imaging 22 , 23 , 24.
  2. Få en samtidige 1-avledningers elektrokardiogram (ECG) sporing gjennom hele echocardiographic studien.
  3. Bedøve kaninen med ketamin 10 mg/kg, kombinert med medetomidine 200 µg/kg, intramuscular (IM) injeksjon.
  4. Kontroller nivået av anestesi etter 10-20 min etter administrasjon av anestesi.
  5. Bruk en hårklipperen fjerne håret av brystet mye (f.eks, under halsen til sub xiphoid regionen) (figur 1A).
  6. Barbere flere regioner av 1-2 cm2 i interne ansiktet høyre forlemen (mediocubital område) og begge bakbeina (mediotibial område) (figur 1B).
  7. Plass selvklebende ECG elektrodene på regionene barbert av lemmer synkront overvåke hjerterytmen under prosedyren (figur 1 c).
  8. Plassere dyret i liggesår supine posisjon på en termisk teppe, med lemmer utstrakt med kirurgisk tape knyttet til tabellen (figur 1 c).
    1. Kontroller at ørene er flexed bakover bak hodet/kaninen, og på en posisjon som er lavere enn sin forelimbs, siden dette bidrar til å opprettholde riktig posisjonering thorax av dyr i hele denne prosedyren.
  9. Tillate dyr å puste spontant mens administrere oksygen av ansiktsmaske gjennom hele prosedyren (100%, 2-3 L/min).

Figure 1
Figur 1. Utarbeidelse av kaninen for IMI. (A) klippet hår fra syn; (B) klippet hår fra lemmer; (C) fest elektrodene og plassere kaninen med Ben utstrakt på en termisk teppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. PCI kontrast Echocardiography-guidede IMI teknikk i kaninen

  1. Rengjør og desinfiser huden av thorax med en chlorhexidine-basert løsning.
    1. Bruk en steril teknikk gjennom hele prosedyren, ifølge dagens beste praksis.
    2. Når det er mulig, og hvis mulig, utføre en fullstendig sterilt prosedyre, inkludert men ikke begrenset til, bruk av steril materiale som kjoler, hansker, kirurgisk såret gardiner, sterile dressing materiale for tabellen, i tillegg til et sterilt ultralyd svinger dekselet og sterile ultralyd gel. Dette vil redusere til et minimum risikoen ved å innføre patogener til dyret mottar IMI og er vanlig praksis i klinisk setting (f.eksunder cardiac punktering).
      Merk: Det anbefales alltid fortsette i tråd med lokale og nasjonale reguleringer av Forsøksdyrutvalget gjelder for lokale institusjonen og landet praksis.
  2. Gjelder ultralyd overføring gel til brystet og/eller svingeren og med svinger ledningen rundt eksperimentators halsen, skanner rask vinduet dyrets hjerte, som ofte er nyttig å visualisere anatomi og planlegge IMI.
  3. Plasser svingeren manuelt på 4th-6th interkostalrom plass, 2-3 cm fra høyre parasternal linjen med en vinkel av forekomst av ~ 90 ° med hensyn til høyre side av thorax veggen (figur 2A).
  4. Justere plasseringen av svingeren interkostalrom plass som sin anteroposterior og dorsoventral vinkel å optimalisere en modifisert kort aksen visning på nivå med papillary musklene. Identifisere i denne visningen høyre ventrikkel (RV), venstre ventrikkel (LV), interventricular septum (IVS), bakre veggen (PW), samt anterolaterale (AL) og posteromedial (PM) papillary muskler (figur 2B).
    1. Har et bredt synsfelt av betydelig økt dybden med den aktuelle kontrollen på systemet (f.eks, knapp, ekstern).
    2. Spesielt oppmerksom på å skaffe en symmetrisk bildet i denne visningen, i tillegg til aktuelle differensiering av endocardial og epicardial konturer, og Juster om nødvendig gjennom optimalisering disse (f.eksgevinst).
  5. Når optimal echocardiographic visning er oppnådd (figur 2B), opprettholde denne posisjonen gjennom resten av prosedyren, mens en andre operatør utfører IMI (se nedenfor).
    1. Mens du holder svingeren, unngå skjuler svinger retning merket, som skal alltid være vendt fremover, slik at justeringen med nålen i de etterfølgende trinnene (figur 2A, C).
  6. Med en 24-G nål knyttet til en 1 mL sprøyte, plassere nålen nær huden av den venstre hemithorax i en symmetrisk speiling posisjon med hensyn til svingeren. Deretter manuelt justere nålen med svinger retning merket i en vinkel på ~ 90° (figur 2C), og langsomt vil avansere nålen gjennom huden og i brystet hulrom.
    Merk: PCI nåleinnføring i denne posisjonen og orientering forenkler visualisering av nålen i flyet av ultralyd strålen (figur 2D, E) dermed gir sanntids overvåking og, når nødvendig, justering av plasseringen av nålen i forhold til målet regionen myokard (figur 2 G, H).
  7. Spissen på målplasseringen, sakte levere injectate (opptil 0,25 mL per injeksjonsstedet) innen 10-30 s (figur 2E), mens sakte og forsiktig trekke nålen under injeksjon for å øke omfanget av myokard behandlet.
    1. Bruke InI 10% (v/v) fortynnet i PBS for standardisering av teknikken, og som en i situ tracer mens anskaffe kompetanse, samt for å bekrefte vellykket målrettingsinnstillingene for alle fire IMI områdene i myokard brutto patologi og histopatologi (se Representant resultater). Når kompetanse er oppnådd, erstattes InI av en egnet kommersielle ultralyd kontrast agent Hvis ønskelig.
      Merk: Levering av 10% (v/v) InI utvannet i PBS med eller uten celler i myokard resultatene i transmuralt hyperechogenicity (dvs., ekko lyse utseende) på webområdet for injeksjon (figur 2E, F). Forbigående retardasjon eller akselerasjon av hjertefrekvensen, forbundet med tidlig ventrikkel sammentrekninger (f.eksisolert, verspar og trillinger) er ofte observert fra den første kontakten nålen med epicardium som under og/eller kort tid etter IMI. Men ikke livstruende arytmi utvikles og akutt bivirkninger er sjelden observert med opptil 0,25 mL (1,25 x 106 celler) injectate per IMI injeksjonsstedet (se Representant resultater og diskusjon).
  8. Utføre subtile endringer i vinkel av forekomsten av nålen som nødvendig for å fullføre injeksjoner av 0,25 mL til hver av de fire mål IMI nettstedene (tre venstre ventrikkel gratis vegg (LVFW) og i IVS).
  9. Etter ferdig med PCI kontrast echocardiography-guidede IMI prosedyre, vurdere hjerterytmen (f.eksgjennom føljetong ECG spor og/eller 24 h Holter EKG), og utføre føljetong vinduet echocardiographic søk for å bekrefte at komplikasjoner, før dyret er helt tilbake fra anestesi, og bare deretter overføre til et lys syklus.
    1. Her bruker vi 24 h Holter ECG for å overvåke effekten av IMI med InI på hjerterytmen 24 h. For dette sammenlignet vi en gruppe 6 kanin med normal fenotypen (Normal gruppe) og en gruppe 6 kaniner som fått intravenøs administrasjon av doksorubicin (et cardiotoxic anthracycline stoff, vanligvis brukes for behandling av kreft; DOX gruppe) på en dose av 2 mg/kg/uke i 8 uker, og deretter begge kohorter fikk IMI med InI.

Figure 2
Figur 2 . PCI kontrast echocardiography-guidede intramyocardial injeksjon i kaninen. (A) plassering av svingeren i den riktige hemithorax i en vinkel på ~ 90 °. (B) representativt bilde av en parasternal kort aksen visning (PSSX) av hjertet på nivå med papillary musklene i kaninen. (C) justeringen av nålen i en vinkel på ~ 90 ° i forhold til svinger retning merket. (D) plassering av pinnen på webområdet i en PSSX visning av hjertet (Merk at nålen er lett å visualisere i planet på ultralyd strålen). (E og F) demonstrasjon av hyperechogenicity på webområdet på intramyocardial injeksjon med blekk (pilspisser høydepunkt transmuralt hyperechogenicity). (G) ved beliggenhet nålen i LV chamber (pilspisser høydepunkt nål akselen). (H) Repositioning av nålen på LV gratis veggen (pilspisser høydepunkt nål akselen). RV = høyre ventrikkel; LV = venstre ventrikkel; IVS = interventricular septum; PW = bakre veggen; AL = anterolaterale papillary muskel; PM = posteromedial papillary muskel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. innlegget IMI analyser

  1. Utføre histopathological analyse av hjertet fra kaniner.
    1. Fikse vev for 24 h i 10% formaldehyd, etterfulgt av dehydrering med økende etanol konsentrasjoner som følger:
      • 1 x 70% (60 minutter)
      • 1 x 95% ethanol/5% metanol (60 minutter)
      • 1 x 100% (60 minutter)
      • 1 x 100% (90 minutter)
      • 1 x 100% (120 minutter)
      Merk: Alle de ovennevnte incubations er utført ved romtemperatur (RT). Deretter erstatte to ganger med 100% xylen (1 h, RT), og til slutt legge inn i parafin i to trinn (60 min, 58 ° C)25.
    2. Utføre 4-5 µm vev seksjoner med en mikrotomen25. Montere delene på lysbilder.
    3. Utføre flekk med hematoxylin-eosin og Masson's trichrome metoder25,26,27.
  2. I vev deler fra transplantert hjerter, utfører du immunohistochemistry for å oppdage EGFP(+) HEK-293 celler (f.eksved hjelp av avidin-biotin komplekse (ABC) metoden), kort:
    1. De voks 4-5 µm tykk hjertet inndelinger i 100% xylen (10 min, på RT). Rehydrate vev ved å vaske med minkende etanol konsentrasjon løsninger (2 x 100% (2 min), 2 x 95% (2 min), 1 x 70% (2 min), 1 x 50% (2 min), 1 x 30% (2 min), 1 x ddH2O (2 min)) på RT.
    2. Utføre endogene peroxidase hemming av dekker delene med 100 µL av 3% H2O2 fortynnet i metanol (forberedt med 5 mL 30% lager H2O2og legge metanol opp til et totalt volum på 50 mL) ( Inkuber 30 min, RT), og deretter vask ved nedsenkning med Tris bufret saltvann (SS, pH 7.6).
    3. Utføre antigen avsløre via enzymatisk behandling, ved å dekke delene med 100 µL av 0,1% Pronase (forberedt med 0,01 g Pronase fortynnet i 10 mL TBS) (Inkuber 12 min, RT), deretter vaske med TBS (5 min, RT).
    4. Inkuber i blokkering løsning (normal geit serum på 10% i TBS) bruker 100 µL per lysbilde (30 min, RT), og vask med TBS (5 min, RT).
    5. Inkuber med kylling anti-grønn fluorescerende protein (GFP) som primære antistoff (1:500 i TBS) (1 time, 30 ° C), og vask med TBS (5 min, RT).
    6. Inkuber med sekundær antistoff biotinylated geit-anti-kylling IgG (1:250 i TBS) (1 time, 30 ° C), og deretter vaske med TBS (5 min, RT).
    7. Inkuber med avidin-biotin kompleks (20 min, 30 ° C), og så merke bruker 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Til slutt mister vask i økende etanol konsentrasjoner (1 x 30% (2 min), 1 x 50% (2 min), 1 x 70% (2 min), 2 x 95% (2 min), 2 x 100% (2 min)) på RT, counterstain inndelinger ved hjelp av hematoxylin-eosin metoden25, og deretter montere dekke lysbilder. Inkluder positive, negative og isotype kontroller.
      Merk: Kort protokollen beskrevet ovenfor er ikke ment for de generelle immunohistochemistry bruk. optimalisering for vev av interesse er nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PCI kontrast Echocardiography-guidede IMI med InI:

Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor, og etter optimal plassering av spissen av nålen ble bekreftet av echocardiography og injeksjon startet, transmuralt hyperechogenicity ble observert under levering av InI (10% v/v i PBS) (figur 2E) , så vel som kort tid etter IMI målregion (figur 2F). Når IMI ble umiddelbart etterfulgt av euthanasia og hjertet fjernet, var forekomster av InI lett synlig på eksterne eksamen av hjertet (figur 3A). I tillegg viste hjertet vev seksjoner, f.ekskort aksen delen på nivå med papillary musklene (figur 3B), transmuralt innskudd InI fargestoff på injeksjonsstedet, dermed demonstrere vellykket og effektiv levering av injectate i myokard bruker denne teknikken. Av notatet, transmuralt hyperechogenicity observert i vivo under IMI (figur 2E, F) korrelert med transmuralt forekomster av InI i ex vivo prøver (figur 3A, B). Dette tydelig demonstrert at InI har to egenskaper i innstillingen av IMI: som en i vivo ultralyd kontrast-agent, samt en ex vivoin situ tracer. Begge disse egenskapene gjør InI en svært allsidig og rimelig ultralyd kontrast agent, spesielt for treningen oppkjøpet av kompetanse i denne teknikken. Således, echogenic egenskaper for InI hjelpe overvåke IMI f.eks, avgjøre vellykket IMI mot utilsiktet intra-kammer eller perikard plass injeksjon, og når nødvendig, gitt sanntid tenkelig evnene av ultralyd, å gjøre Korreksjoner av nålen spore i sanntid (figur 2 g, H). Derimot, er sporing i situ egenskapene til InI verdi å finne injectate i ex vivo eksemplarer av målet myokard.

PCI kontrast Echocardiography-guidede IMI InI og EGFP(+) HEK-293 cellene:

Før IMI, ble vellykket transfection celleområde EGFP(+) HEK-293 bekreftet av fluorescens mikroskopi under i vitro oppdrettsforholdene (Figur 3 c). Vellykket levering av EGFP(+) HEK-293 celler i myokard ble demonstrert via immunohistochemistry analyse av hjertet vev deler der InI innskudd ble observert. Dermed, med metoden avidin-biotin komplekse (se trinn 4.2), rikelig EGFP(+) HEK-293 cellene ble identifisert i myokard ispedd InI innskudd (figur 3D). Forekomster av InI var fortsatt observert 24 timer etter IMI i hjerteinfarkt vevsprøver fra kaniner mottatt enten InI i kombinasjon med EGFP(+) HEK-293 celler (figur 3E) eller InI alene (figur 3F). Av notatet, ble en akutt betennelsesreaksjon observert på dette tidspunkt, med en dominerende neutrophilic infiltrere, i utvalg fra dyr mottar EGFP(+) HEK-293 celler (figur 3E), dermed antyder akutt mobilnettet avvisning. På den annen side, ble makrofager observert i dyr mottar InI alene (figur 3F).

Figure 3
Figur 3 . In situ makroskopisk og histopathological evaluering og sporing av injectate. (A) demonstrasjon av tilstedeværelsen av injectate på eksterne eksamen en forbrukeravgift hjerte etter IMI med InI (pilspisser høydepunkt nettstedene til injeksjon). (B) demonstrasjon av transmuralt distribusjon av injectate etter IMI med InI i en tverrstilt delen av hjertet på nivå med papillary musklene (blå pilspisser markere transmuralt InI innskudd, hvit pil fremhever et synlig innskudd på InI på IVS). (C) Autofluorescence i vitro EGFP(+) HEK-293 celler med fluorescens mikroskopi. (D-F) Histopathological analyse av injisert nettsteder. EGFP(+) celler er synlig ispedd InI innskudd i myokard på 0 h (D) og 24 h (E) innlegg IMI (blå pilspisser utheve EGFP(+) celler, røde piler markere tilstedeværelsen av nøytrofile). Forekomster av InI ispedd i myokard på 24 h (F) etter IMI med InI alene (blå piler høydepunkt tilstedeværelsen av makrofager). RV = høyre ventrikkel; LV = venstre ventrikkel; IVS = interventricular septum; IMI = Intramyocardial injeksjon; InI = tusj. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Har utført over 60 PCI kontrast echocardiography-guidede IMI prosedyrer hittil, mener vi at med nøye oppmerksomhet på detaljer og gode dyr håndtering og omsorg, fremgangsmåten er generelt godt tolerert, og akutte komplikasjoner er svært sjeldne og vanligvis mild. Generelt, i dyr som gjennomgå IMI, den hyppigste observasjonen under og etter prosedyren er forbigående akselerasjon eller retardasjon av hjertefrekvens, forbundet med isolert tidlig ventrikkel komplekser (PVC) (figur 4A). Dermed 24 h Holter EKG overvåking av dyr som fikk InI alene via IMI, avslørte at hyppigste arrhythmia oppdaget (totalt antall episoder innen 24 timer) var isolert PVC, selv om et høyere antall episoder ble funnet i dyr som var behandlet med DOX i 8 uker (figur 5A). PVC verspar og trillinger synes å være mindre hyppige (figur 4B, C og figur 5B, C), selv om trillinger er betydelig mindre hyppige i DOX-behandlet enn i ubehandlet Normal kanin (figur 5C). På den annen side, ikke-vedvarende ventrikkel takykardi (NSVT) ble ofte observert i normale dyr (Figur 4 d og figur 5 d). Betydelig, mens den gjennomsnittlige hjertefrekvensen ikke var forskjellig mellom DOX og Normal grupper etter å ha mottatt IMI med InI alene (figur 5E), standardavviket for normal R-R intervall (SDNN), ble betydelig redusert (< 100 ms) i DOX gruppe ( Figur 5F). SDNN er et ikke-lineære mål på hjertet helsetilstand, og derfor dette resultatet indikerer at gruppen DOX har globale endringer i cardiac fysiologiske status.

Figure 4
Figur 4. Ventrikulær arytmi observert i løpet av 24t Holter overvåking kaniner som fikk IMI med InI. Bildene som vises hentes skjermbilder fra Holter EKG tachograms vises på skjermen under frakoblet analyse, og illustrerer representative eksempler på de vanligste typene arytmi funnet under 24 h overvåking. (A) isolert PVC. (B) PVC i Couplets. (C) PVC i trillinger. (D) NSVT. PVC = tidlig ventrikkel sammentrekninger; NSVT = ikke-vedvarende ventrikkel tachycardia. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Arrhythmic hendelser oppdages av 24 h Holter EKG overvåking etter IMI med InI kaniner. Totalt antall isolerte PVC (A), PVC i couplets (B), PVC i trillinger, (C) og NSVT (D), i ubehandlet kaniner (Normal + IMI) versus doksorubicin-behandlet (3 mg/kg/uke i 6 uker) kaniner (DOX + IMI), etter IMI med InI. Mener hjertefrekvens (E) og SDNN (F), i kaniner fra Normal + IMI og DOX + IMI grupper etter IMI med InI. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM. * angir p < 0,05; og # angir p < 0,01, sammenligne Normal + IMI versus DOX + IMI grupper av t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det primære målet var å utvikle en minimal-invasiv metode som kan brukes for levering av stamceller i myokard kanin (en stor størrelse prekliniske dyremodell)17,18, samtidig utnytter bruk av en relativt rimelig tenkelig system tilgjengelig i mange kliniske og forskning centers. Her viser vi at ved å bruke en klinisk echocardiography, og hjulpet av InI, en utbredt agent, med både i situ sporing evner og echogenic egenskaper, vellykket PCI kontrast echocardiography-guidede IMI er svært effektiv i å levere injectate til målet områder av kaninen hjertet. Så vidt vi vet, er dette den første beskrivelsen av en PCI kontrast echocardiography-guidede IMI og celle levering i en stor dyr modell som kanin18,19. Mens InI er brukt tidligere i studier i situ lokalisering av injectate i vev7,28, er dette vi vet, den første beskrivelsen av to egenskapene for denne agenten som en i vivo ultralyd kontrast agent og en i situ tracer av injectate ex vivo. Faktisk har komplekse blandinger av kontrast agenter og i situ stoffer som tidligere blitt beskrevet i murine studier levere injectates i myokard29. Imidlertid gitt echogenic egenskapene til InI og sine i situ sporing evner, kan dette stoffet være svært nyttig under kompetanse oppkjøpet mens gjennomgår trening med denne teknikken.

Bekreftelse av levering av injectate som inneholder begge InI som EGFP(+) HEK-293 celler ved hjelp av immunohistochemistry demonstrerer anvendelse av denne teknikken prekliniske forskning rettet mot stilk cellen terapi. En IMI av InI sammen med EGFP(+) HEK-293 resulterte i en akutt betennelsesreaksjon med en dominerende neutrophilic infiltrere, antyder en respons av akutt mobilnettet avvisning (innen 24 timer) på xenogeneic cellene. Dette svaret er sannsynligvis ikke overraskende i et immunkompetente dyr. På den annen side, skapt en IMI med InI alene også en akutt betennelsesreaksjon (innen 24 timer) behandlet hjerteinfarkt vev, som viste en dominerende macrophage infiltrere. Dette er i tråd med observasjon av akutt betennelse beskrevet i tidligere studier etter IMI under direkte visning i en åpen kiste prosedyren4,30,31,32,33. Akutt betennelse også har blitt observert ved injeksjon av vanlig saltvann eller PBS løsninger i myokard34,35, og selv i gastrocnemius musklene av rotte36, og derfor dette svaret har vært tilskrives direkte tissue skade i stedet for den injectate per se. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 Ja, det internasjonale samfunnet for hjerte translasjonsforskning erkjenner felles forekomsten av betennelse i innstillingen av IMI, men det er ingen enighet om hvorvidt eller ikke tiltak for å redusere denne prosessen under den Peri-prosedyremessige tid er nyttig (f.eksintravenøs (IV) kortikosteroider)37. Selv om betennelse i denne studien kan også tilskrives for direkte tissue skade, foreslå resultatene også at InI som et fremmedlegeme må også spille en rolle i denne prosessen, gitt en rekke makrofager synes å være phagocytizing InI (figur 3F). En grundig analyse av funksjonelle effekten av denne akutt betennelse sekundært til IMI i hjertet, eller hvorvidt dette kan ameliorated via administrasjon av profylaktisk medisiner som kortikosteroider er utenfor omfanget av dette manuskriptet. Likevel PCI kontrast echocardiography-guidede IMI til fire målrettingsregioner i myokard, med et volum på injectate på opptil 0,25 mL (1,25 x 106 celler) per IMI område, var meget godt tolerert i kaninen.

Med mer enn 60 prosedyrer utført hittil, og etter kompetanse ble oppnådd, var dødeligheten sekundært til prosedyren lav. For eksempel skjedde ingen dødsfall i to kohortene beskrevet i trinn 3.9 (Normal og DOX grupper) etter IMI. Faktisk dato etter 67 IMI prosedyrer utført som del av en pågående forskningsprogram, har vi bare hatt to dødsfall direkte knyttet til prosedyren (2,9% dødelighet). I en av disse, tilstedeværelsen av en hemopericardium ble demonstrert i post mortem eksamen, mens den andre utviklet kliniske nevrologiske tegn, samsvar med akutt cerebral iskemi sekundært til en cardioembolic hendelse, noe som krever en menneskevennlig end-point. Denne dødelighet (2,9%) er betydelig lavere enn rapportert av Lu et al. (11%)8 og Mu et al. (27%)38, i kaniner som mottok IMI direkte visning i en åpen kiste prosedyre. Derfor vi vurdere fremgangsmåten som er beskrevet i denne studien å være sikker, og vi bruker denne teknikken i pågående studier for å vurdere stilk cellen-basert terapi i en kanin modell av AICM med lovende resultater39,40.

Det er flere kritiske punkter for en vellykket PCI kontrast echocardiography-guidede IMI. Forsikre deg om at en parasternal kort aksen visning på nivå med papillary musklene er oppnådd med klare avmerkingen av de endocardial og epicardial konturene. Neste, kontroller at pinne-spissen er i synsfeltet til alle tider når dette har vært brystet hulrom og myokard å hindre utilsiktet levering i perikard plass eller LV kammer. Så sørg for å holde på et minimum antall passeringer gjennom brystet hulrom og i pericardium og myokard, siden dette kan øke sannsynligheten for lokale traumer (f.eks, rive en flenge) disse strukturene, og tilknyttede risikoen for hemopericardium. For dette, samtidig som nålen i brystet hulrom (og for noen målområder, på samme tidspunkt oppføring i visceral pericardium (f.eks, laterale veggen)), nøye utføre subtile endringer i vinkel av forekomsten av nålen. Til slutt, bruk alltid en nål som har en tydelig og lett passasje gjennom huden i brysthulen, og dermed unngår sløv nål skråkanter inn myokard og forårsaker betydelig skade.

Fremgangsmåten som er beskrevet her, ikke bare tillater pålitelige og vellykket levering av injectate til flere målområder i myokard, men det tillater også korrigering av nålen banen i sanntid, og dermed hindre utilsiktet intrachamber levering ( Figur 2 g, H). Mens lukket brystet IMI prosedyrer har blitt beskrevet tidligere i mus, finnes flere begrensninger iboende å denne liten dyr modellen. Disse begrensninger omfatter antall målrettingsregioner i myokard mottakelig for terapi, og lavt volum/antall celler som kan injiseres per målet området29,41. I tillegg nøyaktig levering av injectate er ofte et problem, med en suksessrate nær 60-70%42, og derfor bruk av færre vidt anvendelig høyfrekvent ultralyd systemer er vanligvis nødvendig29,41, 42. Disse systemene er utstyrt med lineær array transdusere som også har iboende tenkelig begrensninger (f.eksgjenklang er en hyppig gjenstand)14. En annen begrensning av små gnager modeller som mus og rotter, er deres iboende forskjeller i Ca2 transportsystemet og mobilnettet elektrofysiologi, som er forskjellig fra mennesker og stor størrelse dyr modeller som hunder, griser og kaniner 15,16,43. Alle disse begrensningene opprette ofte vanskeligheter med å oversette resultatene i disse modellene til klinikken uten forutgående bekreftelse i en stor dyr modell.

Nøye overvåking av dyr i peri-prosedyremessige perioden er obligatorisk i henhold til moderne retningslinjer for behandling av forsøksdyr. Som vist her, denne kan gjort av føljetong echocardiography vinduet skanner og ECG tracings, minst til dyret er våken av bedøvelsen. De akutte virkningene av IMI på hjerterytmen også kan overvåkes av 24 h Holter ECG og er vår standard praksis. Av notatet, de hyppigste arytmi ble isolert PVC, som er relativt godartet i naturen, og som var mer vanlig i dyr som har blitt behandlet med doksorubicin før IMI med InI (se figur 4A og figur 5A). Andre arytmi som var relativt mindre hyppige inkluderer: PVC i couplets; PVC i trillinger; og NSVT (se figur 4B-D og figur 5B-D). Men ble ingen liv truende arytmi som vedvarende ventrikkel takykardi observert. Av notatet fant vi også at noen cardiotoxic manifestasjoner i gruppen DOX ble oppdaget av Holter EKG overvåking, bruke tid frekvens-domene variabler hjertefrekvensvariasjonene (HRV) som SDNN. Dermed ble en redusert SDNN (figur 5E, F), et ikke-lineære mål på hjertet helsetilstand, observert i gruppen DOX sammenlignet med Normal gruppen. Dette er den første rapporten om redusert HRV, som demonstrert av en redusert SDNN, i sammenheng med en kanin modell av AICM, som er i tråd med observasjon som redusert SDNN er en kraftig uavhengig prediktor for hjertestans død hos pasienter med HFrEF44 ,45,46. Endringer i SDNN i gruppen DOX er sannsynligvis ikke relatert til IMI prosedyren. likevel kreves bekreftelse av disse funnene i kaniner mottar doksorubicin, i tillegg til normale dyr som ikke mottar IMI. Om redusert SDNN i HFrEF kan også være forbedret, og derfor brukes som et surrogatmål for stilk cellen basert terapi, gjenstår å bli vurdert, og vil være fokus for fremtidig forskning.

Flere ruter for levering av celler i hjertet har blitt utforsket, inkludert intravenøs, intracoronary, og intramyocardial levering; men har intramyocardial ruten som brukes her, konsekvent vist største nivået av celle oppbevaring priser1,2,3,4,5,37. Vi ikke vurdere celle oppbevaring rate i studiene som blir presentert her, metodene som er brukt er ikke robust og spesifikke nok til å quantitate dette i vivo eller ex vivo, som er en begrensning av denne studien. I stedet brukte vi EGFP(+) HEK-293 celler som har fenotypiske egenskaper tillatt oss å lett diskriminere tilstedeværelsen av disse cellene i myokard, således indikerer vellykket intramyocardial levering. Men var det viktigste målet å utvikle en minimal invasiv teknikk der vi kan utføre IMI og celle levering i myokard av en stor størrelse, preklinisk modell av ikke-iskemiske kardiomyopati. Som vist i figur 2 og Figur 3, ble dette gjort for første gang av PCI kontrast echocardiography-guidede IMI. Videre studier er nødvendig for å vurdere celle oppbevaring rate, samt mulige gunstige effektene av stamceller levert i myokard bruke fremgangsmåten som er beskrevet her; disse studiene er i gang. Vi snakket nylig lovende resultater i forhold til funksjonelle effekter39,40.

Sammenlignet med IMI i en åpen kiste prosedyre, PCI kontrast echocardiography-guidede IMI i en stor prekliniske modell som beskrevet i denne studien er betydelig mindre invasiv i naturen med rask gjenoppretting av dyret følge prosedyren, og som nevnt ovenfor, har det også lavere dødelighet frekvensen8,38. En annen tilnærming til IMI er kateter-baserte IMI, som også har vært testet preklinisk modeller og flere kliniske forsøk (for en vurdering, se Sheng et al.) 47. med denne tilnærmingen, et kateter er avanserte i LV hulrom og deretter plassert på målområder i endocardium. Disse målområder er enten identifisert før prosedyren, f.eksbruke kontrast cardiac magnetisk resonans imaging (CMR)48, eller under prosedyren, f.eksav elektromekaniske endocardial tilordning (EEM), til klart skille levedyktig myokard før injeksjon49. Denne sistnevnte er mindre invasiv sammenlignet med åpne brystet IMI under direkte utsikt, som er en klar fordel. Også, siden IHD hos mennesker har en skinnende, EEM hjelper direkte terapi spesielt til levedyktig steder i myokard, som er spesielt viktig i innstillingen for IHD. En stor ulempe er imidlertid induksjon av ventrikulær arytmi, som er en vanlig funksjon i alle IMI tilnærminger. Andre ulemper med lange fremgangsmåter for tiden, gir EEM er en svært krevende teknikk som krever omfattende opplæring og en tilhørende risiko for hjerte perforering. Derimot PCI kontrast echocardiography-guidede IMI som beskrevet i denne studien teknisk er mindre krevende enn kateter-baserte IMI, og når kompetanse er oppnådd, det kan utføres sikkert innen 25 min etter anestesi. Tilsvarende siden en kort del av nålen er avansert i myokard, er det en lavere risiko for hjerte perforering, men hjerte rive en flenge er fortsatt mulig.

Avslutningsvis PCI kontrast echocardiography-guidede IMI teknikken beskrevet i denne studien i en stor dyr modell, som kanin16,43, er trygg, godt tolerert og effektive i å levere injectate til den hjerte. Derfor utgjør en lovende strategi for prekliniske hypotesetesting av effektene av cardiac regenerativ legemiddelselskap i ikke-iskemiske kardiomyopati (f.eksAICM), inkludert, men ikke begrenset til, stilk cellen-basert terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Forfatterne takker Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz og Manuel Molina for utmerket støtte gitt under innsamling av data og Carlos Bueno for å gi EGFP(+) HEK-293 cellene. Dette arbeidet var støttes delvis av: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spania (JT) (gi nummer: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de jeg + D + jeg 2008-2011 (gi nei. RD12/0019/0001) (JMM), co-finansiert med strukturelle finansiering av den europeiske Union (FEDER) (JMM); og, University of Reading, Storbritannia (AG, GB) (sentrale finansiering). Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. e51566 (2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics