Author Produced

Perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede Intramyocardial injektion og celle levering i en stor prækliniske Model

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Roman terapeutiske strategier i hjertets regenerativ medicin kræver omfattende og detaljerede undersøgelser i store prækliniske dyremodeller, før de kan komme i betragtning til brug i mennesker. Her, vise vi en perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede intramyocardial injektionsteknik i kaniner, som er værdifulde for hypotesetest effekten af sådanne nye behandlingsformer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Celle og -gen terapi er spændende og lovende strategier med henblik på hjerte regenerering i indstillingen af hjertesvigt med nedsat uddrivningsfraktion (HFrEF). Før de kan anses for brug og gennemføres i mennesker, kræves omfattende prækliniske undersøgelser i store dyremodeller til at evaluere sikkerheden, effektiviteten og skæbne af injectate (fx, stamceller) når der leveres i myokardiet. Små gnavere modeller tilbyder fordele (f.eks., omkostningseffektivitet, imødekommenhed for genmanipulation); dog oversætte givet iboende begrænsninger af disse modeller, resultater i disse sjældent til klinikken. Omvendt kan store dyremodeller såsom kaniner, har fordele (fx, ens hjerte Elektrofysiologi i forhold til mennesker og andre store dyr), samtidig med at en god omkostningseffektiv balance. Her, viser vi, hvordan du udfører en perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede intramyocardial injektion (IMI) teknik, som er minimalt invasiv, sikker, veltolereret og meget effektiv i målrettet levering af injectates, herunder celler, i flere steder i myokardiet af en kanin model. For gennemførelsen af denne teknik, har vi også draget fordel af en bredt tilgængelige kliniske ekkokardiografi system. Efter at sætte i praksis den protokol, der er beskrevet her, en forsker med grundlæggende ultralyd viden bliver kompetente i udførelsen af denne alsidige og minimalt invasive teknik anvendes rutinemæssigt i eksperimenter, med henblik på hypotesetest af den kapaciteter af cardiac regenerativ therapeutics i kanin model. Når kompetence er opnået, kan hele proceduren udføres i 25 min efter anaesthetizing kanin.

Introduction

Celle og -gen terapi spændende og nogensinde at udvikle strategier til at regenerere/reparere den tilskadekomne myokardiet i HFrEF. Et par undersøgelser har sammenlignet effektivitet (f.eks., celle tilbageholdelse sats) af de forskellige indgiftsmåder celle levering, som har konsekvent vist IMI overlegenhed over Intrakoronar eller intravenøs ruter1,2 , 3 , 4 , 5. det er således ikke overraskende, at en stor del af undersøgelser på translationel modeller af stamcelleterapi af tilskadekomne myokardiet levere injectate via IMI udføres under direkte visning i en åben bryst procedure6,7 . Denne tilgang har dog flere begrænsninger, herunder invasive karakteren af den procedure, som indebærer risiko for peri-proceduremæssige dødelighed (ofte under-rapporteret)8. Derudover fjerne en IMI under direkte visning ikke muligheden for utilsigtet injektion i den ventrikulære hulrum. I klinisk praksis kan en IMI under åben kiste kirurgi være en velegnet metode til terapeutiske celle levering, fx, under koronararterie bypass graft kirurgi (CABG); dog kan denne tilgang ikke være passende for celle levering i globale kardiomyopati af ikke-iskæmisk oprindelse (f.eks.HFrEF sekundært til antracyklin-induceret kardiomyopati (AICM)).

Der er ingen tvivl om, at iskæmisk hjertesygdom (IHD) er den mest almindelige årsag til HFrEF (~ 66%)9,10; ikke-iskæmisk kardiomyopati, herunder AICM, påvirker imidlertid stadig en betydelig andel af patienter med HFrEF (33%)9 . Faktisk, de seneste fremskridt i klinisk onkologi har resulteret i mere end 10 millioner overlevende fra kræft i USA alene11, skøn over et lignende antal i Europa, i overensstemmelse med en generel tendens til forbedret overlevelse af kræftpatienter12 ,13. Således, at udforske fordelene ved nye behandlingsformer, såsom stamcelletransplantation for ikke-iskæmisk kardiomyopati samt trialing af en effektiv og minimalt invasiv rute af stamceller levering er af største vigtighed, da det stigende antal patienter påvirket af cardiotoxicity sekundært til anticancermedicin.

Af note indebærer hypotesetest undersøgelser ved hjælp af stamcelleterapi satsning hen til reparation/regenerere den tilskadekomne myokardiet ofte anvendelse af små gnavere (fx, mus og rotter). Disse modeller kræver ofte dyre høj frekvens ultralyd systemer til evaluering af Myokardie funktion, normalt udstyret med lineær array transducere, som har nogle iboende tilhørende begrænsninger (f.eks., efterklang)14. Andre modeller som kaniner, der repræsenterer en stor prækliniske model, har dog nogle fordele for hypotese testning af stamceller behandlinger i HFrEF. Således, i modsætning til rotter og mus, kaniner opretholde en Ca+ 2 transportsystem og cellulære Elektrofysiologi, der minder om mennesker og andre store dyr (fx, hunde og svin)15,16,17 ,18,19. En anden fordel, er deres imødekommenhed for kardiale ultrasound imaging bruger relativt billig og bredt tilgængelige kliniske ekkokardiografi systemer udstyret med relativt høj frekvens fase array transducere, f.eks., 12 MHz, som dem, der ofte anvendes i neonatal og pædiatrisk kardiologi. Disse systemer giver mulighed for fremragende ekkokardiografisk imaging med topmoderne teknologi, og de udnytter overlegenhed af harmoniske imaging20. Derudover omfattende hypotesetest af potentialet i hjertets regenerative behandlinger (fx, stamcelleterapi), deres sikkerhed, effektivitet, cardiomyogenic potentiale, samt evaluering af skæbnen, injectate en gang leveret i den myokardiet, er obligatorisk, før de kan komme i betragtning til human brug, og de kræver brug af store prækliniske dyremodeller såsom kanin17,19. Her, beskriver vi en minimalt invasiv teknik til celle levering via perkutan kontrast-ekkokardiografi guidede IMI ved hjælp af en klinisk ekkokardiografi system, som er rettet mod stamcelle transplantation-baseret terapi for ikke-iskæmisk kardiomyopati20 . Vi også beskrive fordelene ved tusch (InI, også kendt som Kina blæk) som en ultralyd kontrast agent og i situ tracer af injectate i kanin hjerte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter beskrevet heri blev godkendt af den etiske forskning på universitetet i Murcia, Spanien, og der blev udført i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU af Europa-Kommissionen. Trinene beskrevet blev udført under drift standardprotokoller, der var en del af planen arbejde og ikke er blevet udført udelukkende med henblik på at filme den ledsagende video til dette papir.

1. forberedelse af celler og pattedyr udtryk vektor

Bemærk: Her, vi kort beskrive en protokol for forberedelse og Transfektion af en cellelinje (menneskelige embryonale nyre 293 (HEK-293)); passende celle specifikke protokoller for celletype af interesse bør imidlertid være optimeret (f.eks.stamceller).

  1. Vedligeholde HEK-293 celler i høje glukose Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% natrium pyruvat, 2 mM glutamin, 1% penicillin/streptomycin, og inkuberes ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 . Når celler er sub sammenflydende, delt i forholdet 1:3.
  2. Begynde at opdele celler af sugning medierne, så vask en gang med steril phosphat bufferet saltvand (PBS), fjerne overskydende PBS og derefter inkuberes med 2,5 mL af 0,5 x Trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA) (5 min, 37 ° C).
    1. Tilføje et bind af DMEM media (suppleret som beskrevet ovenfor) at stoppe reaktionen, og derefter frigør cellerne ved langsomt og forsigtigt sugning op og ned med en elektronisk pipette.
  3. Derefter, overføre cellesuspension til en passende beholder (fx, 15-50 mL konisk centrifugeglas). Der centrifugeres i et sving spand (100 x g), supernatanten og vaske pellet to gange med steril PBS.
  4. Resuspenderes i friske DMEM medier og frø på en passende celle tæthed (fx, 1 x 106 celler i en 75 cm2 kolbe) i frisk kultur kolber eller store retter efter lokale laboratorium praksis.
    1. Erstat eksisterende medier med friske medier hver 2 dage.
      NOTE: Udtrykket vektor var afledt af pIRES1hyg og bruges i overensstemmelse med producentens instruktioner som tidligere beskrevet21. p(EGFP) IRES1hyg blev genereret af subcloning EGFP cDNA som en BamHI + NotI Indsæt fra pEGFP-N1 i BamHI + NotI fordøjet pIRES1hyg21.
  5. 1 dag før Transfektion, celler frø HEK-293 med en tæthed på 0,5 x 105 celler/cm2 i 12 - eller 24-godt vævskultur plader.
  6. På dagen for Transfektion, forberede DNA-lipid Transfektion reagens komplekser i separate 1,5 mL microcentrifuge rør (1 tube/brønd).
    1. Start ved at tilføje 250 µL af reducerede serum medium til hvert rør, og derefter tilføje 4 µg DNA (blandes forsigtigt).
    2. Efterfølgende, tilføje 250 µL fra et tidligere tilberedt blanding af 10 µL lipid Transfektion reagens og 250 µL af reducerede serum medium, til hver tube (blandes igen forsigtigt).
    3. Endelig fortsætte med transfections, ved at inkubere HEK-293 celler med DNA lipid Transfektion reagens komplekser til 4 h, og derefter erstatte med DMEM medium suppleres som beskrevet ovenfor (trin 1.1), og der inkuberes i en anden 48 h. udføre stof udvalg af stabil transfectants med 100 µg/mL hygromycin B.
  7. Frigøre HEK-293 celler med trypsin som beskrevet ovenfor (trin 1.2). Efter vask cellerne i steril PBS, resuspend i et passende køretøj (f.eks.10% v/v InI i PBS), til at opnå en endelig celle koncentration på 5 x 106/mL.

2. forberedelse af kanin

Bemærk: Placering af kaninen og transduceren for IMI er ikke optimal til at evaluere morfologi og funktion af hjertet af dyret. Således er det tilrådeligt at udføre en komplet ekkokardiografisk undersøgelse20 IMI (se nedenfor), og på senere tidspunkter, som defineret af den eksperimentelle design. Dette har til formål at evaluere de baseline anatomiske og funktionelle egenskaber af hjertet i dyret, vil modtage en indsprøjtning, og også evaluere virkningerne af IMI i funktion af hjertet.

  1. Udføre denne undersøgelse i en blindet mode og efter retningslinjerne for ekkokardiografi Udvalget af American College of Veterinary intern medicin og den amerikanske samfund ekkokardiografi/europæiske sammenslutning for hjerte-kar-Imaging 22 , 23 , 24.
  2. Opnå en samtidige 1-bly elektrokardiogram (EKG) sporing i hele den hele ekkokardiografisk undersøgelse.
  3. Bedøver kanin med Ketamin 10 mg/kg, kombineret med medetomidine 200 µg/kg, intramuskulær (I.M.) injektion.
  4. Kontrollér niveauet af anæstesi efter 10-20 min efter administration af anæstesi.
  5. Bruge en hårklipper fjerne hår på brystet bredt (f.eks.under halsen til regionen sub xiphoid) (figur 1A).
  6. Barbere yderligere regioner i 1-2 cm2 i den indvendige side af den rigtige forelimb (mediocubital region) og begge bagben lemmer (mediotibial region) (figur 1B).
  7. Placer klæbende EKG-elektroderne på regionerne barberet af lemmer synkront overvåge hjerterytmen under proceduren (figur 1 c).
  8. Placere dyret i decubitus liggende stilling på et termisk tæppe, med arme og ben strakt ved hjælp af kirurgisk tape tilknyttet tabel (figur 1 c).
    1. Sørg for ørerne er bøjet bagover bag hoved/ryg af kanin, og på en position, der er lavere end dets forbens, da dette bidrager til at opretholde korrekt placering af thorax af dyret under hele proceduren.
  9. Tillad dyret at indånde spontant samtidig administration af ilt ved ansigtsmaske under hele proceduren (100%, 2-3 L/min).

Figure 1
Figur 1. Forberedelse af kanin til IMI. (A) klip håret fra thorax; (B) klip håret fra lemmer; (C) vedhæfte elektroder og Placer kanin med benene strakt på en termisk tæppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI teknik i kanin

  1. Rengøre og desinficere huden på brystkassen med en klorhexidin-baseret løsning.
    1. Bruge en aseptisk teknik under hele proceduren, ifølge aktuelle bedste praksis.
    2. Når det er muligt, og hvis det er praktisk muligt, udføre en fuldstændig steril procedure, herunder, men ikke begrænset til, brug af sterile materiale såsom kjoler, handsker, kirurgiske sår forhæng, sterile dressing materiale til tabellen samt en steril ultralyd transducer cover og sterile ultralyd gel. Dette vil reducere til et minimum risikoen for indslæbning af patogener til dyret modtager IMI, og er almindelig praksis i de kliniske omgivelser (f.eks.under hjerte punktering).
      Bemærk: Det anbefales altid fortsætte i overensstemmelse med lokale og nationale bestemmelser af dyreforsøg gælder for den lokale institution og land af praksis.
  2. Anvende ultralyd transmission gel på brystet og/eller at transduceren og med transducer ledningen rundt om den eksperimentatoren hals, udføre en hurtig vinduet scanning af dyrets hjerte, som er ofte nyttigt at visualisere anatomi og at planlægge for IMI.
  3. Placere transduceren manuelt på de 4th-6th interkostale rum, 2-3 cm fra højre parasternal linje med en indfaldsvinkel på ~ 90 ° til højre side af thorax væggen (figur 2A).
  4. Justere placeringen af transducer i forhold til den interkostale rum samt dens anteroposterior og dorsoventral vinkel til at optimere en modificeret kort akse visning på niveau med de papillærmusklerne. Identificere i denne visning højre hjertekammer (RV), venstre hjertekammer (LV), interventrikulært septum (IVS), posterior væg (PW), samt anterolaterale (AL) og posteromedial (PM) papillærmusklerne (figur 2B).
    1. Har et bredt synsfelt ved væsentligt at øge dybden ved hjælp af passende kontrol på systemet (f.eks., knap, dial).
    2. Være særligt opmærksomme på at opnå et symmetrisk billede i denne visning, samt passende differentiering af endokardial og epikardielle konturer, og Juster om nødvendigt gennem billede optimering kontrolelementer (f.eks.forstærkning).
  5. Når den optimale ekkokardiografisk opfattelse er opnået (figur 2B), opretholde denne position i hele resten af proceduren, mens en anden operator udfører IMI (se nedenfor).
    1. Samtidig holder transduceren, undgå skjuler transducer orientering mark, som bør altid vender fremad, således at dens justering med nålen i efterfølgende trin (figur 2A, C).
  6. Med en 24-G kanyle tilknyttes en 1 mL sprøjte, Placer nålen tæt på huden af den venstre hemithorax i en symmetrisk spejling holdning med hensyn til transduceren. Derefter manuelt justere nålen med varemærket transducer orientering i en vinkel på ~ 90° (figur 2 c), og langsomt forhånd nålen gennem huden og ind i brysthulen.
    Bemærk: Perkutan nål indsættelse i denne position og retning letter visualisering af nålen i flyet af ultralyd BOM (figur 2D, E), således at overvågning i realtid og, når det er nødvendigt, justering af placeringen af nålen i forhold til målområde i myokardiet (figur 2 G, H).
  7. Med spids på mållokationen, langsomt levere injectate (op til 0,25 mL pr. injektionsstedet) inden for 10-30 s (figur 2E), mens langsomt og forsigtigt tilbagetrækningskraften nålen under injektion til at øge omfanget af myokardiet behandlet.
    1. Bruge InI 10% (v/v) fortyndet i PBS for standardisering af teknikken, og som en i situ tracer mens erhverve kompetence, samt for at bekræfte vellykket målretning af alle fire IMI websteder i myokardiet af brutto patologi og histopatologi (jf. Repræsentant resultater). Når kompetence er opnået, kunne InI erstattes af en passende kommercielle ultralyd kontraststof, hvis det ønskes.
      Bemærk: Levering af 10% (v/v) InI fortyndes i PBS enten med eller uden celler ind i myokardiet resultater i transmural hyperechogenicity (dvs., echo lyse udseende) på injektion (figur 2E, F) målwebstedet. Forbigående deceleration eller acceleration af hjertefrekvensen, forbundet med Præmatur ventrikulær kontraktion (fx, isoleret, couplets og trillinger) observeres ofte selv fra den første kontakt med nålen med epicardium samt under og/eller kort efter IMI. Dog ingen livstruende arytmier er udviklet, og akutte bivirkninger er sjældent observeret ved hjælp af op til 0,25 mL (1,25 x 106 celler) injectate pr IMI injektionsstedet (Se Repræsentant resultater og diskussion).
  8. Udføre subtile ændringer i indfaldsvinkel af nålen som nødvendigt at fuldføre injektioner på 0,25 mL til hver af de fire mål IMI sites (tre i venstre ventrikel gratis wall (LVFW) og i IVS).
  9. Efter endt perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI procedure, evaluere hjerterytme (f.eks.via seriel ECG spor og/eller 24 h Holter ECG), og udføre seriel vindue ekkokardiografisk scanninger for at verificere fravær af komplikationer, indtil dyret er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi, og kun derefter overførsel til en lys cyklus værelse.
    1. Her bruger vi 24 h Holter ECG for at overvåge virkningerne af IMI med InI på hjerterytme i 24 timer. For dette sammenlignede vi en gruppe af 6 kaniner med normal fænotype (Normal gruppen) og en gruppe af 6 kaniner, der modtog intravenøs indgift af Doxorubicin (en kardiotoksiske antracyklin stof, almindeligvis anvendes til behandling af kræft; DOX gruppe) i en dosis på 2 mg/kg/uge i 8 uger, og derefter begge kohorter modtaget IMI med InI.

Figure 2
Figur 2 . Perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede intramyocardial injektion i kaninen. (A) placering af transducer i den rette hemithorax i en vinkel på ~ 90 °. (B) repræsentativt billede af en parasternal kort akse visning (PSSX) af hjertet på niveau med papillærmusklerne i kanin. (C) justering af nålen i en vinkel på ~ 90 ° i forhold til transducer orientering mark. (D) placering af nålen på destinationswebstedet i en PSSX visning af hjertet (Bemærk at nålen er let visualiseres i flyet af ultralyd stråle). (E og F) Demonstration af hyperechogenicity på mål-webstedet på intramyocardial injektion med tusch (pilespidser fremhæve transmural hyperechogenicity). (G) tilfældig placering af nålen i LV kammer (pilespidser fremhæve nål akslen). (H) Repositioning af nålen til LV gratis wall (pilespidser fremhæve nål akslen). RV = højre hjertekammer; LV = venstre ventrikel; IVS = interventrikulært septum; PW = posterior væg; AL = anterolaterale papillær muskel; PM = posteromedial papillær muskel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. indlæg IMI analyser

  1. Udføre histopatologiske analyse af hjertet vævsprøver fra kaniner.
    1. Fix væv til 24 h i 10% formaldehyd, efterfulgt af dehydrering med stigende koncentrationer ethanol som følger:
      • 1 x i 70% (60 min)
      • 1 x i 95% ethanol/5% methanol (60 min)
      • 1 x i 100% (60 min)
      • 1 x i 100% (90 min)
      • 1 x i 100% (120 min)
      Bemærk: Alle de ovennævnte inkubationer udføres ved stuetemperatur (RT). Derefter erstatte to gange med 100% xylen (1 h, RT), og endelig indkapsle i paraffin i to trin (60 min, 58 ° C)25.
    2. Udføre 4-5 µm væv sektioner med en mikrotom25. Montere sektioner på dias.
    3. Udføre farvning med eosin hæmatoxylin og Masson's trichrome metoder25,26,27.
  2. I væv sektioner fra transplanterede hjerter, udføre Immunohistokemi til at opdage EGFP(+) HEK-293 celler (f.eks.ved hjælp af metoden begærlighed-biotin komplekse (ABC)), kort:
    1. De voks 4-5 µm tykt hjerte sektioner i 100% xylen (10 min, til RT). Rehydrere væv ved at vaske med faldende ethanol koncentrationen løsninger (2 x i 100% (2 min) 2 x i 95% (2 min) 1 x i 70% (2 min), 1 x 50% (2 min); 1 x i 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) på RT.
    2. Udføre endogene peroxidase hæmning af dækker sektioner med 100 µL af 3% H2O2 fortyndet i () methanol (tilberedt med 5 mL 30% stamopløsning af H2O2og tilføje methanol op til et volumen på 50 mL) Inkubér 30 min, RT), og derefter vaskes ved nedsænkning med Tris bufferet saltvand (TBS; pH 7,6).
    3. Udføre antigen demaskering via enzymatisk behandling, ved at dække sektioner med 100 µL af 0,1% Pronase (udarbejdet med 0,01 g Pronase fortyndes i 10 mL TBS) (Inkubér 12 min, RT), derefter vaske med TBS (5 min, RT).
    4. Inkuber i blokerende løsning (normal ged serum på 10% i TBS) ved hjælp af 100 µL pr. slide (30 min, RT), og vask med TBS (5 min, RT).
    5. Der inkuberes med kylling anti-grøn fluorescerende proteiner (NGL) som primære antistof (1: 500 i TBS) (1 h, 30 ° C), og vask med TBS (5 min, RT).
    6. Der inkuberes med sekundær antistof biotinylated gede-anti-kylling IgG (1:250 i TBS) (1 h, 30 ° C), og derefter vaske med TBS (5 min, RT).
    7. Inkuber med begærlighed-biotin kompleks (20 min, 30 ° C), og derefter mærke ved hjælp af 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Endelig, dehydrere ved vask i stigende koncentrationer ethanol (1 x i 30% (2 min) 1 x i 50% (2 min) 1 x i 70% (2 min), 2 x i 95% (2 min); 2 x i 100% (2 min)) på RT, kontrastfarve sektioner ved hjælp af hæmatoxylin-eosin metode25, og derefter montere dække dias. Omfatte positive, negative og isotype kontrol.
      Bemærk: Den korte protokol beskrevet ovenfor er ikke beregnet til generelle Immunhistokemi brug; optimering for væv af interesse og betingelser er nødvendige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI med InI:

Ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor, og når den optimale placering af spidsen af nålen blev bekræftet af ekkokardiografi og injektion indledt, transmural hyperechogenicity blev observeret under levering af InI (10% v/v i PBS) (figur 2E) , såvel som kort efter IMI til målområde (figur 2F). Når IMI blev straks efterfulgt af aktiv dødshjælp og hjertet fjernet, var aflejringer af InI let synlige efter eksterne undersøgelse af hjertet (figur 3A). Derudover afslørede hjerte væv sektioner, fxkorte akse sektion på niveau med papillærmusklerne (figur 3B), transmural aflejringer af InI farvestof på injektionsstedet, hvilket illustrerer den vellykkede og effektive levering af injectate i myokardiet ved hjælp af denne teknik. Af note, transmural hyperechogenicity observeret i vivo under IMI (figur 2E, F), korreleret godt med transmural aflejringer af InI i ex vivo prøver (figur 3A, B). Det tydeligt, at InI har dobbelt egenskaber i fastsættelsen af IMI: som i vivo ultralyd kontrast agent, samt en ex vivoin situ tracer. Begge disse egenskaber gøre InI en meget alsidige og billig ultralyd kontraststof, især for uddannelse under erhvervelse af kompetencer i denne teknik. Således bidrage echogenic egenskaber af InI til at overvåge IMI fx, bestemme vellykket IMI versus utilsigtet intra-kammer eller perikardial plads injektion, og når det er nødvendigt, gives de real-time imaging funktioner af ultralyd, at gøre rettelser af nålen spor i realtid (figur 2 g, H). På den anden side er i situ -sporing kapaciteter af InI af værdi at finde injectate i ex vivo prøver af target myokardiet.

Perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI med InI og EGFP(+) HEK-293 celler:

Forud for IMI, blev vellykket Transfektion af EGFP(+) HEK-293 celler bekræftet af Fluorescens mikroskopi under i vitro kultur betingelser (figur 3 c). Den succesrige levering af EGFP(+) HEK-293 celler i myokardiet blev demonstreret via Immunhistokemi analyse af hjertet væv sektioner hvor InI indskud blev observeret. Således, ved hjælp af metoden begærlighed-biotin komplekse (Se trin 4.2), rigelige EGFP(+) HEK-293 cellerne blev identificeret i myokardiet spækket med InI indskud (figur 3D). Aflejringer af InI var stadig observeret 24 h efter IMI i Myokardie vævsprøver fra kaniner, der modtog InI i kombination med EGFP(+) HEK-293 celler (figur 3), eller InI alene (figur 3F). Af note konstateredes en akut inflammatorisk reaktion på dette tidspunkt, med en fremherskende neutrophilic infiltrere i prøver fra dyr modtager EGFP(+) HEK-293 celler (figur 3), hvilket tyder på akut cellulære afvisning. På den anden side blev makrofager observeret i dyr modtager InI alene (figur 3F).

Figure 3
Figur 3 . In situ makroskopiske og histopatologiske evaluering og sporing af injectate. (A) påvisning af tilstedeværelsen af injectate på eksterne undersøgelse af en skåret hjertet efter IMI med InI (pilespidser fremhæve steder, hvor injektion). (B) Demonstration af transmural fordeling af injectate efter IMI med InI i et tværsnit af hjertet på niveau med de papillærmusklerne (blå pilespidser fremhæve transmural InI indbetaling; Hvid pil fremhæver en synlig indbetaling af InI på IVS). (C) Autofluorescence in vitro- EGFP(+) HEK-293 celler ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. (D-F) Histopatologisk analyse af injicerede websteder. EGFP(+) celler er synligt spækket med InI indskud i myokardiet ved 0 h (D) og 24 h (E) sende IMI (blå pilespidser fremhæve EGFP(+) celler, røde pile fremhæve tilstedeværelsen af neutrofiler). Aflejringer af InI afbrudt i myokardiet på 24 h (F) efter IMI med InI alene (blå pile fremhæve tilstedeværelsen af makrofager). RV = højre hjertekammer; LV = venstre ventrikel; IVS = interventrikulært septum; IMI = Intramyocardial injektion; InI = tusch. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

At have udført over 60 perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI procedurer til dato, mener vi, at med omhyggelig opmærksomhed for detaljer og god dyr håndtering og pleje, proceduren er generelt veltolereret, og akutte komplikationer er meget sjældne og sædvanligvis milde. Generelt i dyr, der underkastes IMI, den hyppigste observation under og kort efter proceduren er forbigående acceleration eller deceleration af puls, forbundet med isoleret Præmatur ventrikulær komplekser (PVC) (figur 4A). Således, 24 h Holter ECG overvågning af dyr, der modtog InI alene via IMI, afslørede, at den mest hyppige arytmi opdaget (samlet antal episoder inden for 24 timer) var isoleret PVC, selvom et højere antal episoder blev opdaget i dyr, der var tidligere behandlet med DOX i 8 uger (figur 5A). PVC i couplets og trillinger synes at være mindre hyppige (figur 4B, C og figur 5B, C), selv om trillinger er betydeligt mindre hyppige i DOX behandlet end ubehandlet normale kaniner (figur 5 c). På den anden side ikke-vedvarende ventrikulær takykardi (NSVT) blev hyppigere observeret hos normale dyr (figur 4D og fig. 5 d). Betydeligt, mens den gennemsnitlige hjertefrekvens ikke var anderledes mellem DOX og Normal grupper efter at have modtaget IMI med InI alene (figur 5E), standardafvigelsen af normale R-R interval (SDNN), blev reduceret betydeligt (< 100 ms) hos DOX gruppe ( Figur 5F). SDNN er en ikke-lineær foranstaltning af hjertet sundhedsstatus, og derfor dette resultat angiver, at gruppen DOX har globale ændringer i sit hjerte fysiologiske status.

Figure 4
Figur 4. Ventrikulære arytmier observeret under 24 h Holter overvågning i kaniner, der modtog IMI med InI. De viste skærmbilleder hidrører fra Holter EKG tachograms billeder vises på skærmen under offline analyse og illustrere repræsentative eksempler på de mest almindelige typer af arytmi fundet under 24 timers overvågning. (A) isoleret PVC. (B) PVC i Couplets. (C) PVC i trillinger. (D) NSVT. PVC = Præmatur ventrikulær kontraktion; NSVT = ikke-vedvarende ventrikulær takykardi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Arytmiske begivenheder opdaget af 24 h Holter ECG overvågning efter IMI med InI i kaniner. Samlede antal isoleret PVC (A), PVC i couplet (B), PVC i trillinger, (C) og NSVT (D), i ubehandlet kaniner (Normal + IMI) versus Doxorubicin-behandlede (3 mg/kg/uge i 6 uger) kaniner (DOX + IMI), efter IMI med InI. Betyde puls (E) og SDNN (F), i kaniner fra Normal + IMI og DOX + IMI grupper efter IMI med InI. Data er udtrykt i gennemsnit ± SEM. * angiver p < 0,05; og # angiver p < 0,01, sammenligne Normal + IMI versus DOX + IMI grupper af t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det primære mål var at udvikle et minimalt invasive teknik, der kan bruges til levering af stamceller i myokardiet kaniner (en stor størrelse prækliniske dyremodeller)17,18, samtidig med at drage fordel af brugen af en forholdsvis billig imaging system let tilgængelige i mange kliniske og forskningsmæssige Centre. Her, vi viser, at ved hjælp af en klinisk ekkokardiografi system, og hjulpet af InI, et bredt tilgængelige agent, med både i situ -sporing kapaciteter og echogenic egenskaber, vellykket perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI er meget effektiv i at levere injectate til destinationsområderne kanin hjerte. Så vidt vi ved, er dette den første beskrivelse af en perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI og celle levering i en stor animalsk model som kanin18,19. InI er blevet brugt tidligere i undersøgelser for i situ lokalisering af injectate inden for væv7,28, men det er til vores viden, den første beskrivelse af denne agent dual egenskaber som en i vivo ultralyd kontraststof og som en i situ tracer af injectate ex vivo. Faktisk, komplekse blandinger af kontrastmidler og i situ sporing stoffer tidligere er blevet beskrevet i murine undersøgelser sigter mod at levere injectates i myokardiet29. Dog givet echogenic egenskaber af InI og dens i situ -sporing kapaciteter, kunne dette stof være meget nyttigt under kvalifikationer, af bedømmelsesaktiviteterne mens under uddannelse med denne teknik.

Bekræftelse af levering af injectate som indeholder både InI som EGFP(+) HEK-293 celler ved hjælp af Immunhistokemi demonstrerer anvendeligheden af denne teknik til prækliniske forskning rettet mod stamcelleterapi. En IMI af InI sammenholdt med EGFP(+) HEK-293 resulterede i en akut inflammatorisk reaktion med en fremherskende neutrophilic infiltrere, tyder på en reaktion på akut cellulære afvisning (indenfor 24 timer) til de xenogene celler. Denne reaktion er sandsynligvis ikke overraskende i et immunkompetente dyr. På den anden side også fremkaldte en IMI med InI alene en akut inflammatorisk reaktion (inden for 24 timer) i det behandlede Myokardie væv, som udstillede en fremherskende makrofag infiltrere. Dette er i overensstemmelse med observation af akut betændelse beskrevet i tidligere undersøgelser efter IMI under direkte visning i en åben bryst procedure4,30,31,32,33. Akut betændelse er også blevet observeret efter injektion af normale saltvand eller PBS løsninger i myokardiet34,35, og selv i gastrocnemius muskler af rotte36, og derfor denne reaktion har været henføres til direkte vævsskade i stedet for den injectate i sig selv. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 ja, International Society for hjerte-kar-Translationel forskning anerkender den fælles forekomst af inflammation i fastsættelsen af IMI, men der er ikke enighed om, hvorvidt eller ikke foranstaltninger til at reducere denne proces under de peri-proceduremæssige tid er nyttigt (fxintravenøs (IV) kortikosteroider)37. Selv om betændelse i denne undersøgelse kan også tilskrives direkte vævsskade, foreslå resultaterne også, at InI som et fremmedlegeme skal også spille en rolle i denne proces, forudsat en række makrofager synes at phagocytizing InI (figur 3F). En grundig analyse af de funktionelle virkninger af denne akut betændelse sekundært til IMI i hjertet, eller om disse kan være forbedret via administration af profylaktisk stoffer som kortikosteroider er uden for rammerne af dette manuskript. Ikke desto mindre perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI til fire målområder i myokardiet, med en mængde af injectate op til 0,25 ml (1,25 x 106 celler) pr IMI site, var meget godt tolereret i kanin.

Med mere end 60 procedurer udføres til dato, og efter kompetence blev opnået, var dødelighed sekundært til proceduren, der meget lavt. For eksempel, indtraf ingen dødsfald i de to kohorter beskrevet taktfast 3.9 (Normal og DOX grupper) efter IMI. Faktisk, til dato efter 67 IMI procedurer udføres som del af en igangværende forskningsprogram, vi har kun haft to dødsfald direkte relateret til procedure (2,9% dødelighed). I en af disse, tilstedeværelsen af en hemopericardium blev demonstreret af post mortem -undersøgelsen, mens den anden udviklet kliniske neurologiske tegn, i overensstemmelse med akut cerebral iskæmi sekundært til en cardioembolic begivenhed, hvilket kræver en Human end-point. Denne dødelighed (2,9%) er væsentligt lavere end rapporteret af Lu et al. (11%)8 og Mu et al. (27%)38, i kaniner, der modtog IMI under direkte visning i en åben bryst procedure. Således mener vi efter proceduren i den aktuelle undersøgelse at være sikker, og vi bruger denne teknik i igangværende undersøgelser for at evaluere stamcelle-baseret terapi i en kanin model af AICM med lovende resultater39,40.

Der er flere kritiske punkter for en vellykket perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI. Kontroller først, at parasternal kort akse udsigt på niveau med de papillærmusklerne opnås med klar afgrænsning af de endokardial og epikardielle konturer. Næste, sikre, at nålen tip er inden for synsfeltet på alle tidspunkter, når dette har indtastet brysthulen og myokardiet at forhindre utilsigtet levering i perikardial plads eller LV kammer. Så, Sørg for at holde på et minimum antallet af passager gennem brysthulen, og i at hjertesækken og myokardiet, da dette vil kunne øge sandsynligheden for lokale traumer (fx, laceration) til disse strukturer, og den dermed forbundne risiko for hemopericardium. For dette, samtidig med at nålen i brysthulen (og for nogle målwebsteder på samme indførselsstedet i visceral hjertesækken (fx, laterale væg)), omhyggeligt udføre subtile ændringer i indfaldsvinkel af nålen. Endelig, altid bruge en nål, der har en klar og let passage gennem huden ind i brysthulen, således at man undgår stump kanyle facetter fra indtastning af myokardiet og forårsager betydelig skade.

Proceduren beskrevet heri, ikke kun giver mulighed for pålidelige og vellykket levering af injectate til flere målwebsteder i myokardiet, men det giver også korrektion af nålen bane i realtid, hvilket forhindrer utilsigtet intrachamber levering ( Figur 2 g, H). Mens lukket brystet IMI procedurer er blevet beskrevet tidligere i mus, er der flere begrænsninger iboende hen til denne lille dyremodel. Disse begrænsninger omfatter antallet af målområder i myokardiet imødekommenhed over for terapi, og lav volumen/antallet af celler, der kan blive injiceret pr. mål site29,41. Hertil kommer, præcis levering af injectate er ofte et problem, med en succesrate tæt på 60-70%42, og derfor brugen af mindre bredt tilgængelige høj frekvens ultralyd systemer er normalt kræves29,41, 42. Disse systemer er udstyret med lineær array transducere, der også har iboende imaging begrænsninger (f.eks.efterklang er en hyppig genstand)14. En anden begrænsning af små gnavere modeller som mus og rotter, er deres iboende forskelle i Ca+ 2 transportsystem og cellulære Elektrofysiologi, som adskiller sig fra mennesker og store mellemstore dyremodeller såsom hunde, svin og kaniner 15,16,43. Alle disse begrænsninger skaber ofte problemer med at oversætte resultaterne i disse modeller ind på klinikken uden forudgående bekræftelse i en stor animalsk model.

Omhyggelig overvågning af dyret i perioden peri-proceduremæssige er obligatorisk ifølge de moderne retningslinjer for pleje af forsøgsdyr. Som vist her, dette kunne gøres ved seriel ekkokardiografi vindue scanninger og ECG tracings, i det mindste indtil dyret er vågen fra anæstesi. De akutte virkninger af IMI på hjerterytmen også kan overvåges af 24 h Holter ECG og er vores standard praksis. Bemærk, de hyppigste arytmier blev isoleret PVC, som er relativt godartet i naturen, og som var mere almindelige i dyr, der er blevet behandlet med Doxorubicin forud for IMI med InI (jf. figur 4A og figur 5A). Andre arytmier, der var relativt mindre hyppige omfatter: PVC i couplets; PVC i trillinger; samt NSVT (Se figur 4B-D og figur 5B-D). Dog blev ingen liv livstruende arytmier som vedvarende ventrikulær takykardi observeret. Af note fandt vi også, at nogle kardiotoksiske manifestationer i gruppen DOX kunne påvises ved Holter EKG monitorering, bruger tid frekvens-domæne variabler af pulsvariationen (HRV) som SDNN. Således, en reduceret SDNN (figur 5E, F), en lineær foranstaltning af hjertet sundhedsstatus, blev observeret i gruppen DOX sammenlignet med den normale gruppe. Dette er den første betænkning af reduceret HRV, som det fremgår af en reduceret SDNN, i forbindelse med en kanin model af AICM, som er i overensstemmelse med den iagttagelse, at reduceret SDNN er en kraftfuld uafhængig prædiktor for hjertedød hos patienter med HFrEF44 ,45,46. Ændringer i SDNN i gruppen DOX sandsynligvis ikke er relateret til IMI-proceduren bekræftelse af disse resultater i kaniner modtager Doxorubicin, samt normale dyr, der ikke modtager IMI, er dog påkrævet. Om reduceret SDNN i HFrEF kunne også blive forbedret, og derfor anvendes som en surrogat foranstaltning til fordel for baseret stamcelleterapi, mangler at blive evalueret, og vil være i fokus i den fremtidige forskning.

Flere ruter af levering af celler ind i hjertet har været undersøgt, herunder intravenøs, Intrakoronar, og intramyocardial levering; intramyocardial ruten som anvendes heri, har konsekvent vist den største grad af celle opbevaring priser1,2,3,4,5,37. Vi ikke vurdere celle tilbageholdelse i de undersøgelser, der præsenteres her, da metoden ikke er robust og særlige nok til at kvantificere denne i vivo eller ex vivo, der er en begrænsning af denne undersøgelse. I stedet brugte vi EGFP(+) HEK-293 celler hvis fænotypiske egenskaber gjort det muligt at nemt diskriminere tilstedeværelsen af disse celler i myokardiet, der således angiver vellykket intramyocardial levering. Men Hovedformålet var at udvikle et minimalt invasive teknik, hvorved vi kunne udføre IMI og celle levering i myokardiet af en stor størrelse, prækliniske model af ikke-iskæmisk kardiomyopati. Som vist i figur 2 og figur 3, blev dette opnået for første gang ved perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere celle tilbageholdelse samt eventuelle gavnlige virkninger af stamceller leveret i myokardiet ved hjælp af den procedure, der er beskrevet heri. disse undersøgelser er i øjeblikket undervejs. Vi har for nylig meddelt lovende resultater med hensyn til funktionelle virkninger39,40.

I forhold til IMI i en åben bryst procedure, en perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI i en stor prækliniske model som beskrevet i denne undersøgelse, er væsentligt mindre invasiv i naturen med hurtig genopretning af dyret efter proceduren, og som nævnt ovenfor, har det også lavere dødelighed sats8,38. En anden tilgang til IMI er kateter-baserede IMI, som også er blevet testet i prækliniske modeller og flere små kliniske forsøg (for en anmeldelse, se Sheng et al.) 47. med denne tilgang, et kateter er avanceret i LV hulrum og derefter placeret på målwebsteder i endokardiet. Disse målwebsteder er enten identificeret inden proceduren, fxved hjælp af kontrast hjerte magnetisk resonans imaging (CMR)48, eller under proceduren, fxaf elektromekaniske endokardial kortlægning (EEM), at klart differentiere levedygtige myokardiet før injektion49. Denne sidstnævnte tilgang er mindre invasive sammenlignet med åben bryst IMI under direkte visning, som er en klar fordel. Også, da IHD i mennesker har en uensartet fordeling, EEM hjælper direkte terapi specielt til bæredygtige sites i myokardiet, hvilket er særlig vigtigt ved fastsættelsen af IHD. Men en stor ulempe er induktion af ventrikulære arytmier, som er et fælles træk ved alle IMI tilgange. Andre ulemper omfatter den langvarige proceduremæssige tid, give EEM er en meget krævende teknik, der kræver omfattende uddannelse og en tilhørende risikoen for kardiale perforering. Derimod perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede IMI som beskrevet i denne undersøgelse, teknisk er mindre krævende end kateter-baserede IMI, og når kompetence er opnået, det kan udføres sikkert i 25 min efter anæstesi. På samme måde, da kun en kort del af nålen er avancerede i myokardiet, der er en lavere risiko for hjertesygdomme perforation, selvom hjerte laceration er stadig muligt.

Afslutningsvis den perkutane kontrast ekkokardiografi-styrede IMI teknik beskrevet i denne undersøgelse i en stor animalsk model, såsom kanin16,43, er sikker, veltolereret og effektiv i at levere injectate til den hjerte. Derfor, det udgør en lovende strategi for prækliniske hypotesetest af virkningerne af cardiac regenerativ therapeutics i ikke-iskæmisk kardiomyopati (f.eks.AICM), herunder, men ikke begrænset til, stamcelle-baseret terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgements

Forfatterne takke Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz og Manuel Molina fremragende bistand under indsamlingen af data, og Carlos Bueno for at give EGFP(+) HEK-293 celler. Dette arbejde blev støttet delvist af: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spanien (JT) (giver nummer: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de jeg + D + jeg 2008-2011 (give nr. RD12/0019/0001) (JMM), medfinansieres med strukturel finansiering af EU (FEDER) (JMM); og University of Reading, Det Forenede Kongerige (AG, GB) (Central finansiering). Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. e51566 (2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics