أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

ويصف هذا البروتوكول وسيلة تحقيق إدماج مورثة فائدة مستقرة في الجينوم البشري نظام النائمة للتنظيم ترانسكريبتيونالي. وترد إعداد التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة، وتوصيل في المختبر للخلايا البشرية والمقايسة الجزيئية في الخلايا ترانسدوسيد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Benati, D., Cocchiarella, F., Recchia, A. An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector. J. Vis. Exp. (131), e56742, doi:10.3791/56742 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ينقول النائمة (س. ب) نظام تكامل غير فيروسية مع أثبتت فعاليتها لنقل الجينات والجينوم الوظيفي. لتحسين إليه ينقول SB، يعملون ترانسبوساسي مفرط التنظيم ترانسكريبتيونالي (SB100X)، والمستندة إلى T2 ينقول. عادة، يتم توفير ترانسبوساسي وينقول عابر من تعداء بلازميد والتعبير SB100X تحركها مروج تأسيسي. وهنا، يمكننا وصف طريقة فعالة لتوصيل المكونات بينالي الشارقة إلى الخلايا البشرية التي مقاومة للعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية تعداء، التحكم في التعبير SB100X وإدماج [ستبلى] مورثة للفائدة (غوي) من خلال SB "قص ولصق" إليه. يتم التعبير عن ترانسبوساسي مفرط رقابة مشددة من جانب النظام على تيت، تستخدم على نطاق واسع للتحكم في التعبير الجيني منذ عام 1992. الجينات للاهتمام هو محاط يكرر مقلوب (الأشعة تحت الحمراء) من ينقول T2. يتم حزم كلا العنصرين بينالي الشارقة في التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة عابر تنتج في الخلايا HEK293T. الخلايا البشرية، أما من خطوط الخلايا أو الخلايا الأولية من الأنسجة البشرية، في المختبر ترانسدوسيد عابر مع النواقل الفيروسية. عند إضافة الدوكسي (دوكس، التتراسيكلين التناظرية) في المتوسط الثقافة، يقاس الضبط الدقيق للتعبير ترانسبوساسي والنتائج في على تكامل طويلة الأمد للجينات للفائدة في جينوم الخلايا المعالجة. هذا الأسلوب يتسم بالكفاءة وتنطبق على خط الخلية (مثل خلايا هيلا) والخلايا الأولية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية البشرية)، ويمثل بالتالي أداة قيمة للهندسة الوراثية ونقل الجينات العلاجية.

Introduction

تم بالفعل استخدام ترانسبوساسي SB100X مفرط بالإضافة إلى ينقول المستندة إلى T2 في الجينات السريرية العلاج التطبيقات1،2،3، الجينوم التعديلات4،5، و المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية) إعادة برمجة6،7. عادة، مكونات SB توفرها عابر تعداء بلازميد ومروج تأسيسي قوية التعبير عن ترانسبوساسي محركات الأقراص. ومع ذلك، يظل تقديم النظام المكون الثاني على الرغم من تحسين أساليب جديدة من تعداء، تحديا للعديد من التطبيقات. وهكذا، قد وضع بروتوكول جديد بإيصال اهتماما متزايداً. بالإضافة إلى طرق تعداء بلازميد8 ومرناً9، الفيروسية التسليم استناداً إلى أدينوفيرال10،11، مرتبطة بالغدد الفيروسية (إف)12، باكولوفيروس13، جاماريتروفيرال14 وناقلات لينتيفيرال15 وقد اقترح في الماضي. جدير بالذكر أن نظام الاختيار يجب أن تضمن عملية تسليم عابر لمكونات SB دون التكامل بين النواقل الفيروسية. ومع ذلك، التعبير التأسيسي من ترانسبوساسي يثير الشواغل المتعلقة بالسلامة بسبب خطر ريهوبينج لا يمكن السيطرة عليها ينقول.

ولذلك، تنظيم النسخي SB100X بنظام على تيت المكرر هو التحدي الأول. مروج تيت مراعية معدلة، التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال المروج المتقدمة الحد الأدنى الفيروس المضخم للخلايا (CMV) الأصلي مع المروج (-81) الحد الأدنى من الجينات تيميديني كيناز (المعارف التقليدية) من فيروس "الحلأ البسيط"-1 (هامبورغ-1)16، هو استنساخ المنبع كدنا SB100X (pTetOTKSB100X). تحور عكس-التتراسيكلين-ترانساكتيفاتور rtTA2s-أعرب عن M217 تحت سيطرة قوي التأسيسي المروج (المروج فوسفوجليسيراتي، PGK) المستنسخة في بلازميد مختلفة (بتشل-PGKrtTA2S-M2). عند إضافة إلى متوسط الثقافة، يربط دوكس rtTA2s-المغير M2 والحبال المروج تيت المعقدة، أو الناتجة عن ذلك في شكل محكم التنظيم الاستقراء من التعبير SB100X18.

التحدي الرئيسي الثاني ينشأ من تعداء الكفاءة البشرية الابتدائية الخلايا بالعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية. لكفاءة تسليم ترانسبوساسي في الخلايا البشرية مقاومة تعداء، SB100X و rtTA2s-شرائط التعبير M2 يتم حزم في اثنين التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة (إيدلفس)19: إيدلفتكسب و IDLVrtTA2s- M2. يتم إنتاج النواقل الفيروسية عابر كناقلات الجيل الثالث في الخلايا HEK293T20 وبسيودوتيبيد مع بروتين سكري ز فيروس التهاب الفم فيسسيكولار (منظمة-ز)، الذي يمنح طائفة عريضة من العدوى. ناقل الجزيئات هي تتركز تنبيذ فائق ومعاير بفيروس نقص المناعة البشرية-1 "اسكت" إيمونوكابتوري p24. جسيمات ناقلات الرصاصية مع بوليبريني ترانسدوسي خطوط الخلايا والخلايا الأولية، وهي المحتضنة مع الخلايا المستهدفة في وجود أو عدم وجود دوكس. تفعيل مدمني المخدرات من التعبير SB100X في الخلايا ترانسدوسيد تقاس بكمية RT-PCR (قرة-PCR)18.

تحويل غوي (مثلاً، أخضر نيون البروتين، التجارة والنقل) إلى جينوم الخلية المستهدفة بمجرد يتجلى التعبير ينظم تيت SB100X، يتبع الأحداث الجزيئية وضوح المخططة ب باك وميكيلسن21. ثالث إيدلف ناقلات تحمل كاسيت تعبير لحكومة الهند استنساخ بين مصلحة الضرائب T2-ينقول (IDLVT2) وقد شيدت وتعبئتها كما هو مذكور أعلاه. وأخيراً، يمكن استخدام ثلاث ناقلات إيدلف كفاءة ترانسدوسي الخلايا البشرية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية) في المختبر وإدماج غوي حضور الدوكسيسيكلين18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-والبلازميدات المستخدمة

ملاحظة: بلازميد بتشل-PGKrtTA2S-M2 كان يرجى قدمها الأستاذ زابافيجنا (جامعة مودينا وريدجو إميليا، مودينا، إيطاليا). بلازميد pCMVSB100X تحمل الترميز تسلسل ترانسبوساسي مفرط وبلازميد ينقول pT2/البوسنة والهرسك قدمت تفضلت بزين Z. إيفيكس (معهد بول ايرليك، أنغن، ألمانيا)، والأستاذ الدكتور زهير إيزفاك (ماكس ديلبروك مركز "الطب الجزيئي"، برلين، ألمانيا).

  1. لجميع أشكال الاستنساخ في الإشريكيّة القولونية (كولاي)، اتباع استراتيجية الاستنساخ لإجراءات الاختيار وإنزيم التقييد أو [بكر] تضخيم الجزء استنساخ.
    ملاحظة: يلخص الجدول 1 جميع والبلازميدات المستخدمة في هذا البروتوكول. وتقدم وصفاً والمراجع لكل بلازميد.

2. إنتاج النواقل الفيروسية

ملاحظة: يتم إنتاج جميع ناقلات المرض الفيروسي في غطاء واقية على مستوى احتواء BSL2 السلامة الأحيائية، وفقا للقواعد المؤسسية والأنظمة.

  1. وتستكمل الثقافة ملتصقة HEK293T الخلايا في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو مع 10% هيكلوني المصل و 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين الجلوتامين 2 مم.
  2. اليوم 0: إعداد خمس إعداد لوحات/الفيروسية 15 سم والبذور 5.5x106 خلايا في 30 مل الوسط.
  3. يوم 1: تعداء
    1. قبل البدء تعداء، إعداد 100 مل من المحلول الملحي المخزن المؤقت x HEPES 2 (HBS):
      كلوريد الصوديوم (م 5) 5.6 مل
      حبيس (1 م) مل 10.0
      غ2هبو4 (0.5 م) 0.3 مل
      تعقيم المياه مل 84.1
      ضبط للأس الهيدروجيني 7.1 مع 37% HCl.
      ملاحظة: يمكن تخزين 2 x HBS في 4 درجات مئوية. درجة حموضة دقيق أمر بالغ الأهمية لكفاءة تعداء. مجموعة الرقم الهيدروجيني الأمثل هو 7.10 إلى 7.12.
    2. إزالة المتوسطة وإضافة 22.5 مل/طبق من ح 4 متوسطة جديدة قبل تعداء.
    3. ترانسفيكت الخلايا HEK293T مع بلازميد نقل بلازميد التغليف pMD.Lg/pRRE.D64VInt، بلازميد المغلف-ترميز pMD2.G وبرسف Rev (الجدول 1) وفقا للكمية/اللوحة التالية:
      نقل ميكروغرام بلازميد 25.00
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 ميكروغرام
      pMD2.G 8.75 مكغ
      برسف-القس 6.25 ميكروغرام
      ملاحظة: يتم إعداد بلازميد السلطات الوطنية المعينة وفقا لبروتوكول CsCl الموصوفة من مانياتس22 ، أو باستخدام مجموعة مواد تنقية بلازميد خالية من الذيفان.
      1. ريسوسبيند 56.25 ميكروغرام للحمض النووي (مزيج البلازميدات 4) في 1.125 مل الماء المعقم وإضافة 125 ميليلتر من 2.5 م كاكل2 (الحل A).
      2. إضافة مل 1.250 من 2 x HBS إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 15 مل (حل ب).
      3. إضافة الحل (مل 1.250) ب (1.250 مل) دروبويسي بينما محتدما مع 1 أو 2 مل ماصة (حل تعداء، إجمالي حجم مل 2.500).
      4. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      5. استخدام ميكروبيبيتي P1000، توزيع كل من حل تعداء (2.500 مل) أحادي الطبقة خلية دروبويسي.
    4. تبني بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  4. يوم 2: إزالة المتوسطة وإضافة 15 مل متوسطة جديدة (راجع الخطوة 2، 1).
  5. يوم 3: تجميع وتركيز المادة التي تحتوي على الجسيمات لينتيفيرال طافية.
    1. جمع المادة طافية (~ 70 مل) من كل (n = 5) تصفية transfected خلايا لوحات، من خلال 0.45 ميكرومتر بس تصفية وتعبئة أنابيب بوليالومير 2 (1 بوصة × 3.5 بوصة)/الفيروسية إعداد.
    2. تركز الجزيئات متجه تنبيذ فائق في 106,000 س ز ح 2.5، عند 15 درجة مئوية مع الفرامل.
    3. فورا بعد وقف تنبيذ فائق (لتجنب استثارة بيليه في الأنبوب)، بلطف صب المادة طافية في حاوية تحتوي على 10 ٪ التبييض وتعليق الكريات مرئية بالكاد 2 في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x (+ 1% جيش صرب البوسنة). هذا أمر طبيعي كما بيليه واضحة وصغيرة جداً. استخدام ناقل مركزة طازجة أو الكوة وتخزين الاستعدادات الفيروسية في-80 درجة مئوية.
      تنبيه: يحتوي المادة طافية على جزيئات لينتيفيرال التي يجب أن تكون أبيض دقيق قبل التخلص من النفايات واقية.
  6. إلى تيتراتي إعداد ناقلات الأمراض الفيروسية، استخدام أدوات إيمونوكابتوري p24 "اسكت" فيروس نقص المناعة البشرية-1 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    ملاحظة: لتوحيد إنتاج النواقل الفيروسية، ويمكن استخدام الكواشف المستندة إلى الدهنية. ومع ذلك عيار النواقل الفيروسية يعتمد اعتماداً كبيرا على كفاءة تعداء ونقاء بلازميد الحمض النووي.

3-توصيل خطوط الخلايا البشرية (مثل خلايا هيلا)

ملاحظة: خلايا هيلا تستزرع في متوسطة النسر معدلة دولبيكو لتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% و 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين الجلوتامين 2 مم. ويلخص الجدول 1 جميع موجهات المستخدمة في هذا البروتوكول. ويرد وصف لكل ناقل. توصيل خلايا هيلا يسمح تحقق تنظيم النسخي س. ب ترانسبوساسي في الجرعة أفضل مزيج من موجهات إيدلف اثنين. قد تكون متعلقة اختلاف جرعة إيدلف المتجهات المعايرة الجسيمات ونوع الخلية الهدف.

  1. اليوم 0: البذور 2 × 105 خلايا في 3 مل متوسط لكل بئر من لوحة 6-جيدا. إعداد 4 آبار.
  2. يوم 1: توصيل خلايا هيلا.
    1. لكل حالة، وتمييع ناقلات لينتيفيرال إلى وحدة تخزين نهائي لمتوسطة 1 مل (انظر الملاحظة أعلاه) حضور 10 ميكروليتر من بوليبريني (التركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل):
      تمييع جيدا #1: يسخرون من الخلايا ترانسدوسيد (مراقبة سلبية).
      تمييع جيدا #2: ناقل إيدلفتكسب (2,600 نانوغرام p24).
      تمييع لآبار #3، #4: ناقل إيدلفتكسب (2,600 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2s-ناقلات M2 (9,600 نانوغرام p24).
    2. إزالة المتوسطة من كل بئر حيث كانت خلايا هيلا مطلي في اليوم 0 وإضافة تخفيف لينتيفيرال متجه إلى المقابلة جيدا.
    3. سبينوكولاتي لوحة 6-جيدا في غ س 754 لمدة 45 دقيقة في 20-25 درجة مئوية، وثم نقل لوحة 6-جيدا إلى خلية ثقافة حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    4. بعد ح 6، استبدال ناقلات تحتوي على المتوسط بمتوسطة جديدة في جميع الآبار وإضافة الدوكسي إلى 1 ميكرومتر في شكل جيد #4. وضع اللوحة حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية ح 48.
  3. يوم 3: إعداد بيليه خلية لاستخراج الحمض النووي الريبي.
    1. قبل فصل الخلايا، تعد حلاً عامل التربسين (س 1):
      2.5% التربسين (10 x) مل 5.0
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 5 ملم) 0.5 مل
      1 × مل 44.5 برنامج تلفزيوني
    2. حل العامل التربسين الحارة في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تخزين التربسين العامل الحل عند 4 درجة مئوية.
    3. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x. إضافة 0.5 مل حل عملي التربسين قبل حرارة 37 درجة مئوية لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة 7 (في حاضنة ثقافة خلية).
    4. بعد الاحتضان، إضافة 0.5 مل المحتوية على مصل متوسطة لكل بئر لإلغاء تنشيط التربسين وجمع الخلايا في أنبوب الطرد مركزي. أشطف جيدا مرة واحدة مع 3 مل من س 1 برنامج تلفزيوني كل، والطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 240 x ز.
    5. تغسل الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 240 x ز وتجاهل المادة طافية. استخدام الكريات الخلية الطازجة التي يتم جمعها أو تخزينها في-80 درجة مئوية. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الكريات لأداء شبه كمي RT-PCR (راجع الخطوة 6).

4-توصيل الخلايا الأولية البشرية (على سبيل المثال، الكيراتينيه)

ملاحظة: يتم المصنف الكيراتينيه الأولية البشرية على دكت المشع 3T3-J2 الخلايا (وحدة تغذية طبقة)23، هدية نوع من براندون يان (لوزان، لوزان، سويسرا).

  1. تنمو خلايا الفأر السويسري 3T3-J2 في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو وتستكمل مع المانحين 10% مصل البقر والبنسلين U/mL 50-ستربتوميسين الجلوتامين 4 مم (3T3 المتوسطة).
  2. تنمو الخلايا الكيراتينيه مطلي على خلايا المشع دكت 3T3-J2 في المتوسط كفاد و "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو و F12 وسائط مزيج في لحم الخنزير (3:1) تحتوي على مصل بقرى الجنين (10%)، الجلوتامين (2%) الأنسولين (5 ميكروغرام/مل)، (الأدنين، البنسلين-ستربتوميسين (1%) 0.18 مم)، الهيدروكورتيزون (0.4 ميكروغرام/مل)، والسمية الكوليرا (0.1 nM)، و triiodothyronine (2 نانومتر).
  3. اليوم 0: البذور 3 × 105 دكت المشع الخلايا 3T3-J2، تضعف سابقا في 3T3 المتوسطة إلى تركيز نهائي 1 × 105 خلايا/مل، في كل من لوحة 6-جيدا جيدا. إعداد الآبار 9.
  4. يوم 1: توصيل من الخلايا الكيراتينيه الأولية
    ملاحظة: توصيل من الخلايا الكيراتينيه يسمح التحديد الكمي لتنظيم النسخي س. ب ترانسبوساسي في الجرعة أفضل مزيج من موجهات إيدلف اثنين (بواسطة qRT-PCR) والتحقق من التكامل من "حكومة الهند" (التجارة والنقل) في الخلايا الهدف (بواسطة سيتوفلوريميتريك تحليل).
    1. قبل فصل الخلايا، تعد الحل العامل التربسين:
      0.5% التربسين-يدتا (10 x) مل 5.0
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 5 ملم) 0.5 مل
      1 × مل 44.5 برنامج تلفزيوني
    2. حل العامل التربسين الحارة في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تخزين التربسين العامل الحل عند 4 درجة مئوية.
    3. لفصل الخلايا الكيراتينيه سوبكونفلوينت في الثقافة، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة 1 مل من محلول العامل التربسين المعالجون مسبقاً لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة الثقافة الخلية.
    4. بعد الاحتضان، ريسوسبيند خلايا جيدا جيدا ونقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي الذي يحتوي على 2 مل المحتوية على مصل المتوسطة (إذا كان لا يزال يتم إرفاق العديد من الخلايا، احتضانها مين إضافية عند 37 درجة مئوية). أشطف جيدا مرة واحدة مع 3 مل 1 x متوسط جديدة أو برنامج تلفزيوني كل وإضافة الحل شطف الأنبوب الطرد المركزي مع تعليق خلية.
    5. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
    6. تغسل الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
    7. في أنبوب البولي بروبلين 15 مل، تمييع الكيراتينيه 1.6x105 في 1 مل متوسطة كفاد، تمييع واحدة لكل حالة.
    8. تمييع ناقلات لينتيفيرال في 1 مل متوسطة كفاد حضور 20 ميكروليتر من بوليبريني (تركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل في وحدة تخزين نهائي لمل 2):
      تخفيف لآبار #1، #2، #3: يسخرون من الخلايا ترانسدوسيد (مراقبة سلبية دون المتجهات).
      تخفيف لآبار #4، #5: ناقل إيدلفتكسب (13,000 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2s-ناقلات M2 (48,000 نانوغرام p24).
      تخفيف لآبار #6، #7، #8، #9: ناقل إيدلفتكسب (13,000 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2s-ناقلات M2 (48,000 نانوغرام p24) + ناقل IDLVT2 (9,160 نانوغرام p24).
    9. ترانسدوسي الخلايا في تعليق بإضافة كل تمييع متجه لينتيفيرال (1 مل) إلى تعليق keratinocyte المقابلة (الكيراتينيه 1.6x105 في 1 مل).
    10. إزالة المتوسطة من دكت المشع 3T3-J2 الخلايا المصنفة في اليوم 0 ولوحة ترانسدوسيد الكيراتينيه (1.6x105 الكيراتينيه في 2 مل) لهم. وبعد ترانسدوسينج فضلا عن المضي قدما في المرحلة التالية.
    11. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم نقل الخلايا إلى 37 درجة مئوية في ثقافة الخلية الحاضنة ح 6.
      ملاحظة: هل لا الكيراتينيه سبينوكولاتي الأولية، كما البقاء والانتشار ستتأثر بشدة.
    12. بعد ح 6، إضافة 1 مل متوسطة كفاد لكل بئر. أضف 1 ميكرومتر الدوكسي (تركيز النهائية) في الآبار #5 و #8 و #9. إعادة الخلايا إلى 37 درجة مئوية.
  5. يوم 2: استبدال المتوسطة كفاد مع 3 مل متوسطة كيه سي مع 10 نانوغرام/مل مماثلة.
  6. يوم 3: تريبسينيزي ويغسل خلايا من آبار #1 و #4 و 5 # كما هو موضح من قبل (انظر 4.4.1 إلى 4.4.6). تجميد الخلايا الكريات في-80 درجة مئوية لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي لتحليل qRT PCR (راجع الخطوة 7).
  7. تريبسينيزي الخلايا من جيدا #2، #6 و #8 كما هو موضح في الخطوات 4.4.1 إلى 4.4.5 وإجراء تحليل سيتوفلوريميتريك للتعبير التجارة والنقل (راجع الخطوة 5).
  8. الحفاظ على الثقافة من آبار #3 و #7 و #9 دوبلينجس على الأقل 3-4، كافية لإضعاف الأمم المتحدة المتكاملة لناقلات الأمراض IDLVT2 (5 أيام للبشرية الكيراتينيه الابتدائي مطلي في تغذية طبقة).
  9. يوم 6: 5 أيام تقريبا وظيفة توصيل، تريبسينيزي الخلايا (انظر الخطوات 4.4.1 إلى 4.4.5) من آبار #3، #7، و 9 # لإجراء تحليل سيتوفلوريميتريك للتعبير بروتينات فلورية خضراء (راجع الخطوة 5).
    ملاحظة: تتأثر الكفاءة توقيت وتوصيل التجربة عالية حسب نوع الخلية الأولية وتقلب من العينات التي تم جمعها.

5-سيتوفلوريميتريك تحليل الكيراتينيه الابتدائية ترانسدوسيد

ملاحظة: سيتوميتير تدفق تكوينه باستخدام ليزر أزرق (488 نانومتر)، ليزر أحمر (633 نانومتر) ومرشحات ليعمل الكشف عن الأسفار التجارة والنقل، وآسيا والمحيط الهادئ (انظر الجدول المواد).

  1. لتمييز الخلايا الكيراتينيه من طبقة وحدة تغذية 3T3-J2، الماوس التسمية ترانسدوسيد الكيراتينيه منفصلة في يوم 3 ويوم 6 (انظر الخطوات 4.7 و 4-9) مع APC [مونوكلونل]-مترافق تغذية المضادة الأجسام المضادة.
    1. إعداد 4 مل من تلطيخ المخزن المؤقت لكل عينة:
      5% FBS 200 ميكروليتر
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 2.5 ملم) 20 ميكروليتر
      برنامج تلفزيوني 1 x 3780 ميكروليتر
    2. يغسل خلايا منفصلة مع 1 مل من تلطيخ المخزن المؤقت. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
    3. في أنبوب لاقتناء التدفق الخلوي، ريسوسبيند 5 × 104 خلايا في 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت المصبوغة وإضافة 2 ميكروليتر من الأجسام المضادة التغذية (01:50). يخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
    4. وبعد 30 دقيقة، يغسل مع 2 مل من تلطيخ المخزن المؤقت. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت.
    5. الحصول على إشارات APC والتجارة والنقل ب تحليل سيتوفلوريميتريك18. بروتينات فلورية خضراء+ خلية جزء صغير من السكان خلية الجيش الشعبي الكونغوليتشير إلى الخلايا الكيراتينيه ترانسدوسيد.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، إصلاح العينة الملون قبل التدفق الخلوي مع بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني 1 x ومخزن في 4 درجات مئوية في الظلام حتى التشغيل.
  2. تحليل بيانات التدفق الخلوي بالتآمر النسبة بين النسبة المئوية للتجارة والنقل+الخلايا عند نقطة النهاية (5 أيام) والنسبة المئوية للتجارة والنقل+الخلايا أيام 2 وظيفة توصيل، تطبيع لمستوى المتبقية من IDLVT2-ترانسدوسيد الخلايا.

6-شبه كمي RT-PCR

ملاحظة: استخدم بكر cycler حرارية.

  1. استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي من ترانسدوسيد أو التحكم في الخلايا باستخدام مجموعة مواد تنقية الجيش الملكي النيبالي، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن تخزين إجمالي الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
  2. توليف كدنا في رد فعل 20 ميليلتر استخدام 100 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، ومجموعة المنتسخة العكسية، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن تخزين كدنا في-20 درجة مئوية.
  3. كبسولة تفجير تصميم محددة ل SB100X، rtTA2s-M2 وجابده (جين التدبير المنزلي).
    تصاميم مقترحة:
    SB الأمام التمهيدي:-جككاكتكاجكاجاجاج 5 '-3'
    SB عكس التمهيدي:-جتجتجاجاكككاتتجك 5 '-3'
    rtTAM2 إلى الأمام التمهيدي:-جاكجاكاجااكتكجكتك-3 5''
    rtTAM2 عكس التمهيدي:-تاكككججاجكاتجتكا 5 '-3'
    جابده الأمام التمهيدي:-جاككاكاجتككاتجككاتكاك 5 '-3'
    جابده عكس التمهيدي: 5 'ككاككاكككتجتجكتجتاج3'
  4. إجراء PCR في حجم رد نهائي من 50 ميليلتر. على وجه الخصوص، التجمع في كل أنبوبة بكر رد فعل التالي:
    كدنا (1:5 إضعاف) (من الخطوة 6، 2) 1.00 ميليلتر
    إلى الأمام التمهيدي (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
    عكس التمهيدي (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
    دنتبس (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
    المخزن المؤقت (+ مجكل2) (الأسهم 10 x) 5.00 ميليلتر
    بوليميراز بوليميراز (5 أسهم يو/ميليلتر) 0.25 ميليلتر
    ميليلتر الماء المعقم 40.75
  5. استخدام البرنامج التالي من cycler الحرارية: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تمضي إلى 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ق لدورات SB100X 34، 32 دورات ل rtTA2s-M2 ، و 25 دورات جابده.
  6. إعداد 1% [اغروس] هلام. حل ز 1 من [اغروس] في 100 مل TBE 1 × (10 x الأسهم المخفف في الماء المعقم)، في الكأس أو قارورة. تذوب في فرن ميكروويف، يحوم كل دقيقة حتى يذوب تماما [اغروس]. بارد [اغروس] ذاب حتى تصل إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية، ثم قم بإضافة 5 ميليلتر اثيديوم بروميد (الأوراق المالية 10 ملغ/مل). صب ذاب [اغروس] في علبة جل المجتمعين بمشط، لصب جل.
  7. تحميل عينات (10 ميليلتر في كل) على [اغروس] هلام وإجراء التفريد.
  8. إذا رغبت في ذلك، الحصول على صورة جل وإجراء تحليل دينسيتوميتريك على عصابات PCR.

7-الكمية RT-PCR (قرة-PCR)

ملاحظة: يعمل "نظام الكشف عن تسلسل" التجارية. [بكر] كبسولة تفجير، ومسبار 6-كاربوكسيفلوريسسين (الاتحاد الماليزي) لنازعة 3-فوسفات جليسيرالديهيدي (جابده) يتم شراؤها تجارياً.

  1. للرجعية-النسخ، راجع الخطوة رقم 6، 2.
  2. استخدام البرمجيات لتصميم أجهزة الإشعال والتحقيق المحددة ل SB100X.
    التصميم المقترح:
    SB.2 إلى الأمام التمهيدي:-جاجاجككاكتجكتككااا 5 '-3'،
    SB.2 عكس التمهيدي:-ككككاتجتجكاجتجكا 5 '-3'
    التحقيق في الاتحاد الماليزي SB:-كاتاجااجككاجاكتاكج 5 '-3'
  3. إجراء PCR الوقت الحقيقي في لوحات 96-جيدا مع مزيج سيد بكر وخلط كبسولة تفجير + التحقيق، في حجم رد نهائي من 25 ميليلتر. على وجه الخصوص، النظر في الرد التالي لكل بئر:
    كدنا (01:10 إضعاف في الماء المعقم) 1.00 ميليلتر
    2 × ميليلتر ميكس ماجستير 12.50
    كبسولة تفجير + 20 x مسبار مزيج ميليلتر 1.25
    ميليلتر الماء المعقم 10.25
    ملاحظة: تنفيذ جميع ردود الفعل في ثلاث نسخ. لمنع الأخطاء بيبيتينج، إعداد مزيج لردود على الأقل n + 3 (دون كدنا). قاسمة استخدام ماصة متعددة القنوات.
  4. تشغيل PCR الوقت الحقيقي باستخدام البرنامج التالي: 1 دورة في 95 درجة مئوية عن 10 دقيقة، ثم دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 15 s و 60 درجة مئوية 1 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
  5. تحليل بيانات qRT PCR بتطبيع التعبير النسبي (RQ القيمة) من SB100X إلى مستوى جابده من نفس العينة كدنا بالكميCT ΔΔ2، استخدام برمجيات تحليل البيانات النموذجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام الإجراء المعروضة هنا، ثلاث ناقلات إيدلف تحمل مكونات بينالي الشارقة ينظم (SB100X، rtTA2S-ينقول M2 وبروتينات فلورية خضراء-T2) تم تعبئتها واستخدامها لكفاءة تقديم وتنظيم أحكام نظام بينالي الشارقة في الخلايا البشرية. ويبين الشكل 1A مخطط في المختبر توصيل خلايا هيلا، الذي أجرى لتقييم تنظيم النسخي س. ب ترانسبوساسي مع الجرعة أفضل مزيج من موجهات إيدلف اثنين (ذكر في الجدول 2). تنظيم النسخي SB100X كان يقاس قرت-بكر (الشكل 1B) ورسم كقيمة كمية نسبية (RQ) فيما يتعلق بإيقاف الدولة (RQ وحدها إيدلفتكسب = 1). في خلايا هيلا ترانسدوسيد، تم الحصول على تفعيل 8-fold (+ دوكس) للتعبير SB100X على الخلفية (إيدلفتكسب). جدير بالذكر أن خلايا هيلا كوترانسدوسيد في غياب دوكس أظهر التعبير ترانسبوساسي قابلة للمقارنة للدول خارج، مشيراً إلى رقابة صارمة من مروج تيتك بواسطة rtTA2s-M2 المغير.

Figure 1
الشكل 1: توصيل هيلا الخلايا للتعبير عن ترانسكريبتيونالي-وينظم ترانسبوساسي SB تحملها ناقلات إيدلف. (أ) نظام لتوصيل في المختبر من خلايا هيلا مع إيدلفس للتعبير عن ترانسبوساسي. (ب) تحليل qRT PCR خلايا هيلا ترانسدوسيد مع إيدلفتكسب (2,600 نانوغرام p24) في وجود (+) أو عدم وجود (-) IDLVrtTA2S-M2 (9,600 نانوغرام p24) و 1 ميكرومتر الدوكسي (دوكس). خط متقطع يربط عينات عرض قيم مختلفة إلى حد كبير (* * * ف < 0.005). وأجريت التجربة في ثلاث نسخ. يعني S.E.M يظهر كأشرطة الخطأ. (الرقم معدلة من Cocchiarella، واو et al., 201618). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

على سبيل مثال، ويبين الشكل 2 جرعة تتراوح بين التجربة للتوصل إلى تنظيم النسخي الأمثل ترانسبوساسي. كانت ترانسدوسيد خلايا هيلا مع زيادة جرعات (130 و 260 و 2,600 نانوغرام p24) من إيدلفتكسب في تركيبة مع IDLVrtTA2s-M2 (960 و 9,600 نانوغرام من p24)، في وجود أو عدم وجود دوكس. شبه كمي RT-PCR التحليل يبين بوضوح أن جرعات عالية من كلا إيدلفس مطالبون بالحث بشدة على التعبير SB100X. نوع الخلية المستهدفة المختلفة والاختلافات في معايرة ناقلات الأمراض الفيروسية قد يؤدي التعبير SB سوب الأمثل، وذلك، نوصي بإجراء تجارب تحديد الجرعة.

Figure 2
رقم 2: تجربة إعداد جرعة إيدلف في خلايا هيلا لتحديد الجرعة المثالية المزيج من إيدلفس اثنين. تحليل RT-PCR شبه كمي في خلايا هيلا ترانسدوسيد المشترك بجرعات مختلفة من ناقلات إيدلفتكسب (130 و 260 و 2,600 نانوغرام p24) في غياب أو وجود IDLVrtTA2s-M2 المتجهات (نغ 960 و 9,600 من p24) ودوكس. اتسع نطاق جابده كعنصر تحكم قياسي. SB100X ترانسبوساسي و rtTA2s-M2 التعبير يتم الإبلاغ عنها في جميع الظروف المختبرة؛ NC = المراقبة السلبية. (الرقم معدلة من Cocchiarella، واو et al., 201618). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

يمكن أيضا استخدام نظام بينالي الشارقة ينظم النسخي في الخلايا الأولية، لا سيما في تلك الخلايا مقاومة للعديد من الأساليب تعداء، مثل الخلايا الكيراتينيه الأولية البشرية. ويبين الشكل 3 مخطط لتوصيل من الخلايا الكيراتينيه الأولية المزروعة في دكت المشع 3T3-J2 تغذية طبقة، مع إيدلف ناقلات تحمل مكونات SB الخاضعة للتنظيم، في وجود أو عدم وجود دوكس للحث على التعبير SB100X.

Figure 3
الشكل 3: توصيل في تعليق للبشرية الكيراتينيه الأولية مع إيدلف متجهات للتعبير عن ترانسبوساسي بينالي الشارقة ينظم ترانسكريبتيونالي وينقول. نظام لتوصيل في المختبر للبشرية الكيراتينيه الأولية مع إيدلفس للتعبير عن ترانسبوساسي بينالي الشارقة ينظم ترانسكريبتيونالي وينقول، في وجود أو عدم وجود 1 ميكرومتر دوكس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تحليل qRT PCR في الشكل 4A يظهر أن جرعة الأفضل مزيج من ناقلات ترانسبوساسي والمغير، وذكرت في الجدول 2، أدى إلى تنشيط 15-fold SB التعبير حول خارج الدولة (-دوكس). تم إجراء التجربة تبديل في الكيراتينيه ترانسدوسيد مع ثلاث ناقلات إيدلف (إيدلفتكسب، IDLVrtTA2s-M2 و IDLVT2) في وجود أو عدم وجود دوكس. وتم قياس التعبير "حكومة الهند" التجارة والنقل beared قبل T2-ينقول، في حجرة APC ، بتحليل تدفق cytometer 2 يوما بعد توصيل (dpt) وفي اندوبوينت للثقافة (5 أيام للبشرية الكيراتينيه الأولية). وتم التوصل إلى نقطة النهاية عندما تدمج T2-التجارة والنقل ينقول انخفض إلى مستوى بالكاد يمكن كشفها (في متوسط 0.6 في المائة) بسبب تمييع تعتمد على انقسام الخلية. يظهر الشكل 4B النسبة بين النسبة المئوية للتجارة والنقل+ الخلايا في حجرة APC في النهاية والأيام 2 وظيفة توصيل، طبعت على مستوى ينقول وحدها المتبقية. وهذا يشير إلى النسبة المئوية للخلايا استضافة نسخة على الأقل 1 من حكومة الهند أعرب ستابلي المتكاملة في على الجينوم، المقررة في 12% للبشرية الكيراتينيه الأولية.

Figure 4
الشكل 4: تحليل للتعبير عن ترانسبوساسي والتجارة والنقل في ترانسدوسيد البشرية الكيراتينيه الأولية. (أ) الإنزيم qRT-PCR في الابتدائي الكيراتينيه ترانسدوسيد مع إيدلفتكسب و IDLVrtTA2S-M2 في وجود أو عدم وجود دوكس 1 ميكرومتر. (ب) توصيل المشارك من الخلايا الكيراتينيه الأولية مع ينقول IDLVT2 وإيدلفس للتعبير ترانسبوساسي في وجود أو عدم وجود دوكس. على المحور الصادي، خلايا % بروتينات فلورية خضراء+ 5dpt/% بروتينات فلورية خضراء+ الخلايا 2 dpt * 100 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة لتجربتين). * * إظهار القيم تختلف اختلافاً كبيرا (ف < 0.05). (الرقم معدلة من Cocchiarella، واو et al., 201618). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

بلازميد الوصف مراجع
تيتوتكسب بككل نقل بلازميد المستخدمة لتوليد متجه إيدلفتكسب. هذا بلازميد مشتقة من بتيتوتكسب، بعد استنساخ تيتوتكسب في العمود الفقري لينتيفيرال بتشل. 18، 20
بتشل-PGKrtTA2S-M2 نقل بلازميد المستخدمة لتوليد IDLVrtTA2s-ناقلات M2. قدمتها أ. د. ف زابافيجنا
بتشل-T2GFP نقل بلازميد المستخدمة لتوليد متجه IDLVT2. هذا بلازميد مشتقة من pT2GFP، بعد استنساخ التجارة والنقل بين مصلحة الضرائب ينقول T2 في العمود الفقري لينتيفيرال بتشل. 18، 20
pMD.Lg/pRRE.D64VInt التعبئة والتغليف بلازميد لتوليد متجه إيدلف. 19
pMD2.G بلازميد الترميز للمغلف ز منظمة لتوليد متجه لينتيفيرال. 20
برسف-القس بلازميد Rev لتوليد متجه لينتيفيرال. 20
ناقل الوصف
إيدلفتكسب التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة للتعبير عن SB100X تحت سيطرة المروج تيت تستجيب المعارف التقليدية.
IDLVrtTA2s-M2 التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة للتعبير عن rtTA2s-المغير M2 تحت سيطرة PGK المروج.
IDLVT2 التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة للتعبير عن حكومة الهند استنساخ بين مصلحة الضرائب ينقول T2.

الجدول 1: البلازميدات ومتجهات المستخدمة في هذا البروتوكول- وترد أوصاف والمراجع.

ناقلات هيلا (2 × 105 خلايا) الكيراتينيه (1.6x105 خلايا)
إيدلفتكسب 2,600 ng p24 13,000 ng p24
IDLVrtTA2s-M2 9,600 ng p24 48,000 ng p24
IDLVT2 9,160 ng p24

الجدول 2: جرعات ناقلات الأمثل لتوصيل هيلا الخلايا والخلايا الكيراتينيه الأولية البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يمكننا وصف منهجية متاحة على نطاق واسع لإدماج غوي ستابلي في جينوم الخلايا المستهدفة الجمال النائم-بوساطة تبديل. على الرغم من أن وضع نظام بينالي الشارقة لتوفير أسلوب فاجيناليس للتحرير الجينوم، تسليم كفاءة إليه التكامل (ترانسبوساسي وينقول T2) إلزامي. ولذلك، استخدام نظام بينالي الشارقة على الخلايا الأولية لا يكاد ترانسفيكتابل، جرت متابعة عملية تسليم فيروسية لمكونات SB في السنوات الأخيرة10،،من1215. غير أن أيا من النواقل الفيروسية المستخدمة تصل إلى الآن تناول مسألة التعبير التأسيسي من ترانسبوساسي التي يمكن أن يسفر عن مخاطر ريهوبينج لا يمكن السيطرة عليها ينقول.

لتنظيم ترانسكريبتيونالي التعبير ترانسبوساسي، أخذنا الاستفادة من النظام على تيت معدلة16. مروج المعارف التقليدية الحد الأدنى تنصهر فيها العنصر تيتو، عند الربط إلى rtTA2s-المغير M2 حضور دوكس، المخولة الضبط الدقيق للتنشيط ترانسبوساسي على الخلفية (إيقاف-الدولة، في غياب دوكس). الأداء التنظيمي يعتمد على إيدلفس المناسبة (إيدلفتكسب و IDLVrtTA2s-M2) ناقلات تركيبة الجرعة وفي أنواع الخلايا (مثل خلايا هيلا والبشرية الكيراتينيه الأولية). بشكل مستقل عن الخلايا الهدف، الجرعة ناقلات يجب ضمان أعلى مستوى لتوصيل الخلايا المستهدفة دون التأثير على بقاء الخلية، وبالتالي الجمع بين جرعة تصاعد التجربة في خلايا هيلا (أو خطوط الخلايا الأخرى) لتحديد جرعات الأمثل، بواسطة شبه كمي الرايت-بكر، يقترح بشدة.

وقيمت نقل حكومة الهند في الخلايا الأولية. كانت ترانسدوسيد البشرية الكيراتينيه الأساسية المصنفة في 3T3-J2 المشع دكت تغذية طبقة مع إيدلفس 3 (إيدلفتكسب، IDLVrtTA2s-M2 و IDLVT2) بجرعات محددة تجريبيا. وتجلى تفعيل واضحة تعتمد على دوكس ترانسبوساسي بكر قرة. وعلاوة على ذلك، تجلى تكامل مستقرة من حكومة الهند تحليل سيتوفلوريميتريك التعبير بروتينات فلورية خضراء في الخلايا ترانسدوسيد في وجود أو عدم وجود دوكس، مما يشير إلى إمكانية استخدام منصة إيدلف للمركبات بينالي الشارقة ينظم ترانسكريبتيونالي مكونات الخلايا الأولية، وإدماج غوي ناجحة في جينوم الخلايا المستهدفة.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي إنتاج ناقلات إيدلف وتوصيل الخلايا المستهدفة في الكفاءة المثلى وتركيبة الجرعة متجه. قد يؤدي إلى كفاءة منخفضة تعداء الخلايا HEK293T ناقلات منخفضة الغلة. تعريف جرعات من إيدلفتكسب و IDLVrtTA2s-M2 ضروري لتجنب عدم الاتزان تيت على المكونات التي قد ينتج يجتازها عالية في غياب المغير أو في حظيرة منخفضة الاستقراء من المروج تيتوتك عند معاملة دوكس. ويمكن تناول هذه الخطوات الحاسمة بتعديلات طفيفة. على سبيل المثال، يمكن أن تكون موحدة البروتوكول تعداء استخدام الكواشف تعداء التجارية. ينبغي أن يكون البروتوكول توصيل تكييفها وفقا لنوع الخلية من الاهتمام، لا سيما في ضوء ما إذا كان سبينوكوليشن يزيد من كفاءة توصيل دون التأثير على بقاء الخلية. يمكن أن تكون إضافة إلى متوسط الثقافة من الخلايا الهدف ناقلات وبوليبريني واستبدالها بالطازجة المتوسطة بعد الاحتضان ح 6 أو بين عشية وضحاها. كما تجدر الإشارة إلى أن النسبة المئوية للتجارة والنقل+ الخلايا بعد توصيل يمكن أن تتأثر بدمج الخلفية إيدلفس 5 أيام.

حد طفيفة من هذا الأسلوب أن ناقلات إيدلف تنتجها عابر تعداء الخلايا HEK293T. اعتماداً ناقلات تكرار الجرعات التي ستستخدم، ناقل للإنتاج المطلوبة. القيد ثاني بطول غوي، كما قدرة الشحن لناقلات إيدلف حوالي 8 كيلو بايت.

وفي الختام، يسمح هذا الأسلوب هنا إدماج غوي من خلال التنظيم ترانسكريبتيونالي SB المكونات في ناقلات إيدلف، والذي، من بين الأساليب القائمة لتسليم نظام بينالي الشارقة، تظهر مجموعة واسعة نطاق من انتحاء وتوصيل عالية الكفاءة وتعبئتها. وعلاوة على ذلك، يسمح النظام تيت على تعديل لائحة النسخي التعبير SB100X، مسألة ذات صلة في خطر ينقول إعادة التنقل أو في أحداث تبديل تسلسلية متعددة إذا كانت مطلوبة. وتشمل التطبيقات المحتملة لهذا الأسلوب هندسة الجينوم من خطوط الخلايا (مثل الخلايا هيلا، الخلايا HEK293) إنشاء خلايا التغليف مستقرة لناقلات الأمراض الفيروسية، وإدماج الجينات العلاجية السريرية الخلايا الأولية ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر الأستاذ زابافيجنا وجامعة مودينا ريجيو إميليا، مودينا، إيطاليا لتزويدنا بما بتشل-PGKrtTA2S-بلازميد M2. ونعترف أيضا زين Z. إيفيكس (معهد بول الريش، أنغن، ألمانيا)، والأستاذ الدكتور زهير إيزفاك (ماكس ديلبروك مركز "الطب الجزيئي"، برلين، ألمانيا) والبلازميدات pCMVSB100X و pT2/البوسنة والهرسك. أيد هذا العمل ديبرا الدولية ووزارة الجامعة والبحث الإيطالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine Lonza BE12-614F Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized GE Healthcare Life Sciences SH30071.03 Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml Lonza DE17-602E Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM Lonza BE17-605E Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline Lonza BE17-737E Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% Merck 106580 Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl) Sigma-Aldrich 320331 Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection Fresenius Kabi - Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter Whatman 10462100 Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes Beckman Coulter 326823 Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg Lonza BE17-516F Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit Perkin Elmer NEK50001KT Kit for IDLV particle titration.
Polybrene Sigma-Aldrich 107689 Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg GIBCO BE17-160E Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) 100938B AnalaR BDH Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) GIBCO 15400-054 Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin GIBCO 16030-074 Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media GIBCO 21765 Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum Lonza DE14-801F Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin GIBCO 10099-141 Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 Reagents for keratinocyte growth.
Adenine VWR 1152-25 Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone VWR 3867-1 Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Sigma-Aldrich C8052 Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T5516 Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF Austral Biological GF-010-9 Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody Miltenyi Biotech 130-096-099 To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase Life Technologies 18080051 Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) Sigma-Aldrich D7295 Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (any) - Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase Promega M740B Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology Sigma-Aldrich A9539 Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X Invitrogen 15581028 Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510 Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline Sigma-Aldrich D-9891 drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystem 4304437 TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon Corning 352096 Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile Falcon Corning 353025 Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile Falcon Corning 353046 Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL Eppendorf 0030 120.094 Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free (any) - Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystem 4346906 96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap BD Falcon 352052 Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) (any) - Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) (any) - Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter (any) - Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler (any) - Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment (any) - Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2 BD - Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 7900HT Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. (any) - Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor Beckman Coulter - Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41, (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36, (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28, (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41, (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9, (11), e112712 (2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137, (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8, (10), e75344 (2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8, (10), e76771 (2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16, (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39, (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19, (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12, (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1, (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics