Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Benati, D., Cocchiarella, F., Recchia, A. An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector. J. Vis. Exp. (131), e56742, doi:10.3791/56742 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Uyuyan güzel (SB) transposon gen transferi ve fonksiyonel genomik için kanıtlanmış etkinliği ile viral entegre bir sistemdir. SB transposon makine en iyi duruma getirmek için bir transcriptionally düzenlenmiş hiperaktif transposase (SB100X) ve T2 tabanlı transposon istihdam edilmektedir. Genellikle, transposase ve transposon geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve SB100X ifade bir bünye düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir. Burada, SB100X ifade denetlemek ve stabil bir gen ilgi (GOI) "kes ve Yapıştır" SB ile tümleştirmek için çeşitli fiziksel ve kimyasal transfection yöntemler dayanıklıdır insan hücreleri SB bileşenleri sunmak için verimli bir yöntem tarif mekanizma. Hiperaktif transposase ifade sıkı gen ekspresyonu 1992'den beri denetlemek için yaygın olarak kullanılan Tet-ON sistem tarafından kontrol edilir. Gen ilgi ters yineler (IR) T2 transposon tarafından çevrili olduğunu. Her iki SB bileşenleri arızalı lentiviral vektörler geçici HEK293T hücrelerinde üretilen entegre olarak paketlenir. İnsan hücreleri, hücre hatları veya Primer hücre insan dokusundan vitro geçici viral Vektörler ile transduced vardır. Doksisiklin (dox, tetrasiklin analog) ek kültür orta içine, üzerine bir transposase ifade ince ayar ölçülür ve gen tedavi hücre genomu ilgi uzun ömürlü entegrasyonunu sonuçları. Bu yöntem etkili ve uygulanabilir hücre kültürünü (örneğin, HeLa hücreleri) ve Primer hücre (örneğin, insan birincil lenfositi) ve böylece genetik mühendisliği ve tedavi gen transferi için değerli bir araç temsil eder.

Introduction

T2-esaslı transposon birleştiğinde hiperaktif SB100X transposase preklinik gen terapisi uygulamaları1,2,3' te, genom değişiklikler4,5, zaten kullanılmış ve İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC)6,7yeniden programlama. Genellikle, SB bileşenleri geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve güçlü bir bünye organizatörü transposase ifade ediyor. Ancak, transfection gelişmiş yeni yöntemler rağmen birçok uygulama için bir meydan okuma iki bileşenli sistemi teslimini kalır. Böylece, yeni bir teslim iletişim kuralı geliştirilmesi artan ilgi vardır. Plazmid8 ve mRNA9transfection yöntemlerinin yanı sıra, viral teslim dayalı adenoviral10,11, adeno ilişkili viral (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 ve lentiviral vektörler15 geçmişte önerdi. Özellikle, seçim sistemi viral vektör entegrasyonunu olmadan SB bileşenlerinin geçici bir teslimatlar garantilemelidir. Yine de, transposase kurucu ifade güvenlik kaygıları nedeniyle kontrol edilemeyen transposon rehopping riskini yükseltir.

Bu nedenle, bir rafine Tet-ON sistem tarafından transkripsiyon düzenleme SB100X, ilk mücadeledir. Herpes simpleks virüs-1 (HSV-1)16, Timidine kinaz (TK) gen en az organizatörü (-81) ile orijinal gelişmiş en az Sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici yerine kullanarak elde edilen bir değiştirilmiş Tet-duyarlı organizatörü klonlanmış, ters yönde SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Mutasyona uğramış ters-tetrasiklin-transactivator rtTA2s-M217 farklı bir plazmid klonlanmış güçlü kurucu organizatörü (phosphoglycerate organizatörü, PGK) kontrolü altında ifade edilir (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Kültür ortamına eklendiğinde rtTA2sdox bağlar-M2 modülatör ve karmaşık veya SB100X ifade18sıkıca düzenlenmiş indüksiyon sonuçlanan Tet organizatörü tethers.

İkinci büyük sorun insan Primer hücre verimsiz transfection çeşitli fiziksel ve kimyasal yöntemlerle ortaya çıkar. Transposase transfection, SB100X ve rtTA2sdayanıklı insan hücrelerinde verimli bir şekilde teslim etmek-M2 ifade kaset iki Tümleştirme arızalı lentiviral vektörler (IDLVs)19paketlenir: IDLVTKSB ve IDLVrtTA2s- M2. Viral vektörler geçici olarak üçüncü nesil vektörel çizimler HEK293T hücreleri20 ve pseudotyped Vescicular Stomatit virüs (VSV-G), hangi enfeksiyon geniş bir yelpazede confers glikoprotein G ile üretilmektedir. Vektör parçacıklar tarafından ultrasantrifüj konsantre ve HIV-1 Gag p24 immunocapture tarafından titre. Hücre satırları ve Primer hücre transduce için vektör parçacıklar polybrene ile complexed ve hedef hücreleri ile dox içinde inkübe. SB100X ifade transduced hücrelerin aktivasyonu uyuşturucu bağımlı kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)18tarafından ölçülür.

Tet düzenlenir SB100X ifadesi gösterdi sonra GOI (örneğin, yeşil flüoresan protein, GFP) transpozisyonu hedef hücre genomu içine Bak ve Mikkelsen21tarafından açıkça kapsamlıdır moleküler olayları izler. Üçüncü bir IDLV vektör taşıyan bir ifade kaset T2-transposon IRS (IDLVT2) arasında klonlanmış GOI için inşa ve yukarıda da belirtildiği gibi paketlenmiş vardır. Son olarak, üç IDLV vektörler verimli bir şekilde insan hücreleri (örneğin, birincil lenfositi) vitro transduce ve Doksisiklin18huzurunda GOI tümleştirmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plazmid istihdam

Not: Plazmid pCCL-PGKrtTA2S-M2 lütfen Prof. Zappavigna (üniversite, Modena ve Reggio Emilia, Modena, İtalya) tarafından sağlanan. Hiperaktif transposase kodlama dizisi taşıyan pCMVSB100X Plazmid ve pT2/BH transposon plazmid nazikçe Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Enstitüsü, Langen, Almanya) ve Prof. Dr. Z. Izvak (Max Delbruck Merkezi moleküler tıp, Berlin, tarafından verilmiştir Almanya).

  1. Tüm klonlama için Escherichia Coli içinde (E. coli), klonlama strateji seçimi ve restriksiyon enzimi yordam veya PCR güçlendirme parçasının klonlanmış için izleyin.
    Not: Tablo 1 tüm bu protokol için istihdam plazmid özetler. Bir açıklama ve her plazmid için başvurular sağlanır.

2. viral vektör üretim

Not: Viral vektörler biohazard başlıklı bir düzeyde BSL2 Biyogüvenlik çevreleme, kurumsal kurallara ve düzenlemelere göre üretilmektedir.

  1. Kültür yapisan HEK293T hücrelerde Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 HyClone serum, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 2 mM glutamin ile desteklenmiştir.
  2. 0. gün: beş 15 cm tabak/viral hazırlık ve tohum 5.5x106 hücreler orta 30 ml hazırlayın.
  3. 1. gün: Transfection
    1. Transfection başlamadan önce 2 x HEPES arabellek salin (HBS) 100 mL hazırlayın:
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10.0 mL
      Na2HPO4 (0, 5 M) 0.3 mL
      Steril su 84,1 mL
      PH %7.1 37 ile uyum HCl.
      Not: 2 x HBS 4 ° C'de saklanabilir Tam bir pH verimli transfection için son derece önemlidir. 7.10-7.12 optimum pH aralıktır.
    2. Orta kaldırın ve 22,5 mL/tabak taze orta 4 h transfection önce ekleyin.
    3. HEK293T hücreleri transferi plazmid, pMD.Lg/pRRE.D64VInt ambalaj plazmid, zarf kodlama pMD2.G Plazmid ve pRSV-Rev (Tablo 1) aşağıdaki miktar/plaka göre transfect:
      Plazmid 25,00 µg transfer
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µg
      pMD2.G 8,75 µg
      pRSV-Rev 6,25 µg
      Not: Plazmid DNA'lar Maniatis22 veya bir plazmid endotoksin ücretsiz arıtma seti kullanarak açıklanan CsCl protokolüne göre hazırlanır.
      1. DNA (4 plazmid karışımı) 56.25 µg 1,125 ml steril su resuspend ve 125 µL 2.5 M CaCl2 (a çözüm) ekleyin.
      2. 2 x HBS 1.250 mL steril 15 mL konik santrifüj tüpü (çözüm B) ekleyin.
      3. Çözüm (1.250 mL) B (1.250 mL) dropwise köpüren yaparken 1 veya 2 mL pipet ile eklemek (transfection çözüm, Toplam hacim 2.500 mL).
      4. (RT) oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
      5. P1000 micropipette kullanarak, tüm hücre monolayer transfection çözümü (2.500 mL) dropwise dağıtın.
    4. Gecede bir hücre kültür kuluçka 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya.
  4. 2. gün: Orta kaldırın ve taze orta 15 mL ekleyin (bkz. Adım 2.1).
  5. 3. gün: Toplamak ve lentiviral partikül içeren süpernatant konsantre.
    1. Tüm (~ 70 mL) süpernatant toplamak (n = 5) transfected hücre Kaplamalar, filtre PESS filtre ve 2 polyallomer tüpler (1 inç x 3,5 inç) doldurun 0,45 µm ile / viral hazırlık.
    2. Vektör parçacıklar tarafından ultrasantrifüj fren ile 15 ° C'de 2,5 h için 106,000 x g, konsantre ol.
    3. Hemen (Pelet tüp resuspension önlemek için) ultrasantrifüj, yavaşça durdurduktan sonra süpernatant % 10 çamaşır suyu içeren bir konteyner içine dökün ve 2 görünür zor granül 1 x PBS 100 µL içinde askıya alma (+ %1 BSA). Bu açık ve çok küçük Pelet olduğu gibi normaldir. Taze hazırlanmış veya aliquot konsantre vektör kullanın ve viral hazırlıklar-80 ° C'de depolayın
      Dikkat: Süpernatant iyice biohazard atık atılmadan önce ağartılmış gerekir lentiviral parçacıklar içerir.
  6. Viral vektör hazırlık titre için üreticinin protokolüne göre HIV-1 Gag p24 immunocapture seti kullanın.
    Not: lipozomlar tabanlı reaktifler viral vektör üretim standartlaştırmak için istihdam olabilir. Yine de, viral vektör titresi yüksek transfection verimliliği ve plazmid DNA saflığı bağlıdır.

3. iletim insan hücre hatları (örneğin, HeLa hücreleri)

Not: HeLa hücreleri % 10 fetal buzağı serum, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 2 mM glutamin ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal ortamda kültürlenir. Tablo 1 tüm bu protokol için istihdam vektörel çizimler özetler. Her vektör için bir açıklama sağlanmıştır. HeLa hücreleri iletim iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu SB transposase transkripsiyon Yönetmeliği doğrulanmasına izin verir. IDLV doz varyasyonu vektör parçacık titrasyon ve hedef hücre türü için ilgili olabilir.

  1. 0. gün: 2 x 105 için her şey bir 6-şey plaka orta 3 mL hücrelerde tohum. 4 kuyu hazırlayın.
  2. 1. gün: İletim HeLa hücre.
    1. Her koşul için bir son hacim 1 mL orta lentiviral vektörlerinin seyreltik (yukarıdaki nota bakın), polybrene (son konsantrasyon 8 μg/mL) 10 μL huzurunda:
      Seyreltme de #1 için: transduced hücreleri (negatif kontrol) alay.
      Seyreltme için de #2: IDLVTKSB vektör (2.600 p24 ng).
      Seyreltme kuyuları #3 #4 için: IDLVTKSB vektör (2.600 p24 ng) + IDLVrtTA2s-M2 vektör (9600 p24 ng).
    2. Nerede HeLa hücreleri gün 0 kaplama her kuyudan orta kaldırın ve lentiviral vektör dilutions için karşılık gelen de ekleyin.
    3. Spinoculate 6-şey plaka vasıl 754 x g 20-25 ° C ve sonra aktarmak 6-şey plaka bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2, 45 dk için.
    4. 6 h sonra bütün Wells taze orta orta içeren vektörel çizimler yerine ve Doksisiklin de 4 # 1 mikron ekleyin. Bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de 48 h için içine plaka koymak.
  3. 3. gün: Hücre Pelet hazırlanması RNA çıkarılması için.
    1. Hücreleri ayırma önce tripsin çalışan bir çözüm (1 x) hazırlayın:
      % 2.5 tripsin (10 x) 5.0 mL
      500 mM EDTA (son konsantrasyonu 5 mM =) 0.5 mL
      PBS 44.5 mL x 1
    2. Sıcak tripsin çalışma çözüm kullanmadan önce 37 ° C'de. Tripsin çalışma çözüm 4 ° C'de depolayın
    3. Orta kaldırmak ve hücreleri 1 x PBS ile yıkayın. Her şey için 0.5 mL Önceden ısıtılmış 37 ° C tripsin çalışma çözeltisi ekleyin ve 7 dakika (içinde bir hücre kültür kuluçka) 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Kuluçka sonra 0.5 mL serum içeren ekleyin orta tripsin ve toplamak bir santrifüj tüpü hücrelerde devre dışı bırakabilirsiniz için her şey için. Her şey bir kez 3 mL 1 x PBS ile durulayın ve hücre süspansiyon için 240 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi.
    5. 5 mL 1 x PBS, santrifüj 240 x g de 5 min için de hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın. Taze toplanan hücre topakları kullanın veya-80 ° C'de depolayın Toplam RNA yarı kantitatif RT-PCR gerçekleştirmek için çökeltilerini ayıklamak (bkz. Adım 6).

4. insan Primer hücre (örneğin, lenfositi) iletim

Not: İnsan birincil lenfositi öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri (besleyici katman)23, Yan Barrandon (EPFL, Lozan, İsviçre) bir tür hediye üzerine tohumlari.

  1. Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 donör sığır serum, 50 U/mL penisilin-streptomisin ve 4 mM glutamin (3T3 orta) ile desteklenmiş Orta İsviçre fare 3T3-J2 hücrelerinde büyür.
  2. Öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri cFAD orta, bir Dulbecco'nın modifiye kartal orta ve Ham'ın F12 medya karışımı (3:1) içeren fetal sığır serum (% 10), penisilin-streptomisin (% 1), glutamin (% 2), insülin (5 µg/mL), adenin (kaplama lenfositi büyümek 0,18 mM), hidrokortizon (0.4 µg/mL), kolera toksin (0,1 nM) ve triiyodotironin (2 nM).
  3. 0. gün: Tohum 3 x 105 öğrenirim 3T3-J2 hücreleri, daha önce her iyi 6-şey plaka 1 X 105 hücre/mL, son bir konsantrasyon 3T3 orta içine seyreltilmiş ışınlanmış. 9 kuyu hazırlayın.
  4. 1. gün: İletim birincil keratinositler
    Not: Lenfositi iletim miktar SB transposase transkripsiyon Yönetmeliğin iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu (tarafından qRT-PCR) sağlar ve entegrasyon, GOI (GFP) hedef hücrelerdeki (cytofluorimetric tarafından doğrulamak için analizi).
    1. Hücreleri ayırma önce tripsin çalışma çözüm hazırlayın:
      %0.5 tripsin-EDTA (10 x) 5.0 mL
      500mM EDTA (son konsantrasyonu 5 mM =) 0.5 mL
      PBS 44.5 mL x 1
    2. Sıcak tripsin çalışma çözüm kullanmadan önce 37 ° C'de. Tripsin çalışma çözüm 4 ° C'de depolayın
    3. Kültür subconfluent keratinositler ayırmak için orta kaldırın, 1 x PBS hücrelerle yıkayın ve her şey için 1 mL Önceden ısıtılmış tripsin çalışma çözeltisi ekleyin. Hücre kültür kuluçka 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Kuluçka sonra bir de hücrelerin resuspend iyice ve hücre süspansiyon 2 mL serum içeren içeren bir santrifüj tüpü transfer orta (37 ° C'de ek bir min için hücrelerin çoğu hala iliştirilmişse, kuluçkaya). Her biri de bir kez 3 mL 1 x PBS veya taze orta durulama ve hücre süspansiyon ile santrifüj tüpü durulama çözüm ekleyin.
    5. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    6. 5 mL 1 x PBS, santrifüj 580 x g de 5 min için de hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.
    7. Polipropilen 15 mL tüp içinde 1.6x105 lenfositi cFAD orta, her koşul için bir seyreltme 1 ml seyreltik.
    8. Lentiviral vektörler cFAD orta polybrene (8 µg/mL 2 mL son hacmi, son konsantrasyonu) 20 μL huzurunda 1 ml seyreltik:
      Dilutions kuyu #1, #2, #3 için: transduced hücreleri (negatif kontrol vektörel çizimler olmadan) alay.
      Dilutions kuyu #4, #5 için: IDLVTKSB vektör (13.000 p24 ng) + IDLVrtTA2s-M2 vektör (48.000 p24 ng).
      Dilutions için kuyu #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB vektör (13.000 p24 ng) + IDLVrtTA2s-M2 vektör (48.000 p24 ng) + IDLVT2 vektör (9,160 p24 ng).
    9. Süspansiyon hücrelerde her lentiviral vektör seyreltme (1 mL) ekleyerek ilgili keratinosit süspansiyon (1 ml 1.6x105 lenfositi) transduce.
    10. Orta gün 0 ve transduced plaka keratinositler (1.6x105 lenfositi 2 ml) onları üzerine numaralı seribaşı öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri kaldırın. Transducing sonra bir de diğeri ile devam edin.
    11. 25 ° c 30 dk için kuluçkaya ve sonra 37 ° c 6 h hücre kültür kuluçka hücreleri aktarın.
      Not: canlılık ve nükleer silahların yayılmasına karşı şiddetle etkilenir değil spinoculate birincil keratinositler, yap.
    12. 6 h sonra her şey için cFAD orta 1 mL ekleyin. 1 mikron Doksisiklin (son konsantrasyonu) kuyu #5, #8 ve #9 ekleyin. Dönüş hücreleri ile 37 ° c
  5. 2. gün: 3 mL 10 ng/mL EGF ile KC orta cFAD orta yerine.
  6. 3. gün: Trypsinize ve hücreleri (bkz: 4.4.1-4.4.6) daha önce açıklandığı gibi #5 #1 ve #4 kuyulardan yıkayın. Hücre topakları qRT-PCR analiz için toplam RNA ayıklamak için-80 ° C'de dondurmak (bkz. adım 7).
  7. 4.4.1-4.4.5 adımlarda açıklandığı gibi hücreleri de #2, #6 ve #8 trypsinize ve cytofluorimetric çözümlemesi GFP ifade için (bkz. Adım 5).
  8. En az 3-4 doublings, un tümleşik IDLVT2 vektör (5 gündür besleyici katman üzerinde kaplama insan birincil lenfositi) sulandırmak için yeterli için #3 ve #7 #9 kuyulardan kültür tutun.
  9. 6. gün: Yaklaşık 5 gün iletim sonrası, kuyu #3 ve #7 #9 GFP ifade için cytofluorimetric analiz yapmak (bkz: adımları 4.4.1-4.4.5) hücrelerden trypsinize (bkz. Adım 5).
    Not: Deney zamanlama ve iletim verimliliği son derece etkiledi birincil hücre türüne göre ve toplanan örnekleri değişkenliği tarafından.

5. Cytofluorimetric analiz transduced birincil lenfositi üzerinde

Not: mavi lazer ile yapılandırılmış bir Akış Sitometresi (488 nm), kırmızı bir lazer (633 nm) ve GFP ve APC Floresans tespiti istihdam için filtreler ( Malzeme tabloyabakın).

  1. Etiket transduced keratinositler 3 gün ve gün (bkz. Adım 4.7 ve 4,9) 6 ile müstakil fare monoklonal APC lenfositi 3T3-J2 besleyici katmandan ayırımcılık için-konjüge Anti-besleyici antikor.
    1. Her örnek için tampon boyama 4 mL hazırlayın:
      %5 FBS 200 μL
      500 mM EDTA (son konsantrasyonu 2.5 mM =) 20 μL
      PBS 1 x 3780 μL
    2. Müstakil hücreleri arabellek boyama 1 mL ile yıkayın. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    3. Akış Sitometresi Alım için bir tüp, 5 x 104 boyama arabelleği 100 μL hücrelerde resuspend ve anti-besleyici antikor (1:50) 2 μL ekleyin. Mix iyi ve karanlıkta buzda 30 dk için kuluçkaya.
    4. 30 dakika sonra arabellek boyama 2 mL ile yıkayın. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 200 μL arabellek boyama resuspend.
    5. APC ve GFP sinyalleri cytofluorimetric analiz18tarafından elde. APC- hücre nüfusun GFP+ hücre kısmı transduced keratinositler gösterir.
      Not: arzu edilirse, lekeli örnek Akış Sitometresi önce PBS 1 %2 paraformaldehyde ile düzeltmek x ve mağaza koşmak kadar karanlıkta 4 ° C'de.
  2. GFP+yüzdesi arasındaki oran komplo tarafından Akış Sitometresi verileri analizhücreleri (5 gün) bitiş noktası ve GFP+yüzdesihücreleri 2 gün sonrası IDLVT2 transduced kalan seviyesine normalleştirilmiş iletim, hücreleri.

6. yarı kantitatif RT-PCR

Not: bir PCR termal cycler kullanın.

  1. RNA üzerinden transduced veya üreticinin protokole göre bir RNA arıtma seti kullanarak hücreleri kontrol toplam ayıklayın.
    Not: Toplam RNA-80 ° C'de saklanabilir
  2. CDNA 100 kullanarak bir 20 µL tepki olarak sentez ng toplam RNA ve üreticinin protokolüne göre bir ters transkriptaz kit.
    Not:-20 ° C'de cDNA saklanabilir
  3. Tasarım astar SB100X için rtTA2sbelirli-M2 ve GAPDH (bir temizlik gen).
    Önerilen Tasarımlar:
    SB ileri astar: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    SB ters astar: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    rtTAM2 ileri astar: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
    rtTAM2 ters astar: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    GAPDH ileri astar: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    GAPDH ters astar: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'
  4. PCR 50 µL son tepki hacmindeki gerçekleştirin. Özellikle, aşağıdaki reaksiyon her PCR tüpün montajı:
    cDNA (1:5 seyreltme) (Kimden adım 6.2) 1,00 µL
    İleri astar (10 µM hisse senedi) 1,00 µL
    Astar (10 µM hisse senedi) ters 1.00 µL
    dNTPs (10 µM hisse senedi) 1,00 µL
    Tampon (+ MgCl2) (10 x hisse senedi) 5,00 µL
    Taq polimeraz (5 U/µL hisse senedi) 0,25 µL
    Steril su 40.75 µL
  5. Termal cycler aşağıdaki programı kullanın: 1 döngüsü 95 ° C'de 5 dakika sonra devam etmek için 30 95 ° C ile s, 30 58 ° C s ve 30 72 ° C s SB100X için 34 döngü için 32 döngüleri için rtTA2s-M2 ve GAPDH 25 devredir.
  6. % 1'özel jel hazırlayın. Özel TBE 1 100 ml (steril suda seyreltilmiş 10 x hisse senedi), x 1 g bir kabı veya cep şişesi geçiyoruz. Özel tamamen eriyene kadar her dakika dönen bir mikrodalga fırında kavrulur. Yaklaşık 50 ° C ulaşıncaya kadar eritilmiş özel serin ve etidyum bromür (10 mg/mL stok) 5 µL ekleyin. Erimiş özel jel döküm için bir tarak monte jel tepsiye dökün.
  7. Örnekleri (10 µL her) özel jel üzerinde yük ve Elektroforez gerçekleştirin.
  8. İstenirse, jel resmi alacak ve PCR bantları üzerinde densitometric çözümlemesi gerçekleştirin.

7. kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)

Not: Ticari bir sıra algılama sistemi istihdam edilmektedir. PCR astar ve 6-carboxyfluorescein (FAM) prob gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) için ticari olarak satın alınır.

  1. Retro-transkripsiyon için bkz: adım 6.2.
  2. Astar tasarım ve SB100X için özel yoklama için yazılımı kullanın.
    Önerilen tasarım:
    SB.2 ileri astar: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
    SB.2 ters astar: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    SB FAM yoklama: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. Gerçek zamanlı PCR 96-şey pilakalar ve PCR Master Mix gerçekleştirmek ve astar + sonda karıştırın, 25 µL son tepki hacminde. Özellikle, aşağıdaki reaksiyon için her şey göz önünde bulundurun:
    cDNA (1:10 seyreltme steril su) 1,00 µL
    2 x Master Mix 12,50 µL
    Astar + 20 x sonda 1,25 µL mix
    Steril su 10.25 µL
    Not: Bütün tepkiler nüsha gerçekleştirin. Pipetting hataları önlemek için en az n + 3 reaksiyonlar (olmadan cDNA) için bir karışım hazırlayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak aliquot.
  4. Aşağıdaki programı kullanarak gerçek zamanlı PCR çalıştırın: 1 döngüsü 10 dk sonra 95 ° C 40 döngüleri için 95 ° C'de 15 s ve 60 ° C için 1 dk ve 4 ° C'de tutun
  5. SB100X GAPDH aynı cDNA örnek düzeyi için göreli ifade (RQ değer) tipik veri analiz yazılımı kullanarak 2-ΔΔCT miktar tarafından normalleştirme tarafından qRT-PCR veri analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yordamı kullanarak sunulan burada, üç IDLV vektörler düzenlenmiş SB bileşenleri taşıma (SB100X, rtTA2S-M2 ve T2-GFP transposon) paketlenmiş ve verimli bir şekilde teslim ve sıkıca SB sistem insan hücrelerinde düzenlenmesi için kullanılır. Şekil 1A ( Tablo 2' de bildirilen) iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu ile SB transposase transkripsiyon Yönetmeliği değerlendirmek için yapılan vitro iletim HeLa hücrelerin bir düzeni gösterir. SB100X transkripsiyon Yönetmeliği qRT-PCR (şekil 1B) ölçülebilir ve göreli miktarı (RQ) değer kapalı durumu ile ilgili olarak çizilen (IDLVTKSB yalnız RQ = 1). Transduced HeLa hücreleri, bir 8-fold harekete geçirmek (+ dox) SB100X ifade (IDLVTKSB) arka plan üzerinde elde edildi. Özellikle, cotransduced HeLa hücreleri dox yokluğunda transposase ifade kapalı Birleşik karşılaştırılabilir gösterdi TetTK organizatörü sıkı bir denetim tarafından rtTA2sgösteren-M2 modülatör.

Figure 1
Resim 1: Transcriptionally düzenlenmiş SB transposase IDLV vektörler tarafından taşınan bir ifade için iletim HeLa hücreleri. (A) bir şeması vitro iletim HeLa hücre IDLVs ile transposase bir ifade için. (B) qRT-PCR analizi HeLa hücre IDLVTKSB ile transduced (2.600 p24 ng) varlığı (+) veya (-) yokluğu IDLVrtTA2S-M2 (9600 p24 ng) ve 1 µM Doksisiklin (dox). Kesikli çizgi önemli ölçüde farklı değerlerini gösteren örnekleri bağlanır (*** P < 0.005). Deneme nüsha gerçekleştirildi. S.E.M hata çubukları gösterilen demek. (Şekil değiştiren Cocchiarella, F. ve ark., 201618). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Örnek olarak, Şekil 2 deney transposase en uygun transkripsiyon Yönetmeliği ulaşmak için kurmak kadar doz gösterir. HeLa hücreleri transduced ile artan dozlarda (130, 260 ve 2.600 p24 ng) IDLVTKSB IDLVrtTA2sile birlikte,-M2 (960 ve 9.600 ng p24,), varlığı veya yokluğu dox. Yarı kantitatif RT-PCR analiz açıkça her iki IDLVs yüksek dozda şiddetle SB100X ifade ikna etmek için gerekli olduğunu gösterir. Farklı hedef hücre tipi ve viral vektör titrasyon değişimler sup en uygun SB ifadesinde neden olabilir ve bu nedenle doz ayarı deneyler yapmak tavsiye.

Figure 2
Resim 2: IDLV doz ayarı deneyde iki IDLVs en uygun doz kombinasyonu tanımlamak için HeLa hücreleri. IDLVTKSB vektör farklı dozlarda ile ortak transduced HeLa hücreleri üzerinde yarı kantitatif RT-PCR analiz (130, 260 ve 2.600 p24 ng) devamsızlık veya IDLVrtTA2svarlığı-M2 vektör (p24 960 ve 9.600 ng) ve dox. GAPDH standart bir kontrol güçlendirilmiş. SB100X transposase ve rtTA2s-M2 ifade bildirilen tüm test koşullarında; NC = negatif kontrol. (Şekil değiştiren Cocchiarella, F. ve ark., 201618). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Transkripsiyon düzenlenmiş SB sistem, insan birincil lenfositi gibi birkaç transfection yöntemleri için dayanıklı bir bu hücrelerdeki özellikle Primer hücre içinde de kullanılabilir. Şekil 3 SB100X ifade ikna etmek için dox içinde düzenlenmiş SB bileşenleri taşıma IDLV Vektörler ile 3T3-J2 besleyici katmanı, bir düzeni birincil lenfositi öğrenirim ekili iletim için ışınlanmış gösterir.

Figure 3
Şekil 3: IDLV ile insan birincil lenfositi süspansiyon iletim transcriptionally düzenlenmiş SB transposase ve transposon ifadesi için vektörler. Bir düzeni transcriptionally düzenlenmiş SB transposase ve transposon, 1 µM dox içinde ifade insan birincil lenfositi IDLVs ile in vitro iletim için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

En iyi transposase ve modülatör Vektörler, tablo 2'de, rapor kombinasyonu doz qRT-PCR analizde 4A yolunu gösterir SB ifade 15-fold aktivasyonu kapalı durumu sonuçlandı (-dox). Transpozisyon deney üç IDLV Vektörler ile transduced keratinositler gerçekleştirildi (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 ve IDLVT2) varlığı veya yokluğu dox. İfade, GOI (GFP) beared T2-transposon, APC- yerde tarafından Akış Sitometresi Analizi 2 gün sonrası iletim (dpt) ve endopoint (5 gün boyunca insan birincil lenfositi) kültürünün ölçüldü. Hücre bölünmesi-bağımlı seyreltme nedeniyle ancak algılanabilir seviyeye (ortalama % 0.6 oranında) unintegrated T2-GFP transposon düştü son nokta ulaşıldı. Şekil 4B iletim, transposon yalnız kalan seviyeye normalleştirilmiş hücreleri APC- yerde bitiş noktası ve 2 gün sonrası GFP+ yüzdesi arasındaki oranı gösterir. Bu en az 1 kopyasını barındırma: ifade GOI stabil %12 insan birincil lenfositi için değerlendirildi onların genom entegre hücreleri yüzdesini gösterir.

Figure 4
Şekil 4: transduced insan birincil lenfositi transposase ve GFP ifadede analizi. (A) qRT-PCR tahlil birincil lenfositi IDLVTKSB ve IDLVrtTA2S-M2 1 µM dox içinde transduced. (B) varlığı ya da yokluğu dox transposase ifade için birincil lenfositi IDLVT2 transposon ve IDLVs ile ortak hedefidirler. Y ekseni üzerinde % GFP+ hücreleri 5dpt / % GFP+ hücreleri 2 dpt * (ortalama iki deney ± SEM) 100. ** önemli ölçüde farklı değerleri göster (P < 0,05). (Şekil değiştiren Cocchiarella, F. ve ark., 201618). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Plazmid Açıklama Referanslar
pCCL-TetOTKSB IDLVTKSB vektör oluşturmak için kullanılan plazmid aktarın. Bu plazmid pTetOTKSB, TetOTKSB pCCL lentiviral omurga klonlama sonra türetilmiş. 18, 20
pCCL-PGKrtTA2S-M2 Plazmid IDLVrtTA2soluşturmak için kullanılan aktarım-M2 vektör. Prof. V. Zappavigna tarafından sağlanan
pCCL-T2GFP IDLVT2 vektör oluşturmak için kullanılan plazmid aktarın. Bu plazmid GFP arasında pCCL lentiviral omurga T2-transposon IRS klonlama sonra pT2GFP türetilmiş. 18, 20
pMD.Lg/pRRE.D64VInt Plazmid IDLV vektör oluşturmak için ambalaj. 19
pMD2.G Plazmid VSV-G zarf lentiviral vektör oluşturmak kodlama. 20
pRSV-Rev Rev plazmid lentiviral vektör oluşturmak için. 20
Vektör Açıklama
IDLVTKSB Entegrasyon arızalı lentiviral vektör Tet-duyarlı TK organizatörü kontrol altında SB100X bir ifade için.
IDLVrtTA2s-M2 Entegrasyon arızalı lentiviral vektör rtTA2sifade-M2 modülatör PGK organizatörü kontrol altında.
IDLVT2 Entegrasyon arızalı lentiviral vektör GOI ifade arasında T2-transposon IRS klonlanmış.

Tablo 1: Plazmid ve vektörler istihdam bu protokol için. Açıklamaları ve başvurular sağlanır.

Vektörel çizimler HeLa (2 x 105 hücreleri) Keratinositler (1.6x105 hücreleri)
IDLVTKSB 2600 ng p24 13.000 ng p24
IDLVrtTA2s-M2 9.600 ng p24 48.000 ng p24
IDLVT2 9,160 ng p24

Tablo 2: En iyi duruma getirilmiş vektör dozlarda HeLa hücreleri ve insan birincil lenfositi iletim için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, stabil bir GOI genom Uyuyan güzeltarafından hedef hücrelerin içine entegre etmek için yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji açıklayan-hukuka aracılı. SB sistem genom düzenlemek için nonviral bir yöntem sağlamak için geliştirilmiştir, verimli bir şekilde teslim (transposase ve T2 transposon) tümleştirme makinelerin zorunlu olsa da. Bu nedenle, SB sistem pek transfectable Primer hücre üzerinde kullanmak için viral SB bileşenlerinin teslimatlar son yıllarda10,12,15' te takip. Ancak, en fazla istihdam viral vektörler hiçbiri şimdi kontrol edilemeyen transposon rehopping riskini neden olabilir transposase kurucu ifade sorunu ele aldı.

Transcriptionally transposase ifade düzenlemek için biz bir değiştirilmiş Tet-ON sistem16kullandı. En az TK organizatörü erimiş TetO öğesine bağlama rtTA2süzerine-M2 modülatör dox, huzurunda haiz bir transposase aktivasyonu (kapalı-durumu, dox yokluğu) arka plan üzerinde ince ayar. Düzenleyici performansı üzerinde uygun IDLVs bağlı (IDLVTKSB ve IDLVrtTA2s-M2) vektör doz kombinasyonu ve hücre türleri (örneğin, HeLa hücreleri ve insan birincil lenfositi) üzerinde. Hedef hücrelerden bağımsız olarak vektör doz iletim hedef hücrelerin en üst düzeyde hücre canlılığı etkilemeden emin olun, böylece tırmanan bir doz kombinasyon deneme HeLa hücreleri (veya diğer hücre hatları) en uygun dozlarda tanımlamak için tarafından yarı kantitatif RT-PCR, şiddetle önerilen olduğunu.

GOI transpozisyonu Primer hücre değerlendirildi. İnsan birincil lenfositi öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 besleyici katmanda seribaşı ile 3 IDLVs transduced (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 ve IDLVT2) deneysel olarak tanımlanmış dozda. Transposase net dox bağımlı aktivasyonu qRT-PCR tarafından sunuldu. Ayrıca, istikrarlı GOI entegrasyonunu cytofluorimetric analizi GFP ifade varlığı veya yokluğu dox, araç transcriptionally düzenlenmiş SB IDLV platforma istihdam imkanı gösteren transduced hücrelerdeki tarafından gösterilmiştir Primer hücre ve bir GOI başarılı entegrasyon genom hedef hücre içine bileşenleri.

İletişim kuralı kritik adım IDLV vektör üretim ve iletim hedef hücre optimum verimliliği ve vektör doz kombinasyon vardır. HEK293T hücre düşük transfection verimliliği düşük vektör verim neden olabilir. IDLVTKSB ve IDLVrtTA2sdoz tanımı-M2 yüksek leakiness modülatör yokluğu veya düşük kat indüksiyon TetOTK düzenleyicinin dox tedavi üzerine neden olabilir Tet-ON bileşenlerinin bir dengesizlik önlemek gereklidir. Kritik adımları küçük değişiklikler tarafından ele alınabilir. Örneğin, transfection Protokolü ticari transfection reaktifler kullanarak standart. İletim Protokolü ilgi, özellikle göz önüne alındığında olup spinoculation hücre canlılığı etkilemeden iletim verimliliği artırır hücre tipine göre adapte olmalıdır. Vektörel çizimler ve polybrene olabilir hedef hücre kültür ortamına eklenen ve sonra 6 saat veya gece boyunca kuluçka ile taze orta yerine. Bu da GFP+ yüzde 5 gün sonra iletim IDLVs arka plan entegrasyon tarafından etkilenebilir hücreleri dikkati çekiyor.

Bir küçük bu yöntem IDLV vektörler geçici HEK293T hücre transfection tarafından üretilen kısıtlamasıdır. Vektör bağlı olarak doz kullanılmak üzere tekrar vektör yapımları gereklidir. IDLV vektör kargo kapasitesi yaklaşık 8 kb olduğu gibi ikinci bir sınırlama GOI, uzunluğu ilgilidir.

Sonuç olarak, bu yöntem bir GOI özetinizi, SB sistem, sunmak için mevcut yöntemler arasında geniş bir tropism ve yüksek iletim verimliliği IDLV vektörler paketlenmiş gibi transcriptionally düzenlenmiş SB bileşenleri entegrasyon sağlar. Ayrıca, değiştirilmiş Tet-ON sistem bir transkripsiyon, düzenleme, SB100X ifade, ilgili bir sorunu transposon yeniden atlamalı riski veya gerekiyorsa birden çok seri aktarılması olayları izin verir. Bu yöntemin olası uygulamalar genom mühendislik istikrarlı ambalaj hücreler viral vektörler için kurmak için hücre hatları (örneğin, HeLa hücreleri, HEK293 hücreleri) ve tedavi edici genlerin entegrasyonu klinik ilgili Primer hücre içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Prof. Zappavigna, Üniversitesi, Modena ve Reggio Emilia, Modena, İtalya ile pCCL-PGKrtTA2Sbize sağlamak için teşekkür ederiz-M2 plazmid. Biz de Prof Z. Ivics (Paul Ehlrich Enstitüsü, Langen, Almanya) ve Prof. Dr. Z. Izvak (Max Delbruck merkezi için moleküler tıp, Berlin, Almanya) için pCMVSB100X ve pT2/BH plazmidleri kabul edersiniz. Bu eser DEBRA uluslararası ve İtalyanca üniversite ve araştırma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine Lonza BE12-614F Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized GE Healthcare Life Sciences SH30071.03 Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml Lonza DE17-602E Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM Lonza BE17-605E Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline Lonza BE17-737E Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% Merck 106580 Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl) Sigma-Aldrich 320331 Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection Fresenius Kabi - Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter Whatman 10462100 Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes Beckman Coulter 326823 Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg Lonza BE17-516F Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit Perkin Elmer NEK50001KT Kit for IDLV particle titration.
Polybrene Sigma-Aldrich 107689 Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg GIBCO BE17-160E Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) 100938B AnalaR BDH Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) GIBCO 15400-054 Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin GIBCO 16030-074 Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media GIBCO 21765 Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum Lonza DE14-801F Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin GIBCO 10099-141 Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 Reagents for keratinocyte growth.
Adenine VWR 1152-25 Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone VWR 3867-1 Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Sigma-Aldrich C8052 Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T5516 Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF Austral Biological GF-010-9 Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody Miltenyi Biotech 130-096-099 To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase Life Technologies 18080051 Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) Sigma-Aldrich D7295 Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (any) - Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase Promega M740B Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology Sigma-Aldrich A9539 Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X Invitrogen 15581028 Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510 Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline Sigma-Aldrich D-9891 drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystem 4304437 TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon Corning 352096 Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile Falcon Corning 353025 Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile Falcon Corning 353046 Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL Eppendorf 0030 120.094 Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free (any) - Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystem 4346906 96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap BD Falcon 352052 Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) (any) - Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) (any) - Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter (any) - Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler (any) - Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment (any) - Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2 BD - Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 7900HT Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. (any) - Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor Beckman Coulter - Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41, (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36, (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28, (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41, (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9, (11), e112712 (2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18, (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137, (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8, (10), e75344 (2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8, (10), e76771 (2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16, (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39, (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19, (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12, (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1, (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics