Anesthetized चूहों से मस्तिष्कमेरु द्रव के संग्रह के लिए एक बेहतर तरीका

Neuroscience

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Summary

इस प्रोटोकॉल रक्त से कोई संदूषण के साथ मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) के प्रचुर मात्रा में संग्रह के लिए एक बेहतर तकनीक का वर्णन । अधिक से अधिक नमूना संग्रह और शुद्धता के साथ, अधिक विश्लेषण सीएसएफ का उपयोग कर रोगों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है कि मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को प्रभावित.

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Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W. A., Møller, A., Huang, F. D. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

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Abstract

मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान शरीर द्रव है । यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ निकटतम संपर्क में तरल पदार्थ में से एक है और इस प्रकार, सीधे इन ऊतकों तक पहुँचने के बिना मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के रोगग्रस्त राज्य का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, चूहों में यह cisterna magna से रक्त वाहिकाओं, जो अक्सर नमूने दूषित करने के लिए अपनी निकटता के कारण प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । चूहों में सीएसएफ संग्रह के लिए क्षेत्र भी काटना करने के लिए मुश्किल है और अक्सर केवल छोटे नमूनों प्राप्त कर रहे हैं (अधिकतम 5-7 µ l या कम). इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन एक तकनीक है कि संग्रह के वर्तमान तरीकों पर सुधार के लिए रक्त से संदूषण को कम करने और सीएसएफ के प्रचुर मात्रा में संग्रह के लिए अनुमति (औसत 10-15 µ एल पर एकत्र किया जा सकता है) । इस तकनीक का उपयोग चूहों से ऊतक संग्रह के लिए अन्य विच्छेदन विधियों के साथ किया जा सकता है, क्योंकि यह सीएसएफ निष्कर्षण के दौरान किसी भी ऊतकों को प्रभावित नहीं करता है । इस प्रकार ब्रेन और स्पाइनल कॉर्ड इस तकनीक से प्रभावित नहीं होते और बरकरार रहते हैं । अधिक से अधिक सीएसएफ नमूना संग्रह और शुद्धता के साथ, अधिक विश्लेषण इस तरल पदार्थ के साथ आगे सहायता तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान और बेहतर मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को प्रभावित करने वाले रोगों को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

सीएसएफ तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान शरीर द्रव है । सीएसएफ मुख्य रूप से रक्त प्लाज्मा से बना है, जिसमें कुछ कोशिकाओं (कोई लाल रक्त कोशिकाओं और केवल कुछ सफेद रक्त कोशिकाओं) और लगभग प्रोटीन से मुक्त है । यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के साथ निकट संपर्क में तरल पदार्थ में से एक है और यह मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से परिधीय प्रणाली के लिए कई इलेक्ट्रोलाइट्स पारित कर सकते हैं । मानव में, सीएसएफ नमूने रोग निदान में सहायता करने के लिए एकत्र किया जा सकता है या नैदानिक परीक्षणों में अनुसंधान प्रयोजनों के लिए, एक रीढ़ की हड्डी के रूप में नल (या काठ का पंचर) एक छोटी सी, इनवेसिव प्रक्रिया है: सीएसएफ द्रव सीधे इन तक पहुँचने के लिए बिना सीएनएस में परिवर्तन को प्रतिबिंबित कर सकते हैं ऊतकों. इस प्रकार, हाल के वर्षों में, क्लिनिक में अनुसंधान प्रयोजनों के लिए, सीएसएफ के नमूने अल्जाइमर रोग और अन्य परिवारजन1,2,3जैसे neurodegenerative रोगों के रोगियों से प्राप्त किए गए हैं. वहां कई है जो कि सीएसएफ के नमूनों का उपयोग कर विकसित किया गया है क्लीनिक में रोगों के निदान में सहायता के लिए2,3। हालांकि, इन परख की विश्वसनीयता पर बहुत बहस के लिए संगत, संवेदनशील परिणाम विशेष रूप से रोग का निदान करने के लिए4,5का उत्पादन है । तो, वहां बेहतर परख और लक्ष्य है, जो सीएसएफ में पाया जा सकता है के विकास के लिए एक बड़ी जरूरत है, एक मानक तकनीक के उत्पादन में सहायता के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ neurodegenerative रोगों का निदान । रोग में मानव सीएसएफ के नमूनों के संभावित महत्व के कारण, तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में कुतर से सीएसएफ का संग्रह भी ब्याज की है.

चूहों जैविक और चिकित्सा अनुसंधान में महत्वपूर्ण जानवर है और संभावित चिकित्सीय यौगिकों और मानव नैदानिक परीक्षणों से पहले सबूत के अवधारणा अध्ययन के परीक्षण के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, चूहों में यह एक छोटे से पशु में मस्तिष्क के लिए अपनी निकटता के कारण सीएसएफ के नमूनों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, चूहों में सीएसएफ संग्रह की सामान्य विधि के रूप में यह cisterna magna, सेरिबैलम और मज्जा oblongata के पृष्ठीय सतह के बीच एक खोलने के माध्यम से प्राप्त करने के लिए है. इस क्षेत्र के लिए और करीब निकटता में रक्त वाहिकाओं के लिए काटना मुश्किल है के रूप में यह सीएसएफ के नमूनों को इकट्ठा करने में कठिनाई का कारण बनता है, रक्त कोशिकाओं से संदूषण के जोखिम में वृद्धि. इन कठिनाइयों के कारण, ज्यादातर शोधकर्ताओं केवल विश्लेषण के लिए सीएसएफ की एक छोटी राशि प्राप्त कर सकते हैं (आमतौर पर 5-7 µ एल के रूप में कहा जाता है) और रक्त कोशिकाओं द्वारा सीएसएफ के नमूनों की संदूषण विश्लेषण के लिए एक प्राथमिक चिंता का विषय है6,7,8 , 9. रक्त दूषण परिणाम अस्पष्ट कर सकते हैं और सही मायने में सीएनएस की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं. इसके अलावा, सीमित नमूना एकत्र कर सकते है अनुसंधान के रूप में सामांय चूहों से एकत्र की राशि केवल एक ही माप के लिए पर्याप्त है (डुप्लिकेट या तपसिल में) एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) का उपयोग कर । इस प्रकार, सीएसएफ नमूनों आमतौर पर कई चूहों से जमा कर रहे हैं क्रम में करने के लिए पर्याप्त कई परख चलाने के लिए नमूना है. चूहों से सीएसएफ के प्रचुर मात्रा में, दूषित संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का विकास बहुत वांछित है और कुतर का उपयोग कर तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में सुधार लाने में लाभकारी होगा ।

इस प्रोटोकॉल में, प्रचुर मात्रा में (10-15 µ एल के एक औसत) anesthetized चूहों से सीएसएफ के संग्रह के लिए एक तकनीक विस्तार से वर्णित है और सीएसएफ संग्रह के वर्तमान में एक ज्ञात विधि पर सुधार करने के लिए रक्त से संक्रमण को कम करने के लिए10. सीएसएफ संग्रह के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल सीएसएफ के विकास में सहायता करेगा आधारित है, जो रोग निदान में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही तंत्र में अनुसंधान में सुधार है कि आबाद रोगों सीएनएस को प्रभावित ।

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Protocol

समाज तंत्रिका विज्ञान (यूएसए) और फुदन विश्वविद्यालय (शंघाई, चीन) नैतिक समितियों की नीतियों के अनुसार सभी पशु प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया । यह प्रक्रिया एक गैर उत्तरजीविता सर्जरी के लिए है ।

1. सीएसएफ संग्रह तंत्र का सेटअप

  1. कांच केशिका (भीतरी व्यास 0.75 मिमी, बाहरी व्यास 1.0 मिमी) एक micropipette खींचने का उपयोग कर खींचो (के रूप में लियू एट अल में दिखाया गया है । 10; तेज केशिका चित्रा 1) में दिखाया गया है ।
  2. मजबूती से एक micromanipulator (चित्र 1a) पर घुड़सवार केशिका धारक में एक तेज कांच केशिका प्लेस ।
  3. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे सीधे संदंश के साथ तेज केशिका की नोक तोड़, ताकि टूटी हुई टिप के भीतरी व्यास के बारे में 10-20 µm (चित्रा 1C) है ।
  4. एक पतली ट्यूब और केशिका धारक के दूसरे छोर करने के लिए एक सिरिंज देते हैं, और पतली ट्यूब और एक तीन तरह के वाल्व के साथ सिरिंज कनेक्ट.
  5. खोलने के लिए तीन तरह के वाल्व शिफ्ट और किसी भी दूषित पदार्थों को निष्कासित और केशिका ट्यूब में सकारात्मक दबाव बनाने के लिए कांच केशिका करने के लिए टयूबिंग के माध्यम से सिरिंज से हवा उड़ाने के लिए सिरिंज डुबकी ।
  6. यह जिले से कुछ ही बार दोहराएं-जोड़ने और फिर से तीन तरह के वाल्व को सिरिंज जोड़ने, और ऊपर सिरिंज ड्राइंग ~ $१०० µ एल तीन तरह के वाल्व (आंकड़ा 1b) के साथ सिरिंज के पिछले पुनः कनेक्शन से पहले.
  7. माउस विच्छेदन के दौरान क्षति को रोकने के लिए साइड करने के लिए कांच केशिका के साथ micromanipulator ले जाएँ ।

Figure 1
चित्र 1. माइक्रोस्कोप, micromanipulator, और केशिका सेटअप । () केशिका संलग्न सेटअप के साथ माइक्रोस्कोप और micromanipulator, के रूप में अच्छी तरह से () कनेक्टेड सिरिंज और तीन तरह के वाल्व को खोलने के लिए (यहां दिखाया गया है) या पाइपिंग बंद, और () एक अटूट (सही) और टूट (बाएं) के एक करीब छवि केशिका टिप सीएसएफ संग्रह के लिए तैयार है । एक बार टूटी हुई, केशिका की नोक 0.75 मिमी के भीतरी व्यास, 1.0 मिमी के बाहरी व्यास होना चाहिए. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

2. माउस विच्छेदन

  1. माउस Anesthetize ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, C57BL/6 और amyloid के प्रणेता प्रोटीन/presenilin 1 (APP/PS1) ट्रांसजेनिक (अल्जाइमर रोग माउस मॉडल) चूहों का इस्तेमाल किया गया और anesthetized 4% chloral हाइड्रेट के साथ (डीएच20 में) 10 µ एल में intraperitoneal के माध्यम से माउस वजन के/ इंजेक्शन.
  2. जब पूरी तरह से anesthetized, सुनिश्चित करें कि माउस पर्याप्त रूप से anesthetized है । पैर की अंगुली चुटकी के लिए वापसी की प्रतिक्रिया, थोड़ा हिंद अंगों का विस्तार और पैर की उंगलियों चुटकी और एक वापसी प्रतिक्रिया के लिए देख रहा द्वारा, पर्याप्त संज्ञाहरण आश्वासन देने के लिए किया जाता है । सभी चार अंगों चुटकी देकर जाँच करें; यदि कोई प्रतिक्रिया नहीं है माउस ठीक से anesthetized है । आंखों के ऊपर से माउस के सिर के पीछे की ओर, कानों के बीच से गर्दन के नीचे की ओर, विदारक कैंची (चित्र 2a) का प्रयोग करते हुए बालों को काटें और ट्रिम करें । वैकल्पिक रूप से, कतरनी या लोमनाशक क्रीम बालों को हटाने में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. एक माउस अनुकूलक का उपयोग कर माउस के सिर सुरक्षित (नाक के साथ ऊपर का सामना करना पड़ सिर के पीछे ~ 45 °, चित्रा 2a) पर बताया. कान और माउस की आंखों और कस के बीच कान सलाखों फिक्स । सुनिश्चित करें कि सिर कदम नहीं कर सकते है और धीरे माउस के सिर पर नीचे धक्का द्वारा अनुकूलक में सुरक्षित है ।
  4. शल्य चिकित्सा चीरा बनाने के लिए पहले और नियमित रूप से संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान आश्वासन देने के लिए पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए वापसी प्रतिक्रिया की जाँच करें. नेत्रहीन प्रक्रिया के दौरान श्वसन दर में कोई परिवर्तन संज्ञाहरण के विमानों में परिवर्तन को इंगित करने के लिए ध्यान दें । एक साफ, गैर अपूतित, तकनीक इस छोटे गैर अस्तित्व सर्जरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कैंची और घुमावदार संदंश का प्रयोग, त्वचा के माध्यम से कट और मांसपेशी की पहली परत जब तक खोपड़ी के आधार मांसपेशियों की केवल एक पतली परत के साथ उजागर होता है ।
    नोट: गर्दन के पीछे के पार माउस त्वचा के माध्यम से कट और फिर कान और माउस की आंखों के बीच खोपड़ी के बीच नीचे त्वचा में कटौती । त्वचा और ऊतक तो अलग और cisterna magna पर क्षेत्र के बाहर निकाला जा सकता है ।
  5. जबकि विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते हुए, ध्यान से दूर काटना खोपड़ी के आधार पर मांसपेशी की पिछले पतली परतों संदंश का उपयोग कर और पक्ष को और ब्याज के क्षेत्र से बाहर करने के लिए मांसपेशियों की इन परतों को स्थानांतरित । अगर खून बह रहा है, कपास कलियों का उपयोग करने के लिए निकालें और रक्तस्राव को रोकने में मदद ।
  6. एक बार cisterna magna पर बाडी (आकार में आमतौर पर 1-2 बड़े रक्त वाहिकाओं क्षेत्र के माध्यम से चल रहे के साथ सामने आ रहा है; दोनों की ओर या रक्त वाहिकाओं के बीच केशिका सम्मिलन और सीएसएफ संग्रह, चित्रा 2 बी) के लिए इष्टतम है, एक गीला का उपयोग करें कपास की कली को साफ करने के लिए झिल्ली को साफ़ करें और फिर एक सूखी सूती कली का प्रयोग करके क्षेत्र को सुखा लें.

Figure 2
चित्र 2. -सीएसएफ संग्रह के लिए केशिका प्रविष्टि के प्रतिनिधि छवियों के साथ माउस और विच्छेदन सेटअप । के साथ सीएसएफ निष्कर्षण के लिए तैयार माउस का सेटअप (A) मुंडा सिर विच्छेदन के लिए जगह में clamped और () विस्तृत छवि (एक विच्छेदित माउस बाडी के 10x देखने) cisterna magna को कवर (धराशायी तीर एक रक्त क्षेत्र के माध्यम से चल रहे पोत से पता चलता है और ठोस तीर केशिका सम्मिलन के लिए क्षेत्र इष्टतम से पता चलता है) । विस्तृत छवियां (10x देखें) के () कांच की तेज नोक केशिका cisterna magna की बाडी के खिलाफ गठबंधन, () जिस बिंदु पर केशिका लगभग पंचर, बाडी से कुछ प्रतिरोध के साथ, और () केशिका टिप टेप किया गया के माध्यम से सीएसएफ इकट्ठा करने के लिए बाडी । सीएसएफ एक स्पष्ट तरल कांच केशिका (बिंदीदार तीर) में एकत्र किया जाना चाहिए । प्रत्येक माइक्रोस्कोप छवि के नीचे दाईं ओर सभी पैमाने सलाखों 100 µm संकेत मिलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

3. Anesthetized माउस से सीएसएफ संग्रह

  1. कांच केशिकाओं माउस सिर के पीछे करने के लिए संरेखित करें ताकि पैनापन बिंदु सिर्फ एक ~ 30-45 ° कोण पर झिल्ली के पीछे है (चित्र 2c) ।
  2. एक बार सिरिंज या कुछ समय डुबकी और सिरिंज ऊपर आकर्षित ~ $१०० µ एल (यकीन है कि वहां कोई दूषित कर रहे है और वहां कांच केशिका में नकारात्मक दबाव है) ।
  3. micromanipulator का प्रयोग, केशिका टिप प्रतिरोध देखा जा सकता है जब तक झिल्ली के करीब ले जाने के लिए, लेकिन यह नहीं puncturing (चित्रा 2d).
  4. एक बार प्रतिरोध केशिका और झिल्ली की नोक के बीच देखा जाता है, धीरे micromanipulator नियंत्रण पर दस्तक द्वारा झिल्ली के माध्यम से केशिका ट्यूब नल । माइक्रोस्कोप का प्रयोग cisterna magna में केशिका पंचर के पैनापन बिंदु को देखने के लिए । सीएसएफ स्वचालित रूप से केशिका ट्यूब में तैयार किया जाना चाहिए एक बार खोलने पंचर हो गया है (चित्रा 2E) ।
  5. केशिका छोड़ धीरे सीएसएफ इकट्ठा करने के लिए । सीएसएफ बाहर ड्राइंग बंद कर दिया है, तो एक छोटी सी राशि धीरे (~ 50 µ एल) के लिए बाहर सीएसएफ निकालने के लिए केशिका में अधिक नकारात्मक दबाव बनाने के लिए ऊपर सिरिंज आकर्षित ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, केशिका धीरे से किया जा सकता है और धीरे से मस्तिष्क के बाहर खींच लिया ठीक micromanipulator नियंत्रण का उपयोग करने के लिए सीएसएफ फिर से केशिका में प्रवाह करने की अनुमति । सीएसएफ की ~ 10-15 µ l की कुल राशि (~ 3-4 सेमी केशिका में) लेता है ~ 10-30 मिनट, और कभी-कभार 20 µ l या अधिक एकत्र किया जा सकता है । हालांकि बिल्कुल आवश्यक नहीं है, यह सीएसएफ संग्रह के दौरान एक गर्मी पैड का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । सीएसएफ संग्रह कमरे के तापमान (~ 23 डिग्री सेल्सियस) पर किया गया था ।
  6. एक बार वांछित सीएसएफ की राशि एकत्र की है, बंद करने के लिए तीन तरह के वाल्व स्थानांतरण द्वारा टयूबिंग बंद (सीएसएफ बाहर ड्राइंग बंद करने के लिए) ।
  7. बाहर टयूबिंग से जुड़े सिरिंज ले लो, और खुला और फिर टयूबिंग बंद (केशिका, टयूबिंग में बराबर दबाव बनाने के लिए, और केशिका बाहर क्षेत्र) । तीन तरह के वाल्व के साथ सिरिंज जोड़ने, लेकिन सिरिंज डुबकी नहीं है.
  8. धीरे micromanipulator का उपयोग कर माउस से कांच केशिका निकालें ।
  9. संग्रह ट्यूब प्लेस (1 µ एल के साथ 1.5 मिलीलीटर microtubes 20x चिढ़ाना अवरोध करनेवाला) कांच केशिका के पैनापन बिंदु के अंतर्गत ।
  10. टयूबिंग खोलें और धीरे सिरिंज डुबकी: सीएसएफ केशिका के बाहर प्रवाह और संग्रह ट्यूब में होना चाहिए ।
  11. संग्रह के बाद, जल्दी से (एक मिनी केंद्रापसारक का उपयोग करके अधिकतम गति से 5 एस के लिए पल्स स्पिन) सीएसएफ संग्रह ट्यूब के तल पर छेड़ने अवरोधक के साथ नमूना मिश्रण करने के लिए ।
    नोट: सीएसएफ नमूने aliquoted और उसके बाद और अधिक विश्लेषण के लिए संग्रहित किया जा सकता है-80 ° c. माउस के बाकी अंय ऊतकों, जैसे मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के लिए विच्छेदित किया जा सकता है । माउस अभी भी इस स्तर पर जीवित है और इस तरह रक्त भी एकत्र किया जा सकता है, अगर जरूरत है ।

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Representative Results

यहां उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करना (चित्रा 1 और चित्रा 2), सीएसएफ तुरंत केशिका में एकत्र स्पष्ट (चित्रा 2E) होना चाहिए, नहीं गुलाबी या लाल. यदि केशिका में एकत्र द्रव को लाल रंग के लिए गुलाबी है, तो रक्त के साथ संदूषण था ।

इस विधि के साथ एकत्र सीएसएफ नमूना के आवेदन का एक उदाहरण के रूप में, प्रोटीन amyloid के स्तर-बीटा (Aβ) एलिसा का उपयोग कर मापा गया था । सीएसएफ में Aβ का स्तर सामान्यतः अल्जाइमर रोग अनुसंधान में मापा जाता है7. सीएसएफ ज्यादातर प्रोटीन से मुक्त है । अल्जाइमर रोग (APP/PS1 चूहों) के एक माउस मॉडल में, मानव Aβ के स्तर42 काफी बढ़ रहे हैं, इन चूहों मानव अनुप्रयोग के रूप में व्यक्त. यह यहां वर्णित विधियों का उपयोग कर 12 महीने पुराने चूहों से एकत्र सीएसएफ के नमूनों के साथ मनाया जा सकता है (0 स्नातकोत्तर/WT के सीएसएफ में १,३०३ स्नातकोत्तर/चूहों की तुलना में APP/PS1 चूहों, चित्रा 3) के सीएसएफ में ।

Figure 3
चित्र 3. सीएसएफ नमूना एकत्र के लिए प्रतिनिधि परिणाम । सीएसएफ की एलिसा विश्लेषण एकत्र नमूने । अल्जाइमर रोग (APP/PS1) के एक माउस मॉडल में, वहाँ सीएसएफ में मानव Aβ के स्तर में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है, इन चूहों मानव Aβ 42 (१,३०३ स्नातकोत्तर/एमएल) । जंगली में प्रकार (WT) चूहों वहां कोई मानव Aβ42 पाया (0 स्नातकोत्तर/ एक ख़राब t-परीक्षण का उपयोग महत्व मापने के लिए किया गया था, * * p < 0.01, त्रुटि पट्टियां SEM के रूप में दर्शाई गई, n = 3 और 4 चूहों की उंर के 12 महीनों में क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल विस्तार से एक तकनीक जो सीएसएफ संग्रह के10 वर्तमान तरीकों पर सुधार करने के लिए रक्त से संदूषण को कम करने और सीएसएफ के प्रचुर मात्रा में संग्रह के लिए अनुमति देने का वर्णन (औसत पर ~ 10-15 µ एल प्राप्त किया जा सकता है) चूहों से । जब केशिका टिप तोड़कर, केशिका की नोक बहुत छोटा नहीं होना चाहिए (के रूप में तो सीएसएफ बहुत धीरे से निकाला जाएगा) या बहुत बड़ा (सीएसएफ और ऊतक इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त ठीक नहीं होगा) केशिका में दर्ज हो सकता है । ध्यान रखा जाना चाहिए जब सीएसएफ संग्रह के लिए क्षेत्र विदारक: किसी भी खून बह रहा है बंद कर दिया जाना चाहिए और कांच केशिका के सम्मिलन के लिए क्षेत्र डीएच के साथ रक्त से साफ20 नमूने के साथ संक्रमण से बचने के लिए. प्रत्येक माउस के एनाटॉमी अलग है, लेकिन सबसे चूहों है 1-2 प्रमुख रक्त वाहिकाओं क्षेत्र के माध्यम से चल रहा है जहां केशिका सीएसएफ संग्रह के लिए डाला जा करने की जरूरत है । केशिकाओं की प्रविष्टि के लिए सही जगह का चयन महत्वपूर्ण है, के रूप में भी प्रमुख रक्त वाहिकाओं के करीब डालने के रक्त के साथ सीएसएफ दूषित होगा । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, रक्त वाहिकाओं के एक क्षेत्र स्पष्ट है, इस तरह के बीच या प्रमुख रक्त वाहिकाओं के दोनों ओर के रूप में, केशिका सम्मिलन के लिए संक्रमण से बचने के लिए इष्टतम है । अगर सीएसएफ एक स्थिर दर पर बाहर प्रवाह नहीं करता है और कुछ समय के बाद बंद हो जाता है, एक छोटे सिरिंज ड्राइंग (~ 50 µ एल) केशिका में सीएसएफ के प्रवाह को पुनः आरंभ करने में मदद कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, केशिका ही धीरे से ले जाया जा सकता है और धीरे में या बाहर micromanipulator के साथ माउस के सीएसएफ निष्कर्षण के प्रवाह को पुनः आरंभ करने के लिए । देखभाल जब रक्त केशिका में प्रवाह के रूप में अच्छी तरह से कर सकते है के रूप में इन चरणों कर लिया जाना चाहिए । यह तकनीक मस्तिष्क और कांच केशिका से दबाव में मतभेदों के कारण अच्छी तरह से काम करता है के लिए माउस से सीएसएफ बाहर आकर्षित । इस प्रकार, माउस केवल एक बार पंचर किया जा सकता है, के रूप में केशिका के बाद माउस में डाला जाता है और बाहर ले जाया, वहां मस्तिष्क में दबाव की हानि है और सीएसएफ अब केशिका में स्वचालित रूप से तैयार किया जाएगा अगर यह फिर से डाला जाता है । इसलिए, अभ्यास इस तकनीक का उत्पादन करने के लिए कोई रक्त दूषित पदार्थों को सही करेगा और (अनुभव से, 10-20 अभ्यास चूहों इस स्तर तक पहुंचने के लिए पर्याप्त हो जाएगा) में केशिका की पहली प्रविष्टि पर पर्याप्त सीएसएफ संग्रह प्राप्त करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल चूहों से सीएसएफ निकालने के लिए एक बेहतर और कारगर तरीका है और अगर सही ढंग से किया, रक्त से संदूषण को कम करता है (चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3). इस तकनीक को एकत्र करने के लिए सीएसएफ के लिए लिया गया समय तक सीमित है । आम तौर पर, 30 मिनट के कमरे के तापमान (~ 23 डिग्री सेल्सियस) पर सीएसएफ के ~ 15 µ एल या अधिक इकट्ठा करने की जरूरत है । इस समय के दौरान, माउस कपास ऊन या ऊतक के साथ गर्म रखा जा सकता है, लेकिन एक कवर या गर्मी पैड के बिना, सीएसएफ अभी भी सफलतापूर्वक एकत्र किया जा सकता है । एक गर्मी पैड के अलावा या प्रक्रिया से पहले माउस वार्मिंग के मस्तिष्क के बाहर सीएसएफ के प्रवाह में वृद्धि और संग्रह के लिए आवश्यक समय को कम करने से इस तकनीक में सुधार हो सकता है, के रूप में अंय तरीकों में वर्णित10,11। लेकिन प्रोटोकॉल में यहां वर्णित है, कोई गर्मी पैड या माउस के वार्मिंग इस्तेमाल किया गया था और चूहों के बीच सीएसएफ की मात्रा में कोई कठिनाई है कि एकत्र किया जा सकता था । आवेदन के एक उदाहरण के रूप में इस तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मानव Aβ के स्तर42 एलिसा का उपयोग कर मापा गया । Aβ चिपचिपा जाना जाता है और कांच और संग्रह ट्यूबों का पालन कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, borosilicate ग्लास केशिकाओं और के लिए चूहों से सीएसएफ एकत्र ट्यूबों का उपयोग किया गया । जबकि कुछ Aβ ग्लास केशिका और संग्रह ट्यूबों की दीवारों के लिए छड़ी कर सकते हैं, एलिसा परिणाम बताते है कि Aβ स्तर मापा जा सकता है (चित्रा 3) । फिर भी, यह एक संभावना है कि इस प्रोटोकॉल में एकत्र सीएसएफ से मापा Aβ स्तर से कम कर रहे हैं कि अन्य अध्ययनों द्वारा वर्णित है, लेकिन कांच केशिकाओं सीएसएफ इकट्ठा करने के लिए माउस की बाडी के माध्यम से पंचर करने के लिए आवश्यक हैं. Aβ मापने के अलावा, ब्याज के अंय प्रोटीन भी सीएसएफ एकत्र का उपयोग कर मापा जा सकता है ।

जबकि पहले से प्रकाशित सीएसएफ का तरीका लियू एट अल. 10 चूहों से रहने वाले सीएसएफ के सतत संग्रह के लिए किया गया था, यहाँ वर्णित विधि चूहों से सीएसएफ के संग्रह के लिए ऊतक संग्रह और विश्लेषण के लिए बलिदान किया जा करने के लिए है. इस प्रकार, इस तकनीक के साथ माउस ऊतक संग्रह के लिए अंय विच्छेदन तरीकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यह मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को प्रभावित नहीं करता है, और सीएसएफ संग्रह के बाद (यानी, के बाद 10-30 ~ सीएसएफ के 10-15 µ l के लिए), माउस अभी भी सांस लेना चाहिए और संज्ञाहरण के तहत । इसलिए, रक्त, मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी के रूप में अंय ऊतकों, और जिगर अभी भी संग्रह और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए व्यवहार्य हैं । हालांकि लियू एट अल. विधि सीएसएफ बहुत जल्दी एकत्र (10 सीएसएफ के 3-7 µ एल के लिए माउस प्रति मिनट), विधि यहां वर्णित एक लंबा समय लगता है, लेकिन अधिक सीएसएफ10इकट्ठा कर सकते हैं । सीएसएफ संग्रह के लिए एक अन्य विधि मइया एट अल का भी वर्णन किया गया है । 11 दोनों लियू एट अल. और मइया एट अल. तरीकों हाथ से पकड़ ग्लास केशिकाओं या जेल लोडर सुझावों और cisterna magna में puncturing द्वारा चूहों से सीएसएफ इकट्ठा करने का वर्णन । यहां वर्णित विधि एक micromanipulator को केशिका फिक्सिंग से अलग है । यह सुनिश्चित करता है कि केशिका मोबाइल रखा जाता है और सीएसएफ संग्रह के दौरान रक्त से संदूषण कम हो जाती है । micromanipulator भी puncturing cisterna magna में अधिक से अधिक परिशुद्धता और सटीकता के लिए सीएसएफ प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि मइया एट अल. विधि भी माउस प्रति सीएसएफ के 15-20 µ एल प्राप्त करने में सक्षम था, यह जेल लोडर सुझावों के साथ हाथ से cisterna magna बार-puncturing की आवश्यकता है, जो रक्त या ऊतक से संदूषण का खतरा बढ़ सकता है. इसके अलावा, मइया एट अल. विधि cisterna magna के प्रत्येक अनुक्रमिक puncturing के साथ मस्तिष्क में दबाव कम हो सकता है इतना है कि वहाँ एक बार में एक से अधिक और कम है एकत्र सीएसएफ. विधि यहां वर्णित केवल एक पंचर शामिल है और cisterna magna में केशिका छोड़ने के लिए आगे सीएसएफ इकट्ठा के रूप में यह सीएसएफ के साथ फिर से भरना है, जबकि माउस संज्ञाहरण के तहत है । इस प्रकार, प्रोटोकॉल यहां वर्णित लगातार सीएसएफ इकट्ठा और cisterna magna में दोहराया पंचर से संभव संक्रमण को कम करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आसपास के ऊतकों के विघटन ।

अधिक से अधिक सीएसएफ नमूना संग्रह और शुद्धता के साथ, अधिक विश्लेषण तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में आगे सहायता करने के लिए इस द्रव के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । यह अच्छी तरह से शोधकर्ताओं के बीच जाना जाता है कि चूहों से सीएसएफ का संग्रह थकाऊ जा सकता है और केवल एक सीमित नमूना प्राप्त किया जा सकता है (आमतौर पर 5-7 µ l6,7,8,9) की एक अधिकतम के रूप में कहा जाता है । साहित्य में, सीएसएफ निष्कर्षण के लिए प्रकाशित कई विस्तृत प्रोटोकॉल नहीं हैं और इस प्रोटोकॉल एक पहले से प्रकाशित विधि10 पर सुधार करने के लिए रक्त से संदूषण को कम करने, जबकि सीएसएफ का प्रचुर मात्रा में संग्रह को बनाए रखने. सीएसएफ तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में कई आवेदन किया है और सीएनएस के ऊतकों को निकटतम तरल पदार्थ में से एक के रूप में, यह अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान नमूना है । यह पहले से पहचाना गया है कि एक वयस्क माउस सीएसएफ12के 40 µ l की कुल मात्रा है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लिए 25% और संभवतः एक वयस्क माउस में सीएसएफ की कुल राशि का अधिक प्राप्त करने में सक्षम है । के अलावा नस्ल उपभेदों C57BL/6 और APP/PS1 चूहों, नस्लीय तनाव को नियंत्रित करने के नियंत्रण क्षेत्र (ICR) चूहों को भी सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सीएसएफ इकट्ठा किया गया है । विभिंन उंर (4 से 18 महीने) के चूहों से सीएसएफ सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकत्र किया गया है । इस प्रकार, इस विधि के साथ चूहों के विभिन्न उपभेदों या उम्र से सीएसएफ को इकट्ठा करने में कोई कठिनाई नहीं होनी चाहिए । इस विस्तृत प्रोटोकॉल उंमीद है कि कई द्वारा इस्तेमाल किया जाएगा सीएसएफ परख और अंय विश्लेषण तकनीक के विकास के लिए अनुसंधान में सहायता के लिए neurodegenerative रोगों है कि मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को प्रभावित समझ में सुधार होगा ।

यह महत्वपूर्ण है कि माउस के सिर कसकर बांधा जा सकता है, तो यह विच्छेदन और सीएसएफ संग्रह (प्रोटोकॉल की धारा 3) के दौरान कदम नहीं है । cisterna magna में प्रारंभिक पंचर के लिए साइट प्रचुर मात्रा में प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, गैर दूषित सीएसएफ । केशिका भी किसी भी रक्त वाहिकाओं के लिए बंद करने के लिए एकत्र नमूने के संक्रमण से बचने के लिए नहीं डाला जाना चाहिए । इसके अलावा, केशिका का समायोजन इष्टतम सीएसएफ संग्रह के लिए महत्वपूर्ण है । micromanipulator के उपयोग के लिए ठीक समायोजन के लिए बहुत आसपास के ऊतकों को बाधित और सीएसएफ दूषित बिना किए जाने की अनुमति देता है । micromanipulator के ठीक नियंत्रण का उपयोग करना, केशिका धीरे से या बाहर माउस से बाहर प्रवाह और संग्रह के लिए केशिका में करने के लिए सीएसएफ के लिए अनुमति देने के लिए ले जाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

इस काम को चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६५०११०५२७, ८१३७१४००) और चीन के राष्ट्रीय प्रमुख बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2013CB530900) ने समर्थन दिया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

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References

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