Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

Neuroscience

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Summary

Este protocolo describe una técnica mejorada para la abundante colección de líquido cefalorraquídeo (LCR) sin contaminación de la sangre. Con la mayor colección de la muestra y la pureza, se pueden realizar análisis más uso de CSF para mejorar nuestra comprensión de las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

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Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W. A., Møller, A., Huang, F. D. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

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Abstract

El líquido cerebroespinal (CFS) es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. Es uno de los fluidos en contacto más cercano con el sistema nervioso central y por lo tanto, se puede utilizar para analizar el estado enfermo del cerebro o la médula espinal sin acceder directamente a estos tejidos. Sin embargo, en los ratones es difícil de obtener de la cisterna magna debido a su proximidad a los vasos sanguíneos, que a menudo contaminan las muestras. El área de recolección de LCR en ratones también es difícil de diseccionar a y a menudo sólo pequeñas muestras se obtienen (máximo de 5-7 μl o menos). Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora en los métodos actuales de colección para minimizar la contaminación de la sangre y permiten la abundante colección de LCR (en promedio que 10-15 μl se pueden recoger). Esta técnica puede utilizarse con otros métodos de disección para la colección de tejidos de ratones, como no afecta ninguna tejidos durante la extracción de la CSF. Así, el cerebro y la médula espinal no se ven afectadas con esta técnica y permanecen intactos. Con pureza y una mayor recolección de muestra de LCR, análisis más pueden utilizarse con esta investigación de la neurociencia de líquido para más ayuda y entienden mejor las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

Introduction

El LCR es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. El LCR se hace principalmente de plasma de sangre, que contiene pocas células (sin glóbulos rojos y sólo unas pocas células blancas de la sangre) y está casi libre de proteínas. Es uno de los fluidos en contacto con el sistema nervioso central (SNC) y puede pasar muchos electrolitos del cerebro y la médula espinal del sistema periférico. En los seres humanos, CSF muestras se pueden recoger para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad o para fines de investigación en ensayos clínicos, como una punción raquídea (punción lumbar) es un procedimiento invasivo, menor: el líquido cefalorraquídeo puede reflejar los cambios en el SNC sin tener que acceder directamente a estos tejidos. Así, en los últimos años, para fines de investigación en la clínica, se han obtenido muestras de CSF de pacientes de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y otras demencias1,2,3. Hay muchos análisis de biomarcadores que se han desarrollado utilizando muestras de CSF para potencialmente ayudar en el diagnóstico de enfermedades en la clínica2,3. Sin embargo, hay mucho debate sobre la fiabilidad de estos ensayos para producir resultados consistentes y sensibles para diagnosticar específicamente la enfermedad4,5. Por lo tanto, hay una gran necesidad para el desarrollo de mejores ensayos y objetivos, que pueden encontrarse en el líquido cefalorraquídeo, para ayudar en la producción de una técnica estándar para diagnosticar enfermedades neurodegenerativas con mayor sensibilidad y especificidad. Debido a la importancia potencial de muestras humanas de la CSF en la enfermedad, la colección del LCR de los roedores en la investigación de la neurociencia es también de interés.

Ratones son animales importantes en la investigación biológica y médica y permiten la prueba de potenciales compuestos terapéuticos y estudios de prueba de concepto antes de ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, en ratones es difícil obtener muestras CSF debido a su proximidad al cerebro en un animal pequeño, como el método de recolección de LCR en ratones es obtenerlo a través de la cisterna magna, una abertura entre el cerebelo y la superficie dorsal de la médula oblongada. Esto causa dificultad en la recolección de muestras de CSF como esta área es difícil de diseccionar a y en proximidad cercana a los vasos sanguíneos, aumentando el riesgo de contaminación de las células de la sangre. Debido a estas dificultades, la mayoría de los investigadores sólo puede obtener una pequeña cantidad de LCR para análisis (generalmente indicado como μl 5-7) y la contaminación de muestras de CSF en las células de la sangre es una preocupación primaria para análisis6,7,8 , 9. contaminación de la sangre puede ocultar resultados y no verdaderamente reflejan el estado del SNC. Además, muestra limitada recogida puede impacto investigación como en la cantidad habitual de ratones es suficiente sólo una medición (en duplicado o triplicado) usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Así, muestras CSF son agrupadas generalmente de varios ratones con el fin de tener suficiente muestra para ejecutar múltiples ensayos. Desarrollando un protocolo para la abundante, colección incontaminada de la CFS de ratones se desea grandemente y será beneficiosa en la mejora de la investigación de la neurociencia con roedores.

En el presente Protocolo, una técnica para la abundante (un promedio de 10-15 μl) colección de LCR de ratones anestesiados se describe en detalle y mejora en un método actualmente conocido de recolección de LCR para minimizar la contaminación de sangre10. Un protocolo robusto para recolección de LCR ayudará en el desarrollo de análisis de biomarcadores basados en la CSF, que podría utilizarse para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad, así como mejorar la investigación en los mecanismos que subyacen a las enfermedades que afectan el SNC.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las políticas de la sociedad para la neurociencia (USA) y comités de ética de la Universidad de Fudan (Shanghai, China). Este procedimiento es una cirugía no supervivencia.

1. instalación de aparatos de la colección de LCR

  1. Tire el vaso capilar (diámetro interno 0, 75 mm, diámetro externo de 1,0 mm) utilizando un extractor de micropipeta (como se muestra en Liu et al. 10; tubo capilar afilado se muestra en la figura 1).
  2. Lugar un capilar en el porta capilar de vidrio afilado montado firmemente en un micromanipulador (figura 1A).
  3. Romper la punta del tubo capilar afilado con pinzas rectas con un microscopio de disección, por lo que el diámetro interno de la punta rota es de 10-20 μm (figura 1).
  4. Conecte una jeringa y un tubo delgado en el otro extremo del soporte del tubo capilar y conecte la jeringa y la sonda delgada con una válvula de tres vías.
  5. Cambiar la válvula de tres vías para abrir y hundir la jeringa para soplar aire de la jeringa a través del tubo para el capilar para expulsar cualquier contaminante y crear la presión positiva en el tubo capilar de vidrio.
  6. Repita esto unas cuantas veces por dis-conectar y volver a conectar la jeringa a la válvula de tres vías y elaborar la jeringa ~ 100-200 μL antes de la última re-conexión de la jeringa con la válvula de tres vías (figura 1B).
  7. Mueva el instrumental quirúrgico con el capilar de vidrio al lado para evitar daños durante la disección del ratón.

Figure 1
Figura 1. Microscopio, instrumental quirúrgico y configuración capilar. (A) microscopio e instrumental quirúrgico con tubo capilar unida de configuración, así como una imagen más cercana de (B) la jeringa conectada y la válvula de tres vías para abrir (mostrado aquí) o cierre la tubería y (C) una intacta (derecha) y rota (izquierda) Punta capilar lista para recolección de LCR. Una vez roto, la punta del tubo capilar debe tener un diámetro interno de 0,75 mm, diámetro externo de 1,0 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. ratón disección

  1. Anestesiar el ratón.
    Nota: para este protocolo, C57BL/6 y amiloide precursora proteínas/presenilin 1 (aplicación/PS1) transgénicos (modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer) de ratones fueron utilizado y anestesiado con hidrato de cloral 4% (en dH20) a 10 μl/g de peso del ratón vía intraperitoneal inyección.
  2. Cuando completamente anestesiados, asegúrese de que el ratón es adecuadamente anestesiado. La respuesta de retirada a los pies, pizca, ligeramente extendiendo los miembros posteriores y pellizcos de los dedos del pie y observando una respuesta de retirada, se realiza para asegurar la anestesia adecuada. Compruebe pellizcando las cuatro extremidades; Si no hay reacción el ratón correctamente está anestesiado. Corte y recorte el pelo en la parte posterior de la cabeza del ratón por encima de los ojos, entre las orejas a la parte inferior del cuello usando tijeras de disección (figura 2A). Por otra parte, clippers o crema depilatoria puede utilizarse para ayudar en la eliminación del vello.
  3. Fije la cabeza del ratón utilizando un adaptador de ratón (la parte posterior de la cabeza hacia arriba con la nariz apuntada hacia abajo en el ~ 45 °, figura 2A). Fijar barras de oído entre los oídos y los ojos del ratón y apriete. Asegúrese de que la cabeza no se mueva y esté asegurada firmemente en el adaptador presionando suavemente hacia abajo sobre la cabeza del ratón.
  4. Vuelva a verificar la respuesta de retirada para dedo pellizco antes de realizar la incisión quirúrgica y regularmente después de eso para asegurar el plano quirúrgico de anestesia. Observe visualmente cualquier cambio en la frecuencia respiratoria durante el proceso de indicar cambios en los planos de la anestesia. Una técnica limpia, aséptica, puede utilizarse para esta cirugía no supervivencia corta. Usando tijeras y pinzas curvas, corte a través de la piel y la primera capa del músculo hasta la base del cráneo está expuesta con sólo una capa delgada de músculo.
    Nota: Corte a través de la piel de ratón en la parte posterior del cuello y luego se corta la piel a la mitad del cráneo entre las orejas y los ojos del ratón. Piel y el tejido pueden entonces tirar aparte y fuera de la zona sobre la cisterna magna.
  5. Mientras que la observación mediante el microscopio de disección, diseccionar cuidadosamente lejos el último delgadas capas de músculo sobre la base del cráneo con unas pinzas y mover estas capas de músculo en el lado y fuera del área de interés. Si hay sangrado, utilizar bastoncillos de algodón para eliminar y ayudar a detener el sangrado.
  6. Una vez que se expone la dura sobre la cisterna magna (forma triangular con 1-2 vasos sanguíneos recorren la zona; ambos lados o entre los vasos sanguíneos son ser óptimo para la inserción capilar y recolección de LCR, figura 2B), utilizar un mojado bastoncillo de algodón para limpiar la membrana y luego use un bastoncillo de algodón seco para secar el área.

Figure 2
Figura 2. Configuración del ratón y la disección con imágenes representativas de la inserción capilar para recolección de LCR. Configuración del ratón listo para la extracción de la CSF con (A) afeitó la cabeza sujetada en su lugar para disección y (B) una detallada imagen (vista de 10 x) de una dura ratón disecado que la cisterna magna (Flecha discontinua muestra un vaso sanguíneo por la zona y Flecha sólida muestra área óptima para la inserción capilar). Imágenes detalladas (vista de 10 x) de (C) afilan la punta del capilar de vidrio contra la dura de la cisterna magna, (D) el punto en el cual el capilar pinchazos casi dura, con alguna resistencia de dura y (E) la punta capilar aprovechada a través de la duramadre para recoger CSF. CSF debe ser un líquido claro en el capilar de vidrio (flecha punteada). Todas las barras de escala en la parte inferior derecha de cada imagen de microscopio indican 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. CSF colección de ratón anestesiado

  1. Alinee el tubo capilar de vidrio en la parte posterior de la cabeza de ratón para que el afilado es justo detrás de la membrana en un ~ ángulo de 30-45 ° (figura 2).
  2. Sumir la jeringa una vez o unas cuantas veces y elaborar la jeringa ~ 100-200 μl (para asegurarse de que no son contaminantes y hay presión negativa en el vaso capilar).
  3. Mediante el micromanipulador, mueva el tubo capilar punta cerca de la membrana hasta que la resistencia puede verse, pero lo (Figura 2D) pinchar no.
  4. Una vez que la resistencia se ve entre la extremidad del tubo capilar y la membrana, golpee suavemente el tubo capilar a través de la membrana por la anulación de los controles de instrumental quirúrgico. Usar el microscopio para ver el punto afilado de la punción capilar en la cisterna magna. CSF automáticamente debe ser dibujada en el tubo capilar una vez que la apertura ha sido perforada (Figura 2E).
  5. Dejar el tubo capilar para recoger lentamente la CSF. Si el CSF ha dejado sacar, extraer lentamente la jeringa una pequeña cantidad (~ 50 μL) para crear presión más negativa en el capilar para extraer al CSF.
    Nota: Como alternativa, el capilar se puede suavemente y poco a poco sacar del cerebro usando los controles del micromanipulador fina para permitir que la CSF fluya dentro del tubo capilar nuevo. Un total de ~ 10-15 μl de la CFS (~ 3-4 cm en el tubo capilar) toma ~ 10-30 min y de vez en cuando 20 μl o más pueden ser recogidos. Aunque no es absolutamente necesario, se recomienda utilizar una almohadilla de calor durante la recolección de LCR. Recolección de LCR se realizó a temperatura ambiente (~ 23 ° C).
  6. Una vez se recoge la cantidad de LCR deseado, cierre el tubo desplazando la válvula de tres vías para cerrar (para dejar de dibujar hacia fuera el líquido cefalorraquídeo).
  7. Sacar la jeringa conectada a la tubería y abra y cierre el tubo (para crear presión ecualizada en el tubo capilar, tubo y la zona exterior del tubo capilar). Vuelva a conectar la jeringa con la válvula de tres vías, pero no sumergir la jeringa.
  8. Suavemente Retire el capilar de vidrio el ratón utilizando el instrumental quirúrgico.
  9. Coloque el tubo de colección (microtubos de 1.5 mL con 1 μl de 20 x inhibidor de la proteasa) bajo el punto de afilado del vaso capilar.
  10. Abra el tubo y sumergirse suavemente la jeringa: el CSF debe fluir fuera del tubo capilar y en el tubo de la colección.
  11. Después de la recolección, centrifugar rápidamente (pulso centrifugado durante 5 s a máxima velocidad utilizando una centrífuga mini) el LCR para mezclar la muestra con el inhibidor de la proteasa en la parte inferior del tubo de colección.
    Nota: Las muestras CSF pueden ser alícuotas y almacena para su posterior análisis a-80 ° C. El resto del ratón puede ser disecado para otros tejidos, como cerebro y médula espinal. El ratón está todavía vivo en esta etapa y así puede también ser extraído sangre, si es necesario.

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Representative Results

Utilizando el procedimiento descrito aquí (figura 1 y figura 2), el CSF recogido inmediatamente en el tubo capilar debe ser claro (Figura 2E), no color de rosa o rojo. Si hay un color de rosa a la tonalidad rojiza al líquido en el capilar, luego hubo contaminación con sangre.

Como un ejemplo de la aplicación de la muestra de LCR obtenidas con este método, los niveles de la proteína amiloide beta (Aβ) se midió usando ELISA. Niveles de Aß en el LCR se mide comúnmente en la enfermedad de Alzheimer investigación7. CSF es en su mayoría proteínas. En un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer (APP/PS1 ratones), los niveles de Aβ humano42 se aumentan significativamente, como estos ratones sobreexpresan APP humano. Esto puede observarse con las muestras de LCR de ratones 12 meses utilizando los métodos descritos aquí (0 pg/mL en el LCR de los ratones (WT) de tipo salvaje comparado con 1.303 pg/mL en el LCR de APP/PS1 ratones, figura 3).

Figure 3
Figura 3. Resultados representativos para la muestra de LCR recogido. Análisis ELISA de muestra de LCR recogido. En un modelo murino de la enfermedad de Alzheimer (APP/PS1), hay un aumento significativo en los niveles de Aβ humano42 en el LCR, como estos ratones sobreexpresan humano Aß42 (1.303 pg/mL). En wild-type (WT) ratones allí deben ser no humano Aß42 detectado (0 pg/mL). Un impar t-test se utilizó para medir la importancia, ** p < 0.01, barras de error representadas como SEM, n = 3 y 4 ratones en 12 meses de edad respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora las actuales métodos10 de recolección de LCR para minimizar la contaminación de la sangre y permitir la abundante colección de LCR (promedio ~ 10-15 μl pueden obtenerse) de ratones. Al romper la punta del capilar, la punta del tubo capilar no debe ser demasiado pequeña (como el LCR se extraerán muy lentamente) o demasiado grandes (no ser fina suficiente para recoger el LCR y tejido puede alojarse en el capilar). Debe tenerse cuidado al disecar el área para recolección de LCR: cualquier sangrado debe ser detenido y limpia el área de inserción del vaso capilar de sangre con dH20 para evitar la contaminación con la muestra. La anatomía de cada ratón es diferente, pero la mayoría Ratones tienen vasos sanguíneos principales 1-2 por la zona donde el tubo capilar debe insertarse para recolección de LCR. Elegir que el lugar correcto para la inserción del tubo capilar es importante, como la inserción de cerca los vasos sanguíneos principales contaminará el LCR con sangre. Como se muestra en la figura 2, una zona libre de vasos sanguíneos, tales como entre o en ambos lados de los vasos sanguíneos principales, es óptima para la inserción capilar evitar la contaminación. Si el LCR no fluye hacia fuera a un ritmo constante y se detiene después de algún tiempo, dibujar un poco la jeringa (~ 50 μL) puede ayudar a reiniciar el flujo de la CFS en el capilar. Alternativamente, el tubo capilar sí mismo se puede mover suavemente y lentamente dentro o fuera del ratón con el micromanipulador para reiniciar el flujo de extracción de la CSF. Debe tenerse cuidado al hacer estos pasos como la sangre puede fluir en el tubo capilar, así. Esta técnica funciona bien debido a las diferencias de presión del cerebro y vidrio capilar para extraer CSF del ratón. Así, el ratón puede sólo pinchar una vez, como después de que el capilar se inserta en el ratón y sacar, hay una pérdida de presión en el cerebro y CSF, ya no ser arrastrado hacia el capilar automáticamente si se inserta otra vez. Por lo tanto, práctica perfecciona esta técnica para no producir contaminantes de la sangre y obtener la adecuada recolección de LCR en la primera inserción del tubo capilar en el ratón (de experiencia, 10-20 ratones de práctica será suficiente para llegar a esta etapa).

Este protocolo es un método mejorado y eficiente para la extracción de CSF de ratones y si se hace correctamente, minimiza la contaminación de la sangre (figura 1, figura 2, figura 3). Esta técnica está limitada por el tiempo necesario para que la CSF a recogerse. Normalmente, se necesita 30 minutos para recoger ~ 15 μl o más de la CFS a temperatura ambiente (~ 23 ° C). Durante este tiempo, el ratón puede conservarse caliente con algodón o tejido, pero sin cubierta o almohadilla de calor, CSF puede todavía ser correctamente recogida. Además de una almohadilla de calor o calentamiento el ratón antes de que el procedimiento puede mejorar esta técnica al aumentar el flujo de LCR en el cerebro y reducir el tiempo necesario para la colección, como se describe en otros métodos10,11. Pero en el protocolo descrito aquí, sin almohadilla de calor o calentamiento del ratón fue utilizado y entre ratones sin dificultad por la cantidad de CSF que se recaudaban. Como ejemplo de la aplicación de para que esta técnica puede utilizarse los niveles de Aβ humano42 se midieron mediante ELISA. Aβ es conocido por ser pegajosa y puede adherirse al vidrio y los tubos de la colección. En este protocolo, se utilizaron Capillares de vidrio de borosilicato y tubos de polipropileno para recoger el LCR de los ratones. Mientras que algunos Aβ puede adherirse a los capilares de cristal y paredes de los tubos de la colección, el ELISA resultados demuestran que los niveles de Aß pueden ser medidos (figura 3). Sin embargo, es posible que niveles de Aß medidos desde el LCR recogido en este protocolo son inferiores a lo descrito por otros estudios, pero los tubos capilares de vidrio son necesarios para perforar a través de la duramadre del ratón para recoger el LCR. Además de medición de Aβ, otras proteínas de interés se pueden también medir utilizando el LCR recogido.

Mientras que el método anteriormente publicado de recolección de LCR por Liu et al. 10 fue significada para la recogida continua de la CFS de ratones vivos, el método descrito aquí es para la colección del LCR de los ratones para ser sacrificado para el análisis y colección de tejido. Así, esta técnica puede utilizarse junto con otros métodos de disección para la colección de tejido de ratón como no afecta el cerebro y la médula espinal y después de la recolección de LCR (es decir, después de 10-30 min de ~ 10-15 μl de LCR), el ratón todavía debe respirar y bajo anestesia. Por lo tanto, otros tejidos como sangre, cerebro, médula espinal y el hígado son aún viables para la recolección y el análisis bioquímico. Aunque la de Liu et al. método había recogida CSF muy rápidamente (10 minutos por ratón para 3-7 μl de LCR), el método descrito aquí lleva más tiempo pero puede recoger más de CSF10. Otro método para recolección de LCR ha sido también descrito por Maia et al. 11 tanto el Liu et al. y métodos de Maia et al describen recogiendo CSF de ratones por Capillares de vidrio de explotación de la mano o puntas de cargador de gel y pinchar en la cisterna magna. El método descrito aquí es diferente al fijar el tubo capilar a un micromanipulador. Esto asegura que el capilar se mantiene inmóvil y disminuye la contaminación de la sangre durante la recolección de LCR. El micromanipulador también permite mayor precisión y exactitud en la punción de la cisterna magna para obtener CSF. Aunque el método de Maia et al también pudo obtener 15-20 μl de la CFS por ratón, requiere puncionar repetidamente la cisterna magna de mano con puntas de gel cargador, que puede aumentar el riesgo de contaminación de la sangre o tejido. Además, el Maia et al método puede disminuir la presión en el cerebro con cada punción secuencial de la cisterna magna por lo que hay menos CSF recogido cada vez. El método aquí descrito implica sólo una punción y dejando el tubo capilar en la cisterna magna para recoger más CSF como recargas con CSF cuando el ratón está bajo anestesia. Así, el protocolo descrito aquí continuamente recoge CSF y disminuye la posible contaminación de punciones repetidas en la cisterna magna, así como alteración de los tejidos circundantes.

Con pureza y una mayor recolección de muestra de LCR, análisis más pueden utilizarse con este líquido para ayuda adicional en la investigación de la neurociencia. Es bien conocido entre los investigadores que la colección de LCR de ratones puede ser tedioso y sólo puede obtenerse una muestra limitada (generalmente indicado como un máximo de 5-7 μl6,7,8,9). En la literatura, no hay muchos detallan protocolos publicados para la extracción de la CSF y este protocolo mejora en un método previamente publicado10 para minimizar la contaminación de la sangre, manteniendo la abundante colección de LCR. CSF tiene muchas aplicaciones en la investigación de la neurociencia y como uno de los más líquidos a los tejidos del SNC, es una muestra valiosa para la investigación. Se ha identificado previamente que un ratón adulto tiene un volumen total de 40 μl de CSF12. Así, este protocolo es capaz de obtener el 25% y posiblemente más de la cantidad total de LCR en un ratón adulto. Además ratones C57BL/6 y aplicación/PS1 de la cepas consanguíneas, la cepa exogámica impresión región de control (ICR) ratones también se han utilizado con éxito recoger CSF utilizando este protocolo. CSF de ratones de diferentes edades (4 a 18 meses) se han recogido con éxito usando este protocolo. Por lo tanto, no debería haber ninguna dificultad en la recolección de CSF de diferentes cepas o edad de los ratones con este método. Este protocolo detallado que se utilizará por muchos para mejorar el desarrollo de los análisis de CSF y otras técnicas de análisis para ayudar en la investigación para entender las enfermedades neurodegenerativas que afectan el cerebro y la médula espinal.

Es fundamental que la cabeza del ratón apretar firmemente, por lo que no se mueve durante la disección y la recolección de LCR (artículo 3 del Protocolo). El sitio de la punción inicial en la cisterna magna es importante para la obtención de abundante, no contaminado de la CSF. El capilar no debe insertarse demasiado cerca para cualquier vasos sanguíneos para evitar la contaminación de la muestra recogida. Además, ajuste el tubo capilar es fundamental para una óptima recolección de LCR. El uso de las amalgamas dentales permite ajustes finos sin grandemente afectar el tejido circundante y contaminar el líquido cefalorraquídeo. Utilizando los controles finos de las amalgamas dentales, el capilar puede lentamente mover adentro o hacia afuera para permitir la CSF fluya hacia fuera del ratón y en el capilar para la colección.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81650110527, 81371400) y nacional clave básica de investigación programa de China (2013CB530900).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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