الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا البروتوكول وصف أسلوب استنساخه وموثوق بها لإعداد المستندة إلى التسامي الفورمالين الثابتة الأنسجة الموجهة للتصوير الطيف الكتلي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

O'Rourke, M. B., Padula, M. P., Smith, C., Youssef, P., Cordwell, S., Witting, P., Sutherland, G., Crossett, B. Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows. J. Vis. Exp. (131), e56778, doi:10.3791/56778 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

استخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين، الكتلي التصوير (استخدام MSI) وقد توسعت بسرعة، منذ هذا الأسلوب بتحليل مجموعة من الجزيئات الحيوية من الأدوية والدهون إلى جليكانس ن. على الرغم من وجود تقنيات إعداد نموذج مختلف، اكتشاف الببتيدات من فورمالدهايد الحفاظ على الأنسجة يبقى واحداً من أصعب التحديات لهذا النوع من التحليل الشامل والمطيافيه. لهذا السبب، نحن إنشاء وتحسين منهجية قوية تحافظ على المعلومات المكانية الواردة ضمن العينة، مع التماس أكبر عدد من الببتيدات التأين. ونحن أيضا تهدف إلى تحقيق هذا الهدف بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وبالتالي القضاء على خطأ التحيز أو إعداد المحتملة، التي يمكن أن تحدث عند استخدام الآلي الأجهزة. والنتيجة النهائية بروتوكول استنساخه وغير مكلفة.

Introduction

استخدمت الليزر ساعد مصفوفة التصوير (استخدام MSI) الطيف الكتلي الامتزاز/التأين كأسلوب صورة القائمة للعقدين الماضيين1،2، تحليل مجموعة من الجزيئات الحيوية بما في ذلك: الدهون3، الببتيدات2 ،4البروتينات2،5، والايضات6،7، جليكانس ن8والجزيئات الاصطناعية مثل العقاقير العلاجية9،10. ازداد عدد المنشورات التي تبين مدى فائدة هذا الأسلوب إلى حد كبير على الماضي العقد6،11،،من1213. بعض الجزيئات، مثل الدهون، سهلة نسبيا لتحليل عن طريق استخدام MSI، كما أنها تتأين سهولة نظراً لطبيعتها الكيميائية ومن ثم تتطلب إعداد مسبق قليلاً3. أكثر صعوبة من الأهداف مثل الببتيدات والخطوات المطلوبة لفعالية تتأين هذه الجزيئات غير واسعة ومعقدة عموما14. وهناك حاليا عدد قليل جداً من المنشورات التي تهدف إلى معالجة أو إثبات إمكانية تكرار نتائج في المنهجيات التي تستخدم لإعداد الأنسجة لهذه التقنية البصرية الفريدة15. ولهذا السبب، لدينا تجميع الملاحظات وتنفيذ تحسينات في واحدة، سهلة التنفيذ، المنهجية التي ينبغي أن تتطلب القليل إلى أي تعديل، لتحليل الببتيدات من فورمالدهايد تصميمهما الأنسجة المصدر14.

في هذه المخطوطة، لقد قمنا بوصف منهجية استنساخه تم التحقق من صحتها، ومنخفضة التكلفة للكشف ورسم الخرائط المكانية من الببتيدات، المتولدة من الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) أقسام الأنسجة وثابتة الفورمالين المجمدة (FFF). لا تتطلب هذه المنهجية أو الاعتماد على أي الأجهزة المتخصصة3. على وجه التحديد، علينا التصدي للجوانب العديدة لإعداد نموذج المتخصصة اللازمة لتحليل الببتيدات؛ خطوات مثل استرجاع مستضد16 ومصفوفة الطلاء. لدينا بروتوكول يستخدم أيضا معدات غير مكلفة والمواد الكاشفة، مما يجعل هذه المنهجية من الوصول إلى مجتمع أوسع الذي خلاف ذلك سيكون غير قادر على تحمل تكاليف الأجهزة الروبوتية بديل17.

كان السبب الكامن وراء تطوير أسلوب إعداد عينة يدوي شقين: أولاً، استخدام سوبليماتور يقوم بطلاء متجانسة ومتسقة من بلورات المصفوفة التي هي ~ 1 ميكرومتر في الطول18، شيء لا يمكن تحقيقه برش أكثر شيوعاً تقنيات. ثانيا، إعداد تكاليف صغيرة نسبيا: بلغت التكلفة الإجمالية لجهاز مخصص < 1500 دولار أسترالي ونلاحظ، من حيث فعالية التكاليف، السعر لكل عينة أرخص بكثير عندما يوجد لا الآلات الروبوتية. استخدام التسامي أبلغ سابقا، ومع ذلك، على حد علمنا، لم تم الإبلاغ عن المنهجيات خطوة بخطوة التي تصف هذه العملية ونماذج إعداد لا الموصوفة في الأدب.

هذا البروتوكول يهدف إلى مساعدة الباحثين التي يستطيعون الوصول إلى استخدام مطياف كتلة، والذين عازمة على توليد المعلومات المكانية بالنسبة لجزيء بيو الفائدة19. في جوهرها، هي استخدام MSI شكلاً من أشكال النسيجي الفرز التي لا تعتمد على الأجسام المضادة أو البقع2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: جميع احتياطات السلامة الواجبة التطبيق ينبغي اتباعها عند تنفيذ هذا الإجراء، بما في ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) (مثلاً، مختبر المعاطف، القفازات النتريل، سلامة النظارات، إلخ)

1-إعداد الكواشف والمعدات

  1. إعداد الحلول
    1. إعداد 500 مل السائل في كارني، خلط الإيثانول 100% (EtOH)، كلوروفورم، وحمض الخليك الجليدية في 6: نسبة 3:1 v/v/v في زجاجة شوت زجاج نظيفة.
    2. لجعل السائل النيتروسليلوز (NC)، تذوب غشاء NC (تستخدم عادة في النشاف غربي) في الأسيتون أنيق، بالانفعالات لطيف، إلى تركيز نهائي من 40 ملغ/مل.
  2. إعداد شرائح NC المغلفة
    1. استخدام تقنية مماثلة لتلك المستخدمة لإعداد الدم مسحات ل الفحص النسيجي20 إلى إعداد NC مغلفة بالشرائح.
    2. "الماصة؛" ميليلتر 40 من نورث كارولاينا السائل على حافة واحدة من شريحة مجهر إنديوم موصل أكسيد القصدير (إيتو). استخدام شريحة الميكروسكوب زجاجية عادية، اسحب NC تحت التوتر السطحي عبر الشريحة لإنشاء طلاء حتى رقيقة.
    3. تسمح NC لتجف في درجة حرارة الغرفة 20 s والمتجر ثم حتى حاجة في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين العينات في ظل هذه الظروف إلى أجل غير مسمى شريطة المحافظة على الأنسجة وخالية من الغبار.
      ملاحظة: هذا الأسلوب من إعداد المعروف "رقيقة" وسوف ينتج طلاء موحد يعتمد على لزوجة NC، فضلا عن افتقاره إلى التوتر السطحي المستوى الذاتي على الشريحة. فقط الرعاية التي ينبغي اتخاذها عند إعداد الشرائح لا تتحرك بسرعة كبيرة جداً، مما سيخلق الشرائط NC بدلاً من تغطية كاملة.
      تنبيه: كما NC السائل يجف بسرعة كبيرة، من الضروري للعمل بسرعة لتفادي التجفيف الحل قبل قد انتشر بشكل صحيح. ينبغي أيضا توخي الحذر عند التعامل مع نورث كارولاينا في حالته السائلة، كما هو مركب نشيطة جداً ولا ينبغي الاتصال بمصدر الإشعال منع انفجار حارقة. كما يخضع NC انتقالات ماص للحرارة عند التجفيف ويمكن أن تسبب الحروق الباردة إذا سمح لفترات طويلة تتلامس مع الجلد أو الأيدي القفاز. لتقليل المخاطر المرتبطة بها جميعا، ينبغي إعداد كميات صغيرة فقط في كل مرة (< ينصح مل 1). وبمجرد جفاف أنها مستقرة في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، يمكن أن تظل NC المتفجرة عندما تكون موجودة بكميات كبيرة.
  3. إنشاء دوائر بخار مخصصة
    1. قص قطعة من ورق نشاف ثخين مع زوج من مقص كبيرة بما يكفي لاحتواء الجزء السفلي نصف طبق بيتري البلاستيك القياسية (94 مم وقطرها 3 مم).
    2. قص الورقة، ترك شريط مستطيل في الوسط، بنفس حجم شريحة مجهر، ترك ما يكفي الزائدة حيث أن الورقة سوف تحافظ على موقفها في طبق بتري (تكميلية الشكل 1).

2-إعداد مقاطع الأنسجة

  1. الأنسجة FFPE21.
    1. حدد كتلة الأنسجة المرجوة وقسم أنه في 12 ميكرون سمك في مقاعد البدلاء قياسية محملة مبضع وتعويم جبل على NC المغلفة مسبقاً إيتو الشرائح.
    2. غمر شرائح زيلين نفط جديدة لإزالة البارافين المتبقية لمدة 2 دقيقة، وكرر العملية مرة ثانية.
      ملاحظة: إذا كانت كتلة البارافين منتشر خاصة أو الأنسجة صغيرة نسبيا بالمقارنة مع كتلة البارافين، يمكن تسخين العينات عند 60 درجة مئوية لإذابة أغلبية بعيداً قبل الغسيل في زيلين نفط.
    3. تغسل العينات ديبارافينيزيد بغمر الشرائح في سلسلة المذيبات متدرج: 70% v/v EtOH المياه، 100% EtOH، كارني للسوائل، 100% EtOH، مياه نقية جداً و 100% EtOH. وينبغي أن تكون مدة غمر كل 30 ثانية، باستثناء السائل في كارني، والتي يجب أن تستمر 2 دقيقة.
      تنبيه: السائل في كارني وزيلين نفط يجب المخزنة والمستخدمة في غطاء دخان، كما أنها شديدة السمية إذا استنشق.
  2. الأنسجة الثابتة الفورمالين المجمدة (FFF)
    ملاحظة: العينات يجب الفعل تجميد، على نحو مناسب وفقا لنوع العينة.
    1. حجته كتلة الأنسجة عند درجة حرارة التشغيل مبضع ل 20 دقيقة22.
      ملاحظة: درجة حرارة الموازنة تعتمد على نوع الأنسجة.
    2. قسم الأنسجة باستخدام مبضع في جبل 12 ميكرومتر وذوبان الجليد المقاطع على NC معدّة سلفا المغلفة إيتو الشريحة.
    3. تخزين الشرائح في مجفف فراغ على مقاعد البدلاء في الظلام.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات لعدة أسابيع في ظل هذه الظروف.
    4. تغسل العينات في سلسلة المذيبات متدرج كما ذكر للأنسجة FFPE (2.1.3).
      ملاحظة: ليست هناك حاجة لخطوة ديبارافينيسيشن زيلين نفط ليس هو جزءا لا يتجزأ من العينة.

3-الميثيلين التشعب التحلل المائي

  1. تحميل الشرائح عينة (FFF أو FFPE) في مربع شريحة بلاستيكية التي مليئة بالأعلى 20 ملمول تريس-HCl (pH 8.8). ختم المربع ووضعه في حمام مائي، التي تحتوي على 500 مل الماء، يسمح مربع للمس الأسفل. ثم الحرارة لمدة 15 دقيقة على 120 درجة مئوية في طنجرة الضغط الذي يمكن أن تحققه ضغط تشغيل 70 كيلو باسكال.
  2. إزالة الشرائح، وتسمح لهم ببارد، والسماح لهم الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

4-الأنسجة الهضم

  1. عندما تحلل، معطف العينات مع 10 ميليلتر لحل التربسين (1 ملغ/مل) في المياه النقية فائقة، قبل بيبيتينج ميليلتر 10 الحل على حافة مقطع الأنسجة، ثم استخدام نفس تلميح ماصة، اسحب الحبرية عبر السطح كله من الأنسجة تحت سطح التوتر.
    ملاحظة: تجنب خدش سطح النسيج مع طرف ماصة، وعبر نشر الإنزيم خارج حدود حواف الأنسجة.
  2. تسمح العينات لتجف في درجة حرارة الغرفة.
  3. وبمجرد جفاف، جبل العينات داخل الجزء العلوي من قاعة بخار شيدت سابقا (الأنسجة أسفل) مع شريط اﻷوتوكﻻف أما الحافة من الشريحة (تكميلية الشكل 2).
  4. "الماصة؛" 600 ميليلتر من محلول يحتوي على مزيج 1:1 v/v من بيكربونات الأمونيوم الاسيتو الانيتريل و 50 مم 100% بعناية على ورقة نشاف الإصبع في الجزء السفلي من صحن بيتري حتى يبدو أن الإصبع الرطب بالتساوي.
  5. ضع النصف العلوي من قاعة بخار في أسفل النصف، وضمان الشريحة الإصبع ونموذج ورقة محاذاة تماما، وختم الدائرة حول به خط الاستواء مع الفيلم البارافين.
  6. اترك العينة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح بإكمال عملية الهضم.

5-مصفوفة الطلاء عبر التسامي

  1. وبمجرد يهضم، تزن الشريحة عينة على توازن ميكرواناليتيكال 5 أرقام.
  2. جبل الشريحة على إصبع تبريد جهاز التسامي وآمنة مع الشريط النحاس، بنفس الطريقة كما هو موضح لقاعة بخار (تكميلية الشكل 3).
    ملاحظة: للتأكد من أن الشريحة يتم الاتصال بالتساوي بأصبع التبريد، يتم وضع طبقة من الشريط النحاس على الجزء السفلي من إصبع تبريد مستوى السطح. وهذا ما يضمن أن الشريحة يتم تبريده بشكل متساو مما يؤدي إلى ترسب حتى من المصفوفة.
  3. ضع 300 ملغ من حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك (شكا) مصفوفة في طبق بتري زجاج في الجزء السفلي من الدائرة وانتشارها بشكل متساو لخلق طبقة رقيقة من بلورات المصفوفة.
  4. التجمع في سوبليماتور وتأمين النصفي مع المشبك حدوة الحصان. تعليق تجميع الوحدة 15-20 سم فوق حمام رملي، يسخن في 220 درجة مئوية، بوضعه في حلقة معدنية متصلة بموقف معوجة.
  5. توصيل الدائرة بمصدر فراغ والانخراط في الفراغ، والسماح لها بتحقيق الاستقرار وصولاً إلى متور ~ 25 لمدة 5 دقائق.
  6. حزمة إصبع تبريد إلى الأعلى مع الجليد وإضافة 50 مل الماء. السماح لجهاز لتسوية 5 دقائق أخرى قبل المتابعة.
  7. انخفاض الدائرة على سطح الرمل، ضمان اتصالات الرمال تماما الجزء السفلي من الغرفة، وترك الأمر لمدة 45 دقيقة لإنشاء طلاء مثالية من 0.22 ملغم/سم2
    تنبيه: يجب توخي الحذر عند التعامل مع الأواني الزجاجية في فراغ عالية، كأي ضرر للجهاز، في حين تم إجلاء، يمكن أن يؤدي في فشل ذريع لقاعة الزجاج.
  8. وبعد 45 دقيقة، إزالة الدائرة من حمام الرمل برفع حلقة معدنية والتنفيس عن الدائرة.
    ملاحظة: بمجرد قد تم تنفيس الدائرة، الشريحة يجب إزالتها بشكل سريع جداً كما سوف تبدأ المياه في الجو تتكثف على الشريحة الإصبع وعينه تجميد.
  9. قم بإزالة الشريحة وتزن على كفالة الطلاء المطلوب قد تحقق.
    ملاحظة: إذا أنجز طلاء غير كافية، ببساطة تكرار عملية التسامي للشريحة حتى سمك الطلاء المطلوب قد تحقق.

6-البلورة

  1. بمجرد المتسامي، جبل الشريحة عينة داخل الجزء العلوي من قاعة بخار المشيدة سابقا، كما وصف سابقا (الأنسجة إلى الأسفل).
  2. "الماصة؛" 600 ميليلتر من محلول يحتوي على 1:1 (v/v) مزيج من حامض trifluoroacetic v/v الاسيتو الانيتريل و 0.1% 100% في الماء بعناية على ورقة نشاف في الجزء السفلي من صحن بيتري لضمان طلاء حتى.
  3. تجميع الدائرة، وضمان الشريحة التبويب ومجهر ورقة محاذاة تماما، وترك في حاضنة 37 درجة مئوية أجل ح 1.
    تنبيه: لا ختم الدائرة.
    ملاحظة: مرة واحدة يتطلب، هوي الأصفر عادة من المصفوفة يجب تغيير إلى اللون الأبيض وتبدو أقل لامعة وتظهر جداً حتى. يشير هذا إلى أن البلورة قد أجريت بشكل صحيح.
  4. النموذج جاهز الآن للتحليل.

7-الأجهزة

  1. تفحص الشريحة في الماسح ضوئي مسطح لإنشاء صورة رقمية.
  2. تحميل العينة في مطياف كتلة وتحليلها ثم استخدام منصة برمجيات مناسبة.
  3. تحليل العينات في وضع ريفليكترون أيون إيجابية مع مجموعة شامل دا 750-3,500، مع دقة موضعية التي تنطبق على النتيجة المرجوة. في معظم الحالات، 20-50 ميكرون النقطية العرض غير كافية، ولكن أقل من 10 ميكرون يمكن أن تستخدم15.
    تحذير: استخدام الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر مصدرا من مصادر الإشعاع المؤين وينبغي أن لا ينظر إليها مباشرة. ضمان أن الليزر يرد ضمن صك التدريع قبل إجراء العملية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إذا اتبعت بشكل صحيح، ينتج هذا البروتوكول الصور التي تمثل وضوح مورفولوجية إجمالية للأنسجة دون أي خدوش أو التشوهات الأخرى (الشكل 1). التحقق من صحة مثالية لإعداد نموذج يقوم بشكل صحيح، القدرة على التمييز بين مختلف الهياكل المادية عن طريق تغيير يجري جزيء شوهدت (الشكل 2).

دليل جيد لتحديد ما إذا كانت العينات قد أعدت بشكل غير صحيح للتحقق من وجود تمركز أو تجميع مصفوفة؛ تواقيع الببتيد التي تمتد إلى ما وراء حدود الأنسجة الجسدية هي مؤشرات الكمال الجزيئات تحركت أثناء إعداد عينة. وهذا هو شرح بالتفصيل في اورورك وبادلا (2017)15.

الطيف الببتيد المنتجة، يجب أن تحتوي على وفرة عالية من الجزيئات المنفصلة التي يتم توزيعها أيضا عبر1،النطاق الجماعي الذي تم اختياره23 (هذا هو إلى حد كبير عينة يتوقف، مع ذلك، ليس من النادر أن ترى ما يزيد على 50 تواقيع الببتيد منفصلة من الأنسجة FFPE) (الشكل 3)18.

Figure 1
الشكل 1 : نموذج معدّة بشكل صحيح لانسجة المخ البشري FFF. هذه العينة الأنسجة المجهزة قد تم تصويرها في 50 ميكرومتر، ويظهر هيكل ماكرو جيدة وفرق واضح بين مسألة الأبيض (WM) والمادة الرمادية (جنرال موتورز). سوف تظهر بنجاح إعداد عينات تمايز واضح في مواقع مختلفة من الأنسجة. هنا، هناك منطقة واضح التنظيم أعلى من الببتيد (ممثلة بواسطة نسبة الكتلة إلى تهمة، M/Z) 1085 في منطقة وات من الفريق "ألف التفريق" يتجلى كذلك غياب هذا الشكل المحدد في لوحة ب متبوعاً بعودتها في الفريق جيم بالمعايرة توزيع ثلاث جزيئات مختلفة في نفس القسم الأنسجة، وتبين أن بعضها شكل موحد توزيعها، بينما بعضها الآخر يقتصر على المواقع المادية المنفصلة، يمكننا أن نرى أن إعداد عينة تم أداؤه بشكل صحيح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : قسم معدّة بشكل غير صحيح من أنسجة المخ البشري FFF. هذه العينة قد تم تصويرها في 50 ميكرومتر إنما تدل على مستوى واسع النطاق للتوطن. أنماط الجزيئات الحالية عبر لوحات 1 و 2 و 3 تبين بوضوح أن هناك خلافا الرقم 1، لا يوجد تعريف واضح بين المناطق البيولوجية أو الاختلافات في وفرة الجزيئات عرض. نظراً للصور هي نفسها، بغض النظر عن جزيئات محددة للعرض، يمكننا أن نستنتج أن قد كان الطابع نظراً لإعدادها بشكل غير صحيح. حيث أن هذه أنسجة المخ، هذه النتيجة لا معنى منطقي، والبيولوجية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الطيف الشامل العالمي للصورة التي يتم عرضها في الشكل 1. الطيف يحتوي على وفرة توقيعات الببتيد عبر الطرف الأدنى من النطاق الشامل، مع عدة قمم عالية الببتيد الجماعية الحالية كذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 1
التكميلية رقم 1 : التخطيطي لقطع الورق نشاف المستخدمة في غرفة البخار. يتم قطع ورق نشاف سميك في شكل دائري يبلغ قطرها مم 94. علامة تبويب مستطيلة قطع أيضا بما يتناسب مع حجم شريحة الميكروسكوب الزجاجية القياسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 2
التكميلية رقم 2 : الجمعية التخطيطي دائرة البخار. هذا التخطيطي يبين كيف ينبغي تجميع الدائرة بخار مع ملاحظة محددة من كيف الشرائح عينة وورق نشاف وشريط لاصق تتطابق مع بعضها البعض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 3
التكميلية رقم 3 : التخطيطي التسامي قاعة الجمعية: يعرض الشكل التالي كيف يتم ترتيب الشريحة عينة، سوبليماتور، وجهاز تدفئة للسماح بالتسامي استنساخه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تصميم هذا البروتوكول إلى أقصى حد توليد الأنواع الجزيئية التأين في حين القضاء على تمركز لتحليلها. العوامل الرئيسية التي تنطوي على استخدام نفس المبدأ الأسمى عند تطبيق مصفوفة، هضم العينة، أو ريكريستاليزينج بعد التسامي24؛ إلا وهي أن حتى ترسب بخار، مصفوفة أو خلاف ذلك، تحتاج إلى إنشاء وصون. بيبيتينج يغسل المذيب للبلورة والهضم، بالتساوي تحت العينة، يمنع أي منطقة فردية تلقي بخار المذيب أكثر من أي مكان آخر. هذا أمر مهم لمنع تشكيل التكثيف مرئية وعموما يحول دون تمركز الجزيئات السطحية، فضلا عن ضمان أن العينة بالتساوي هضمها ويتطلب. لا بد من تحقيق ترسب حتى من المصفوفة، كما سوف تظهر القليل جداً من كثافة منخفضة نسبيا وتنوع الأنواع، وسوف قمع الكثير الأيونات من العينة، كما خفض كثافة وتنوع الأنواع25. لتحقيق ترسب حتى من المصفوفة، ضمان وضع طبقة رقيقة، وحتى من بلورات مصفوفة متجانسة الحجم، مباشرة أسفل بصمة الشريحة المجهر مع وقف التنفيذ. إذا كانت الطبقة رقيقة جداً أو غير متكافئ، ثم تسأم المصفوفة وسوف تمضي ببطء شديد أو سيكون متفاوتاً26. الإمكانات القضايا مع التطبيق اليدوي للمذيبات وإنزيم يأتي إلى تجربة المستخدم الفردية. هناك حاجة إلى مستوى بعض "الممارسات" بغية ضمان نتيجة لتكرار، وقد يكون هناك بعض إعداد غير صحيحة عرضي الأولية. ومع ذلك، إذا هو الحرص على التأكد من أن الصورة النهائية وفقا لخصائص العينة "جيدة" وقد قدمنا، ثم أي عينات المعدة غير سليمة لا تؤدي إلى استنتاجات خاطئة البيولوجية.

من الضروري لفعالية هضم عينة أنسجة الاحتفاظ في فورمالدهايد (FFPE أو FFF)، إزالة أكبر عدد ممكن من كروسلينكس الميثيلين قدر الإمكان قبل التربسين ترسب16. ويتحقق ذلك بسهولة بتدفئة العينة في طنجرة الضغط على > 100 درجة مئوية، لمدة قصيرة، دون التسبب في الواقع الفقاعات يمكن ميكانيكيا ننأى العينة. الأنسجة يمكن بسهولة فقدان عندما يعامل بهذه طريقة، ذلك من أجل مكافحة هذا، تستخدم شرائح NC. في حين لا حرج، ضمان السلامة الجسدية للعينة عند التعرض للحرارة والضغط، والمذيبات العضوية. هضم العينة ثم يتحقق من خلال تطبيق الإنزيم في دولة التي تمنع التنشيط ومن ثم السماح جففه، أي تعليق في مياه نقية جداً. قاعة بخار ثم يتبع نفس المبدأ البلورة، توفير ما يكفي من بيئة رطبة للسماح بحركة المترجمة للانزيم لقاء وتنشق البروتين العمود الفقري، ولكن لا يكفي "البلل" السماح الببتيدات الناتجة الانجراف إلى حد كبير من على الموقع الأول26. بيبيتينج مباشرة على الشريحة سوف لا ديلوكاليزي أي التحاليل السطحية، بسبب آثار متبقية crosslinking وإينسولوبيليتي العام للبروتينات الكبيرة في المياه.

على الرغم من أننا ركزنا على تطبيق هذه المنهجية على الببتيدات، يمكن تطبيقها بسهولة على مهام سير العمل لتحليل نواتج الأيض والدهون والبروتينات سليمة. سوف تحتاج إلى بعض الخطوات إزالتها أو زيادتها؛ تصوير البروتين سليمة لا تتطلب أي خطوات الانقسام وبروتيوليتيك، ولكن سير العمل الأساسي لتقطيع العينة وتصاعد متبوعاً بمصفوفة التسامي والبلورة، وتحليل يمكن تطبيقها على ما يقرب من أي نوع العينة. لدينا نية لتطوير هذا البروتوكول وضمان موثوقية ومتانة من خلال تحقيقات تجريبية واسعة النطاق، وكان لإنشاء أسلوب يتطلب التعديل القليل أو لا، أن يستخدم معدات غير مكلفة، وهي قابلة لمجموعة واسعة المجتمع بدرجات متفاوتة من الأدوات والمهارات الحيوية. ونأمل أن يؤدي هذا إلى فتح سبل جديدة للتحقيق للمختبرات التي سوف خلاف ذلك رفض هذا الأسلوب معقدة أو مكلفة جداً. كما أننا على ثقة أن قدمنا طريقة إعداد نموذج نهائي أول الببتيد إس. في وقت كتابة هذا التقرير، تم إلى حد كبير على أساس الأجهزة معظم المنهجيات، مع تركيز بشكل خاص على سهولة استخدام الرش الآلي على أساس منهجيات27،،من2829. كما كان هناك القليل من منهجيات التحلل الميثيلين موثوق بها مع التخمين فيما يتعلق بالإجراء الصحيح والأجهزة لاستخدامها.

وفي الختام، نحن نعتبر أن تطبيق المنهجية المذكورة أعلاه على الأنسجة FFPE والاتحاد الفرنسي، سيؤدي إلى قدر أكبر من الثقة في فعالية استراتيجية موريشيوس لتحليل الببتيدات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في المصالح أو المصالح التجارية الكشف عن

Acknowledgements

الكتاب تود أن تقر بمؤسسة المدرسة الطبية في سيدني وكآبة ومؤسسة لتمويل جزء من هذا العمل من خلال برنامج المنح الدراسية الدكتوراه لأبحاث مرض الزهايمر، ومنحة اكتشاف القوس (DP160102063) منحت إلى PKW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryo Microtome Leica CM3050 For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides Bruker 8237001 For preparation and section of tissue.
Coplin Jars Sigma Aldrich S5516 For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker Kambrook KPR620BSS For preparation and section of tissue.
Sublimator Chem Glass NA For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made 
Sand bath NA NA For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish Sigma Aldrich CLS70165100 For sublimation procedure.
Vacuum Pump NA NA For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer 
Cold trap Chem Glass CG-4510-02 For sublimation procedure.
Hot Plate John Morris EW-15956-32.  For sublimation procedure.
Plastic petri dish Sigma Aldrich Z717223 For sublimation procedure.
37 °C incubator NA NA For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old 
Blotting paper Sigma Aldrich P7796 For sublimation procedure.
Nitrocellulose  Sigma Aldrich N8395 For washing of slides.
Acetone Sigma Aldrich 650501 For washing of slides.
Xylene Sigma Aldrich 214736 For washing of slides.
100% EtOH Sigma Aldrich 1.02428 For washing of slides.
70% EtOH Sigma Aldrich NA For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol 
Chloroform Sigma Aldrich C2432 For washing of slides.
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich ARK2183 For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8 Sigma Aldrich TRIS-RO For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water Sigma Aldrich NA For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate Sigma Aldrich A6141 For proteolytic cleavage. 
Trypsin Sigma Aldrich T0303 For proteolytic cleavage. 
CHCA Matrix Sigma Aldrich C2020 For recrystallisation.
Acetonitrile Sigma Aldrich 1.00029 For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)  Sigma Aldrich 302031 For recrystallisation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38, (7), 699-708 (2003).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69, (23), 4751-4760 (1997).
  3. Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6, (14), 5001-5007 (2014).
  4. O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29, (19), 1836-1840 (2015).
  5. O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29, (7), 637-644 (2015).
  6. Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110, (5), 3237-3277 (2010).
  7. Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, (1), 130-145 (2013).
  8. Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9, (9), 10655 (2014).
  9. Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139, (6), 759-783 (2013).
  10. Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 34-49 (2014).
  11. Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11 (2012).
  12. Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65, (8), 1039-1055 (2013).
  13. Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9, (9), 683-694 (2011).
  14. O'Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. (2017).
  15. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11, (3-4), (2017).
  16. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60, (5), 229-238 (2016).
  17. Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6, (11), 1695-1709 (2011).
  18. Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291, (15), 8109-8120 (2016).
  19. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18126-18131 (2008).
  20. Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55 (1925).
  21. Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
  22. Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88, (11), 5988-5995 (2016).
  23. Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5, (6), 1623-1628 (2013).
  24. Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14, (1), 90-96 (2017).
  25. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83, (14), 5728-5734 (2011).
  26. Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126, (1), 177-185 (2005).
  27. Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
  28. Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87, (1), 64-82 (2015).
  29. Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16, (11-12), 1613-1621 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics