Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

Biochemistry

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und zuverlässige Methode für die Sublimation-basierte Erstellung von Formalin fixiert Gewebe für bildgebende Massenspektrometrie bestimmt.

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O'Rourke, M. B., Padula, M. P., Smith, C., Youssef, P., Cordwell, S., Witting, P., Sutherland, G., Crossett, B. Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows. J. Vis. Exp. (131), e56778, doi:10.3791/56778 (2018).

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Abstract

Die Verwendung von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung hat Massenspektrometrie imaging (MALDI MSI) schnell erweitert, da diese Technik eine Vielzahl von Biomolekülen von Drogen und Lipide zu N-Glykane analysiert. Obwohl verschiedene Probe Präparationstechniken vorhanden, bleibt Erkennung Peptide aus Formaldehyd konserviert Gewebe eine der schwierigsten Herausforderungen für diese Art der massenspektrometrischen Analyse. Aus diesem Grund haben wir erstellt und optimiert eine robuste Methode, die die räumliche Informationen innerhalb der Probe, während die größte Anzahl an ionizable Peptide zu entlocken bewahrt. Wir haben auch zum Ziel, zu erreichen dies in eine kostengünstige und einfache Möglichkeit, wodurch möglichen Voreingenommenheit oder Vorbereitung Fehler, die auftreten kann, wenn mit Instrumenten automatisierten. Das Endergebnis ist eine reproduzierbare und kostengünstige Protokoll.

Introduction

Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie imaging (MALDI MSI) als Bild-basierte Technik für zwei Jahrzehnte1,2, eine Reihe von Biomolekülen einschließlich Analyse beschäftigt: Lipide3, Peptide2 ,4, Proteine2,5, Metaboliten6,7, N-Glykane8und synthetische Moleküle wie z. B. Medikamente9,10. Die Anzahl der Publikationen zeigen die Nützlichkeit dieser Technik sind deutlich über der letzten Dekade6,11,12,13gewachsen. Bestimmte Moleküle wie Lipide, sind relativ einfach, über MALDI MSI zu analysieren, wie sie leicht aufgrund ihrer chemischen Natur ionisieren und erfordern daher wenig Vorbereitung3. Jedoch sind die Schritte erforderlich, um effektiv diese Moleküle ionisieren für schwieriger Ziele wie Peptide, umfangreich und in der Regel kompliziert14. Derzeit gibt es nur wenige Veröffentlichungen, die darauf abzielen, Adresse oder demonstrieren Reproduzierbarkeit in den Methoden, die eingesetzt werden, um Gewebe für dieses einzigartige visuelle Technik15vorzubereiten. Aus diesem Grund haben wir zusammengestellt, Beobachtungen und Optimierungen umgesetzt in einer einzigen, einfach zu implementieren, Methodik, die wenig bis gar keine Änderung für die Analyse von Peptiden aus einem Formaldehyd erfordern sollte vernetzt Gewebe Quelle14.

In dieser Handschrift haben wir eine validierte, low-cost reproduzierbare Methode zum Nachweis und zur räumlichen Zuordnung von Peptiden, generiert von Formalin fixiert gefroren (FFF) und Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeschnitte beschrieben. Diese Methode erfordert und verlassen Sie sich auf spezielle Instrumentierung3. Insbesondere gehen wir auf die vielen Aspekte der spezialisierten Probenvorbereitung notwendig, Peptide zu analysieren; Schritte wie Antigen-Retrieval-16 und Matrix-Beschichtung. Unser Protokoll nutzt auch preiswerte Geräte und Reagenzien, wodurch diese Methodik zugänglich zu einer größeren Gemeinschaft, die sonst nicht die Alternative Roboter Apparat17leisten.

Die Beweggründe für die Entwicklung einer manuellen Probe Vorbereitung Methode hatte zwei Ziele: Erstens die Verwendung von einem Sublimator schafft eine konsistente und homogene Beschichtung von Matrix-Kristalle, ~ 1 µm Länge18, etwas Unerreichbares mit häufiger Spritzen sind, Techniken. Zweitens die relativ kleine Einrichtung Kosten: die Gesamtkosten für den benutzerdefinierten Apparat war <$ 1500 AUD. Wir beachten Sie, dass in Bezug auf Wirtschaftlichkeit, der Preis pro Probe viel billiger ist, wenn keine Roboter Maschinen beteiligt ist. Die Verwendung von Sublimation wurde zuvor jedoch nach bestem Wissen und Gewissen, berichtet schrittweise Methoden, die diesen Prozess beschreiben und Probenvorbereitung nicht berichtet noch in der Literatur beschrieben worden.

Dieses Protokoll soll Forscher zu unterstützen, Zugang zu einem MALDI-Massenspektrometer und die Absicht auf die Generierung von räumlichen Informationen in Bezug auf ein Bio-Molekül des Interesses19. MALDI MSI ist im Wesentlichen eine Form der histologischen screening, verlässt sich nicht auf Antikörper oder2Flecken.

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Protocol

Achtung: Alle geltenden Sicherheitsvorkehrungen sollten befolgt werden, bei der Durchführung dieses Verfahrens, einschließlich der Verwendung von geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) (z.B. Kittel, Nitril-Handschuhe, Schutzbrille, etc.)

1. Vorbereitung der Reagenzien und Geräte

  1. Vorbereitung der Lösungen
    1. 500 mL Carnoys Flüssigkeit vorbereiten, mischen Sie 100 % Ethanol (EtOH), Chloroform und Eisessig in einem 6:3:1 V/V/V-Verhältnis in einer sauberen Glas Schott.
    2. Um flüssige Nitrozellulose (NC) zu machen, lösen Sie NC-Membran (allgemein verwendet in westliche Beflecken auf) in ordentlich Aceton durch sanfte Bewegung, um eine Endkonzentration von 40 mg/mL.
  2. Vorbereitung der NC beschichtete Folien
    1. Verwendung eine Technik ähnlich dem verwendet für die Zubereitung von Blut für histologische Untersuchung20 NC Vorbereitung schmiert beschichteten Folien.
    2. Pipette 40 µL Flüssigkeit NC auf eine Kante des einen Objektträger leitfähigem Indium-Zinn-Oxid (ITO). Verwenden einen normales Glas-Objektträger, ziehen Sie die NC unter Oberflächenspannung über die Folie, um eine sogar Dünnfilm-Beschichtung zu erstellen.
    3. Lassen Sie die NC bei Raumtemperatur für 20 s und dann speichern, bis benötigt bei Raumtemperatur trocknen. Lagerung von Proben unter diesen Bedingungen kann auf unbestimmte vorgesehen Gewebe gepflegt sind und frei von Staub sein.
      Hinweis: Diese Methode der Vorbereitung ist besser bekannt als "thin Film" und erzeugt eine gleichmäßige Beschichtung, die abhängig von der Viskosität des NC sowie das Fehlen der Oberflächenspannung, die auf der Folie einzunivellieren. Die einzige Sorge, die ergriffen werden sollten, bei der Vorbereitung der Folien nicht zu schnell bewegt, die Streifen von NC, anstatt eine vollständige Abdeckung schaffen wird.
      Achtung: Flüssige NC sehr schnell trocknet, ist es wichtig, schnell zu arbeiten, um zu vermeiden, die Lösung zu trocknen, bevor es richtig ausgebreitet hat. Auch sollte darauf geachtet werden, bei der Handhabung von NC in seinem flüssigen Zustand, wie es ist eine hoch energetische Verbindung und wenden keine Zündquelle Brandsätze Explosion zu verhindern. NC erfährt auch endotherm Übergänge beim Trocknen und kalten Verbrennungen verursachen können, wenn erlaubt, in längerer Kontakt mit Haut oder behandschuhten Hände kommen. Um alle damit verbundenen Risiken zu minimieren, sollten nur geringe Mengen zu jeder Zeit bereit sein (< 1 mL wird empfohlen). Nach dem Trocknen ist es bei Raumtemperatur stabil. NC bleiben jedoch kann explosive wenn in großen Mengen vorhanden.
  3. Erstellung von benutzerdefinierten Dampf Kammern
    1. Schneiden Sie ein Stück dickes Löschpapier mit einer Schere groß genug, um unten passen die Hälfte einer standard Kunststoff Petrischale (94 mm im Durchmesser und 3 mm dick).
    2. Schneiden Sie das Papier, so dass einen rechteckige Streifen in der Mitte, die gleiche Größe wie ein Mikroskop-Objektträger, genug überschüssige verlassen, so dass das Papier seine Position in der Petrischale (ergänzende Abbildung1) zu halten.

2. Vorbereitung von Gewebeschnitten

  1. FFPE Gewebe21.
    1. Wählen Sie das gewünschte Gewebe Block und es bei 12 µm Dicke in einem standard Bank montiert Mikrotom und Schwimmer montiert auf der NC ITO Folien vorbeschichtet.
    2. Tauchen Sie die Folien in frischen Xylol, Rest Paraffin für 2 min zu entfernen, und wiederholen Sie den Vorgang ein zweites Mal.
      Hinweis: Wenn der Paraffinblock besonders weit verbreitet ist, das Gewebe relativ klein im Vergleich zu den Paraffinblock ist können die Proben bei 60 ° C zu schmelzen die Mehrheit entfernt vor dem Waschen in Xylol beheizt werden.
    3. Waschen Sie die deparaffinized Proben durch Eintauchen der Folien in einer abgestuften Lösungsmittel Serie: 70 % V/V EtOH/Wasser, 100 % EtOH, Carnoy Flüssigkeit, 100 % EtOH, Reinstwasser und 100 % EtOH. Die Dauer der einzelnen eintauchen sollte 30 s, mit Ausnahme von Carnoy Flüssigkeit, die 2 min dauern muss.
      Achtung: Carnoy Flüssigkeit und Xylol muss gespeichert und verwendet in einer Dampfhaube sind sehr giftig beim Einatmen.
  2. Formalin fixiert gefroren (FFF) Gewebe
    Hinweis: Proben sollten bereits, entsprechend je nach Probentyp eingefroren werden.
    1. Equilibrate des Gewebe-Blocks bei der Betriebstemperatur der Mikrotom für 20 min22.
      Hinweis: Gleichgewichtherstellung Temperatur ist abhängig von der Art des Gewebes.
    2. Abschnitt 12 µm und Tauwetter Mount ein Mikrotom mit Gewebe in den Abschnitten auf einer vorbereiteten NC ITO beschichtet schieben.
    3. Speichern Sie die Folien in einem Vakuum Exsikkator auf der Bank im Dunkeln.
      Hinweis: Proben können für mehrere Wochen unter diesen Bedingungen gelagert werden.
    4. Waschen Sie die Proben in einer abgestuften Lösungsmittel wie FFPE Gewebe (2.1.3) angegeben.
      Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit für einen Xylol Deparaffinisation Schritt, wie die Probe nicht eingebettet ist.

(3) Methylen Crosslink Hydrolyse

  1. Laden Sie die Probe-Folien (FFF oder FFPE) in einer Kunststoff-Folie-Box, die an der Spitze mit 20 Mmol Tris-HCl (pH 8,8) gefüllt ist. Versiegeln Sie die Box und legen Sie sie in ein Wasserbad mit 500 mL Wasser, so dass das Feld, um den Boden berühren. Erhitzen Sie es dann für 15 min bei 120 ° C in einem Schnellkochtopf, der einen Betriebsdruck von 70 kPa erreichen kann.
  2. Entfernen Sie die Folien, abkühlen lassen und bei Raumtemperatur 15 Minuten trocknen lassen.

(4) Gewebe Verdauung

  1. Sobald hydrolysiert, Mantel der Proben mit 10 µL Trypsin-Lösung (1 mg/mL) in Reinstwasser, von Pipettieren 10 µL der Lösung auf den Rand des Abschnitts Gewebe, verwenden die gleichen Pipettenspitze, und ziehen Sie dann das Tröpfchen über die ganze Oberfläche des Gewebes unter Oberfläche Spannung.
    Hinweis: Vermeiden Sie Kratzer auf der Gewebeoberfläche mit der Pipettenspitze und über das Enzym über die Grenzen der Gewebe Kanten zu verbreiten.
  2. Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur trocknen.
  3. Nach dem Trocknen montieren Sie die Proben innerhalb der Spitze der zuvor gebaute Dampf Kammer (Gewebe nach unten) mit Autoklav Klebeband auf entweder Seite des Schlittens (ergänzende Abbildung2).
  4. Pipette 600 µL einer Lösung mit einem 1:1 V/V-Mix aus 100 % Acetonitril und 50 mM Ammonium Bicarbonat vorsichtig auf dem Löschpapier Finger im Unterteil der Petrischale bis die Finger scheint gleichmäßig feucht sein.
  5. Legen Sie die obere Hälfte der Dampf Kammer auf die untere Hälfte, Sicherstellung der Papier-Finger und Probe-Folie perfekt ausrichten, und Verschließen der Kammer um seinen Äquator mit Paraffin Film.
  6. Lassen Sie die Probe über Nacht in einem 37 ° C Inkubator komplette Verdauung zu ermöglichen.

5. Matrix Beschichtung über Sublimation

  1. Einmal verdaut, wiegen Sie die Beispielfolie 5-stellige mikroanalytische auflegen.
  2. Montieren Sie die Folie auf die Kühlung Finger der Sublimation Vorrichtung und sichern Sie es mit Kupferband, genauso, wie für die Dampf-Kammer (ergänzende Abbildung 3) beschrieben.
    Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Folie gleichmäßig durch den kühlen Finger kontaktiert wird, befindet sich eine Schicht aus Kupferband auf der Unterseite des kühlenden Fingers, die Oberfläche zu ebnen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Folie gleichmäßig gekühlt wird, sogar Abscheidung der Matrix führt.
  3. Legen Sie 300 mg α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) Matrix in einer Petrischale Glas am unteren Rand der Kammer und verteilt gleichmäßig auf eine dünne Schicht von Matrix-Kristalle zu erstellen.
  4. Montieren Sie der Sublimator und befestigen Sie die beiden Hälften mit den Hufeisen-Klemme. Unterbrechen Sie die montierte Einheit 15-20 cm über ein Sandbad, indem man sie in einen Metallring verbunden mit einem Stativ bei 220 ° C vorgeheizt.
  5. Schließen Sie die Kammer an die Vakuumquelle, engagieren Sie das Vakuum zu und lassen Sie ihn bis zu ~ 25 mTorr für 5 min zu stabilisieren.
  6. Packen Sie den kühlen Finger an der Spitze mit Eis und fügen Sie 50 mL Wasser hinzu. Lassen Sie das Gerät für weitere 5 min bevor Sie fortfahren zu begleichen.
  7. Senken Sie die Kammer auf der Oberfläche des Sandes, sicherzustellen, dass der Sand vollständig den Boden der Kammer, Kontakte zu, und warten sie 45 min. eine ideale Beschichtung von 0,22 mg/cm2 erstellen
    Vorsicht: Darauf sollte geachtet werden, beim Umgang mit Glaswaren im Hochvakuum, wie Schäden an dem Gerät, während evakuiert, Totalausfall der Glas-Kammer führen kann.
  8. Nach 45 min entfernen der Kammers aus dem Sandbad durch die Erhöhung des Metallringes und Entlüften der Kammers.
    Hinweis: Wenn die Kammer entlüftet, die Folie muss entfernt werden sehr schnell Wasser in der Luft auf der eisigen Finger und Probe-Folie zu kondensieren beginnt.
  9. Entfernen Sie die Folie und wiegen Sie es um sicherzustellen, dass die gewünschte Beschichtung erreicht worden ist.
    Hinweis: Wenn nicht genügend Beschichtung erreicht worden ist, einfach wiederholen Sie Sublimation für die Folie bis die gewünschte Schichtdicke erreicht ist.

(6) Rekristallisation

  1. Sobald sublimiert, montieren Sie die Beispielfolie innerhalb der Spitze der zuvor gebaute Dampf-Kammer, als beschrieben früheren (Gewebe nach unten).
  2. Pipette 600 µL einer Lösung mit einem 1:1 (V/V) Mischung aus 100 % Acetonitril und 0,1 % V/V Trifluoroacetic Säure im Wasser vorsichtig auf das Löschpapier im Unterteil der Petrischale um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten.
  3. Montieren Sie die Kammer, Sicherstellung der Papier-Registerkarte und Mikroskop-Folie perfekt ausrichten, und lassen Sie in einem Inkubator 37 ° C für 1 h.
    Achtung: Nicht verschließen der Kammers.
    Hinweis: Sobald umkristallisiert, die normalerweise gelblich der Matrix sollte weiß, sehen weniger glänzend und scheinen sehr sogar. Dies bedeutet, dass die Rekristallisation korrekt ausgeführt wurde.
  4. Die Probe ist nun bereit für die Analyse.

(7) Instrumentierung

  1. Scannen Sie die Folie in einen Flachbett-Scanner, ein digitales Bild zu erstellen.
  2. Laden Sie die Probe in das Massenspektrometer zu analysieren Sie und dann mit der entsprechenden Software-Plattform.
  3. Analysieren Sie die Proben im positiven Ionen Reflektron Modus mit einem Massenbereich von 750-3.500 Da, mit einer vor Ort Auflösung, die für das gewünschte Ergebnis. In den meisten Fällen 20-50 µm Raster Breite ist ausreichend, aber weniger als 10 µm verwendet15kann.
    Achtung: MALDI UV-Laser sind eine Quelle der ionisierenden Strahlung und sollte nicht direkt einsehbar. Sicherstellen Sie, dass der Laser innerhalb Instrument Abschirmung vor Operation enthalten ist.

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Representative Results

Wenn korrekt befolgt, produziert dieses Protokoll Bilder, die eindeutig die grobe Morphologie des Gewebes ohne jegliche Kratzer oder andere Deformationen (Abbildung 1). Die ideale Validierung für eine korrekt durchgeführte Probenvorbereitung ist, dass die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen verschiedenen physikalischen Strukturen durch eine Änderung des Moleküls wird angezeigt (Abbildung 2).

Eine gute Anleitung für die Bestimmung, wenn Proben nicht falsch vorbereitet wurde ist für das Vorhandensein von Betriebsverlagerungen oder Matrix-Aggregation zu überprüfen; Peptid-Signaturen, die über die Grenzen der körperlichen Gewebe hinaus sind perfekte Indikatoren, die Moleküle während der Probenvorbereitung verschoben haben. Dies wird ausführlich im O' Rourke und Padula (2017)15.

Die produzierten Peptid-Spektrum sollte eine hohe Fülle von diskreten Moleküle, die in der gewählten Massenbereich1,23 gut verteilt sind (Dies ist weitgehend abhängig von probieren, allerdings ist es nicht ungewöhnlich, von mehr als 50 sehen diskrete Peptid Unterschriften aus FFPE Gewebe) (Abbildung 3)18.

Figure 1
Abbildung 1 : Eine richtig vorbereiteten Probe von FFF menschlichen Hirngewebe. Das verarbeitete Gewebe Exemplar hat bei 50 µm abgebildet worden und zeigt gute Makrostruktur und einen klaren Unterschied zwischen weißen Substanz (WM) und die graue Substanz (GM). Erfolgreich vorbereitete Proben zeigen klare Differenzierung der unterschiedlichen Gewebe Standorte. Hier gibt es eine klare Region des Up-Regulierung des Peptids (vertreten durch Masse-Ladungs-Verhältnis, M/Z) 1085 in der WM-Region des Panels A. Differenzierung sich weiter durch das Fehlen dieser definierten Form im Bedienfeld "B zeigt" gefolgt von seiner Rückkehr im Bedienfeld "C." Durch Untersuchung der Verteilung der drei verschiedene Moleküle auf dem gleichen Gewebe und zeigen, dass einige sind gleichmäßig verteilt, während andere auf diskrete physische Standorte beschränkt sind, können wir sehen, dass Probenvorbereitung korrekt ausgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Ein nicht falsch vorbereitet Abschnitt des menschlichen Hirngewebe FFF. Dieses Exemplar hat bei 50 µm abgebildet worden aber zeigt eine großflächige Verlegung. Die Muster der Moleküle über Platten 1, 2 und 3 zeigen deutlich, dass im Gegensatz zu Abbildung 1, gibt es keine klare Definition zwischen biologischen Regionen oder Unterschiede in der Fülle der Moleküle angezeigt. Da die Bilder identisch, unabhängig von den Molekülen, die für die Anzeige ausgewählt sind können wir feststellen, dass es wegen nicht falsch vorbereitet delokalisiert wurde hat. Da das Gehirngewebe ist, macht dieses Ergebnis nicht logisch, biologischen Sinn. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Globale Massenspektrum des Bildes angezeigt Abbildung 1. Das Spektrum enthält eine Fülle von Peptid-Signaturen sowie über das untere Ende des Massenbereich mit mehreren hohen Masse Peptid Gipfeln anwesend. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure 1
Zusätzliche Abbildung 1 : Schaltplan für Schneiden Löschpapier in Dampf Kammer verwendet. Dickes Löschpapier wird in eine Runde Form mit einem Durchmesser von 94 mm geschnitten. Eine rechteckige Registerkarte wird auch mit der Größe einer standard-Glas-Objektträger entsprechen ausgeschnitten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure 2
Zusätzliche Abbildung 2 : Montage Schaltplan Dampf Kammer. Dieses Schema zeigt, wie die Dampf-Kammer montiert werden sollte, mit spezifischen zur Kenntnis wie die Probe-Folien, Löschpapier und Klebeband miteinander korrespondieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure 3
Zusätzliche Abbildung 3 : Schaltplan der Sublimation Kammerversammlung: Diese Abbildung zeigt, wie die Beispielfolie, Sublimator und Heizgeräten angeordnet werden, um reproduzierbare Sublimation zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Generation der ionizable Molekülsorten ohne Verlagerung des Analyten zu maximieren. Die Schlüsselfaktoren betreffen mit dem gleichen oberstes Prinzip bei der Matrix, die Probe zu verdauen, oder recrystallizing nach Sublimation24Anwendung; nämlich, dass eine sogar Ablagerung von Dampf, Matrix oder andernfalls erstellt und gepflegt werden muss. Pipettieren Lösungsmittel wäscht für Rekristallisation und Verdauung, gleichmäßig unter der Probe verhindert, dass jeder einzelnen Bereich empfangen mehr Lösungsmitteldampf als irgendwo sonst. Dies ist wichtig für die Verhinderung der Bildung von sichtbare Kondensation und insgesamt hemmt Verlagerung der Oberflächenmoleküle sowie sicherstellen, dass die Probe gleichmäßig verdaut und abgebaut. Es ist zwingend notwendig, um eine sogar Ablagerung von Matrix, zu erreichen, wie zu wenig ein relativ geringer Intensität und Vielfalt der Arten zeigt, und zuviel werden die Ionen aus der Probe, auch Senkung Intensität und Vielfalt der Arten25unterdrücken. Um eine sogar Abscheidung der Matrix zu erreichen, sicherzustellen Sie, dass eine gleichmäßige, dünne Schicht von Matrix-Kristallen eine homogene Größe, befinden sich direkt unter den Fußabdruck des suspendierten Objektträger. Wenn die Schicht ungleichmäßig oder zu dünn ist, dann Sublimation der Matrix zu langsam gehen oder werden ungleichmäßige26. Die potenzielle Probleme mit der manuellen Anwendung der Lösungsmittel und Enzym kommt es auf die individuelle Erfahrung des Benutzers. Gewisses Maß an "Praxis" ist erforderlich, um eine wiederholbare Ergebnis zu gewährleisten, und möglicherweise einige versehentliche falsche Vorbereitung. Jedoch wenn geachtet wird, um sicherzustellen, dass das endgültige Bild entsprechend den Eigenschaften der "gute" Probe haben wir vorgesehen, dann unsachgemäß vorbereiteten Proben nicht zu falschen biologischen Schlussfolgerungen führen.

Um eine Gewebeprobe konserviert in Formaldehyd (FFPE oder FFF) effektiv zu verdauen, ist es erforderlich, möglichst vieler Methylen Querverbindungen wie möglich vor dem Trypsin Ablagerung16zu entfernen. Dies lässt sich durch Erhitzen der Probe in einem Schnellkochtopf bei > 100 ° C, für eine kurze Dauer, ohne tatsächlich verursacht Bläschen, die mechanisch die Probe distanzieren können. Gewebe kann leicht verloren, wenn so, also, um gegen diese, behandelt NC-Folien eingesetzt werden. Zwar nicht kritisch, gewährleistet es die körperliche Unversehrtheit der Probe bei Hitze, Druck und organische Lösungsmittel. Verdauung der Probe wird dann erreicht, indem Sie das Enzym in einem Staat, der seine Aktivierung verhindert, dass die Anwendung und dann trocknen lassen, d. h. in hochreinem Wasser suspendiert. Die Dampf-Kammer folgt dann das gleiche Prinzip wie Rekristallisation, bietet genug von einer feuchten Umgebung ermöglichen lokalisierte Bewegung des Enzyms zu begegnen und Sie Spalten das Eiweiß Rückgrat, aber nicht genug "Nässe", die daraus resultierenden Peptide treiben lassen deutlich von ihrer ursprünglichen Position26. Pipettieren direkt auf der Folie wird jede Oberfläche Analyten durch die Auswirkungen der verbleibenden Vernetzung und die allgemeine Unlöslichkeit von großen Proteinen in Wasser nicht anderen.

Obwohl wir über die Anwendung dieser Methodik auf Peptide konzentriert haben, kann es auch einfach zu Workflows für die Analyse von Metaboliten, Lipide und intakte Proteine angewendet werden. Einige Schritte müssten entfernt oder ergänzt werden. intakte Protein Bildgebung erfordert keine proteolytische Spaltung Schritte, aber die grundlegenden Workflow von Probe-Schnitt und Montage, gefolgt von Matrix Sublimation, Rekristallisation und Analyse kann auf fast jede Probenart angewendet werden. Unsere Intention für die Entwicklung dieses Protokolls und seine Zuverlässigkeit und Robustheit durch umfangreiche empirische Untersuchungen zu gewährleisten wurde eine Methode erstellen, die wenig oder keine Änderung erfordert, die preiswerte Ausrüstung verwendet und ist offen für ein breites Gemeinschaft mit unterschiedlicher Instrumentierung und biochemische Geschick. Wir hoffen, dass dies öffnet neue Wege der Untersuchung an Labore, die sonst diese Technik als zu kompliziert oder teuer zurückgewiesen haben würde. Auch sind wir zuversichtlich, dass wir die erste endgültige Stichprobe Vorbereitung Methode für Peptid MSI zur Verfügung gestellt haben. Zum Zeitpunkt des Schreibens die meisten Methoden wurden weitgehend Instrumentierung, mit besonderer Betonung der Benutzerfreundlichkeit der Roboter Spritzen basierte Methoden27,28,29. Auch gab es kaum zuverlässige Methylen Hydrolyse Methoden mit Vermutung hinsichtlich der richtigen Verfahren und Geräte verwendet werden.

Zusammenfassend halten wir die Anwendung der oben genannten Methode Proteinkinase und FFF Gewebe führt zu mehr Vertrauen in die Wirksamkeit von MSI für die Analyse von Peptiden.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt oder kommerzielles Interesse, offen zu legen

Acknowledgements

Die Autoren möchte Sydney Medical School Foundation und Blues und Stiftung für die Finanzierung Bestandteil dieser Arbeit durch ihre PhD-Stipendien-Programm für die Alzheimer-Krankheit-Forschung und ein ARC Entdeckung Zuschuss (DP160102063), PKW anerkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryo Microtome Leica CM3050 For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides Bruker 8237001 For preparation and section of tissue.
Coplin Jars Sigma Aldrich S5516 For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker Kambrook KPR620BSS For preparation and section of tissue.
Sublimator Chem Glass NA For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made 
Sand bath NA NA For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish Sigma Aldrich CLS70165100 For sublimation procedure.
Vacuum Pump NA NA For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer 
Cold trap Chem Glass CG-4510-02 For sublimation procedure.
Hot Plate John Morris EW-15956-32.  For sublimation procedure.
Plastic petri dish Sigma Aldrich Z717223 For sublimation procedure.
37 °C incubator NA NA For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old 
Blotting paper Sigma Aldrich P7796 For sublimation procedure.
Nitrocellulose  Sigma Aldrich N8395 For washing of slides.
Acetone Sigma Aldrich 650501 For washing of slides.
Xylene Sigma Aldrich 214736 For washing of slides.
100% EtOH Sigma Aldrich 1.02428 For washing of slides.
70% EtOH Sigma Aldrich NA For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol 
Chloroform Sigma Aldrich C2432 For washing of slides.
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich ARK2183 For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8 Sigma Aldrich TRIS-RO For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water Sigma Aldrich NA For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate Sigma Aldrich A6141 For proteolytic cleavage. 
Trypsin Sigma Aldrich T0303 For proteolytic cleavage. 
CHCA Matrix Sigma Aldrich C2020 For recrystallisation.
Acetonitrile Sigma Aldrich 1.00029 For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)  Sigma Aldrich 302031 For recrystallisation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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