एक काइनेटिक प्रतिदीप्ति-Ca के आधार2 + जुड़ाव परख जी प्रोटीन की पहचान के लिए-युग्मित रिसेप्टर एगोनिस्ट, विरोधी, और Allosteric मॉडुलन

Medicine

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Summary

वर्णित सेलुलर परख CXC chemokine रिसेप्टर 4 की पहचान के लिए डिज़ाइन किया गया है (CXCR4)-एजेंटों कि बाधित या उत्तेजित, या तो प्रतिस्पर्धी या allosterically, intracellular Ca2 + रिलीज CXCR4 सक्रियण द्वारा शुरू बातचीत.

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Claes, S., D'huys, T., Van Hout, A., Schols, D., Van Loy, T. A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators. J. Vis. Exp. (132), e56780, doi:10.3791/56780 (2018).

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Abstract

जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) दवा उद्योग के लिए बहुत महत्व के हैं के रूप में वे कई मानव रोगों में शामिल हैं और अच्छी तरह से चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए मान्य लक्ष्य शामिल हैं. नेतृत्व यौगिकों की खोज, छोटे सिंथेटिक अणुओं सहित, कि विशेष रूप से रिसेप्टर के समारोह को बाधित, दवा के विकास में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है और संवेदनशील, विशिष्ट, और मजबूत सेल आधारित परख पर निर्भर करता है. यहां, हम एक फ्लोरोसेंट readout के साथ एक काइनेटिक सेलुलर परख का वर्णन मुख्य रूप से रिसेप्टर की पहचान करने के लिए विशिष्ट विरोधी है कि intracellular Ca2 + रिलीज CXC chemokine रिसेप्टर 4 (CXCR4) के सक्रियकरण पर पैदा रोकना बनाया अंतर्जात ligand, द CXC chemokine ligand १२ (CXCL12). इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह भी आंतरिक agonistic गुणों के साथ संपंन यौगिकों की स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है (यानी, यौगिकों में वृद्धि intracellular Ca2 + CXCL12 के अभाव में एकाग्रता) या यौगिकों allosteric बाइंडिंग साइटों (यानी, सकारात्मक और नकारात्मक allosteric मॉडुलन (पम्म और NAMs, क्रमशः)) के साथ बातचीत के माध्यम से रिसेप्टर्स समारोह संग्राहक. नीचे की ओर, फ्लोरोसेंट यौगिकों परख readout के साथ हस्तक्षेप हो सकता है, जिससे विश्वसनीय डेटा व्याख्या में बाधा । सबसे अधिक संभावना इस परख, ंयूनतम रूपांतरों के साथ कार्यांवित किया जा सकता है, जिनमें से कई अंय GPCRs के लिए एक सामांय दवा खोज परख के रूप में सक्रियकरण intracellular Ca के एक रिलीज की ओर जाता है2 +

Introduction

GPCRs कोशिका सतह प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण superfamily है जो extracellular ligand बाइंडिंग पर सिग्नल transduction कैस्केडिंग को सक्रिय करता है । वे पेप्टाइड्स, प्रोटीन हार्मोन, biogenic अमीन, और लिपिड सहित उत्तेजनाओं की एक बड़ी विविधता से सक्रिय किया जा सकता है, जो विविध intracellular संकेत मार्ग और अंत में जैविक प्रतिक्रियाओं की दीक्षा में परिणाम1,2 . इसके अलावा, GPCRs कई में शामिल हैं, नहीं तो सभी, विकासात्मक और शारीरिक प्रक्रियाओं और कई मानव रोगों बेकार GPCR संकेतन या रिसेप्टर एक्सप्रेस के साथ जुड़े रहे हैं. GPCRs चिकित्सा में सबसे मान्य औषधीय लक्ष्य1,3के बीच इसलिए कर रहे हैं ।

आमतौर पर, एक GPCR दवा खोज कार्यप्रवाह ऐसे छोटे अणुओं, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में यौगिकों की पहचान को सक्षम करने सेलुलर स्क्रीनिंग परख के साथ शुरू होता है, और पेप्टाइड्स कि एक विशेष GPCR की गतिविधि मिलाना कर सकते हैं. GPCR दवा खोज में कई परख के विभिंन प्रकार के लिए ऐसे यौगिकों, जिनमें से ज्यादातर मध्य के साथ संगत कर रहे है उच्च प्रवाह जांच अभियानों के लिए खोज मौजूद हैं । सबसे अधिक इस्तेमाल किया परख रिसेप्टर बाइंडिंग प्रयोगों, प्रतिदीप्ति या luminescence आधारित तथाकथित माध्यमिक दूतों (जैसे, Ca2 +, चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (AMP)), phenotypic के स्तर में उतार चढ़ाव का पता लगाने परख शामिल जांच परख, और β-arrestin भर्ती परख4। परख के एक विशेष प्रकार के लिए विकल्प कई कारकों पर निर्भर हो सकता है, लेकिन यह भी पहले एक दिया GPCR के संकेत गुणों के विषय में ज्ञान से निर्धारित है । एक GPCR के लिए बाध्यकारी एगोनिस्ट diphosphate जी प्रोटीन की guanidine-उपइकाई पर ट्राइफॉस्फेट GTP (α) के लिए guanidine heterotrimeric (जीडीपी) के आदान-प्रदान catalyzing एक गठनात्मक परिवर्तन लाती है । इसके बाद जीα-GTP उप इकाई से dissociates जीβγ उपइकाई और दोनों उपइकाईयों से आगे संकेतात्मक रास्ते आरंभ करेंगे. Hydrolysis के GTP-अणु और उसके बाद पुनः संघ के जीα-सकल घरेलू उत्पाद और जीβγ उपइकाईयों के जी प्रोटीन को अपने निष्क्रिय अनुरूप5,6में बहाल करेंगे । अनुक्रम के आधार पर gα उपइकाई के विभिन्न प्रकार के g प्रोटीन को परिभाषित किया जाता है (gs, gi, gq, g12/13)7. जीα उपइकाई के माध्यम से संकेतन इस तरह की वृद्धि के रूप में कई विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को जन्म देता है (जीएसके माध्यम से) या कमी (जी के माध्यम सेi) चक्रीय AMP उत्पादन और intracellular सीए2 + संघटन (जीक्यू) के माध्यम से5 ,7. Gβγ उपइकाई भी intracellular प्रभाव मार्ग प्रेरित करने में सक्षम हैं । उदाहरण के लिए, जीमैं-युग्मित GPCRs के सक्रियकरण पर, जीβγ सीधे phospholipase सी (पीएलसी-β) inositol ट्राइफॉस्फेट उत्पादन करने के लिए उत्तेजित कर सकते हैं (आईपी3) कि intracellular स्टोर से सीए2 + की रिहाई ट्रिगर7 . निंनलिखित रिसेप्टर सक्रियकरण, GPCRs GPCR kinases (GRKs) जो β-arrestins के साथ बातचीत को बढ़ावा देता है द्वारा phosphorylated हैं । यह प्रक्रिया जी प्रोटीन संकेतन समाप्त हो जाती है और रिसेप्टर के लिए विसंवेदीकरण और अंततः internalization की ओर जाता है । β-arrestins भी बहु-आणविक परिसरों कि अन्य संकेतन जी प्रोटीन के स्वतंत्र रास्ते ट्रिगर कर सकते हैं बनाने के लिए सक्षम हैं8संकेतन ।

chemokine रिसेप्टर्स के उपपरिवार के भीतर, जीमैं-युग्मित CXCR4 एक GPCR है कि दवा की खोज के लिए एक होनहार लक्ष्य के रूप में ज्यादा ब्याज उठाया है । मानव इम्यूनो वायरस 1 के लिए एक प्रमुख सह रिसेप्टर के रूप में इसकी स्थापना की भूमिका को देखते हुए (एचआईवी-1) वायरल प्रवेश और संक्रमण, यौगिकों लक्ष्यीकरण CXCR4 शुरू में विरोधी एचआईवी दवा उंमीदवारों के रूप में विकसित किए गए थे9. हाल ही में, सबूत के एक बढ़ती शरीर tumorigenesis और कैंसर में CXCR4 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की ओर इशारा किया है यह एक अच्छी तरह से कैंसर विज्ञान के रूप में अच्छी तरह से सत्यापित चिकित्सीय लक्ष्य10बनाने मेटास्टेसिस । CXCR4 अत्यधिक मानव कैंसर के बीस से अधिक प्रकार में व्यक्त की है और ट्यूमर सेल अस्तित्व, प्रसार, और प्रवास के साथ ही ट्यूमर से संबंधित angiogenesis10नियंत्रण । विभिंन रासायनिक वर्गों के CXCR4 विरोधी पहले11,12वर्णित किया गया है, लेकिन केवल छोटे अणु AMD3100 वर्तमान में एक स्टेम सेल समाज सेवा लिंफोमा के उपचार के दौरान इस्तेमाल एजेंट के रूप में क्लिनिक में उपयोग के लिए मंजूरी दे दी है और मायलोमा रोगियों13,14। नैदानिक परीक्षणों की सुरक्षा और विभिन्न मानव रोगों में कई अन्य CXCR4 विरोधी की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए चल रहे हैं, लेकिन ऑन्कोलॉजी12पर एक मजबूत ध्यान के साथ. CXCR4 विरोधी के लिए कई संभावित अनुप्रयोगों को देखते हुए, बेहतर pharmacokinetic गुणों के साथ उपंयास यौगिकों के लिए खोज, बेहतर जैव उपलब्धता, या संभावित कम दुष्प्रभाव वारंट है ।

इस के साथ साथ, एक काइनेटिक प्रतिदीप्ति आधारित सेलुलर परख मुख्य रूप से बाधा CXCR4 के लिए सक्षम यौगिकों के लिए स्क्रीन का वर्णन किया है । इस विधि के फ्लोरोसेंट माप intracellular Ca के क्षणिक वृद्धि पर आधारित है2 + एकाग्रता CXCR4 सक्रियण पर अपने अंतर्जात एगोनिस्ट द्वारा पैदा की, chemokine ligand CXCL12 (पूर्व stromal कोशिका व्युत्पंन फैक्टर 1α के रूप में जाना जाता है ( SDF1-α)), और इस CXCL12 के संभावित निषेध-प्रेरित Ca2 + विशेष यौगिकों द्वारा प्रतिक्रिया । इस परख में, U87 मानव ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं छुरा मानव CXCR4 रिसेप्टर व्यक्त किया जाता है । एक ही समय में, इन कोशिकाओं CXCR7 के अंतर्जात अभिव्यक्ति की कमी, एक संबंधित chemokine रिसेप्टर भी CXCL1215,16,17बांधता है । CXCR7 पहले भी CXCR4 के साथ heterodimers बनाने में सक्षम होना दिखाया गया है, जिससे इस बाद रिसेप्टर18के संकेतन गुण संग्राहक. intracellular ca के स्तर में उतार चढ़ाव2 + CXCR4 द्वारा मध्यस्थता fluo-2 acetoxymethyl (AM) एस्टर, एक सेल-पारगंय उच्च संबंध फ्लोरोसेंट सीए2 +-बाध्यकारी डाई के साथ CXCR4+ कोशिकाओं लदान द्वारा निगरानी कर रहे हैं । Fluo-2 हूं एक एकल तरंग दैर्ध्य फ्लोरोसेंट अणु कि ४९० एनएम पर उत्साहित किया जा सकता है, जबकि इसके उत्सर्जन प्रतिदीप्ति ५२० एनएम पर मापा जाता है । इस उत्सर्जन प्रतिदीप्ति ca पर बढ़ जाती है2 + बाइंडिंग, के बीच एक बड़ी गतिशील श्रेणी के साथ सीए2 +-बाउंड और असीमित स्थिति । फ्लोरोसेंट संकेत में वृद्धि क्षणिक है, कुछ ही मिनटों के एक समय अंतराल के भीतर होने वाली है, और बाद में क्षय होगा । फ्लोरोसेंट उत्सर्जन की चोटी ऊंचाई आगे रिसेप्टर सक्रियण के स्तर के साथ संबद्ध । परख ही एक प्रतिदीप्ति microplate एक तेज सीसीडी (आईसीसीडी) कैमरा है कि एक एकीकृत pipetting प्रणाली है कि परख में pipetting कदम के मानकीकरण की अनुमति देता है के पास के साथ सुसज्जित पाठक का उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें) . इसके अलावा, एक microplate के सभी कुओं में फ्लोरोसेंट संकेत के एक साथ माप प्रतिदीप्ति पाठक का एक और महत्वपूर्ण लाभ है कि प्रयोग किया जाता है । परख के पहले भाग के दौरान जांच के तहत यौगिकों (उदा, एक स्थिर एकाग्रता में या एक कमजोर पड़ने की श्रृंखला में छोटे अणुओं के एक पैनल) fluo-2 के लिए जोड़ रहे है CXCR4+ U87 कोशिकाओं के बाद एक ~ 10 मिनट की मशीन अवधि के दौरान जो यौगिकों के संभावित agonistic प्रभाव लगातार वास्तविक समय में मापा जाता है । फिर, अंतर्जात एगोनिस्ट (यानी, CXCL12) कोशिकाओं को जोड़ा जाता है एक CXCR4-मध्यस्थता क्षणिक वृद्धि intracellular Ca2 +के स्तर में पैदा करने के लिए । परख के इस भाग के दौरान परीक्षण यौगिकों के संभावित विरोधी गतिविधि का मूल्यांकन किया जा सकता है । परख के सामांय कार्यप्रवाह के एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 1में प्रस्तुत किया है ।

हालांकि इस Ca2 + जुड़ाव परख मुख्य रूप से पहचान करने के लिए और प्रतिस्पर्धी CXCR4 विरोधी की निरोधात्मक शक्ति (यानी, यौगिकों कि बांध और रिसेप्टर को उत्तेजित करने के लिए अंतर्जात एगोनिस्ट को रोकने का निर्धारण किया गया है), यह भी रिसेप्टर एगोनिस्ट की पहचान कर सकते हैं और, इसके अलावा, यौगिकों कि allosteric साइटों पर बाध्यकारी द्वारा अपने समारोह में लागू (यानी, साइटों है कि स्थलाकृतिक अंतर्जात एगोनिस्ट द्वारा कब्जा orthosteric बंधन साइट से अलग). यौगिकों के उत्तरार्द्ध श्रेणी के उदाहरण allosteric एगोनिस्ट और पम्म और NAMs19,20शामिल हैं । जबकि रिसेप्टर-विशिष्ट विरोधी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NAMs CXCL12 प्रेरित Ca2 + प्रतिक्रिया बाधित होगा, पम्म इस प्रतिक्रिया में वृद्धि होगी (भी चर्चा अनुभाग देखें). हालांकि परख वर्णित विशेष रूप से CXCR4 लक्ष्य, यह प्रत्याशित है कि इस विधि को ंयूनतम अनुकूलन प्रयास के साथ अंय GPCRs के लिए लागू किया जा सकता है, कम से कम अगर वे intracellular Ca के रिलीज के माध्यम से संकेत2 +

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Protocol

नोट: सभी कदम वर्गों 1 और 2 के तहत वर्णित एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है ।

1. U87 का रख-रखाव । CD4. hCXCR4 कक्ष

  1. ३७ ° c में T75 संस्कृति कुप्पी में कोशिकाओं को विकसित और 5% CO2 एक humidified मशीन में ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त इन विट्रो सेल लाइन एक U87 ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन छुरा 4 (CD4) और मानव CXCR4 के क्लस्टर व्यक्त कर रहा है और पहले17वर्णित किया गया है । CD4 और CXCR4 की कोशिका सतह अभिव्यक्ति लगातार प्रवाह cytometry द्वारा निगरानी की जाती है और अभिव्यक्ति का स्तर समय के साथ स्थिर रहते हैं (~ १००% CD4+ और ~ १००% CXCR4+ कोशिकाओं). उपयोग की गई कक्ष पंक्ति और प्रवाह cytometry प्रक्रिया रिसेप्टर अभिव्यक्ति स्तर की जांच करने के लिए की जनरेशन का विस्तृत विवरण इस प्रोटोकॉल के क्षेत्र में नहीं है ।
    1. 80-85% पर उपसंस्कृति कोशिकाओं को प्रभावित । सभी एजेंट कक्ष संवर्धन से पहले कमरे के तापमान (आरटी) तक पहुंचने के लिए अनुमति दें ।
    2. कोशिकाओं से कंडीशन्ड कल्चरल मीडियम को हटा दें और 5 एमएल फास्फेट बफ़र्ड खारा (पंजाब) के साथ एक बार सेल monolayer को धो लें ।
    3. ०.२५% trypsin-EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें और यह सेल monolayer पर समान रूप से वितरित । फिर trypsin-EDTA के अतिरिक्त निकालें और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस तक की मशीन जब तक कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू करते हैं ।
    4. ताजा पूरा विकास मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + ०.०१ एम HEPES + उपयुक्त चयन एजेंटों). धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड । एक बाँझ ५० एमएल ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    5. पसंद की एक विधि का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती । U87 ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के मामले में, व्यवहार्यता आम तौर पर पहुंच ~ १००% ।
      नोट: कक्ष संख्याओं को कई तरीकों से निर्धारित किया जा सकता है । हम नियमित रूप से एक स्वचालित सेल विश्लेषण trypan नीले दाग पर आधारित प्रणाली का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) अपने मानक प्रक्रियाओं से निपटने के अनुसार, लेकिन अंय शिष्टाचार भी समान रूप से अच्छी तरह से काम करना चाहिए ।
    6. 2 x 106 या 3 x 106 (व्यवहार्य) कोशिकाओं को एक T75 संस्कृति कुप्पी और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर गर्मी में 25 मिलीलीटर ताजा विकास माध्यम के एक अंतिम खंड में जोड़ें ।
      नोट: यदि 3 x 106 कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है कोशिकाओं को 2 दिनों के बाद 80-90% प्रवाह तक पहुंच जाएगा । यदि 2 x 106 कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, वे 3 दिनों के बाद एक ही प्रवाह तक पहुंच जाएगा । कोशिकाओं की वृद्धि दर पहले empirically निर्धारित किया जाना चाहिए यदि अन्य सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है.

2. सीए के लिए कोशिकाओं के सीडिंग2 + जुड़ाव परख

  1. सेल passaging के दिन (0 दिन), कोट काले घिरी polystyrene ९६-साफ नीचे के साथ अच्छी तरह से प्लेटें ( सामग्री की तालिकादेखें) एक ०.१% जिलेटिन समाधान के साथ सेल लगाव की सुविधा के लिए ।
    नोट: ९६ की कोटिंग-जिलेटिन के साथ अच्छी तरह से प्लेटें लोप हो सकता है अगर पूर्व लेपित प्लेटें, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें), उपयोग किया जाता है. यह प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने से पहले जांच के तहत प्रत्येक सेल लाइन के लिए मैनुअल कोटिंग के बजाय पूर्व लेपित प्लेटों के उपयोग का मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है ।
    1. एक 1% समाधान प्राप्त करने के लिए १०० मिलीलीटर पंजाबियों के लिए जिलेटिन की 1 जी जोड़कर जिलेटिन समाधान तैयार करें । आगे उपयोग से पहले पंजाबियों के साथ 10x द्वारा पतला । जिलेटिन की घुलनशीलता में सुधार करने के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान गर्मी ।
    2. ९६-अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर प्लेट के प्रति अच्छी तरह से ०.१% जिलेटिन समाधान के १०० µ एल जोड़ें । आरटी में 2 एच के लिए मशीन ।
  2. इस बीच में, लेपित ९६-well थाली में बोने के लिए कोशिकाओं को तैयार ।
    1. संस्कृति कुप्पी से अलग कोशिकाओं, उंहें ताजा विकास के माध्यम में reसस्पेंड, और उंहें trypan ब्लू धुंधला विधि का उपयोग कर गिनती ।
    2. आरटी में ४०० x g पर 5 मिनट के लिए एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं नीचे स्पिन
    3. ताजा वृद्धि मध्यम में कोशिकाओं reसस्पेंड (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, कोई एंटीबायोटिक दवाओं) ०.१ x 106 (व्यवहार्य) कोशिकाओं/एमएल के एक सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए ।
  3. प्लेट पर flipping और यह एक ऊतक पर सुखाने के द्वारा स्पष्ट नीचे के साथ काले दीवारों प्लेट से जिलेटिन समाधान निकालें । Add २०० µ l/अच्छी तरह से पंजाब अतिरिक्त जिलेटिन हटाने और प्लेट पर फिर से फ्लिप करने के लिए ।
  4. सेल निलंबन के २०० µ एल वितरण (०.२ x 105 कोशिकाओं के लिए इसी) प्रति अच्छी तरह से जिलेटिन में लेपित ९६-अच्छी तरह से थाली (अब से एक इस थाली आगे "माप प्लेट" के रूप में भेजा जाएगा) ।
  5. ३७ ° c और 5% CO2पर रात भर थाली की मशीन ।

3. एक फ्लोरोसेंट सीए के साथ कोशिकाओं की लोडिंग2 + -संवेदनशील डाई

  1. 1 दिन में वास्तविक ca2 + जुड़ाव परख प्रदर्शन, फ्लोरोसेंट ca के साथ2 +बाध्यकारी डाई fluo-2 हूं के साथ वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की लोडिंग के साथ शुरू ।
    1. ४० मिलीलीटर HEPES (1 एम) को जोड़ने के द्वारा परख बफर तैयार २०० मिलीलीटर हांक है संतुलित नमक समाधान (HBSS, 10x, नहीं phenol लाल, कोई सोडियम बिकारबोनिट) । 2 एल के एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए ultrapure पानी जोड़ें और 4 जी गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) जोड़ें । चुंबकीय सरगर्मी के माध्यम से BSA भंग. ७.४ (NaOH के साथ) के लिए पीएच समायोजित करें और समाधान फ़िल्टर ।
      नोट: सभी निंन चरणों के दौरान एक ही बफर, के रूप में संदर्भित करने के लिए "परख बफर", प्रयोग किया जाता है ।
    2. एक शेयर समाधान तैयार (dimethyl sulfoxide (DMSO में 4 मिमी) फ्लोरोसेंट Ca के2 +-संवेदनशील डाई fluo-2 AM । प्रकाश के लिए अत्यधिक जोखिम से बचें । भंग 1 मिलीग्राम fluo-2 हूं (आण्विक वजन: १,०६१ g/मॉल) में २३५.६ µ l DMSO ।
    3. fluo-2 AM का एक वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें । १ ९६ के लिए अच्छी तरह से परख प्लेट मिश्रण १२.५ µ fluo के एल-2 हूं शेयर समाधान (4 मिमी) और १२.५ µ l ईओण surfactant polyol (जैसे, pluronic एफ-१२७) समाधान (20% वजन/DMSO में मात्रा, सामग्री कीतालिका देखें) । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 11 मिलीलीटर परख बफर करने के लिए इस मिश्रण के 22 µ एल जोड़ें । fluo के अंतिम एकाग्रता-2 हूं 4 µ एम ।
      नोट: ईओण surfactant एक फैलाव एजेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है fluo के जलीय घुलनशीलता में सुधार-2 हूं और, परिणाम में, सेल लोडिंग बढ़ाने के लिए । DMSO में surfactant solubilize करने के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी और एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए नियमित रूप से मिश्रण ।
    4. ९६-अच्छी तरह से माप प्लेट में पहले से वरीयता प्राप्त कोशिकाओं से विकास के माध्यम को प्लेट पर flipping और यह एक कागज तौलिया पर सुखाने से निकालें ।
    5. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर अच्छी तरह से प्रति लोड डाई समाधान के १०० µ एल जोड़ें और अंधेरे में आर टी पर ४५ मिनट के लिए मशीन ।

4. ९६-अच्छी तरह से Chemokine Ligand CXCL12 या जांच के तहत यौगिकों युक्त प्लेट की तैयारी

  1. राउंड बॉटम (पीपी) ९६-अच्छी तरह से प्लेटें ( सामग्री की तालिकादेखें) प्राप्त करें ।
    1. CXCL12 के शेयर समाधान की अनुमति दें (1 मिलीग्राम/एमएल) और जांच के तहत यौगिकों के शेयर समाधान आरटी पर equilibrate के लिए ।
      नोट: CXCL12 के शेयर समाधान ०.०१% Tween20 के साथ पूरक ultrapure पानी में तैयार किया जाता है और एकल उपयोग aliquots के रूप में-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    2. परख बफर में CXCL12 के एक 5x केंद्रित समाधान तैयार (२५० एनजी/एमएल जो ३१.२५ एनएम के बराबर होती है) और एक 5x केंद्रित कमजोर पड़ने के एक परिसर (परख बफर में) ।
    3. एक पूर्वनिर्धारित प्लेट लेआउट के अनुसार उचित ९६-अच्छी तरह से थाली में स्टॉक समाधान बांटें । औषधालय ७५ µ l/CXCL12 युक्त प्लेट में ("chemokine प्लेट"), औषधालय ५० µ एल/अच्छी तरह से यौगिकों युक्त प्लेट में ("यौगिक प्लेट").
      नोट: दोनों यौगिकों और CXCL12 अंत में माप प्लेट में वितरण पर 5x पतला हो जाएगा । यह भी नकारात्मक नियंत्रण दोनों यौगिक थाली में ही परख बफर युक्त कुओं के रूप में अच्छी तरह से chemokine थाली शामिल महत्वपूर्ण है । इसके अलावा सकारात्मक नियंत्रण कुओं की जरूरत है (यानी, chemokine थाली में CXCL12 के साथ कुओं, लेकिन परख के साथ यौगिक प्लेट के इसी कुएं में बफर) ।

5. प्रतिदीप्ति Microplate रीडर पर प्रोटोकॉल सेटिंग्स

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त प्रतिदीप्ति microplate रीडर को सामग्री की तालिकामें संदर्भित किया जाता है ।

  1. प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर के कूलर यूनिट पर स्विच पहले, और फिर प्रतिदीप्ति रीडर पर ही स्विच । कुछ मिनट के लिए आरंभ और प्रणाली के सॉफ्टवेयर खोलने चलो ।
  2. है परख प्रोटोकॉल खींचें और ड्रॉप मेनू है कि निंनलिखित कदम शामिल है का उपयोग कर बनाएं:
    1. "सेटिंग्स" बॉक्स में, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ ' Read_Mode ' का चयन करें: 470-495 एनएम; उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य: 515-575 एनएम ।
      नोट: चयनित तरंग दैर्ध्य Ca के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त हैं2 +-संवेदनशील डाई fluo2.
    2. "TF के साथ मिश्रण" (स्थानांतरण द्रव) बॉक्स यौगिक थाली में यौगिकों के मिश्रण स्वचालित करने के लिए, कि डिवाइस के स्रोत 2 स्थिति में डाल दिया जाएगा (कदम ६.४ देखें) शामिल हैं । प्रत्येक कुआं में समाधान के 15 µ l को स्वचालित रूप से aspirated और मिश्रित तीन बार चुनें । तरल सतह के नीचे 20 µ एल पर पिपेट सुझावों की ऊंचाई समायोजित करें । आकांक्षा और औषधालय की गति निर्धारित ५० µ l/
      नोट: पिपेट युक्तियों की ऊंचाई पिपेट युक्तियों के नीचे छोड़ दिया जाता है जो वॉल्यूम को संदर्भित करता है । उदाहरण के लिए, यदि एक यौगिक प्लेट के कुओं में ५० µ l होते हैं, तो 30 µ l की ऊंचाई तरल सतह के नीचे 20 µ l से मेल खाती है । मिश्रण करने के लिए ले लिया यौगिक समाधान की मात्रा, मिश्रण के दौरान पिपेट सुझावों की स्थिति, और मिश्रण चक्र की संख्या सभी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है ।
    3. "स्थानांतरण द्रव" बॉक्स में, निर्धारित करें कि यौगिक प्लेट से प्रत्येक कुआं के 20 µ एल माप प्लेट में स्थानांतरित कर दिया जाएगा । पिपेट युक्तियों को तरल सतह के नीचे 20 µ l पर स्थित करें अर्थात्, मापन प्लेट में औषधालय के दौरान यौगिकों की आकांक्षा के दौरान ऊंचाई 30 µ l पर और ऊँचाई ६० µ l पर. ५० µ पर आकांक्षा की गति निर्धारित करें l/एस और 25 µ एल पर औषधालय की गति/
      नोट: यौगिक प्लेट (4.1.3 चरण देखें) प्रति अच्छी तरह से समाधान के ५० µ एल शामिल हैं, इस प्रकार 30 µ एल की एक ऊंचाई तरल सतह के नीचे एक स्थिति 20 µ एल से मेल खाती है. माप प्लेट के प्रति अच्छी तरह से परख बफर के ८० µ एल शामिल होंगे (६.३ कदम देखें), इस प्रकार ६० µ एल की ऊंचाई सुझावों की एक ऐसी ही स्थिति से मेल खाती है ।
    4. "TF के साथ पढ़ें" बटन का चयन करें । पहले अंतराल के दौरान, का चयन करें ६० पढ़ता है (फ्लोरोसेंट माप) के एक पढ़ने के अंतराल के समय के साथ 1 s. परिभाषित है कि 10 पुस्तकें माप प्लेट में यौगिकों के वितरण से पहले दर्ज कर रहे हैं, और ५० बाद में पढ़ता है. 30 s और 18 पढ़ता के पठन अंतराल समय के साथ दूसरा अंतराल निर्धारित करें ।
      नोट: इस कदम के दौरान प्रतिदीप्ति (निर्धारित समय अंतराल पर) काइनेटिक मापा जाएगा कुल में ~ 10 मिनट के लिए ।
    5. प्रोटोकॉल में तीन बार "वॉश टिप्स" बटन शामिल करें । प्रत्येक धुलाई चरण के भीतर, द्रव प्रकार का चयन करें: द्रव एक (ultrapure पानी) या द्रव बी (७०% इथेनॉल), धोने चक्र की संख्या (1), पंप गति (तेज), और स्ट्रोक की संख्या (5) प्रत्येक धोने के कदम के दौरान.
      नोट: पहली और अंतिम धोने चरण द्रव एक के दौरान प्रयोग किया जाता है, दूसरा धोने के चरण के दौरान द्रव B का उपयोग किया जाता है ।
    6. "रोकें Pipettor" फ़ंक्शन शामिल करें । ३०० s के लिए ठहराव के लिए pipettor सेट करें ।
      नोट: प्रोटोकॉल में इस कदम को शामिल करके, pipettor सिर, प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर डिवाइस में एकीकृत है जो, प्रोटोकॉल जारी रखने से पहले 5 मिनट के लिए ठहराव होगा.
    7. chemokine प्लेट में CXCL12 समाधान के मिश्रण की अनुमति देने के लिए "TF के साथ मिश्रण" बॉक्स शामिल करें, जो डिवाइस के स्रोत 3 स्थिति पर तैनात किया जाएगा (चरण ६.४ देखें) । प्रत्येक कुआं में समाधान के 15 µ l को स्वचालित रूप से aspirated और मिश्रित तीन बार चुनें । आकांक्षा और मिश्रण के दौरान, स्थिति पिपेट युक्तियां 20 µ तरल सतह के नीचे l । आकांक्षा और औषधालय की गति ५० µ l/एस पर सेट है ।
      नोट: चरण 5.2.2 के लिए समान, इन पैरामीटर्स समायोजित किया जा सकता है ।
    8. बाद में "स्थानांतरण द्रव" बॉक्स में, परिभाषित करें कि chemokine प्लेट के प्रत्येक कुआं से 25 µ एल माप थाली में स्थानांतरित किया जाएगा । स्थिति युक्तियां 20 µ एल तरल सतह के नीचे अर्थात्, ऊंचाई ५५ µ l पर chemokine थाली है कि ७५ µ एल/अच्छी तरह से (कदम 4.1.3 देखें) से आकांक्षा के दौरान, और ऊंचाई पर ८० µ एल में वितरण के दौरान माप प्लेट । ५० µ पर आकांक्षा की गति निर्धारित करें l/एस और 25 µ एल पर औषधालय की गति/
    9. "TF के साथ पढ़ें" बटन शामिल करें । पहले अंतराल के दौरान, का चयन करें १४५ पठन अंतराल के समय के साथ पढ़ता है 1 s. परिभाषित है कि 5 पढ़ता माप प्लेट में CXCL12 वितरण से पहले दर्ज हैं, और १४० बाद में पढ़ता है । 6 s के पठन अंतराल समय के साथ दूसरा अंतराल निर्धारित करें और 20 पढ़ता चुनें ।
      नोट: एक साथ लिया, पूरे प्रोटोकॉल २४३ पुस्तकें (फ्लोरोसेंट माप) में दर्ज कर रहे हैं: कदम पर ७८ 5.2.4 और १६५ चरण 5.2.9 के दौरान ।
    10. चरण 5.2.5 के समान, "वॉश टिप्स" बटन प्रोटोकॉल में तीन बार शामिल हैं ।
      नोट: प्रोटोकॉल के अंत में इस कदम सहित अनुमति देता है कि सुझावों को फिर से किया जा सकता है के लिए सुझावों को बदलने की जरूरत के बिना एक और परख प्रदर्शन करते थे ।
  3. "स्टेज तापमान सेट करें" बटन पर क्लिक करके और ३७ डिग्री सेल्सियस का चयन करके ३७ डिग्री सेल्सियस पर डिवाइस का तापमान सेट करें ।

6. प्रतिदीप्ति परख रनिंग

  1. के बाद माप प्लेट ४५ मिनट के लिए बफर लोड करने के साथ मशीन है (चरण 3.1.5 देखें), बफर प्लेट पर flipping और यह एक ऊतक पर सूखी द्वारा निकालें ।
  2. १५० µ एल जोड़कर बीज की कोशिकाओं को धो/अच्छी तरह से परख बफर और 2 मिनट के लिए मशीन ।
  3. बफ़र प्लेट पर flipping द्वारा फिर से निकालें । जोड़ें ८० µ एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ परख बफर के एल/
  4. डिवाइस में सभी प्लेटें अपने उपयुक्त स्थान पर रखें: स्रोत 2 स्थिति में यौगिक प्लेट, स्रोत 3 स्थिति में chemokine प्लेट, और पढ़ने की स्थिति पर माप प्लेट. स्रोत 1 युक्तियां स्थिति में काले सुझावों का एक बॉक्स रखो । डिवाइस का दरवाज़ा बंद करें और प्रोटोकॉल को जारी रखने से पहले 5 मिनट के लिए मशीन ।
  5. पृष्ठभूमि सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (RLUs) और प्लेट पर प्रतिदीप्ति विचरण निर्धारित करने के लिए "प्रोटोकॉल संकेत परीक्षण" बटन का चयन करें । एक नई विंडो पॉप अप होगा । "परीक्षण संकेत" का चयन करें ।
    नोट: इस कदम के दौरान, पृष्ठभूमि RLUs आईसीसीडी कैमरा है, जो प्रतिदीप्ति रीडर डिवाइस के प्रकाशिकी डिब्बे में एकीकृत है द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । Ca के उत्तेजना से ये RLUs परिणाम2 +-संवेदनशील डाई (fluo-2) द्वारा प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एल ई डी) (एलईडी उत्पादन तरंग दैर्ध्य 470-495 एनएम). 8000-10000 RLUs के मान इस अनुप्रयोग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं । RLUs, यदि आवश्यक हो, उत्तेजना तीव्रता (select Exc. तीव्रता), या कैमरा गेट (चयन गेट खोलो) को बदलने के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है । प्लेट पर विचरण आदर्श रूप से कम ७.५% होना चाहिए ।
  6. 8000-10000 RLUs की पृष्ठभूमि मान प्राप्त होते हैं, तो "अद्यतन" का चयन करें । सहेजें बटन क्लिक करके मुख्य प्रोटोकॉल सहेजें ।
    नोट: ऐसा करके, प्रोटोकॉल संकेत परीक्षण से सेटिंग्स को मुख्य प्रोटोकॉल पर किया जाएगा ।
  7. भागो "बटन" धक्का द्वारा परख चलाते हैं ।

7. डेटा विश्लेषण और गुणवत्ता

  1. परख समाप्त होने के बाद, सिस्टम के सॉफ्टवेयर में "विश्लेषण" बॉक्स खोलें ।
    1. "कॉंफ़िगर सुधार" पर जाएं और "बेस लाइन पर प्रतिक्रिया" चुनें । माप 1 पर प्रारंभ करने और माप 5 पर समाप्त करने के लिए बेस लाइन 1 निर्धारित करें; मतलब प्रतिदीप्ति माप 1 और 5 के बीच एक अच्छी तरह से गणना की जाएगी ।
      नोट: एक विशेष अच्छी तरह से सभी आगे की माप इस अच्छी तरह से विशिष्ट बेस लाइन 1 द्वारा विभाजित कर रहे हैं ।
      1. माप ८३ (CXCL12 माप ८३ के बाद तिरस्कृत किया गया है, जब तक मापन ७८ पर प्रारंभ करने के लिए बेस लाइन 2 निर्धारित करें प्रतिदीप्ति मतलब माप ७८ और ८३ के बीच प्रत्येक कुआं में गणना की है और इस सुधार कारक निम्नलिखित सभी माप करने के लिए लागू किया जाता है माप ८३) ।
    2. टिक बॉक्स को सक्रिय करें "प्रतिशत के रूप में दिखाएँ" और "पृष्ठभूमि घटाना".
    3. "कॉंफ़िगर काइनेटिक कटौती" पर जाएं । CXCL12-प्रेरित Ca पर यौगिकों के निरोधात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए2 + प्रतिक्रिया, माप ८४ (यानी, पहला माप जिसके बाद CXCL12 तिरस्कृत किया जाता है) से शुरू करने के लिए २४३ (यानी, अंतिम माप) का चयन करें ।
      नोट: अधिकतम-ंयूनतम माप ८४ और माप २४३ के बीच आधार रेखा पर न्यूनतम और अधिकतम प्रतिसाद के बीच अंतर का चयन करके रिपोर्ट की गई है । यदि अधिकतम-ंयूनतम माप 11 और माप ७८ के बीच प्रारंभ करना चुना है, तो आधार रेखा 1 के सापेक्ष आधारभूत पर ंयूनतम और अधिकतम प्रतिसाद के बीच अंतर रिपोर्ट की गई है । इस मान का उपयोग यौगिकों की संभावित agonistic गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, चर्चादेखें) ।
    4. डेटा सिस्टम के सॉफ्टवेयर में visualized किया जाएगा । यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त विश्लेषण और अन्य सामान्य विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज में विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अपुष्ट डेटा निर्यात करें.

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Representative Results

U87 में intracellular Ca2 + जुड़ाव पर CXCL12 उत्तेजना का प्रभाव । CD4. CXCR4+ व U87. CD4 कोशिकाओं सीए2 + जुड़ाव परख के साथ मूल्यांकन किया गया । इसके बजाय परीक्षण यौगिक के 20 µ एल कि आम तौर पर प्रोटोकॉल के पहले pipetting कदम के दौरान जोड़ा जाएगा (चित्रा 1), परख बफर fluo में जोड़ा गया था-2 U87 भरी हुई हूं । CD4. CXCR4+ माप की थाली में कक्ष । दूसरा वितरण कदम के दौरान, CXCL12 के विभिंन सांद्रता (0.2-102.4 एनएम, अंतिम एकाग्रता) माप थाली में तिरस्कृत किया गया । प्रतिदीप्ति में एक खुराक-निर्भर वृद्धि, Ca के रिलीज के एक खुराक पर निर्भर वृद्धि के साथ correlating2 +, (चित्र 2a) का प्रदर्शन किया है । यहां, नकारात्मक नियंत्रण नमूना उन कुओं जिसमें दोनों अतिरिक्त केवल परख बफर पर माप की थाली (यानी, 0 एनएम CXCL12), एक प्रतिक्रिया (चित्रा 2a) के अभाव में जिसके परिणामस्वरूप जोड़ा गया था का प्रतिनिधित्व करता है । CXCL12 की मात्रा बढ़ रही है कि समय के साथ क्षय प्रतिदीप्ति की वृद्धि हुई स्तर प्रेरित (चित्रा 2a). इन आंकड़ों से, एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र आधार पर माप ८४ के बीच "अधिकतम न्यूनतम प्रतिक्रिया" पर उत्पन्न हुआ था (यानी, CXCL12 के बाद पहली माप) और माप २४३ (यानी, प्रोटोकॉल में अंतिम माप ). रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करना, चुनाव आयोग५० मूल्य (यानी, एकाग्रता के लिए आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रिया पैदा करने की जरूरत) निर्धारित किया गया था और १.१४ एनएम (चित्रा बीएम) से मेल खाती है । कोई फ्लोरोसेंट Ca2 +से संबंधित प्रतिक्रिया CXCL12 द्वारा पैदा किया गया था, यहां तक कि उच्च एकाग्रता पर (१०२.४ एनएम), जब U87 । कार्यात्मक CXCR4 अभिव्यक्ति की कमी CD4 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया । यह CXCL12 (चित्रा 2c) द्वारा पैदा माप की रिसेप्टर विशिष्टता को दर्शाता है.

इस सेल के लिए एक महत्वपूर्ण आवेदन-परख आधारित छोटे अणुओं की पहचान विशेष रूप से CXCR4 लक्ष्यीकरण और CXCL12-प्रेरित सीए2 + जुड़ाव बाधा के सक्षम है । यदि सक्रिय यौगिकों ("हिट") की पहचान कर रहे हैं, वे आगे यौगिक के धारावाहिक कमजोर पड़ने के परीक्षण और अधिक विस्तार में निरोधात्मक शक्ति का विश्लेषण द्वारा विशेषता हो सकती है । एक उदाहरण के रूप में, bicyclam AMD3100 के प्रभाव, एक अच्छी तरह से स्थापित छोटे अणु CXCR4-शक्तिशाली विरोधी एचआईवी-1 गतिविधि के साथ विशिष्ट रिसेप्टर प्रतिपक्षी21,22, चित्रा 3में सचित्र है. AMD3100 की एक एकाग्रता श्रृंखला (n = 4, 3 µ एक 1/3 कमजोर पड़ने की श्रृंखला में १.३७ एनएम अंतिम एकाग्रता के लिए नीचे एम) U87 पर तिरस्कृत किया गया था । CD4. CXCR4+ प्रोटोकॉल के पहले चरण के दौरान कक्ष । यौगिक तो प्रतिदीप्ति संकेत लगातार दर्ज की गई थी, जिसके दौरान ~ 10 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ मशीन की अनुमति दी थी । फिर CXCL12 के ६.४ एनएम (५० एनजी/एमएल, अंतिम एकाग्रता) सेल प्लेट के सभी कुओं में एक साथ जोड़ा गया था CXCR4-मध्यस्थता सीए2 + जुड़ाव प्रेरित । खुराक-AMD3100 के विभिन्न कमजोर पड़ने से इस प्रतिक्रिया के आश्रित संकोच चित्रा 3ए में दिखाया गया है । इस मामले में, केवल CXCL12 के साथ निंनलिखित ग्राफ का हिस्सा दिखाया गया है । के रूप में एक नकारात्मक नियंत्रण (नीली रेखा) केवल बफर परख में लागू किया गया था (कोई पूर्व AMD3100 के साथ मशीन, कोई CXCL12 कुओं में जोड़ा), प्रतिक्रिया की कमी की उंमीद में जिसके परिणामस्वरूप । सकारात्मक नियंत्रण (लाल रेखा) नमूनों में ६.४ एनएम CXCL12 AMD3100 की पूर्व मशीन (चित्रा 3) के बिना कुओं में जोड़ा गया था से मेल खाती है । इन के आधार पर परिभाषित नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण इस परख में Z मूल्य आमतौर पर ०.५ और 1 के बीच है । AMD3100 की निरोधात्मक शक्ति का निर्धारण करने के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र ७७०.८ एनएम (चित्र बी) के एक परिकलित आईसी५० मूल्य में जिसके परिणामस्वरूप गैर रेखीय प्रतीपगमन द्वारा उत्पन्न किया गया था. आगे एक गैर-सक्रिय यौगिक के व्यवहार को समझाने के लिए, maraviroc इस experiment में शामिल किया गया था । Maraviroc एक छोटे से विशेष रूप से बाधा chemokine रिसेप्टर 5 (CCR5) जिससे अवरुद्ध अणु है (CCR5)-रेखा एचआईवी-1 संक्रमण23 . यहां तक कि उच्च एकाग्रता पर (10 µ एम अंतिम एकाग्रता) इस परिसर का कोई निरोधात्मक प्रभाव CXCR4-मध्यस्थता Ca2 + प्रतिक्रिया (चित्रा 3) पर मनाया गया.

अंत में, यह प्रदर्शित करने के लिए कि इस Ca2 + जुड़ाव परख भी अंय GPCRs, सीसी chemokine ligand 5 (CCL5), अंतर्जात के लिए ligand CCR5 के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, CCR5 एक्सप्रेस कोशिकाओं को जोड़ा गया था (U87 । CD4. CCR5+) बिल्कुल एक ही प्रयोगात्मक शर्तों और हार्डवेयर सेटिंग्स का उपयोग कर । एक खुराक पर निर्भर फ्लोरोसेंट Ca2 + प्रतिक्रिया CCL5 के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के अलावा (चित्रा 3सी) के बाद प्रदर्शन किया है । इसके अलावा, और CXCR4 पर अपने प्रभाव के विपरीत, १०० एनएम (maraviroc के अंतिम एकाग्रता) के साथ पूर्व-मशीन दृढ़ता से इस प्रतिक्रिया (चित्र 3 डी) बाधित ।

Figure 1
चित्रा 1: परख के कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध सिंहावलोकन । दिन 0 पर (इस मामले CXCR4 में) ब्याज की GPCR व्यक्त कोशिकाओं स्पष्ट नीचे के साथ काले दीवारों ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर रातोंरात बड़े हो रहे हैं2. 1 दिन में प्रतिदीप्ति-Ca पर आधारित2 + परख किया जाता है । कोशिकाओं को पहली बार एक फ्लोरोसेंट सीए के साथ भरी हुई हैं2 +-संवेदनशील डाई (fluo-2 AM) और अंधेरे में आरटी पर ४५ मिनट के लिए मशीन. एक "chemokine प्लेट" और "यौगिक प्लेट" तैयार कर रहे हैं (पीपी =) । डाई लोडिंग के साथ मशीन के बाद, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं परख बफर के साथ एक बार धोया जाता है (१५० µ एल/अच्छी तरह से) जिसके बाद ८० µ एल/ सभी प्लेटें तो परख शुरू करने से पहले ३७ ° c पर डिवाइस में 5 मिनट के लिए मशीन रहे हैं । फिर, ब्याज की यौगिकों (जैसे, छोटे अणुओं) माप प्लेट के कुओं में वांछित एकाग्रता में तिरस्कृत कर रहे हैं और प्रतिदीप्ति लगातार मापा जाता है, जबकि ~ 10 मिनट के लिए मशीन की अनुमति दी. अगले, GPCR के अंतर्जात एगोनिस्ट की एक निश्चित एकाग्रता (यहां CXCL12) के लिए Ca2 + रिलीज और प्रतिदीप्ति आगे समय पर दर्ज की गई है आह्वान जोड़ा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: CXCR4+ कक्षों और पता लगाए गए प्रतिसाद की विशिष्टता पर CXCL12 की एगोनिस्ट गतिविधि । () U87 में सीए2 + संघटन पर CXCL12 की खुराक पर निर्भर प्रभाव । CD4. CXCR4+ कक्ष । (B) माप ८४ और २४३ के बीच आधार रेखा पर अधिकतम-ंयूनतम प्रतिसाद पर आधारित एक खुराक-प्रतिसाद वक्र उत्पंन हुआ था और EC५० मान परिकलित किया गया था (n = 4, माध्य ± SD) । () U87 पर तिरस्कृत किया गया था जब CXCL12 द्वारा कोई प्रतिक्रिया प्रेरित किया गया था । CD4 कोशिकाओं कमी CXCR4. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक CXCR4 विरोधी के प्रभाव का चित्रण (AMD3100) और एक गैर सक्रिय यौगिक (maraviroc) पर CXCR4+ कोशिकाओं और CCR5 के सक्रियण द्वारा इसके अंतर्जात एगोनिस्ट, CCL5. (एक) खुराक-AMD3100 के आश्रित निरोधात्मक प्रभाव पर सीए2 + U87 के लिए ६.४ एनएम CXCL12 जोड़कर पैदा संघटन । CD4. CXCR4+ कक्ष । Maraviroc (पर 10 µ एम अंतिम एकाग्रता) CXCL12-प्रेरित Ca पर कोई निरोधात्मक प्रभाव नहीं दिखाया2 + प्रतिक्रिया । (B) माप ८४ और २४३ के बीच आधार रेखा पर अधिकतम-ंयूनतम प्रतिसाद पर आधारित, एक निरोधात्मक खुराक-प्रतिसाद वक्र जनरेट किया गया था और आईसी५० मान ७७०.८ एनएम (n = 4, माध्य ± SD) होने के लिए परिकलित किया गया था । () CCR5 के अपने अंतर्जात एगोनिस्ट, CCL5 द्वारा खुराक-निर्भर सक्रियण । () CCR5 के निषेध-मध्यस्थता Ca2 + maraviroc के १०० एनएम के साथ कोशिकाओं की पूर्व-मशीन द्वारा प्रतिक्रिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Ca2 +-जुड़ाव परख वर्णित पहले से एक महत्वपूर्ण उपकरण की पहचान करने के लिए और रिसेप्टर विरोधी लक्ष्यीकरण CXCR417को निशाना बनने के लिए दिखाया गया है । यह है, तथापि, प्रत्याशित है कि इस विधि और आम तौर पर अंय GPCRs का एक बड़ा समूह है कि ट्रिगर एक cytosolic Ca2 + उनके सक्रियकरण पर रिलीज के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में संबंधित chemokine रिसेप्टर CCR5 के लिए सचित्र । जबकि CCR5 के मामले में बिल्कुल ही प्रयोगात्मक शर्तों लागू किया जा सकता है, प्रोटोकॉल में कई कदम (उदा, चढ़ाना पर सेल संख्या, एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ कोशिकाओं की लोडिंग) को परख स्थानांतरित करने से पहले फिर से अनुकूलित की आवश्यकता होगी अंय GPCRs क्रम में एक अनुकूल संकेत करने के लिए शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए । एक महत्वपूर्ण मुद्दा यहां भी इन विट्रो सेलुलर मेजबान उच्च स्तर की अभिव्यक्ति की अनुमति के चयन में है GPCR ब्याज और कार्यात्मक युग्मन के Ca2 + मार्ग के लिए । CXCR4 के मामले में, मानव ग्लियोब्लास्टोमा U87 कोशिकाओं की वजह से चुना गया: (1) CXCR7 की अंतर्जात अभिव्यक्ति की कमी (एक संबंधित chemokine रिसेप्टर कि एगोनिस्ट के रूप में एक ही CXCR4 के लिए रह रहे हैं), (2) उनकी क्षमता जोड़ा CXCR4 सक्रियकरण करने के लिए Ca के लिए2 +-संकेतन मार्ग, (3) फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया के अनुकूल गतिशील रेंज सीए के साथ कोशिकाओं के लदान के बाद प्राप्त की2 +-संवेदनशील डाई, और (4) उनके परख प्रक्रिया में सेल अशांति को कम करने के लिए उत्कृष्ट पालन प्लेटें । इन मापदंडों के सभी के लिए प्रयोगात्मक हित के प्रत्येक उपंयास GPCR और प्रत्येक सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है ।

जब एक और GPCR के लिए एक समान परख की स्थापना, कई वैकल्पिक कदम या प्रोटोकॉल में रिएजेंट माना जा सकता है । उदाहरण के लिए, अन्य Ca2 +-संवेदी fluorophores (उदा., fluo-4, fluo-3) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए fluorophore (fluo-2) के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग किया जा सकता है । शिथिलता से पालन कोशिकाओं के मामले में, कोशिकाओं की धुलाई नहीं-धोने रंजक सेल के लिए24कम करने के लिए शुरू द्वारा छोड़ा जा सकता है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल से धुलाई कदम को छोड़कर आगे है परख प्रवाह में वृद्धि होगी । हालांकि इस परख भी CXCR4 के अंतर्जात अभिव्यक्ति दिखा कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है, उदाहरण के लिए मानव कैंसर सेल लाइनों के कई प्रकार सहित10,25, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि छुरा transfected सेल लाइनों के साथ उच्च GPCR समय के साथ स्थिर रहने वाली अभिव्यक्ति का स्तर प्राप्त किया जा सकता है । यह अधिक स्पष्ट परख माप, विश्वसनीय डेटा व्याख्या के लिए एक बड़ी खिड़की, और लंबे समय पर लगातार परख प्रदर्शन में परिणाम होगा । जब कोशिकाओं का उपयोग कर endogenously व्यक्त CXCR4 यह अधिक कठिन हो जाएगा इस परिणाम को प्राप्त करने के लिए ।

परख का एक प्रमुख दोष यह है कि यह एक प्रतिदीप्ति माप पर निर्भर करता है । इसलिए, फ्लोरोसेंट यौगिकों परख माप है, जो उंहें अविश्वसनीय डेटा व्याख्या के कारण विश्लेषण से बाहर निकालता है के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । इसके अलावा, इस Ca2 + जुड़ाव परख आदर्श एक सेलुलर स्क्रीनिंग एक एकीकृत pipetting प्रणाली है कि मानकीकृत मिश्रण और सभी में माप की थाली में यौगिकों और रिसेप्टर एगोनिस्ट के पेंशन की अनुमति देता है के साथ सुसज्जित प्रणाली का उपयोग कर प्रदर्शन किया है एक साथ कुंए । परख सकते हैं, तथापि, काइनेटिक मापन क्षमताओं के साथ अंय, कम खर्चीला प्रतिदीप्ति microplate पाठकों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यौगिकों और एगोनिस्ट के अलावा तो मैंयुअल रूप से प्रदर्शन करने की आवश्यकता होगी मल्टीचैनल पिपेट, जो हाथों में वृद्धि होगी समय पर और परख का प्रवाह कम करती है । इसके अलावा, एक काइनेटिक परख के एक निश्चित समय अंतराल के भीतर प्रतिदीप्ति माप की एक समान संख्या प्राप्त करने के रूप में कई microplate पाठकों उपाय अच्छी तरह से संकेतों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल होगा, जबकि उच्च अंत स्क्रीनिंग सिस्टम सभी कुओं उपाय साथ.

रिसेप्टर विरोधी रिसेप्टर और अंतर्जात एगोनिस्ट (CXCL12) द्वारा बाद में सक्रियण के लिए बाध्यकारी को रोकने वर्तमान में विशेष रूप से लक्षित यौगिकों की मुख्य श्रेणी के रूप में CXCR411,12. AMD3100, छोटे अणु कि Ca2 + जुड़ाव परख के प्रदर्शन को वर्णन किया गया था, CXCR4 विरोधी के सबसे प्रमुख उदाहरण में से एक है26। रिसेप्टर विरोधी के अलावा, अणुओं है कि GPCR को विनियमित अलग संकेत के रूप में अच्छी तरह से सामान्य ब्याज बढ़ा. इन अणुओं में प्रतिलोम एगोनिस्ट, साथ ही GPCR पम्म और NAMs19,20,27शामिल हैं । इस पांडुलिपि में वर्णित परख की एक दिलचस्प विशेषता यह है कि यह न केवल रिसेप्टर विरोधी की पहचान कर सकते हैं, लेकिन यह भी एगोनिस्ट और allosteric मॉडुलन । हालांकि, परख और सीमाओं के लिए कुछ मामूली रूपांतरों को ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

पम्म और NAMs रिसेप्टर साइटों को orthosteric बंधन रिसेप्टर की अंतर्जात ligand द्वारा कब्जा कर लिया साइट से स्थलाकृतिक अलग करने के लिए बाइंड । जबकि पम्म शक्ति और/या रिसेप्टर अंतर्जात ligand (ओं) की प्रभावकारिता को बढ़ाने, NAMs शक्ति और/या अंतर्जात ligand (ओं) की प्रभावकारिता को बाधित19,20. पम्म कोई आंतरिक एगोनिस्ट गतिविधि है । वे केवल तथाकथित allosteric एगोनिस्ट के विपरीत, अंतर्जात एगोनिस्ट की उपस्थिति में सक्रिय हैं । क्योंकि allosteric GPCR मॉडुलन शास्त्रीय रिसेप्टर विरोधी जब नैदानिक सेटिंग्स28,29में लागू की तुलना में कम साइड इफेक्ट पैदा होता है, वे मूल्यवान औषधीय उपकरण हैं. हमारे परख में, allosteric एगोनिस्ट तुरंत CXCR4+ कोशिकाओं के अलावा पर प्रतिदीप्ति संकेत के एक क्षणिक वृद्धि पैदा करेगा । इस संकेत के रिसेप्टर विशिष्टता तो एक ही परख के साथ एक ही यौगिक परीक्षण द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए, लेकिन CXCR4 कमी कोशिकाओं पर. जब विशेष रूप से पम्म, अंतर्जात एगोनिस्ट के एक कम एकाग्रता के लिए स्क्रीनिंग परख में इस्तेमाल किया जाना चाहिए एक फ्लोरोसेंट सीए2 + प्रतिक्रिया प्रेरित । हालांकि एगोनिस्ट की यह कम राशि एक छोटे फ्लोरोसेंट संकेत उत्पन्न करेगा, यह अतिरिक्त रिसेप्टर उत्तेजना का पता लगाने के लिए एक बड़ा विंडो छोड़ देता है. आम तौर पर, एक एगोनिस्ट चुनाव आयोग के10-ईसी रिसेप्टर उत्तेजना के30 मूल्य के लिए इसी30,31चुना जाता है । परख के पहले भाग के दौरान एक पाम के अलावा एक वृद्धि की फ्लोरोसेंट माप में परिणाम नहीं होता । हालांकि, फ्लोरोसेंट Ca2 + इसके अंतर्जात एगोनिस्ट के साथ रिसेप्टर के बाद उत्तेजना के बाद संकेत वृद्धि होगी । इसी तरह, एक NAM एगोनिस्ट अलावा से पहले फ्लोरोसेंट माप बदल नहीं करता है, लेकिन एगोनिस्ट के अलावा के बाद रिसेप्टर की प्रतिक्रिया को बाधित करता है. इसलिए, एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी और एक गुटनिरपेक्ष आंदोलन की गतिविधि प्रोफ़ाइल इसी तरह दिखेगा । वे दोनों एगोनिस्ट अलावा के बाद फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया के निषेध में परिणाम होगा । इसलिए, आगे प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए एक विरोधी और एक गुटनिरपेक्ष आंदोलन के बीच भेदभाव की आवश्यकता है । यहां, रिसेप्टर बाइंडिंग अध्ययन जिससे unलेबलित यौगिकों CXCR4 पर बाध्यकारी के लिए CXCL12 लेबल की एक निश्चित राशि के साथ प्रतिस्पर्धा17,३२ एक विरोधी है, जो रोकने के बीच भेदभाव करने के लिए एक मूल्यवान रणनीति हो सकता है लेबल रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी से एगोनिस्ट, और एक गुटनिरपेक्ष आंदोलन है कि नहीं के रूप में यह एक ही रिसेप्टर बाइंडिंग साइट का हिस्सा होगा.

Ligand स्वतंत्र (या बेसल या गठन) GPCRs की गतिविधि कई GPCRs के लिए मनाया गया है३३ हालांकि बेसल गतिविधि के स्तर पर आम तौर पर कम है जब GPCRs recombinantly27व्यक्त कर रहे हैं । बेसल GPCR गतिविधि स्वाभाविक रूप से होने वाले उत्परिवर्तनों३३ और एक बिंदु वृद्धि बेसल CXCR4 गतिविधि के लिए अग्रणी उत्परिवर्तन द्वारा बढ़ाया जा सकता है पहले३४वर्णित किया गया है । युग्मन द्वारा इस constitutively सक्रिय CXCR4 उत्परिवर्ती खमीर में फेरोमोन प्रतिक्रिया मार्ग के लिए और [३५S] द्वारा बाध्यकारी प्रयोगों GTPγS, यह दिखाया गया है कि T140, एक पेप्टाइड-शक्तिशाली विरोधी के साथ CXCR4 प्रतिपक्षी-एचआईवी गतिविधि17,३५ काफी इस बेसल गतिविधि में कमी आई और इस प्रकार एक व्युत्क्रम एगोनिस्ट३४के रूप में व्यवहार करने के लिए दिखाया गया था । नोट की, एक फ्रा-2 में प्रतिदीप्ति-ca आधारित2 + संघटन परख एक ही लेखक ca में एक छोटी सी क्षणिक कमी मनाया2 +-संबंधित प्रतिदीप्ति T140 के अलावा कोशिकाओं को उत्परिवर्ती CXCR4 व्यक्त करने के लिए निंनलिखित, बेसल की कमी का सुझाव रिसेप्टर गतिविधि३४। हालांकि, जब चक्रीय pentapeptide के एक अतिरिक्त पैनल का विश्लेषण-आधारित CXCR4 व्युत्क्रम T140 से डिजाइन एगोनिस्ट, एक Ca के साथ कम बेसल गतिविधि का पता लगाने2 + जुड़ाव परख कम था सरल३६। जब जंगली प्रकार CXCR4 व्यक्त कोशिकाओं पर T140 के प्रभाव के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित Ca2 + जुड़ाव परख का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था, बेसल प्रतिदीप्ति संकेत में कोई परिवर्तन17मनाया गया । इसके अलावा, प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव तेजी से और क्षणिक और बेसल Ca2 + में बढ़ जाती हैं, उदाहरण के लिए, constitutively सक्रिय जीαq-युग्मित रिसेप्टर्स4व्यक्त कोशिकाओं में नहीं मनाया जाता है । एक साथ लिया, व्युत्क्रम एगोनिस्ट के प्रभाव बहुत मुश्किल होगा, यदि असंभव को पहचानने और हमारे परख के साथ मज़बूती से मूल्यांकन नहीं है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एरिक Fonteyn और गीर्ट Schoofs शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस काम को कू Leuven ने सपोर्ट किया है (ग्रांट नं. PF/10/018), शौकीनों voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, अनुदान सं. छ. 485.08), और सप्रेम Dormeur Vaduz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-2 AM Abcam ab142775 fluorescent Ca2+ sensitive dye
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G pluronic acid
Gelatin Sigma G9391
AMD3100 Sigma A5602-5 mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc kind gift of AnorMed antiretroviral drug, CCR5 antagonist
Chemokine ligand CXCL12 PeproTech 300-28A
Chemokine ligand CCL5 PeproTech 300-06
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco (Life Technologies) 41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1 M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red Gibco (Life Technologies) 25200-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Falcon tubes, 50 mL Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid Costar/Fisher Scientific 10530753 assay plate (96-well), for cell seeding
Polypropylene (PP) plates Thermo Scientific (VWR) 732-2661 plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system Molecular Devices Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm Molecular Devices 0200-6128 Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm Molecular Devices 0200-6203 emission filter compatible with the fluorescent dye
FLIPR Tetra 96 Head Molecular Devices 0310-4536 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader
ScreenWorks Molecular Devices software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra
Vi-CELL Beckman Coulter cell viability analyzer
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile Corning 3340 Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.

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References

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