Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

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Summary

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.

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Claes, S., D'huys, T., Van Hout, A., Schols, D., Van Loy, T. A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators. J. Vis. Exp. (132), e56780, doi:10.3791/56780 (2018).

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Abstract

Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son de gran importancia para la industria farmacéutica ya que están implicados en muchas enfermedades humanas e incluyen objetivos bien validados para la intervención terapéutica. Descubrimiento de compuestos de plomo, incluyendo pequeñas moléculas sintéticas, que inhiben específicamente la función del receptor, es un paso inicial importante en el desarrollo de fármacos y se basa en ensayos de la célula sensibles, específicos y sólidos. Aquí, describimos un análisis celular cinético con una lectura fluorescente diseñada principalmente para identificar los antagonistas específicos de receptores que inhiben la Ca2 + liberación intracelular evocada la activación de los receptores de quimiocina CXC 4 (CXCR4) por su ligando endógeno, el ligando de quimiocina CXC 12 (CXCL12). Una ventaja clave de este método es que además, permite la detección de compuestos con propiedades agonistas intrínsecas (es decir, compuestos que un aumento de Ca2 + concentración intracelular en la ausencia de CXCL12) o compuestos modulación de la función del receptor vía la interacción con sitios de Unión alostérica (es decir, moduladores alostéricos positivos y negativos (PAMs y NAMs, respectivamente)). En el lado de abajo, autofluorescent compuestos interfieren con la lectura del ensayo, así dificultando la interpretación de datos confiable. Más probable es que este análisis pueden aplicarse, con adaptaciones mínimas, como un ensayo de descubrimiento de medicamentos genéricos para muchos otros GPCRs que la activación conduce a una liberación de Ca intracelular2 +.

Introduction

GPCRs son una superfamilia importante de proteínas de la superficie celular que activan cascadas de transducción de la señal al ligando extracelular. Pueden activarse por una gran variedad de estímulos incluyendo péptidos, hormonas proteicas, aminas biógenas y lípidos, que da lugar a la iniciación de diversas vías de señalización intracelular y respuestas biológicas eventualmente1,2 . Además, GPCRs participan en muchos, si no todos, los procesos fisiológicos y de desarrollo y muchas enfermedades humanas están asociadas con sobreexpresión de señalización o receptores GPCR disfuncional. GPCRs son por lo tanto entre los objetivos farmacológicos validados más en medicina1,3.

Por lo general, un flujo de trabajo de descubrimiento de drogas GPCR comienza con ensayos de proyección celular que permite la identificación de compuestos como moléculas pequeñas, anticuerpos monoclonales, péptidos que pueden modular la actividad de un particular GPCR. En el descubrimiento de la droga GPCR existen diferentes tipos de ensayos para buscar dichos compuestos, la mayoría de los cuales es compatible con campañas de proyección de rendimiento medio a alto. Los ensayos más usados incluyen experimentos de unión del receptor, fluorescencia o luminiscencia basado en análisis de detección de fluctuaciones en el nivel de supuestos mensajeros secundarios (p. ej., Ca2 +, monofosfato de adenosina cíclico (AMP)) fenotípicas ensayos de selección y reclutamiento de β-arrestin ensayos de4. La elección de un tipo particular de análisis puede depender de múltiples factores, pero también está determinada por el conocimiento previo de las propiedades de la señalización de un GPCR dado. Agonista a un GPCR induce un cambio conformacional que catalizan el intercambio de difosfato de guanidina (PIB) para el trifosfato de guanidina (GTP) en la subunidad α de las proteínas heterotriméricas G. Posteriormente la subunidad Gα-GTP se disocia de la subunidadβγ de G y ambas subunidades iniciará otras vías de señalización. Hidrólisis de la molécula de GTP y posterior re-Asociación de laαde la G / PIB y Gβγ subunidades restaurará la proteína G en su conformación inactiva5,6. Basado en la semejanza de la secuencia de la subunidadα G se definen diferentes tipos de proteínas G (GsGGq, G12/13)7. Señalización mediante elα de la G subunidad da lugar a varias respuestas típicas tales como el aumento (a través de Gs) o disminuir (via G) de la producción de AMP cíclico y Ca2 + movilización intracelular (via Gq)5 ,7. Gβγ subunidades también son capaces de inducir las vías efectoras intracelulares. Por ejemplo, en la activación de la G-GPCRs juntados, Gβγ pueden estimular directamente la fosfolipasa C (PLC-β) para producir trifosfato de inositol (IP3) que desencadena la liberación de Ca2 + intracelular tiendas7 . Tras la activación del receptor, GPCRs son fosforilados por las kinasas GPCR (GRKs) que promueve la interacción con β-arrestins. Este proceso termina G proteína de señalización y conduce a la internalización y la desensibilización del receptor. Β-arrestins también son capaces de formar complejos moleculares múltiples que pueden desencadenar otras vías de señalización independientes de la proteína G señalización8.

Dentro de la subfamilia de receptores del chemokine, la G-CXCR4 acoplado es un GPCR que ha levantado mucho interés como un prometedor objetivo de descubrimiento de fármacos. Dado su papel establecido como un co-receptor importante para virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) entrada viral e infección, compuestos dirigidos a CXCR4 se desarrollaron inicialmente como de los candidatos de drogas anti-VIH9. Más recientemente, un creciente cuerpo de evidencia ha señalado a un papel importante para CXCR4 en tumorigenesis y cáncer metástasis convirtiéndolo en un objetivo terapéutico validado en oncología, así10. CXCR4 es altamente expresada en más de veinte tipos de cáncer en humanos y controles tumor celular supervivencia, proliferación y migración así como angiogénesis tumorales10. Antagonistas CXCR4 de diferentes clases químicas previamente han sido descritas11,12, pero sólo la molécula pequeña que AMD3100 es actualmente aprobado para su uso en la clínica como un agente de movilización de células madre utilizado durante el tratamiento del linfoma y mieloma pacientes13,14. Los ensayos clínicos están en curso para evaluar la seguridad y la eficacia de varios otros antagonistas CXCR4 en diferentes enfermedades humanas, pero con un fuerte enfoque en oncología12. Habida cuenta de las muchas aplicaciones posibles para los antagonistas CXCR4, se justifica la búsqueda de nuevos compuestos con propiedades farmacocinéticas mejoradas, mejor biodisponibilidad o potencialmente menos efectos secundarios.

Aquí, un análisis cinético de celular basado en fluorescencia se utiliza principalmente para pantalla de compuestos capaces de inhibir la CXCR4 se describe. La medición fluorescente de este método se basa en el transitorio aumento de la Ca2 + concentración intracelular evocado en la activación de CXCR4 por su agonista endógeno, el ligando de la QUIMIOCINA CXCL12 (anteriormente conocido como células estromales derivan factor 1α ( SDF1-α)) y la potencial inhibición de esta CXCL12-inducida de Ca2 + respuesta de compuestos particulares. En este ensayo, se utilizan células de glioblastoma humano U87 estable expresando el receptor CXCR4 humano. Al mismo tiempo, estas células carecen de expresión endógena de CXCR7, un receptor de chemokine relacionados que también une CXCL1215,16,17. CXCR7 ha también ha demostrado previamente para ser capaces de formar heterodímeros con CXCR4, tal modo modulando las señalización características de este último receptor18. Fluctuaciones en el nivel intracelular Ca2 + mediada por CXCR4 son monitoreadas por la carga de la CXCR4+ células con éster de fluo-2 acetoxymethyl (AM), una afinidad alta permeable a la célula fluorescente Ca2 +-enlace colorante. Fluo-2 AM es una molécula fluorescente de longitud de onda única que puede ser excitada a 490 nm mientras que la fluorescencia de emisión se mide a 520 nm. Esta fluorescencia de emisión aumenta al Ca2 + enlace, con un amplio rango dinámico entre el Ca2 +-atado y desatado el estado. El aumento de la señal fluorescente es transitorio, que ocurre dentro de un intervalo de tiempo de unos pocos minutos y luego decaerá. La altura de la emisión fluorescente más correlaciona con el nivel de activación del receptor. El ensayo sí mismo se realiza mediante un lector de microplacas de fluorescencia equipado con una cámara CCD intensificado (ICCD) que posee un sistema de pipeteado integrado que permite la estandarización de los pasos de pipeteo en el análisis (véase Tabla de materiales) . Además, la medida simultánea de la señal fluorescente en todos los pocillos de una microplaca es otra ventaja clave del lector de fluorescencia que se utiliza. Durante la primera parte del análisis de los compuestos en investigación (por ejemplo, un grupo de pequeñas moléculas a una concentración fija o en una serie de diluciones) se agregan a la fluo-2 AM cargado CXCR4+ U87 células seguida de un ~ 10 minutos de incubación durante el cual el potencial efecto agonístico de los compuestos se mide continuamente en tiempo real. Entonces, el agonista endógeno (es decir, CXCL12) se agrega a las células para evocar un aumento transitorio en el nivel de Ca intracelular2 +CXCR4-mediated. Durante esta parte del análisis se puede evaluar la potencial actividad antagonista de los compuestos probados. Una descripción esquemática de flujo de trabajo general del ensayo se presenta en la figura 1.

Aunque este ensayo movilización de Ca2 + se ha utilizado principalmente para identificar y determinar la potencia inhibitoria de competencia antagonistas CXCR4 (es decir, compuestos que impiden que el agonista endógeno para enlazar y estimular el receptor), también puede identificar agonistas del receptor y, además, compuestos que ejercen su función uniéndose a sitios alostéricos (es decir, sitios que topográficamente el sitio de unión de orthosteric ocupado por el agonista endógeno). Ejemplos de esta última categoría de compuestos son agonistas alostéricos y PAMs y NAMs19,20. Mientras que los antagonistas específicos del receptor así como NAMs inhibiría la respuesta de CXCL12-inducida de Ca2 + , PAMs mejoraría esta respuesta ( véase también sección). Aunque el ensayo descritos específicamente objetivos CXCR4, se prevé que este método puede ser aplicado a otros GPCRs con esfuerzo mínimo de optimización, por lo menos si la señal a través de la liberación de Ca intracelular2 +.

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Protocol

Nota: Todos los pasos descritos en las secciones 1 y 2 se llevan a cabo en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar.

1. mantenimiento de U87. Células CD4.hCXCR4

  1. Crecen las células en T75 frascos de cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
    Nota: La línea de célula en vitro utilizada en este protocolo es una línea de células de glioblastoma U87 estable expresar el cúmulo de diferenciación 4 (CD4) y humanos CXCR4 y ha sido descrito previamente17. Expresión superficial de la célula CD4 y CXCR4 es continuamente supervisada por citometría de flujo y niveles de expresión se mantienen constantes en el tiempo (~ 100% CD4+ y ~ 100% CXCR4+ células). Una descripción detallada de la generación de la línea celular utilizada y el procedimiento de citometría de flujo para investigar los niveles de expresión del receptor no está dentro del alcance del presente Protocolo.
    1. Células de subcultura en el 80-85% de confluencia. Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente (RT) antes de cultivo celular.
    2. Retire el medio de cultivo condicionado de las células y lavar la monocapa de células una vez con solución fisiológica 5 mL tamponada fosfato (PBS).
    3. Añadir 3 mL de 0.25% tripsina-EDTA y distribuirlo uniformemente sobre la monocapa celular. Luego retirar el exceso de tripsina-EDTA e incubar hasta 5 min a 37 ° C hasta que las células comienzan a separar.
    4. Añadir 10 mL de medio fresco crecimiento completo (de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) + 10% suero bovino Fetal (FBS) + 0.01 M HEPES + agentes de selección adecuada). Resuspender las células transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Transferir la suspensión de células a un tubo estéril 50 mL.
    5. Contar el número de células viables usando un método de elección. En el caso de las células de glioblastoma U87, viabilidad generalmente alcanza ~ 100%.
      Nota: Número de células puede determinarse de varias maneras. Habitualmente utilizamos un sistema de análisis automatizado de la célula basado en trypan azul tinción (véase Tabla de materiales) según su nivel de manejo de procedimientos, pero otras maneras debería funcionar igualmente bien.
    6. Añadir 2 x 106 o 3 x 106 células (viables) a un volumen final de medio de cultivo fresco de 25 mL en un matraz de cultivo T75 e incubar a 37 ° C y 5% CO2.
      Nota: Si se utilizan 3 x 106 células las células llega a confluencia de 80-90% después de 2 días. Si se utilizan 2 x 106 células, alcanzan la misma confluencia después de 3 días. La tasa de crecimiento de las células debe primero determinarse empíricamente si se utilizan otras líneas celulares.

2. siembra de las células para el análisis de Ca2 + movilización

  1. En el día de pases (día 0), capa negra pared Poliestireno placas de 96 pocillos con el claro de la célula inferior (véase Tabla de materiales) con una solución al 0.1% gelatina para facilitar la fijación de la célula.
    Nota: Revestimiento de las placas de 96 pocillos con gelatina puede omitirse si se utilizan placas prelacadas, que están disponible comercialmente (véase Tabla de materiales). Se recomienda evaluar el uso de placas pre-cubiertas en lugar de capa manual para cada línea celular bajo investigación antes de continuar con el protocolo.
    1. Preparar solución de gelatina agregando 1 g de gelatina en 100 mL de PBS para obtener una solución al 1%. Diluir 10 veces con PBS antes de cualquier uso. Para mejorar la solubilidad de la gelatina, calentar la solución a 37 ° C.
    2. Añada 100 μl de solución al 0.1% gelatina por pocillo de la placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar por 2 h a TA.
  2. Mientras tanto, preparar las células para la siembra en la placa de 96 pocillos recubierta.
    1. Separar las células del frasco de cultivo, resuspender en medio de cultivo fresco y contar con tinción azul de trypan.
    2. Desactivación de las células en un tubo de 50 mL por 5 min a 400 x g a TA.
    3. Resuspender las células en el medio de cultivo fresco (DMEM 10% FBS + 1% HEPES, sin antibióticos) para obtener una densidad celular de 0.1 x 106 células/mL (viable).
  3. Retire la solución de gelatina de las placas de pared negro con fondo claro por los bancos sobre la placa y secarla en un tejido. Agregar 200 μL/pocillo de PBS para eliminar exceso gelatina y voltee la placa otra vez.
  4. Dispensar 200 μL de la suspensión celular (correspondiente a 0.2 x 105 células) por pocillo de la placa de 96 pocillos recubiertos de gelatina (a partir de ahora uno esta placa hará más referencia a como la "placa de medición").
  5. Incube la placa durante la noche a 37 ° C y 5% CO2.

3. carga de las células con un fluorescente de la Ca2 + -tinte sensible

  1. En el día 1 realizar el real Ca2 + movilización análisis, comenzando con la carga de las células sembradas con el fluorescente Ca2 +-enlace colorante fluo-2 AM.
    1. Tampón de ensayo se preparan mediante la adición de 40 mL HEPES (1 M) para equilibrada solución de 200 mL Hank de sal (HBSS, 10 x, sin rojo de fenol, sin bicarbonato de sodio). Añadir agua ultrapura para obtener un volumen final de 2 L y agregar 4 g de albúmina de suero bovino (BSA). Disolver la BSA mediante agitación magnética. Ajustar el pH a 7.4 (con NaOH) y filtrar la solución.
      Nota: Durante todos los pasos siguientes se utiliza el mismo buffer, conocido como "tampón de ensayo".
    2. Preparar una solución stock (4 mM en dimetil sulfóxido (DMSO)) de la fluorescente Ca2 +-sensible colorante fluo-2 AM. Evite la exposición excesiva a la luz. Disolver 1 mg fluo-2 AM (peso molecular: 1.061 g/mol) en 235.6 de μl DMSO.
    3. Preparar una solución de trabajo de fluo-2 AM. Para una placa de 96 pocillos de ensayo mezclar 12,5 μl de la solución madre de fluo-2 AM (4 mM) y solución de poliol (p. ej., f-127 de pluronic) de surfactante no iónico de μl 12.5 (20% peso/volumen en DMSO, véase Tabla de materiales). Añadir 22 μL de esta mezcla a 11 mL de tampón de ensayo en un tubo de 15 mL. La concentración final de fluo-2 AM es el μm 4.
      Nota: El surfactante no iónico se utiliza como agente de dispersión para mejorar la solubilidad acuosa de fluo-2 AM y, en consecuencia, para mejorar la carga de la célula. Para solubilizar el surfactante en DMSO, calentar la muestra a 37 ° C y la mezcla con regularidad para obtener una solución homogénea.
    4. Retire el medio de crecimiento de las células previamente sembradas en la placa de 96 pocillos medida por los bancos sobre la placa y secarla sobre papel absorbente.
    5. Añada 100 μl de solución de tinte por pozo con una pipeta multicanal de carga e incubar durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad.

4. preparación de polipropileno de 96 pocillos platos que contiene el ligando de la QUIMIOCINA CXCL12 o los compuestos en investigación

  1. Obtener placas de 96 pocillos fondo redondo polipropileno (PP) (véase Tabla de materiales).
    1. Permite la solución de CXCL12 (1 mg/mL) y la solución de los compuestos investigados se equilibren a TA.
      Nota: Se prepara la solución madre de CXCL12 en agua ultrapura suplementado con 0.01% Tween20 y se almacenó a-20 ° C como partes alícuotas de un solo uso.
    2. Preparar un 5 x solución concentrada de CXCL12 en tampon de ensayo (250 ng/mL que equivale a 31.25 nM) y un 5 x dilución concentrada de cada compuesto (en tampon de ensayo).
    3. Dispensar las soluciones en la placa de 96 pocillos apropiada según un diseño de placa predefinida. Distribuir 75 μL/pocillo de la placa que contiene CXCL12 (la "placa de chemokine"), dispensar 50 μL/pocillo de la placa que contiene los compuestos (la "placa compuesto").
      Nota: Ambos compuestos y CXCL12 llegará a ser finalmente diluyen 5 x sobre la dispensación en la placa de medición. También es importante incluir pozos de control negativo que contiene sólo tampón de ensayo en la placa compuesta, así como la placa del chemokine. También pozos de control positivo deben incluirse (es decir, pozos con CXCL12 en la placa de chemokine, pero con tampón de ensayo en los pocillos correspondientes de la placa compuesta).

5. el protocolo configuración en el lector de microplacas de fluorescencia

Nota: El lector de microplacas de fluorescencia utilizado en este protocolo se denomina en la Tabla de materiales.

  1. Encienda la unidad del lector de la placa de fluorescencia primero y luego en el lector de fluorescencia propia. Permiten iniciar por unos minutos y abra el software del sistema.
  2. Crear el protocolo del ensayo utilizando el menú de drag-and-drop que incluye los siguientes pasos:
    1. En el cuadro de "Configuración", seleccione 'Read_Mode' con longitud de onda de excitación: 470-495 nM; longitud de onda emisión: 515 575 nM.
      Nota: Las longitudes de onda seleccionadas son apropiados para su uso con el Ca2 +-tinte sensible fluo2.
    2. Incluyen la caja de "Mezcla con TF" (transferencia de líquido) para la mezcla automática de los compuestos en la placa compuesta, que se pondrá en la posición de la fuente 2 del dispositivo (ver paso 6.4). Seleccione 15 μl de la solución en cada pocillo se aspira automáticamente y mezclado tres veces. Ajuste la altura de las puntas de pipetas en 20 μl por debajo de la superficie del líquido. Ajustar la velocidad de aspiración y dispensación a 50 μl/s.
      Nota: La altura de las puntas de la pipeta se refiere al volumen que queda por debajo de las puntas de pipetas. Por ejemplo, si los pozos de una placa compuesta contienen 50 μL, 30 μl de altura corresponde a 20 μl por debajo de la superficie del líquido. El volumen de solución compuesta a la mezcla, la velocidad de la mezcla, la posición de la pipeta consejos durante la mezcla, y el número de ciclos de mezcla se puede ajustar usando el software.
    3. En el cuadro de 'Transferencia de fluido', definir que 20 μl de cada pocillo de la placa compuesta se transferirá en la placa de medición. Coloque las puntas de pipetas en 20 μl a continuación el líquido de la superficie , es decir, en altura 30 μL durante la aspiración de los compuestos y en altura 60 μL durante la distribución de la placa de medición. Establecer la velocidad de aspiración a 50 μl/s y la velocidad de suministro a 25 μl/s.
      Nota: La placa compuesta contiene 50 μl de solución por pozo (ver paso 4.1.3), una altura de 30 μL corresponde así a una posición 20 μl por debajo de la superficie del líquido. La placa de medición contiene 80 μl de tampón de ensayo por pozo (ver paso 6.3), por lo tanto una altura de 60 μL corresponde a una posición similar de los consejos.
    4. Seleccione el botón de "Leer con TF". Durante el primer intervalo, seleccione 60 Lee (medidas fluorescentes) con un tiempo de intervalo de lectura de 1 s. definir que 10 lecturas se graban antes de dispensar de los compuestos en la placa de medición, y 50 Lee luego. Definir el intervalo de segunda con un tiempo de leer intervalo de 30 s y 18 Lee.
      Nota: Durante este paso la fluorescencia se medirá cinéticamente (en los intervalos de tiempo definido) para ~ 10 min en total.
    5. Incluir el botón de "Trucos de lavado" en el protocolo de tres veces. Dentro de cada paso de lavado, seleccione el tipo de fluido: líquido (agua ultrapura) o fluido B (etanol al 70%), el número de ciclos de lavado (1), la bomba de velocidad (rápido), y el número de trazos (5) durante cada paso de lavado.
      Nota: Durante el primer y último lavado paso A líquido se utiliza, durante el segundo fluido paso de lavado que b se utiliza.
    6. Incluyen la función "Pausa pipeta". Establecer la pipeta para hacer una pausa para 300 s.
      Nota: Al incluir este paso en el protocolo, la cabeza de la pipeta, que está integrada en el dispositivo de lector de la placa de fluorescencia, hará una pausa durante 5 minutos antes de continuar con el protocolo.
    7. Incluyen la caja de "Mezcla con TF" para permitir la mezcla automática de la solución de CXCL12 en la placa de quimioquinas, que se colocará en la posición de la fuente 3 del dispositivo (ver paso 6.4). Seleccione 15 μl de la solución en cada pocillo se aspira automáticamente y mezclado tres veces. Durante la aspiración y la mezcla, coloque la pipeta puntas de 20 μl por debajo de la superficie del líquido. La velocidad de aspiración y dispensación está fijada en 50 μl/s.
      Nota: Similar en cuanto a paso 5.2.2, estos parámetros pueden ajustarse.
    8. En el cuadro de 'Transferencia de fluido' posterior, definir que 25 μl de cada una de la quimiocina se transferirá la placa en la placa de medición. Posición de puntas de 20 μl a continuación el líquido de la superficie , es decir, en altura 55 μl durante la aspiración de la placa de chemokine que contiene 75 μL/pocillo (ver paso 4.1.3) y en altura 80 μl durante la distribución de la placa de medición. Establecer la velocidad de aspiración a 50 μl/s y la velocidad de suministro a 25 μl/s.
    9. Incluir el botón de "Leer con TF". Durante el primer intervalo, seleccione 145 lecturas con un intervalo leer de 1 s. definir que 5 Lee se graban antes de dispensar CXCL12 en la placa de medición, y 140 Lee luego. Definir el intervalo de segunda con un tiempo de intervalo de lectura de 6 s y seleccione 20 Lee.
      Nota: Tomados en conjunto, todo el conjunto del Protocolo se registran 243 Lee (medidas fluorescentes): 78 a paso 5.2.4 y 165 durante paso 5.2.9.
    10. Similar al paso 5.2.5, incluir el botón de "Consejos de lavado" tres veces en el protocolo.
      Nota: Incluye este paso en el final del protocolo permite que los consejos podrán reutilizarse para llevar a cabo un ensayo sin necesidad de cambiar las puntas.
  3. Ajustar la temperatura del dispositivo a 37 ° C haciendo clic en el botón de "Temperatura de etapa" y seleccionar a 37 ° C.

6. ejecuta el ensayo de fluorescencia

  1. Después de la medición placa ha incubada con buffer para 45 minutos de carga (ver paso 3.1.5), eliminar el buffer por los bancos sobre la placa y secarla en un tejido.
  2. Lavar las células sembradas por agregar 150 μL/pocillo del tampón de ensayo e incúbelos durante 2 minutos.
  3. Eliminar el buffer nuevamente poniendo sobre la placa. Añadir 80 μL/pocillo del tampón de ensayo con una pipeta multicanal.
  4. Poner las placas en el dispositivo en su posición adecuada: la placa compuesta en la posición de la fuente 2, la placa del chemokine en la posición de la fuente 3 y la placa de medición en la posición de lectura. Poner una caja de puntas negras en la posición de puntas de la fuente 1. Cierre puerta el dispositivo de la e incube durante 5 minutos antes de continuar con el protocolo.
  5. Seleccione el botón de "Prueba de la señal de protocolo" para determinar las unidades de luz relativas antecedentes (RLUs) y variación de fluorescencia sobre la placa. Se abrirá una nueva ventana. Seleccione "Señal de prueba".
    Nota: Durante este paso, fondo RLUs están determinadas por la cámara ICCD, que está integrada en el compartimiento de la óptica del dispositivo lector de fluorescencia. Estos RLUs resultan de la excitación de la Ca2 +-tinte sensible (fluo-2) por emisión de diodos (LED) de luz (LED de salida de longitud de onda de 470-495 nm). Valores de 8.000-10.000 RLUs son muy adecuados para esta aplicación. RLUs, si es necesario, se puede adaptar cambiando la intensidad de excitación (seleccione exc. intensidad), o la puerta de la cámara (seleccionar puerta abierta). La varianza sobre la placa debe ser idealmente menos de 7,5%.
  6. Seleccione "Actualizar" si se obtienen valores de fondo de 8.000-10.000 RLUs. Guardar el protocolo principal haciendo clic en el botón Guardar.
    Nota: Al hacerlo, la configuración de la prueba de la señal de protocolo se llevará el protocolo principal.
  7. Ejecutar el ensayo pulsando el botón "Ejecutar".

7. calidad y análisis de datos

  1. Cuando el análisis haya terminado, abra el cuadro de "Análisis" en software del sistema.
    1. Ir a "configurar correcciones" y elija "respuesta sobre línea de base". Definir línea base 1 para iniciar la medición 1 y terminan en medida 5; la fluorescencia media se calculará en cada pozo entre medición 1 y 5.
      Nota: Todas las mediciones de más de un determinado bien se dividen por esta línea de base bien específicas 1.
      1. Definir línea base 2 para comenzar a medida 78 hasta medición 83 (CXCL12 es despachado después de medición 83; otra vez la fluorescencia media se calcula en cada bien entre factor de medida 78 y 83 y esta corrección se aplica a todas las medidas siguientes medida 83).
    2. Activar la casilla "Mostrar porcentaje" y "quitar fondo".
    3. Ir a "Configurar reducción cinética". Para evaluar el efecto inhibitorio de compuestos sobre la respuesta de CXCL12-inducida de Ca2 + , elija Max-Min a partir de la medición 84 (es decir, la primera medida después de que haya salido CXCL12) a 243 (es decir, la medición final).
      Nota: Eligiendo Max-Min la diferencia entre la respuesta máxima y mínima sobre línea de base entre medición y medición 84 243 se divulga. Si Max-Min es elegido a partir entre medida 11 y la medida 78, se informa la diferencia entre la respuesta máxima y mínima sobre línea de fondo en relación con la línea de base 1. Este valor puede ser utilizado para analizar la potencial actividad agonística de los compuestos, ver discusión).
    4. Los datos se visualizan en software del sistema. Si es necesario, exportar los datos en bruto para análisis adicionales y visualización en otros paquetes de software de análisis comunes.

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Representative Results

El efecto de la estimulación de CXCL12 en el intracelular Ca2 + movilización en U87. CD4.CXCR4+ y U87. Las células CD4 se evaluó con el ensayo de Ca2 + movilización. En lugar de 20 μl de la sustancia de ensayo que normalmente se habrían agregado durante el primer paso de pipeteado del Protocolo (figura 1), tampón de ensayo se añadió a la fluo-2 AM cargado U87. CD4.CXCR4+ las células de la placa de medición. Durante el segundo paso de dosificación, concentraciones de CXCL12 (102,4 0,2 nM, concentración final) se distribuye en la placa de medición. Está demostrado un aumento dependiente de la dosis en la fluorescencia, la correlación con un aumento dosis dependiente de la liberación de Ca2 +, (figura 2A). Aquí, la muestra control negativo representa los pozos en que en ambas adiciones sólo tampón de ensayo se agregó a la placa de medición (es decir, 0 nM CXCL12), resultando en la ausencia de una respuesta (figura 2A). Crecientes cantidades de CXCL12 inducen el aumento de los niveles de fluorescencia que decae con el tiempo (figura 2A). De estos datos, se generó una curva de respuesta de dosis basados en la "respuesta de Max-Min sobre la línea de base" entre la medida 84 (es decir, la primera medida después de la adición de CXCL12) y medida 243 (es decir., la medida final en el protocolo ). Mediante regresión no lineal, el valor de CE50 (es decir, la concentración necesaria para evocar la respuesta máxima media) se determinó y corresponde a 1.14 nM (figura 2B). No fluorescente Ca2 +-relacionados con la respuesta fue evocada por CXCL12, incluso a alta concentración (102,4 nM), cuando U87. Falta de expresión de CXCR4 funcional de células CD4 fueron utilizadas. Esto demuestra la especificidad del receptor de la medición por CXCL12 (figura 2).

Una clave de aplicación para este celular es la identificación de pequeñas moléculas dirigidas específicamente a CXCR4 y capaz de inhibir la movilización de CXCL12-inducida de Ca2 + . Si se identifican compuestos activos ("hits"), puede ser caracterizados más por diluciones seriadas del compuesto de prueba y análisis de la potencia inhibitoria más detalladamente. Por ejemplo, el efecto de la bicyclam AMD3100, un antagonista de receptores de CXCR4-específica de molécula pequeña bien establecida con potente actividad anti-VIH-1 de21,22, se ilustra en la figura 3. Una serie de concentración de AMD3100 (n = 4, 3 μm hasta 1.37 concentración final nM en una serie de diluciones de 1/3) se dispensó el U87. CD4.CXCR4+ las células durante el primer paso del protocolo. El compuesto entonces se permitió a incubar a las células para ~ 10 minutos durante el cual la señal de fluorescencia se registró continuamente. Entonces 6,4 nM de CXCL12 (50 ng/mL, concentración final) fue agregado en todos los pocillos de la placa celular simultáneamente para inducir la movilización de CXCR4-mediated Ca2 + . Inhibición dependiente de la dosis de esta respuesta de las diferentes diluciones de AMD3100 se muestra en la Figura 3A. En este caso, se muestra sólo la parte del gráfico después de adición de CXCL12. Como un buffer de control negativo (línea azul) solo se aplicó en el análisis (sin preincubación con AMD3100, no CXCL12 añadida a los pocillos), dando por resultado la esperada falta de respuesta. El control positivo (línea roja) corresponde a las muestras en que 6.4 nM CXCL12 fue agregado a los pozos sin incubación previa de AMD3100 (Figura 3A). Basado en estos definidos positivos y negativos controla el Z' valor en este ensayo es normalmente entre 0,5 y 1. Para determinar la potencia inhibitoria de una curva dosis-respuesta se generó por regresión no lineal, resultando en un valor de50 IC calculado de 770.8 AMD3100 nM (figura 3B). Para ilustrar aún más el comportamiento de un compuesto inactivo, maraviroc se incluyó en este experimento. Maraviroc es una pequeña molécula que inhibe específicamente los receptores de quimiocina CC 5 (CCR5) bloqueando así (CCR5)-trópico HIV-1 infección23 . Incluso a alta concentración (concentración final de 10 μm) ningún efecto inhibitorio de este compuesto se observó en la respuesta de CXCR4-mediated Ca2 + (Figura 3A).

Por último, para demostrar que este ensayo movilización de Ca2 + se puede aplicar también para estudiar otros GPCRs, una dilución seriada del ligand de quimiocina CC 5 (CCL5), el ligando endógeno para el CCR5, se añadió a las células que expresan CCR5 (U87. CD4.CCR5+) usando exactamente las mismas condiciones experimentales y configuración de hardware. Dependiente de la dosis fluorescentes Ca2 + respuesta se demuestra después de la adición de una dilución seriada de CCL5 (figura 3). Además y en contraste con su efecto sobre el CXCR4, previa incubación con 100 nM (concentración final) de maraviroc fuertemente había inhibida esta respuesta (figura 3D).

Figure 1
Figura 1: Descripción esquemática del flujo del ensayo de. En las células del día 0 expresando el GPCR de interés (en este caso CXCR4) se siembran en negro de paredes de placas de 96 pocillos con fondo claro y crecen durante la noche a 37 ° C y 5% CO2. En el día 1 el Ca2 + ensayo basado en la fluorescencia se realiza. Las células se cargan primero con un fluorescente Ca2 +-tinte sensible (fluo-2 AM) y se incuba durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Preparan una "placa de chemokine" y "placa compuesta" (PP = polipropileno). Después de la incubación con tinte de carga células sembradas se lavan una vez con tampón de ensayo (150 μL/pocillo) después de lo cual se agrega 80 μL/pocillo del tampón de ensayo. Todas las placas se incuban luego por 5 min en el dispositivo a 37 ° C antes de comenzar el ensayo. Entonces, compuestos de interés (por ejemplo, moléculas pequeñas) son dispensados a la concentración deseada en los pocillos de la placa de medición y permite incubar ~ 10 min mientras que la fluorescencia se mide continuamente. A continuación, se agrega una concentración fija del agonista endógeno de lo GPCR (CXCL12 aquí) para evocar el comunicado de Ca2 + y fluorescencia se registra más en el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Actividad agonista de CXCL12 en CXCR4+ las células y la especificidad de la respuesta detectada. (A) el efecto dependiente de la dosis de CXCL12 en la Ca2 + movilización en U87. Células CD4.CXCR4+ . (B) basados en la respuesta de Max-Min sobre la línea de base entre la medida 84 y 243 se generó una curva de dosis-respuesta y el valor de CE50 calculadas (n = 4, media ± SD). (C) ninguna respuesta fue inducida por CXCL12 cuando fue despachado el U87. Células CD4 falta CXCR4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ilustración del efecto de un antagonista de CXCR4 (AMD3100) y un compuesto inactivo (maraviroc) en CXCR4+ las células y la activación de CCR5 por su agonista endógeno, CCL5. (A) dependiente de la dosis efecto inhibitorio de AMD3100 sobre la Ca2 + movilización evocada mediante la adición de 6,4 nM CXCL12 y U87. Células CD4.CXCR4+ . Maraviroc (en concentración final de 10 μm) no mostró ningún efecto inhibitorio sobre la respuesta de CXCL12-inducida de Ca2 + . (B) se basa en la respuesta de Max-Min sobre la basal entre medición 84 y 243, se generó una curva de dosis-respuesta inhibitoria y se calculó el valor de50 IC que 770.8 nM (n = 4, media ± SD). Dependiente de la dosis (C) activación de CCR5 por su agonista endógeno, CCL5. (D) la inhibición de la respuesta de CCR5-mediada de la Ca2 + por preincubación de las células con 100 nM de maraviroc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El Ca2 +-ensayo de movilización descrito anteriormente ha demostrado ser una herramienta valiosa para identificar y caracterizar a los antagonistas del receptor CXCR417de focalización. Es, sin embargo, anticipó que este método puede ser aplicado más generalmente a un grupo grande de otros GPCRs que desencadenan una citosólica Ca2 + liberación tras su activación, como se ilustra para el receptor del chemokine relacionados con CCR5. Mientras que en el caso de CCR5 podrían aplicarse exactamente las mismas condiciones experimentales, varios pasos en el protocolo (por ejemplo, el número de células en el revestimiento, carga de las células con un colorante fluorescente) tendrá que ser nuevamente optimizada antes de transferir el ensayo a otros GPCRs para obtener una favorable relación de señal a ruido. Un tema importante aquí es también la selección de un adecuado en vitro celular host que permite la expresión de alto nivel de lo GPCR de interés y de acoplamiento funcional de la vía de Ca2 + . En el caso de CXCR4, células de glioblastoma humano U87 fueron elegidas por: (1) la falta de expresión endógena de CXCR7 (un receptor de chemokine relacionados que ocupa el mismo agonista como CXCR4), (2) su capacidad para acoplar CXCR4 de activación para el Ca2 +-señalización vía, (3) el rango dinámico favorable de la respuesta fluorescente obtenido después de la carga de las células con el Ca2 +-sensible del tinte y (4) su excelente adherencia para el ensayo de placas minimizando la célula disturbio durante todo el procedimiento. Todos estos parámetros que tenga que ser determinado experimentalmente para cada sistema de expresión celular y cada novela GPCR de interés.

Al configurar un análisis similar para otro GPCR, pueden considerarse varios pasos alternativos o reactivos en el protocolo. Por ejemplo, otros Ca2 +-fluoróforos sensibles (por ejemplo, fluo-4, fluo-3) podrían ser utilizado como una alternativa para el fluoróforo (fluo-2) utilizada en el presente Protocolo. En el caso de células adherentes libremente, lavado de las células podrían omitirse mediante la introducción de colorantes no lave para minimizar la célula salga24. Además, excepto el paso de lavado del Protocolo adicional aumentaría rendimiento del ensayo. Aunque este análisis podrían realizarse también con células que muestran expresión endógena de la CXCR4, por ejemplo, incluyendo varios tipos de cáncer humano célula líneas10,25, cabe señalar que con la célula estable transfected líneas alta GPCR niveles de expresión que permanecen estables con el tiempo se pueden obtener. Esto resultará en más pronunciado de las mediciones de ensayo, una ventana más grande para la interpretación de datos confiable y consistente Análisis rendimiento durante períodos más prolongados. Al utilizar células endógeno expresan CXCR4 será mucho más difícil lograr este resultado.

Un inconveniente importante del análisis es que se basa en una medición de fluorescencia. Por lo tanto, autofluorescent compuestos pueden interferir con la medición del ensayo, que excluye del análisis debido a la interpretación de los datos poco confiables. También, este ensayo movilización de Ca2 + se realiza idealmente utilizando un celular sistema equipado con un sistema de pipeteado integrado que permite una mezcla estandarizada y cantidades de compuestos y agonista del receptor en la placa de medición en todos los los pozos simultáneamente. El ensayo, sin embargo, sería adaptado para el uso con el otro, menos los lectores de microplacas de fluorescencia caro mediciones cinéticas. La adición de compuestos y agonista tendría entonces que realizarse manualmente utilizando pipetas multicanales, que aumentarán las manos en tiempo y reduce el rendimiento de la prueba. Además, obtener un número similar de las mediciones de fluorescencia dentro de un determinado intervalo de tiempo de un análisis cinético sería difícil de lograr como muchos lectores de microplacas medir señales bien por bien considerando que los sistemas de inspección de alta calidad medir todos los pozos al mismo tiempo.

Antagonistas del receptor de prevenir atascamiento al receptor y la activación posterior por el agonista endógeno (CXCL12) actualmente forman la principal categoría de compuestos dirigidos específicamente contra CXCR411,12. AMD3100, la molécula pequeña que se usó para ilustrar el funcionamiento del Ca2 + movilización ensayo, es uno de los ejemplos más destacados de CXCR4 antagonistas26. Además de los antagonistas del receptor, moléculas que regulan GPCR signaling diferentemente levantar interés general así. Estas moléculas incluyen agonistas inversos, así como GPCR PAMs y NAMs19,20,27. Una característica interesante del ensayo que se describe en este manuscrito es que no sólo puede identificar antagonistas de los receptores, pero también agonistas y moduladores alostéricos. Sin embargo, algunas adaptaciones menores al ensayo y limitaciones deben tomarse en cuenta.

PAMs y NAMs se unen a los sitios receptores topográficamente distintos desde el sitio de unión de orthosteric ocupado por el ligando endógeno del receptor. Mientras que PAM mejorar la potencia o la eficacia de la ligand(s) endógena del receptor, NAMs inhiben la potencia o la eficacia de la ligand(s) endógena19,20. PAMs no tienen ninguna actividad agonista intrínseca. Sólo son activos en presencia del agonista endógeno, a diferencia de los llamados agonistas alostéricos. Porque los moduladores alostéricos de GPCR evocan menos efectos secundarios que los antagonistas del receptor clásico cuando se aplica en ajustes clínicos28,29, son valiosas herramientas farmacológicas. En nuestro análisis, agonistas alostéricos evocaría un aumento transitorio de la señal de fluorescencia inmediatamente después de la adición a la CXCR4+ las células. Especificidad del receptor de esta señal debe determinarse entonces por el mismo compuesto con el mismo ensayo, pero en las células CXCR4 de falta de prueba. Cuando específicamente detección de PAMs, una concentración inferior del agonista endógeno debe utilizarse en el ensayo para inducir una respuesta de Ca2 + fluorescente. Aunque esta menor cantidad de agonista generará una señal fluorescente más pequeño, sale una ventana para detectar estímulo receptor adicional. Por lo general, una concentración de agonista correspondiente al EC10- CE30 valor de la estimulación del receptor es elegida30,31. Adición de un PAM durante la primera parte del ensayo no resultaría en una mayor medida fluorescente. Sin embargo, aumentaría la fluorescente Ca2 + señal después de la estimulación posterior del receptor con su agonista endógeno. Asimismo, un NAM no altera la medición fluorescente antes de la adición de agonistas, pero inhiben la respuesta del receptor después de añadir el agonista. Por lo tanto, el perfil de actividad de un antagonista del receptor y un NAM se parecen. Dará lugar a la inhibición de la respuesta fluorescente después de la adición de agonistas. Por lo tanto, más estudios experimentales deben discriminar entre un antagonista y un NAM. Aquí, estudios de enlace del receptor por el que los compuestos compiten con una cantidad fija de etiquetado CXCL12 para enlace a CXCR417,32 puede ser una estrategia valiosa para discriminar entre un antagonista, que impediría la etiquetado como agonista de unión a los receptores y un NAM que no como que no compartiría el mismo sitio de unión del receptor.

Ha observado actividad independiente (o basal o constitutiva) de ligando de los GPCRs GPCRs numerosos33 aunque el nivel de actividad basal suele ser bastante bajo cuando GPCRs se expresan por vía recombinante27. Actividad basal de GPCR puede ser mejorada por naturales mutaciones33 y una mutación de punto hacia CXCR4 basal mayor actividad ha sido describen anterior34. Este mutante constitutivamente activa de CXCR4 de acoplamiento a la vía de respuesta de feromona en la levadura y experimentos [35S] enlace de GTPγS, fue demostrado que T140, un antagonista de CXCR4 basados en péptidos con actividad potente contra el VIH17,35 disminuyó significativamente esta actividad basal y así fue demostrado para actuar como un agonista inverso34. De nota, en un Fura-2 basado en fluorescencia Ca2 + movilización análisis de los mismos autores observaron una pequeña disminución transitoria Ca2 +-relacionados con fluorescencia después de adición del T140 a células que expresan mutante CXCR4, lo que sugiere una disminución de la basal receptor actividad34. Sin embargo, cuando analizando un panel adicional de cíclica basada en pentapeptide CXCR4 inversos agonistas diseñado de T140, detección de actividad basal reducida con un ensayo de Ca2 + movilización fue menos sencilla36. Cuando se analizó el efecto de T140 en células que expresan el tipo salvaje CXCR4 usando el Ca2 + movilización análisis como se describe en este manuscrito, ningún cambio en la señal de fluorescencia basal se observó17. Además, las fluctuaciones de la fluorescencia son rápidos y transitorios y aumento basal Ca2 + , por ejemplo, no se observan en las células expresan constitutivamente activa Gαq-juntado receptores4. Tomados en conjunto, sería muy difícil, si no imposible, identificar y evaluar de forma fiable con nuestro análisis el efecto de los agonistas inversos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Eric Fonteyn y Geert Schoofs excelente asistencia técnica. Este trabajo ha sido apoyado por el KU Leuven (subsidio no. PF/10/018), el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, subsidio no. G.485.08) y la Fundación Dormeur Vaduz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-2 AM Abcam ab142775 fluorescent Ca2+ sensitive dye
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G pluronic acid
Gelatin Sigma G9391
AMD3100 Sigma A5602-5 mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc kind gift of AnorMed antiretroviral drug, CCR5 antagonist
Chemokine ligand CXCL12 PeproTech 300-28A
Chemokine ligand CCL5 PeproTech 300-06
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco (Life Technologies) 41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1 M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red Gibco (Life Technologies) 25200-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Falcon tubes, 50 mL Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid Costar/Fisher Scientific 10530753 assay plate (96-well), for cell seeding
Polypropylene (PP) plates Thermo Scientific (VWR) 732-2661 plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system Molecular Devices Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm Molecular Devices 0200-6128 Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm Molecular Devices 0200-6203 emission filter compatible with the fluorescent dye
FLIPR Tetra 96 Head Molecular Devices 0310-4536 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader
ScreenWorks Molecular Devices software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra
Vi-CELL Beckman Coulter cell viability analyzer
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile Corning 3340 Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.

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