Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

이 프로토콜에서 우리 Zika 바이러스 특정 진단 펩 티 드 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 여 발견 하는 기법을 설명 합니다. 이 프로토콜 readly 다른 신흥 감염 증에 대 한 적응 될 수 있다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sabalza, M., Barber, C. A., Abrams, W. R., Montagna, R., Malamud, D. Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery. J. Vis. Exp. (130), e56784, doi:10.3791/56784 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

고밀도 펩타이드 microarrays 단일 표준 현미경 슬라이드에서 6 천 이상의 펩 티 드의 심사를 허용합니다. 이 방법은 약물 발견, 치료 대상 식별 및 개발에 적용할 수 있습니다 진단의. 여기, 선물이 특정 Zika 바이러스 (ZIKV) 진단 펩 티 드 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 여 발견 하는 프로토콜. 인간의 혈 청 샘플 ZIKV 감염 14-aa 잔류물 중복 3,423 독특한 15 선형 아미노산 (aa) 잔류물으로 번역 전체 ZIKV 단백질을 포함 하는 고밀도 펩 티 드 microarray와 알을 품는 대 한 유효성 검사 중복에서 인쇄. 동일한 배열 내에서 다른 이차 항 체와 얼룩, 우리 면역 글로불린 M (IgM) 및 혈 청에 있는 항 체는 면역 글로불린 G (IgG)에 바인딩되는 펩 티 드를 발견 했습니다. 이러한 펩 티이 드 추가 검증 실험에 대 한 선정 됐다. 이 프로토콜에서 우리는 디자인, 처리, 그리고 고밀도 펩타이드 microarray 분석 전략을 설명 합니다.

Introduction

Zika 바이러스 (ZIKV) 진단에 따라 임상 증상은 뎅 그 열과 Chikungunya 바이러스 감염1벡터, 지리적 분포와 증상을 공유 하기 때문에 도전 이다. 여자 임신 중 ZIKV 감염에 불리 한 임신 결과 대 한 위험을 감안할 때, 그것은 3 바이러스 사이 구별 하는 것이 중요. 현재 분자 진단 테스트 특정 있지만, 그들은 단지 혈액 이나 타 액에 유용 급성 감염2,3의 상대적으로 짧은 기간 동안. 혈 청 학적인 분석 실험 진단 감염4의이 초기 기간이 필수적입니다.

ZIKV 특정 혈 청 학적인 분석 결과의 개발은 두 가지 이유로 도전: 첫째, 인간의 면역 체계에 응답 Zika 항 현재 알려져 있지 않습니다; 그리고 두 번째, 보존 flaviviruses 아미노산 시퀀스 유도 항 체 분. 우리의 목표는 독특한 ZIKV 특정 펩 티 드 진단에 사용할 수 발견 했다. 다른 방법을 개발 되었으며, 살 균 소, 세균를 포함 하 여 전체 단백질을 다루는 화면 펩타이드 라이브러리 및 효 모 표면 표시5,6,7,,89, 10. 우리의 전략은 신속 하 고 저렴 한 높은 처리량 serological 검사11,12 를 허용 하는 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 고 이후에 확인 된 펩 티 드 serological 전류를 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다. ZIKV 감염의 탐지를 위한 분석 실험입니다.

이 프로토콜 Zika 바이러스 특정 진단 펩 티 드의 고밀도 펩타이드 microarray (그림 1)를 사용 하 여 검색을 수 있습니다. 고밀도 펩 티 드 microarray 펩 티 드 레이저 인쇄 기술을 사용 하 여 제작 되었다. 프랑스 폴리네시아 스트레인 기반 3,423 아미노산 잔류물의 구성 된 전체 ZIKV 단백질 시퀀스 (은행: KJ776791.2), 표준 유리 슬라이드에 대 한 중복 14 아미노산 잔류물의 중복 15 선형 잔류물의 블록에서에 인쇄 되었다는 총 6,846 펩 티 드 명소입니다. 전체 Zika 단백질 시퀀스 펩 티 드, 이외는 microarray 인플루엔자 조류 활용 (HA) 펩 티 드 내부 통제에 대 한.

Zika 검증 긍정적인 워즈워스 센터 (알바 니, 뉴욕)에서 얻은 혈 청 샘플 특정 면역 글로불린 M (IgM) 및 면역 글로불린 G (IgG) 반응 펩 티 드 식별 하는 데 사용 되었다. 밤새 샘플 잠복기 후에 microarray는 보조 형광 색소 활용 된 항 체 (반대로 인간 IgM 또는 반대로 인간 IgG), 물 고 microarray 스캐너에 분석. 자리 농도 및 펩 티 드 주석의 정량화는 microarray 제조 같은 회사에 의해 제공 하는 특정 소프트웨어와 함께 수행 되었다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

이러한 데이터 치과의 뉴욕 대학 대학에서 실시 하는 지속적인 연구의 일부 이며는 뉴욕 대학의과 대학, IRB의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 # H10 01894. 이 연구에 사용 된 임상 샘플 드 식별된 샘플 진단 및 허가 워 즈 워드 센터의 뉴욕 국무부 건강, 알바 니, 뉴욕의 이전에 사용 했다.

1. 설치 ZIKV 고밀도 펩 티 드 Microarray 슬라이드 특정 보육 용지함에

  1. 파우더 프리 글러브를 사용 하 여 가장자리에 의해 유리 슬라이드를 처리 합니다. 유리 슬라이드 크기는 25.0 m m와 1 m m 두께의 75.4 m m입니다. Microarray 표면 위로 향하도록 슬라이드 인큐베이션 트레이에 넣습니다.
  2. Microarray 인쇄 표면에 아래쪽으로 직면 하는 인감의 광택 면을 놓습니다. 좋은 위치를 보장 하기 위해, 인감 및 베이스 플레이트의 나사 구멍을 겹칩니다.
  3. Microarray 챔버를 만드는 장소 인감에 용지함의 위쪽 부분.
  4. 강화 하 여 동일 하 게 고정 하는 손잡이 하나 다른 손을 번갈아 패턴 뒤에 오른쪽 아래 왼쪽 위에서 시작 하 여 트레이에 있는 슬라이드를 보안 합니다. 인큐베이션 트레이 뚜껑을 놓습니다.

2. 배경 상호 작용 탐지: 이차 항 체와 Microarray 얼룩

참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (표준 및 차단 버퍼, 희석된 이차 항 체)를 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.

  1. 표준 버퍼 (1 x 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 0.05% 트윈 20, pH 7.4, 0.45 μ m 필터 필터링) microarray를 품 어 (총 2000 µ L/microarray의 볼륨) 140 rpm에서 궤도 통에 상 온 (RT)에서 15 분.
  2. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다. Microarray 슬라이드의 침입을 방지 하기 위해 빈 슬라이드에 빈 슬라이드 홀더 채우십시오.
  3. Microarray 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 60 분에 대 한 블로킹 버퍼 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)를 차단 합니다.
  4. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음에 의해 블로킹 버퍼를 제거 합니다.
  5. 반대로 인간의 IgM 형광 색소 활용 된 항 체 보조와 microarray를 품 어, 희석된 1: 5000 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)는 얼룩에 140 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 RT에서 30 분 (10% 차단 하는 표준 버퍼에서 버퍼) 버퍼 rpm을.
  6. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 이차 항 체를 제거 합니다.
  7. 씻어 microarray 3 x, 1 분 당 세척 표준 버퍼 (2000 µ L/140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에 microarray의 총 볼륨입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.
  8. 슬라이드 2를 담가 갓된 찍기 버퍼 (1 mM Tris, pH 7.4)에 x, (200 mL의 총 볼륨).
  9. 건조는 microarray 신중 하 게, 약 1 분 동안 슬라이드 화면을 건드리지 않고 슬라이드의 하단을 위쪽에서 매우 신중 하 게 초과 하는 액체를 발음으로. Microarray 스캐너 리더에서 슬라이드 분석.

3. 혈 청 호스트 Microarray의 노출

주의: Biosafety 수준 2 (BSL-2) 혈 청 표본의 잠재적인 감염 특성 실험실 안전 조건 하에서이 단계를 수행 합니다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛 (BSC) 내에서 작동 합니다.

  1. 30 분 동안 56 ° C에서 혈 청 샘플 및 4 ° C13에서 5 분 동안 16000 rcf에 원심 분리기를 비활성화.
    참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (얼룩, 표준 버퍼 및 희석된 혈 청)을 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.
  2. 1:1,000 (총 양의 2000 μ/microarray) 희석 시작 얼룩 버퍼에 혈 청 샘플을 희석. 사용 될 때까지 그것은 4 ° C 유지.
  3. 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 15 분 동안 얼룩 버퍼 (전체 양의 2000 μ/microarray) microarray를 품 어.
  4. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 얼룩 버퍼를 제거 합니다.
  5. 140 rpm에서 궤도 통에 4 ° C에서 하룻밤 희석된 혈 청 샘플 microarray를 품 어.
  6. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 희석된 혈 청 샘플을 제거 합니다.
  7. 씻어 microarray 3 x, 1 분 당 세척 표준 버퍼 (140 rpm에서 궤도 셰이 커에 RT에서 2000 μ/microarray의 총 볼륨입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.

4. 2 차 항 체와 레이블된 컨트롤 항 체 얼룩이 지기

참고: microarray 챔버의 구석에 솔루션 (표준 버퍼, 희석 및 레이블 항 체)를 입금 하는 피 펫을 사용 합니다.

  1. 얼룩 버퍼에서 이차 항 체 희석.
    참고: 사용 방지 인간 IgM 형광 색소 활용 항 체 또는 얼룩 버퍼에 1:5,000 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨)의 희석에 안티 인간 IgG 형광 색소 활용 된 항 체.
  2. 혼합 컨트롤 레이블 항 체 (단일 클로 널 안티-하 형광 색소 활용 된) 1:1,000 (전체 양의 2 000 µ L/microarray) 이전 버퍼 얼룩에 희석 이차 항 체와 버퍼를 얼룩에 한 희석에.
  3. RT에서 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 30 분 동안 microarray와 품 어.
  4. Microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫으로 발음 하 여 희석 및 레이블 항 체의 혼합을 제거.
  5. 워시 표준 버퍼 (2000 µ L/microarray의 총 볼륨) 3 배. 각 세척 140 rpm에서 궤도 셰이 커에 1 분입니다. 각 세척 후 microarray 챔버의 모퉁이에서 피 펫과 발음으로 표준 버퍼를 제거 합니다.

5입니다. Microarray 검사

  1. 슬라이드 2를 담가 갓된 찍기 버퍼 (1 mM Tris, pH 7.4) (200 mL의 총 볼륨)에 x.
  2. 건조는 microarray 신중 하 게, 슬라이드 화면을 건드리지 않고 슬라이드의 하단을 위쪽에서 매우 신중 하 게 발음 하 여 약 1 분.
  3. Microarray 스캐너의 지침에 따라 스캔. 인쇄 된 표면 위로 향하도록 스캐너에 슬라이드를 놓습니다.
  4. 새 프로젝트를 만들고 검색 영역을 선택 합니다. 스캐너 매개 변수 설정: 해상도: 21 µ m, 700와 800 nm 채널에 대 한 강도: 7.0, 스캔 품질: 매체 및 오프셋: 0.8.
  5. 취득 하 고 16 비트 회색조 TIFF 파일 형식으로 스캔 raw 이미지를 저장 합니다.

6. Microarray 분석 특정 소프트웨어를 사용 하 여

  1. Raw 이미지 (TIFF 이미지)를 엽니다. 배열 그리드 파일을 엽니다.
  2. 컴퓨터의 마우스 또는 키보드 화살표 키 스캔 이미지를 배열 눈금에 맞춥니다.
  3. 각 자리에 대 한 신호 강도, 배경 값 및 해당 펩 티 드 순서를 포함 하는 판독 파일을 만들어 특정 소프트웨어에서 "계량 선택"을 선택 합니다.
    참고:이 출력 파일 또한 추가 분석 및 그래프를 스프레드시트 프로그램으로 가져올 수 있습니다.

7. Microarray 스토리지

  1. 산소 무료 질소 또는 아르곤 가스에서 4 ° C에서 어둠 속에 봉인 microarray를 저장 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 그림 2 에 표시 된 그림 3. 아니 배경 상호 작용 미리 보조 안티 인간 IgM (데이터 표시 되지 않음) microarray 얼룩 때 지적 했다. 공액 배경 녹색 형광 강렬, 이러한 펩 티이 드에 IgM와 호스트 혈 청 샘플 (그림 2)에서 바인딩을 나타내는 위의 여러 분야에서 결과 반대로 인간 IgM와 얼룩. IgG 탐지 (빨간색 형광 신호) 공개만 몇 펩 (그림 2).

제조는 microarray 같은 회사에 의해 제공 하는 특정 소프트웨어 스캔 후는 microarray를 분석 합니다. 만든 판독 파일에는 각 명소에 대 한 신호 강도, 배경 값 및 해당 펩 티 드 순서 포함 되어 있습니다. IgM에 대 한 강력한 대응으로 각 펩 티 드의 자리 형광 강렬은 원시 값 (그림 3)에서 백그라운드를 뺀 후 얻은 녹색 전경의 중간 값을 그려서 시각 했다.

Figure 1
그림 1: 고밀도 펩타이드 Microarray에 대 한 분석 과정을 보여주는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 펩 티 드 Microarray 스캔 이미지. ZIKV 혈 청으로 잠복기 후 펩타이드 microarray 얼룩의 원시 형광 이미지 샘플 희석된 1: 250. IgG 반응성 (왼쪽), 빨간색으로 표시 하 고 IgM 반응성 그린 (오른쪽)에 표시 됩니다. 하 제어 펩 티 드는 펩 티 드 microarray 프레임. 확대/축소 패널 IgM 또는 IgG에 대 한 강력한 대응을 나타내는 높은 형광 강렬과 펩 티 드의 그룹을 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 대표 Zika 바이러스 Epitope 합의 시퀀스 호스트 혈 청 샘플에 IgM 반응. 펩 티 드를 겹치는 녹색 전경 중간 값 그래프에 그릴 했다. 펩 티 드 epitope 합의 시퀀스에서 빨간색으로 강조 표시 됩니다. 펩 티 드 높은 형광 강도 굵게 표시 됩니다. 벡터 기반 그래픽 디자인 소프트웨어는이 그림을 생성 하는 데 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

우리는 프로토콜을 포함 하는 전체 Zika 바이러스 단백질 시퀀스 (프랑스어 폴 리 네 시안 스트레인) 고밀도 펩 티 드 microarray를 이용 하 여 설계 되었습니다. microarray 인쇄 3,423 다른 겹치는 선형 펩 티 드에 의해 제조 되었다. 각 펩 티 드 아미노산 15 이었고 시퀀스 (, 14 잔류물 오버랩)에 가까운 이웃에서 한 잔류물에 의해 다양 한. 비록 짧은 겹침 인쇄 될 수 있다, epitope 매핑은 더 이상 중복으로 더 정확한입니다. 각 펩 티 드 안정성 향상을 중복 인쇄 했다.

미리 가능한 배경 상호 작용을 검출 하 고 샘플 특정 신호에서 그들을 차별화 하는 이차 항 체와 microarray 얼룩과 프로세스를 시작 하려면 필수적 이다. 특정 블로킹 버퍼를 사용 하 여도 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 말린 우유 분말 감소 신호 강도 발생할 수 있습니다 같은 다른 차단 버퍼 만큼 중요 하다. ZIKV IgM 항 체에 대 한 유효한 혈 청 샘플 먼저 1:1,000에 microarray와 인 큐베이 팅 하지만 신호가 감지 되었습니다. 1: 500의 낮은 희석에 후속 인큐베이션 샘플에 IgM 항 체와 반응 하는 펩 티 드에서 나오는 낮은 강도 신호 귀착되는. 최상의 결과 얻으려면 Zika 유효한 혈 청 샘플은 1: 250에서 희석 할 때 얻은 했다. 우리 않았다 하지 배경 신호 증가 피하기 위해 높은 농도에서 혈 청 샘플을 다시 테스트 합니다. microarray의 주의 깊은 취급 microarray 표면 긁힘 방지에 필수적 이다. 따라서,는 솔루션 같은 우리 희석 혈 청 및 표준 버퍼 추가 하 고 제거 microarray 챔버의 모퉁이에서. 또한, 성공적인 결과 대 한 중요 한 최소한의 샘플 볼륨으로 작업을 허용 하도록 설계 된 microarray를 제조 하는 회사에 의해 제공 슬라이드 특정 보육 트레이입니다. 인큐베이션 트레이 크기는 9.0 m, 두께의 3 cm 13.0 c m입니다. 3 슬라이드 3 다른 슬라이드를 동시에 시 금 수 있는 인큐베이션 트레이에 구멍 지정을 확인 하 고 있습니다. 그러나,이 실험에서 우리는 단 1 슬라이드를 사용. 빈 현미경 슬라이드 트레이 균형 배열 슬라이드의 침입을 방지 하는 다른 두 구멍에 배치 했다. 인큐베이션 트레이 4 부분으로 구성 됩니다: 슬라이드에 지정 된 충 치; 배치 됩니다 베이스 플레이트 실리콘의 다른;에서 각 슬라이드를 분리 구성 하는 마감재 베이스 플레이트와 마감재를 가입 하 고 버퍼 또는 혈 청 샘플 세척 등 분석 결과 대 한 솔루션을 추가 하기 위한 microarray 챔버를 만들 하 나사를 포함 하는 위쪽 부분. 마감재 및 상부 오염 또는 슬라이드 사이의 솔루션의 혼합 하지 마십시오. 마지막 섹션 구성 요소는 증발의 위험 또는 샘플의 환경 오염을 최소화 하기 위해 뚜껑. 궤도 흔드는 일로 얼룩 조건 최적의 얻으려면 선호 된다.

바이러스 결과 특정 Zika IgM 호스트를 감염 하는 때에 따라 혈 청에서 항 체 농도 높은 또는 낮은 수 있습니다. 따라서, 그것은 더 높은 IgM 농도와 혈 청 샘플을 사용 하 여 상대 형광 신호 강렬을 증가 것 이라고 예상 했다. IgM 검출 후 동일한 혈 청 샘플은 1: 250, microarray와 희석에 알을 품을 하지만 반대로 인간 IgG 이차 항 체로 사용 되었다. 또는, 다른 항 체 클래스는 다른 형광 염료로 각각 활용 된 이차 항 체의 혼합물을 사용 하 여 동일한 microarray 내 동시에 검색할 수 있습니다. 동일한 microarray 수 있습니다 얼룩이 질 다시 더 집중 세럼 샘플 신호 강도가 낮은 경우. 제대로 저장 하는 경우는 microarray 안정적인 몇 달 동안 이며 가능성이 다시 사용 될 수 있습니다.

자리 농도 및 펩 티 드 주석을의 정량화는 또한 ".psf" 파일 배열 포맷의 템플릿을 제공 하는 microarray를 제조 하는 회사에서 독점 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. Psf 파일은 기본적으로 독점 소프트웨어를 사용 하 여 원시 스캐너 이미지를 정렬 하는 격자입니다. 소프트웨어 알고리즘 분석 원시로 각 명소의 상대 형광 강도 (스팟의 신호 강도 값), (일반적인 바인딩에 의해 발생 하는 신호 예상된 값) 배경과 전경 (원시에서 배경 빼고 값) 신호입니다. 그것은 또한 전경 중간 값과 중복 있는 각 펩 티 드의 2 개의 중간 자리 값의 의미에 해당 하는 집계 전경 중간값 계산 합니다. 또한, 소프트웨어 중복 펩 티 드 내에서 합의 모티브/epitope를 식별 합니다. 신호 강도 측정할 수 있다 또는, microarray 스캐너 소프트웨어와 배열 형식의 서식 파일을 사용 하 여, 펩 티 드 순서를 확인할 수 있습니다.

이 프로토콜에 따라 몇 가지 유망한 펩 티 드 후보자는 형광 강도에 따라 확인 되었다. 이후 폭발14 분석 다른 flavivirus에 잠재적인 분와 잔류물을 식별 하기 위해 사용 되었다. 총 14 확인 된 펩 티 드 ZIKV 3 프로테옴 데이터베이스에서 확인에 있습니다. Microarrays의 두 번째 시리즈를 계획 하는 첫 번째 배열에서 선택 된 펩 티 드를 포함 됩니다. 이 여러 검증된 표본으로 ZIKV 다른 flavivirus 만으로 감염 환자 로부터 샘플 특이성을 확인 하려면 테스트 수 있게 됩니다. 심사에 대 한 선택 된 펩 티 드와 플레이트를 코팅 하 고 인간의 혈 청과 타 액 샘플에서 ZIKV 특정 항 체 바인딩 테스트는 ELISA 분석 결과 형식 적응 합니다 우리.

ZIKV 처리 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 시설15에서 작업 해야 합니다. 저희가 ZIKV 감염에 대 한 유효성을 검사 하는 혈 청 샘플으로 우리는 모든 샘플 조작 클래스 II (또는 더 높은) 생물 안전 캐비닛 (BSC)를 수행 하는 BSL-2 시설에서 일했다. 이것은 왜 우리가 microarray13샘플 잠복기 전에 30 분 동안 56 ° C에서 혈 청 샘플을가 열 하는 바이러스를 비활성화. 열 비활성화, 다음 또한 권장 감염의 기회를 피하기 위해 적절 한 좋은 실험실 안전 연습 BSL-2 시설에서 작업을 계속.

우리가 설계 microarray 선형 펩 티 드 및 consequentially 구조적 epitopes 진단 못 되었습니다 수 있습니다 귀중 한 될 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 이 한계는 고밀도 사용 하 여 해결할 수 있습니다 반복된 epitope를 모방 주기적 제한 된 펩 티 드를 포함 하는 microarray 구조16. 이 프로토콜 빠르게 새로운 microarray 잠재적인 진단 펩 티 드의 발견을 위해 디자인 될 수 있다 단백질 순서 되 면 있기 때문에 다른 병원 체에 적용할 수 있습니다. 그것은 또한 바이오 마커 발견17, 백신 개발 또는 치료 대상18,19항 및 epitope 발견 같은 다른 응용 프로그램에 대 한 적용할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

현재 지원 NIDCRR44 DE024456에서 SBIR (중소 기업 혁신 연구) 관리 보충 그랜트에 의해 제공 됩니다. 에이즈에 대 한 확실 한 포인트의 의료 진단의 개발에 대 한 NIDCR 부여 U01 DE017855 진화 NIDCR 에이즈 그랜트. 우리는 기꺼이 그녀의 기술 지원 및 지원 종류에 대 한 질 케 Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany)를 인정합니다. 우리는 또한 리 오호 오디세이 이미징 시스템에 대 한 NYU Langone 의료 센터 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray PEPperPRINT PPC.001.001 Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1 PEPperPRINT PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) PEPperPRINT PPC.037.002
PepSLide Analyzer PEPperPRINT PSA.004.001 14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer Rockland MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 Rockland 609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680 Thermo Scientific SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System LI-COR
Orbital shaker device IKA MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator Adobe
Deltagraph Redrocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18, (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38, (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11, (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8, (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12, (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421, (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11, (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16, (1), 6 (2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7, (12), e50748 (2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11, (1), e0005330 (2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. 2nd ed, (2013).
  15. Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20, (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11, (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics