إجراءات تصنيع وقياسات إنكسار مزدوج لتصميم أيون لانثانيدات مغناطيسيا استجابة خالب فسفوليبيد التجميعات

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وترد الإجراءات تلفيق لايون لانثانيدات استجابة عالية مغناطيسيا خالب بوليموليكولار التجميعات. الاستجابة المغناطيسية يمليها حجم الجمعية، التي هي مصممة بقذف من خلال الأغشية نانوبوري. الجمعيات اليجنابيليتي مغناطيسي والتغيرات الهيكلية الناجمة عن الحرارة تخضع مقاييس إنكسار مزدوج، تقنية مجانية للرنين المغناطيسي النووي وتشتت النيوترونات زاوية صغيرة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بيسيليس تجميعات الانضباطي القرص مثل بوليموليكولار التي تكونت من مجموعة كبيرة ومتنوعة من خليط الدهن. تطبيقات تتراوح من غشاء بروتين الدراسات الهيكلية بالرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) للتطورات نانوتيتشنولوجيكال بما في ذلك تشكيل الهلام نشطة ضوئياً ومغناطيسيا للتحويل. هذه التكنولوجيات تتطلب مراقبة ارتفاع حجم الجمعية والاستجابة المغناطيسية والمقاومة الحرارية. خليط من 1، 2-ديميريستويل-sn-جليسيرو-3-phosphocholine (دمبك) وبه أيون لانثانيدات (Ln3 +) خالب فسفوليبيد المتقارن، 1، 2--ديميريستويل-تريامينيبينتاسيتاتي-جليسيرو-3-والرمات-ايثانولامين-الغلايكول (sn دمبيدتبا)، التجمع في الجمعيات استجابة عالية مغناطيسيا مثل دمبك/دمب-دتبا/Ln3 + (المولى نسبة 4:1:1) بيسيليس. مقدمة من نسبة الكولسترول في الدم (شول-OH) ومشتقات الستيرويد في نتائج بلير في مجموعة أخرى من الجمعيات توفر الخصائص الفيزيائية-الكيميائية الفريدة. لتكوين دهن معين، اليجنابيليتي المغناطيسي يتناسب مع حجم بسيلي. كومبليكسيشن Ln3 + النتائج في الردود المغناطيسي لم يسبق لها مثيل من حيث الحجم والمحاذاة اتجاه. الحرارية-عكسها انهيار هياكل شبيهة بالقرص إلى حويصلات عند التسخين يسمح للخياطة لإبعاد الجمعيات بقذف من خلال مرشحات الغشاء مع أحجام مسام المعرفة. يتم إعادة إنشاء بيسيليس النابل مغناطيسيا بالتبريد إلى 5 درجات مئوية، أسفر عن أبعاد الجمعية تعرف حويصلة والسلائف. هنا، هو تفسير هذا الإجراء تلفيق وهو كمياً اليجنابيليتي المغناطيسي للجمعيات بقياسات إنكسار مزدوج تحت حقل مغناطيسي تي 5.5. كذلك تمكن الإشارة إنكسار مزدوج، منشؤها بلير فسفوليبيد، رصد بوليموليكولار التغييرات التي تطرأ بلير. هذه التقنية البسيطة مكملة لتجارب الرنين المغناطيسي النووي التي تستخدم عادة لوصف بيسيليس.

Introduction

بيسيليس هي بوليموليكولار القرص مثل التجميعات التي تم الحصول عليها من العديد دهن المزائج. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 أنها تستخدم على نطاق واسع لتوصيف الجزيئات الحيوية الغشاء الهيكلي بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. 6 , 7 ولكن الجهود التي بذلت مؤخرا تهدف إلى توسيع مجال التطبيقات الممكنة. 5 , 8 , 9 أهم درس بيسيلي وتتألف من خليط من 1، 2-ديميريستويل-sn-جليسيرو-3-phosphocholine (دمبك)، التي تشكل الجزء مستو من الجمعية العامة، و 1، 2-ديهيكسانويل-sn-جليسيرو-3-phosphocholine (DHPC) فسفوليبيد تغطي الحافة. 1 , 2 , 3 هندسة جزيئية فوسفوليبيدات يؤلف بلير إملاء بنية هيكل بوليموليكولار الذاتي تجميعها. 4 , 5 استبدال DHPC مع دتبا دمب يولد أنظمة بسيلي استجابة عالية مغناطيسيا والانضباطي. 10 , 11 دمبك/دمب-دتبا/Ln3 + (المولى نسبة 4:1:1) بيسيليس المنتسبين مع العديد من أيونات لانثانيدات باراماجنيتيك أكثر (Ln3 +) على السطح لبلير، أسفر عن استجابة مغناطيسية معززة. 10 علاوة على ذلك، الاستعاضة عن الجزيئات DHPC للذوبان في الماء مع دمب-دتبا/Ln3 + يتيح تشكيل بيسيليس المقاوم للتخفيف. 11

اليجنابيليتي المغناطيسي للجمعيات بوليموليكولار مستو تمليه على الطاقة المغناطيسية عموما،

Equation 1(1)

حيث B هو قوة الحقل المغناطيسي، Equation 2 ن المستمر، المغناطيسي عدد التجميع و Equation 3 تباين قابلية دياماجنيتيك الجزيئية الدهون يؤلف في بيلايير. ولذلك، مصمم خصيصا استجابة دمبك/دمبي-دتبا/Ln3 + بيسيليس للحقول المغناطيسية بحجمها (n العدد الكلي) و Δχ تباين قابلية دياماجنيتيك الجزيئية. ويتحقق هذا الأخير سهولة بتغيير طبيعة Ln الكلاب3 +. 12 , 13 , 14 , 15 إدخال نسبة الكولسترول في الدم (شول-OH) أو مشتقات ستيرويد أخرى في بيلايير يتيح إمكانية ضبط n العدد الكلي و Δχ قابلية مغناطيسية للجمعيات. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 لتكوين دهن معين، تتضمن التجميعات أكبر الدهون أكثر قادرة على الإسهام في هماج (n عدد أكبر تجميعية)، أسفر عن الأنواع اليجنابل أكثر. على سبيل المثال، حجم دمبك/DHPC بيسيليس، يسيطر تقليديا من خلال الاستغلال الأمثل لتركيز الدهن يؤلف نسبة أو مجموعة. 20 , 21 , 22 على الرغم من أن هذا أمر ممكن في دمبك/دمبي-دتبا/Ln3 + بيسيليس، تحولها عكسها الحرارية من بيسيلي إلى حويصلات عند تدفئة العروض إضافة خيارات للخياطة. يعني الميكانيكية مثل قذف من خلال مرشحات غشاء يسمح تشكيل الحويصلات. يتم إعادة إنشاء بيسيليس اليجنابل مغناطيسيا عند التبريد إلى 5 درجة مئوية وهي تملي أبعادها من السلائف حويصلة. 11 هيرين، نحن نركز على إمكانات التصنيع الميكانيكي الإجراءات مع دمبك/دمبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) أو دمبك/تشول-أوه/دمبي-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) كالنظم المرجعية. وتعمل العملية المثل عند العمل مع سائر Ln3 + من الخرائط المواضيعية3 +. مجموعة واسعة من الإمكانيات التي تتيحها هذه التقنيات وأبرزت في الشكل 1 ونوقشت باستفاضة في أماكن أخرى. 23

Figure 1
رقم 1: نظرة عامة التخطيطي الإجراءات الممكن تصنيع. درس مغناطيسيا النابل Ln3 + شيلاتينغ بوليموليكولار التجميعات مؤلفة من أما دمبك/دمب-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) أو دمبك/تشول-أوه/دمب-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5). الفيلم الدهن الجاف هو رطب مع عازلة فوسفات 50 مم في قيمة الرقم الهيدروجيني 7.4 وتركيز الدهون الإجمالية 15 ملم. ترطيب فعال للفيلم الدهن يتطلب أما تجميد ذوبان دورات (قدم) أو تدفئة وتبريد دورات (ح & ج). ح & ج دورات ضرورية لتجديد عينات بعد تجميد الماضي ذوبان خطوة، أو لتجديد عينات أبقى مجمدة على مدى فترة طويلة من الزمن إذا كانت ستستخدم دون مزيد من الإقصاء. وتناقش هذه الخطوات على نطاق واسع من إيسابيتيني وآخرون. وتتحقق 23 بوليموليكولار اليجنابل أقصى التجميعات، تسليم أبنية الجمعية مختلفة استناداً إلى تكوين الدهن. حجم بيسيلي واليجنابيليتي المغناطيسي الانضباطي بقذف (تحويله) من خلال مرشحات غشاء نانوبوري. حسبت عوامل بمحاذاة قدمو من زاوية صغيرة في 2D النيوترون نثر (SANS) أنماط دمبك/تشول-أوه/دمبي-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) عينة مقذوف من خلال 800، 400، 200، أو 100 المسام شمال البحر الأبيض المتوسط. بلا قياسات هي وسيلة مكملة للتحديد الكمي للمحاذاة بيسيلي التي لن تكون مشمولة بمزيد من التفصيل هنا. 11 , 16 Aو تتراوح بين-1 (التشتت النيوتروني موازية أو المحاذاة العمودية بيسيليس فيما يتعلق باتجاه المجال المغناطيسي) إلى 0 لنثر الخواص.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ودرست بنية بيسيليس على نطاق واسع بمجموعة واسعة من تقنيات الوصف. 13 تم كمياً محاذاة بيسيليس المعرضة لمجال المغناطيسي باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي أو زاوية صغيرة النيوترون تجارب نثر (بلا). 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 لكن التحول وتوسيع قمم الرنين المغناطيسي النووي تحدث حضور Ln3 + قيود خطيرة على الأسلوب. 15 , 26 , 27 , 28 "بلا على الرغم من أن" التجارب لا تعاني من هذا القيد، بديلة وتقنيات أكثر يسرا ومن المستصوب للقياس الكمي الروتينية لمحاذاة مغناطيسيا مستحث التجميعات في الحل. إنكسار مزدوج القياسات بديلاً صالحاً وبسيطة نسبيا. المثل تكشف قياسات إنكسار مزدوج لتجارب الرنين المغناطيسي، معلومات قيمة بشأن ترتيبات جديدة الدهن والدهن المراحل التي تحدث في بلير. وعلاوة على ذلك، يتم رصد التحولات الهندسية التي تحدث في الجمعية بوليموليكولار مع تغير الظروف البيئية مثل درجة الحرارة. 11 , 12 , 13 , 16 Δn′ مغناطيسيا مستحث إنكسار مزدوج، قد استخدمت لدراسة مختلف أنواع النظم فسفوليبيد. 13 , 29 , 30 مقاييس إنكسار مزدوج استناداً إلى تقنية التحوير المرحلة في مجال المغناطيسي وسيلة فعالة للكشف عن اتجاه بيسيليس. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 إمكانية التحقيق بيسيليس مع إنكسار مزدوج في الحقول المغناطيسية عالية تصل إلى 35 ر كما تجلى ليبي M. et al. 13

عندما يدخل الضوء المستقطبة مادة متباين، سوف يتخلله في موجه العادية وغير العادية. 11 دفعتين بسرعات مختلفة وهي تحول في المرحلة قبل δ التخلف العقلي. يتم قياس درجة التخلف العقلي δ وتحويلها إلى إشارة إنكسار مزدوج Equation 5 لقياس درجة تباين في استخدام المواد

Equation 6(2)

حيث λ هو طول موجه بالليزر ومد هو سمك العينة. فوسفوليبيدات بصريا متباينة، وعلى المحور البصري يتزامن مع محاورها الجزيئية منذ وقت طويل، موازية لذيول الهيدروكربونية. 11 , 12 التخلف العقلي لا يقاس إذا هي الموجه فوسفوليبيدات عشوائياً في الحل. يتم قياس التخلف العقلي عند محاذاة فوسفوليبيدات موازية لبعضها البعض. إنكسار مزدوج مغناطيسيا مستحث Equation 5 يمكن أن يكون علامة إيجابية أو سلبية تبعاً لاتجاه الجزيئات في المجال المغناطيسي؛ انظر الشكل 2. فوسفوليبيدات الانحياز موازية للمحور السيني سيؤدي إلى صورة سلبية Equation 5 ، في حين أن تسفر تلك المنحازة على طول محور ع إيجابية Equation 5 . ويلاحظ لا إنكسار مزدوج المحور البصري عندما تتزامن مع اتجاه انتشار الضوء كما فسفوليبيد محاذاة موازية للمحور الصادي.

Figure 2
الشكل 2: محاذاة فوسفوليبيدات وعلامة المقابلة لانكسار مزدوج مغناطيسيا مستحث Equation 12 . علامة قياس Equation 12 يعتمد على اتجاه فسفوليبيد في المجال المغناطيسي. تشير الخطوط المتقطعة إلى المحور البصري للجزيء. الضوء هو الاستقطاب في 45°، وتنتشر في اتجاه y. المجال المغناطيسي ب في الاتجاه z. وقد تم تعديل هذا الرقم من م. ليبي. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في حالة وقف الغروية الخواص بيسيليس، سيتم اتجاه المستحث بترتيب فوسفوليبيدات في بيلايير فقدان، التصفير δ التخلف العقلي. كما يجب محاذاة بيسيليس بغية توجيه فوسفوليبيدات بصريا النشطة في ما بيلاييرس، مما تسبب في δ التخلف العقلي ضوء الاستقطاب. ونتيجة لذلك، إنكسار مزدوج أداة حساسة لقياس المغناطيسية اليجنابيليتي من الجمعيات بوليموليكولار. بيسيليس محاذاة خط عمودي على المجال المغناطيسي سوف تسفر عن إيجابية Equation 5 ، في حين أن تلك الانحياز مواز سوف تسفر عن سلبية Equation 5 . العلامة يعتمد على المواءمة بين الإعداد وقد راجعت مع عينة مرجعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-التصنيع الداخلي دمبك/دمب-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) وجمعيات دمبك/تشول-أوه/دمب-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) بوليموليكولار

  1. التحضيرات الأولية
    1. أغسل جميع الأواني الزجاجية واسطة بيغ مرة واحدة مع الإيثانول استقرت كلوروفورم (> كلوروفورم 99 ٪) والجافة بالهواء المضغوط.
    2. إنتاج 2 متميزة 10 ملغ/مل حلول الأسهم دمبك ودتبا دمبي في كلوروفورم استقرت الإيثانول (> كلوروفورم 99 ٪)، حل أسهم 10 ملم شول-أوه في كلوروفورم استقرت الإيثانول (> كلوروفورم 99 ٪) وحل أسهم 10 مم تمكل3 في والميثانول.
    3. إعداد المخزن مؤقت فوسفات 50 مم في قيمة الرقم الهيدروجيني 7.4 بخلط 0.121 ز من ثنائي هيدرات فوسفات هيدروجين الصوديوم وز 0.599 اللامائى دي-الصوديوم فوسفات الهيدروجين في 100 مل من النقاوة H2o.
  2. إعداد الفيلم الدهن الجاف
    1. المبالغ المطلوبة من أمفيفيليس (دمبك دتبا دمب واختيارياً شول-OH) و Ln3 + الأسهم الحلول في وزن منفصلة 3 مل الزجاج الأداة الإضافية-كوب مع حقنه زجاجية 2.5 مل.
      1. لحجم عينة 3 مل دمبك/دمب-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1: تركيز الدهون الإجمالية 1، 15 ملم)، تزن 3.6435 ز الحل دمبك الأسهم، 1.4731 ز الحل الأسهم دتبا دمب و 0.7126 ز الحل تمكل الأسهم3 .
      2. لكمية عينة 3 مل من دمبك/تشول-أوه/دمب-دتبا/Tm3 + (16:4:5:5 نسبة المولى، وتركز الدهون الإجمالية 15 ملم)، في 2.9148 ز الحل الأسهم دمبك ز 1.4731 الحل الأسهم دتبا دمب و 1.0749 غ من محلول الأسهم شول-يا وز 0.7126 من وزن الحل تمكل الأسهم3 .
        تنبيه: كلوروفورم الميثانول والسامة والمتفجرة في درجة حرارة الغرفة. تعمل تحت غطاء دخان والمضي قدما على وجه السرعة مع القياسات الشامل.
    2. نقل محتوى الأداة الإضافية-كوب مل 25 جولة قارورة السفلي. مسح كل الأدوات الإضافية-كأس في قارورة أسفل جولة مع حوالي 2.5 مل المذيب المقابلة.
    3. إزالة المذيب تحت فراغ في مبخر دوراني عند 40 درجة مئوية. تعيين الضغط الأولى إلى 30 000 السلطة الفلسطينية حتى تتم إزالة معظم المذيبات. الحد من الضغط على 100 الجاف العينة تحت التناوب لحد أدنى من 2 حاء والسلطة الفلسطينية الحصول على فيلم دهن جاف موحدة على جدران زجاجية قارورة.
    4. ضع الفيلم الدهن الجاف لمدة 1 دقيقة تحت دفق مستمر من الأرجون تجنب الأكسدة الدهنية في الهواء وتخزين العينة في الثلاجة قبل الإماهة.
  3. ترطيب الفيلم الدهن الجاف
    1. إضافة مل 3 من المخزن المؤقت للفوسفات إلى قارورة أسفل جولة للوصول إلى تركيز دهن الكلي من 15 ملم.
    2. القيام بدوره (قدم) ذوبان تجميد التي تغرق قارورة تحت التناوب في النتروجين السائل حتى يتم تجميد شامل (توقف النتروجين السائل المغلي)، ثم الحرارة مرة أخرى تصل إلى 60 درجة مئوية قبل وضع العينة لمدة 5 دقائق في حمام مائي، يحوم في قارورة باستمرار إلى المساعدة في عملية الصهر. تطبيق 30 s فورتيكسينج قبل كل دورة التجميد عندما تكون العينة السائلة المعونة الماء الفيلم الدهن.
      ملاحظة: الفيلم الدهن لا يجب أن تكون مرئية على جدران قارورة بعد تجميد الثانية دورة ذوبان.
    3. كرر 1-3-2 مجموع خمس مرات. إغلاق قارورة مع غطاء لتجنب التبخر لا لزوم لها للفوسفات المخزن المؤقت عندما تكون العينة الساخنة. قد يكون مؤقتاً في البروتوكول عندما يتم تجميد العينة.
    4. المضي قدما إلى اثنين من تدفئة وتبريد (ح & ج) دورات تستقر عينة الخروج من آخر خطوة التجميد، أو تبقى مجمدة لمدة تصل إلى شهرين. حرارة العينة إلى 40 أو 60 درجة مئوية دمبك/دمبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) أو دمبك/تشول-أوه/دمبي-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5)، على التوالي، قبل التبريد إلى 5 درجة مئوية في 1 درجة مئوية/دقيقة الحفاظ على العينة 5 دقيقة في الحد الأقصى والحد الأدنى درجات الحرارة دورة.
    5. الآن، أما تحديد إشارة إنكسار مزدوج من العينة في حقل مغناطيسي خارجي (الخطوة 2) أو كذلك قذف العينة لتكييف أبعاد بيسيلي والمغناطيسية اليجنابيليتي (الخطوة 1، 4).
      ملاحظة: دمبك/دمبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) عينات هي تتألف أساسا من بيسيليس قطره يعني هيدرودينامية دح 70 نانومتر كما كشف بتوزيع أرقام تم الحصول عليها من تشتت الضوء الحيوي (DLS) القياسات في 5 درجة مئوية. هذه العينات تحتوي أيضا على الجمعيات بوليموليكولار أكبر مع د يعنيح 500 نانومتر كما يتبين من توزيع كثافة. دمبك/تشول-أوه/دمبي-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) العينات غاية بوليديسبيرسي في الحجم مع توزيع كثافة نموذجي الكشف عن د يعنيح 700 نانومتر، بينما تكشف توزيع عدد سكان تهيمن أصغر بيسيليس في نطاق حجم 200 نانومتر. توزيع حجم أكثر تفصيلاً والبرد صور المجهر الإلكتروني انتقال هذه العينات قد أبلغت عن إيسابيتيني et al. 23
  4. البثق للجمعيات بوليموليكولار.
    1. تجميع الطارد كما هو مبين في الشكل 3. استخدام قفازات وملاقط مع حماية أنابيب السليكا للمناولة. ويت ورق الترشيح (5) مع بضع قطرات من المخزن المؤقت للسماح لموضع أمثل لتصفية الأغشية (6). تأكد من أن الورقة قد لا طيات بعد وضع الدائري (7) على أعلى.
      ملاحظة: تم اختبار عملية البثق على غشاء فلاتر (6) مع قطر مسام من 800 و 400، 200 و 100 نانومتر؛ انظر الشكل 7.
    2. تعيين حمام المياه إلى 40 درجة مئوية دمبك/دمبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) عينات أو 60 درجة مئوية دمبك/تشول-أوه/دمبي-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) عينات لضمان تشكيل الحويصلات اكسترودابل.
    3. الاتصال في الطارد لزجاجة نيتروجين مضغوط باستخدام أنبوب بولي كلوريد الفينيل ذات الضغط العالي (> 4 الآلام والكروب الذهنية) مجهزة بمحولات سيرتو وقذف المواد السائلة عبر الغشاء. 1 ميغاباسكال الضغط مطلوب عادة لقذف من خلال مرشحات غشاء (6) مع قطر مسام من 200 نانومتر والمذكورة أعلاه. 1.5-2.5 MPa مطلوبة للمرشحات الغشاء أصغر (6) مع قطر مسام من 100 نانومتر.
      ملاحظة: تغيير عامل تصفية الغشاء إذا طبيعي الضغوط العالية (> 2.5 ميغاباسكال) مطالبون بقذف العينة (وهذا هو أول بادرة من انسداد).
    4. افتح الغطاء (10) وإدراج نموذج استخدام ماصة زجاجية 2 مل. ثم قم بإغلاق الغطاء (10) وفتح صمام الضغط (12) حين عقد أنبوب منفذ عينة (2). إغلاق صمام الضغط (12) بعد اكتمال دورة البثق والتنفيس وتواصل مع الدورة القادمة.
      ملاحظة: لا تترك العينة في الاتصال وقتاً طويلاً مع السفينة تغلف الساخنة (8) لتجنب فقدان عينة المفرط بالتبخر.
30-60 ثانية هو ما يكفي من الوقت لمل 3 عينة حجته في الطارد قبل فتح صمام الضغط (12).
  • المضي قدما إلى 10 دورات البثق لبعد مسام غشاء معين كما هو مبين في الشكل 3. معظم النظم بسيلي هي مقذوف 10 مرات من خلال الأغشية يبلغ قطرها 200 وآخر 10 مرات من خلال الأغشية مسام مع قطر مسام من 100 نانومتر، تضمن نموذج القابلية للمقارنة.
  • والآن، تحديد إشارة إنكسار مزدوج من العينة في حقل مغناطيسي خارجي (الخطوة 2).
  • Figure 3
    الشكل 3: الطارد المختبرية المستخدمة للإعداد بسيلي وحويصله- يتم تجميعها في الطارد من أسفل إلى أعلى: (1) جبل، (2) نموذج جمع الفضاء مع أنبوب البلاستيك منفذ 2.4 مم (القطر الداخلي) والدائري، (3) ومش استقرار (4) الكبيرة والصغيرة، (5) تصفية ورقة، مرشحات (6) غشاء، يا الدائري (7)، (8) تغلف السفينة، (9. ) أعلى الغطاء مع اتصال مدخل والضغط، والغطاء (10)، مسامير الفراشة (11)، صمام الضغط (12). ويرد رسماً تخطيطياً الطارد تجميعها من اليمين الجانب. غاز النيتروجين (N2) توفرها وعاء ضغط، والسفينة تغلف (9) متصل بحمام مائي للتحكم في درجة الحرارة. العينة يخضع 10 دورات البثق لأي قطر المسام تصفية غشاء معين (مسار نموذج يظهر باللون الأزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    2-إنكسار مزدوج قياسات دمبك/دمبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) وجمعيات دمبك/تشول-أوه/دمبي-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) بوليموليكولار.

    1. بناء والاتصال الإعداد إنكسار مزدوج كما عرض في الشكل 4 ، وتوفير الطاقة للعناصر الإلكترونية الخاصة بكل منها. لا مكان يم، والعينة، والمستقطب الثاني في مسار الليزر في هذه المرحلة. تجنب الكشف عن ضوء الليزر المنتشرة في ظهره بتغطية الأسطح تعكس، على سبيل المثال الألومنيوم مرآة المكلفين، مع ورقة سوداء.
    2. ضبط المرايا لزيادة كثافة الليزر في الكاشف، الذي يتم تمثيله بكثافة التيار المباشر إلى Equation 7 التي تم الحصول عليها من مرشح تمرير منخفض في الشكل 4B.
      تنبيه: ارتداء حماية العين المناسبة عند ضبط المرايا والتشاور مع مدرب سلامة ليزر إذا كان التلاعب بأشعة الليزر لأول مرة.
    3. تشغيل أول عبرت المستقطب الخطي (الحفاظ على خط عمودي لشعاع الليزر الحادث) إلى أقصى حد ممكن Equation 7 .

    Figure 4
    الشكل 4: التمثيل التخطيطي للإعداد إنكسار مزدوج واتصالات للإشارات الضوئية- A) مغناطيس المغناطيسية فائقة التوصيل إمدادات حقل مغناطيسي تي 5.5. الضوء من ليزر أشباه الموصلات في 635 نانومتر هو الاستقطاب المستقطبات متقاطعة اثنين. المغير فوتويلاستيك يم-90 تعمل على 50 كيلو هرتز مع سعة0 من راد 2.405 ووضعها بين المستقطبات اثنين. العينة يكمن في المغناطيس بين يم والمستقطب الثاني. مرايا الاستقطاب عدم توجيه الضوء من خلال العناصر المختلفة، وأخيراً يتم الكشف عن جهاز الكشف عن صور. التوافقية الأولى والثانية Equation 10 و Equation 11 من إشارة التيار المتردد ترصد، تسمح بحساب إشارة إنكسار مزدوج إعطاء معلومات بشأن اليجنابيليتي المغناطيسي Ln3 + خالب بوليموليكولار التجميعات. ومبومو نموذج متصل بحمام مياه خارجية للتحكم في درجة الحرارة (أزرق). يتم رصد درجة حرارة العينة مع مجس حرارة (أحمر). ب) يتم تغذية الإشارة من الكشف عن صور في ثانية أمر Sallen-مفتاح تمرير منخفض مرشح (إمدادات الطاقة V AC 24) مع وقف إنتاج المواد الانشطارية من تردد 360 هرتز عبر كبل براديد إمدادات طاقة ±12 V DC (3). مرشح تمرير منخفض مقتطفات المكون DC Equation 7 وأوصلها إلى الكمبيوتر-الواجهة (4) من خلال كابل Ω BNC 50. يتم تسليم الإشارة من الكشف عن صور للمكبرات قفل اثنين (الذي استخراج التوافقي الأولى والثانية Equation 10 و Equation 11 ) من خلال كابل Ω BNC 50 (1) & (2). يتم الكشف عن كثافة متناسق بالكشف عن مرحلة حساسة. ونتيجة لذلك، كيم الإشارة إشارة مرجعية لقفل في المكبرات (1f-الإخراج ليم إلى أول قفل في مكبر للصوت والإخراج 2 واو إلى الثانية، متصلة مع BNC 50 Ω الكابلات). يتم تسليم إشارات الإخراج إلى وحدة واجهة الكمبيوتر عن طريق الكابلات Ω BNC 50. اكتساب التناظرية وحدات الحراجية المعتمدة-منظمة العفو الدولية-110 والحركة--سي بي-1 الرقمي الإشارات التي يتم نقلها إلى جهاز الكمبيوتر من خلال كابل RS 232 للرصد. مسبار درجة الحرارة نوع ك متصل أيضا إلى وحدة واجهة الكمبيوتر حيث رقمنة التناظرية اقتناء وحدات الحراجية المعتمدة-سي بي-3 والحراجية المعتمدة-TC-120 الإشارة قبل نقلها إلى جهاز الكمبيوتر من خلال كابل RS 232 للرصد. يتم تعريف ج) صورة للإعداد التخطيطي قدمت في العناصر الرئيسية باء مع الأرقام المقابلة من 1 إلى 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    1. المكان الثانية عبرت المستقطب الخطي عمودي على شعاع الليزر الحادث، كما هو مبين في الشكل 4A. التقليل إلى أدنى حد Equation 7 عن طريق تعيين المستقطب الثاني بزاوية 90 درجة فيما يتعلق بالأولى.
    2. مكان المغير فوتويلاستيك (بيم) في 0° بين المستقطبات الخطية متقاطعة وعمودي على شعاع الليزر الحادث كما هو موضح في الشكل 4A. قم بضبط يم بتردد 50 كيلو هرتز والسعة A0 إلى راد 2.405 كما هو موضح في الشكل 5 ألف. وهذا ما يجعل عنصر DC مستقلة عن إنكسار مزدوج ويعزز Equation 7 .
      ملاحظة: يجوز ضبطها محور بصري يم ببضع درجات للحفاظ على ثابت Equation 7 في الهواء قبل قياس أي عينة.
    3. انتظر ح 1 بعد تشغيل الليزر والمعدات الإلكترونية لتحقيق استقرار الإشارة.
    الإشارة مستقر بمجرد السيارات التدريجي من مكبرات الصوت في سجن لا تزال مستمرة.
  • ضع العينة في ومبومو كوارتز مقطورات بمسار-طول 10 ملم وتوصيله إلى حمام مياه خارجية مبدئياً في 5 درجة مئوية.
  • ضع الحرارية نوع سميكة ك 0.5 مم (درجة حرارة مسبار) مباشرة في العينة لرصد درجة حرارة العينة. تحقق من أن التحقيق لا تتداخل مع أشعة الليزر بوضع ورقة بيضاء في مسار الليزر (بعد ومبومو) وتبحث عن الظلال الناتجة عن التحقيق.
    ملاحظة: هناك فرق 2-3 درجة مئوية بين تسجيل درجة الحرارة حمام الماء ودرجة حرارة العينة.
  • مكان في ومبومو في التجويف المغناطيسي، كما هو مبين في الشكل 4A. ضوء الليزر تنتشر أفقياً من خلال العينة وتحرف بمرايا غير الاستقطاب والكشف عنها بواسطة جهاز الكشف عن صور.
    ملاحظة: هو الليزر الموجه إلى أسفل، ومن خلال العينة، والنسخ الاحتياطي على نفس المسار لمراعاة الآثار فاراداي (أي دوران الطائرة استقطاب الضوء الناجم عن المجال المغناطيسي عند نزول إلغاء عند الخروج مرة أخرى في الاتجاه المعاكس).
  • تطبيق تدفق هواء ثابت من الهواء المضغوط في درجة حرارة الغرفة و 10000 السلطة الفلسطينية بشأن ومبومو تجنب تكثيف مياه على جدران الخلية، مما يقلل كثافة الإشارات وزيادة الضوضاء. وهذا مهم بشكل خاص عندما بلغت قوته 5 درجات مئوية.
  • اكتشاف التوافقية الأولى والثانية Equation 10 و Equation 11 من إشارة التيار المتردد مع اثنين قفل في مكبرات الصوت. المرحلة قفل في مكبرات الصوت بالضغط على زر (2) هو موضح في الشكل 5 (ب) السيارات وضبط الحساسية كما هو مبين في الشكل 5 (ب) (1). تأكد من أن ليس هناك أكثر من أربعة أشرطة حمراء على مكبرات الصوت كما هو موضح في الشكل 5 (ب) (3) لتجنب الحمل الزائد للإشارات. ملاحظة انخفاض حساسية العاملين لكل قفل في مكبرات الصوت في برنامج Tesla_Magnet_Const_V092 كما هو موضح في الشكل 5 (8). وتقدم البرنامج كمعلومات تكميلية.
  • منحدر الحقل المغناطيسي تصل إلى 5.5 طن بتزويد الحالية للمغناطيس عن طريق برنامج Tesla_Magnet_Const_V092 كما هو موضح في الشكل 5 (5).
  • الحصول على إنكسار مزدوج في Equation 5 باستخدام المعادلة 2، حيث يحسب التخلف العقلي مع
    Equation 13(3)
    حيث Equation 14 و Equation 15 وظائف بسل من النوع الأول، مع Equation 16 و Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 قطعة التخلف العقلي في برنامج Tesla_Magnet_Const_V092، كما هو مبين في الشكل 5 (4).
    ملاحظة: التخلف العقلي المقدمة من البرنامج ينبغي أن لا ستستخدم لحساب إشارة إنكسار مزدوج إذا اثنين في سجن من مكبرات الصوت لا تعمل في حساسية نفسه (راجع الخطوة 2، 12). كثافات متناسق تسجيل Equation 10 و Equation 11 يجب أن يكون مضروباً في حساسية قفل في مكبرات الصوت للحصول على الأبعاد الصحيحة. وعلاوة على ذلك، يجب تطبيع إنكسار مزدوج الإشارة المقاسة تحت حقل مغناطيس بطرح إشارة إنكسار مزدوج يعني الحصول على ت. 0
  • رصد إشارة إنكسار مزدوج للعينة في ثابت أو تغيير درجة الحرارة (1 درجة مئوية/دقيقة) من خلال تنظيم درجة حرارة حمام المياه متصلة ومبومو هو مبين في الشكل 4.
  • تسجيل بيانات تجريبية بملء في وصف تجريبي في الشكل 5 (8)، توفير اسم ملف في (9)، والضغط على زر "بدء تسجيل الدخول" (10).
  • Figure 5
    الرقم 5: الرسوم التوضيحية لإعدادات المستخدمين ولقطات من البرنامج- A) إعدادات يم: التخلف العقلي 2.405 راد، الطول الموجي 635 نانومتر، تردد 50 هرتز-الأبيض الدوائر تبين ما هي إعدادات لتنشيط (USR = تخلف المعرفة من قبل المستخدم، لوك = الوضع المحلي للعملية). ب) في قفل إعدادات مكبر للصوت. الحساسية (1) قد يتم اختيارها من قبل كل قياس كما هو مطلوب في خطوة 2.11. لا ينبغي أكثر من أربعة أشرطة حمراء على الشاشة (3) لتجنب إشارة زائد. يحدث التحميل زائد عند يضيء الأحمر أدت في (1)، مما يجعل من المستحيل قياس. اضغط على الزر المرحلة السيارات (2) قبل كل قياس. ج) لقطات البرنامج Tesla_Magnet_Const_V092 المقدمة كمعلومات تكميلية. هذا البرنامج يتيح السيطرة على المجال المغناطيسي وتسجيل جميع نواتج الإشارة كدالة للزمن. يتم رسمها بقوة الحقل المغناطيسي ودرجة حرارة العينة في (1). التوافقية الأولى والثانية Equation 10 و Equation 11 من إشارة التيار المتردد تقاس اثنين في سجن من مكبرات الصوت يتم رسمها في (2). كثافة التيار المباشر Equation 7 المرسومة في (3). يحسب كما هو موضح في الخطوة 2، 13 التخلف العقلي والمرسومة في (4). يتم تعيين قوة الحقل المغناطيسي في (5). القياس المباشر لدرجة حرارة سجلتها الحرارية "ك نوع" يرد في (6) وإشارات الإخراج (Equation 23 و Equation 22 ) في (7). قد يكون إدراج معلومات إضافية عينة في (8) مثل حساسية العاملين مكبرات الصوت، واسم العينة، إلخ. قد يتم تسجيل البيانات وتصديرها إلى ملف.txt في (9). بدء وإيقاف الحصول على البيانات باستخدام الزر "بدء تسجيل الدخول" (10). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    إشارة إنكسار مزدوج غير مقذوف دمبك/دمبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) عينة تم رصدها في إطار حقل مغناطيسي تي 5.5 خلال تدفئة والتبريد دورة من 5 إلى 40 درجة مئوية، ومرة أخرى بمعدل 1 درجة مئوية/دقيقة (الشكل 6). وأكدت نتائج إنكسار مزدوج التحالفات مغناطيسية عالية في 5 درجة مئوية بقيمة 1.5 × 10-5، مرتين كقوى فيما يتعلق بنظم مقذوف المبلغ عنها. 6 , 7 , 23 التصفير إنكسار مزدوج الإشارة أعلاهم تي من دمبك في 24 درجة مئوية بسبب تشكيل حويصلات غير اليجنابل. آثار ظهور الحركة المرحلة السائلة اضطرابه ترتيبات جديدة رئيسية في الجمعيات بوليموليكولار. هذه ترتيبات جديدة يتم عكسها الحرارية. تم إعادة إنشاء الأنواع النابل عند التبريد أدناه تيم ويتبع إشارة إنكسار مزدوج الاتجاه نفسه كما في التدفئة. علامة قمم المتميزة التي تحدث حول تيم استبدال التجميعات النابل من حويصلات غير النابل. 23 حركية بطيئة لترتيبات جديدة الجزيئية فيما يتعلق بتطبيق التدفئة والتبريد معدل 1 درجة مئوية/دقيقة توضح لماذا لم تكن متداخلة على قمم. بدلاً من ذلك، بدأت كل القمم في تيم من دمبك، مما يوحي بأن الدهون بلير يجب أن يكون على درجة معينة من النظام لصالح تشكيل الأنواع النابل.

    Figure 6
    الشكل 6: إنكسار مزدوج الإشارة كدالة لدرجة الحرارة لغير مقذوف دمبك/دمبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) عينة عند التدفئة (أحمر) والتبريد (أزرق) في 1 درجة مئوية/دقيقة وقد أعد العينة اتباع الخطوات البروتوكول 1 إلى 1.3.5. وأجريت قياسات إنكسار مزدوج بعد أن البروتوكول الخطوة 2. وقد رفعت قوة الحقل المغناطيسي تصل إلى 5.5 طن وأبقى العينة عند درجة 5، تحقيق إشارة إنكسار مزدوج من 1.5 × 10-5 قبل الشروع في دورة التدفئة والتبريد. فلاتلينيس إشارة إنكسار مزدوج في درجات الحرارة فوق 35 درجة مئوية حيث لوحظ لا الانحياز كالعينة فقط يتكون من الحويصلات. عند التبريد، تم إعادة إنشائها في بيسيليس وتحقق إشارة إنكسار مزدوج نهائي 7.2 × 10-6 في 5.5 طن و 5 درجة مئوية. وقد رفعت قوة الحقل المغناطيسي وصولاً إلى 0 ر وقد أبقى على العينة في 5 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    دمبك/تشول-أوه/دمب-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) عينة كان رطب بعد التدفئة والتبريد الداخلي في الخطوة 1-3-4 وفي وقت لاحق مقذوف 10 مرات عند 60 درجة مئوية من خلال مرشحات غشاء المسام مختلفة الأحجام، راجع الخطوة 1، 4. عند 60 درجة مئوية، تجميع خليط الدهن إلى حويصلات، التي تشكلها عملية البثق. 16 , 35 , 36 , بعد الانتهاء البثق، 37 تم إعادة إنشاء في بيسيليس بالتبريد إلى 5 درجة مئوية وقطر هيدرودينامية دح تم قياسه بواسطة دائرة الأراضي والمساحة. تم تقييم اليجنابيليتي المغناطيسي بيسيليس في 5 درجة مئوية بالحوسبة Aو مع بلا الساعة 8 ر وقياس الإشارات إنكسار مزدوج على 5.5 طن؛ انظر الشكل 7. تم الحصول على إشارة إنكسار مزدوج التعلية الحقل تصل إلى 5.5 طن والعودة إلى 0 ر كما هو موضح في الشكل 7 ألف. وقع إنكسار مزدوج الذروة في 5.5 طن حيث كان من المتوقع وفقا للمعادلة 1 أعلى درجة من التوافق. وخفضت قطر هيدرودينامية دح بيسيليس إلى 220 و 190، 106، و 91 شمال البحر الأبيض المتوسط بالألمنيوم المتعاقبة من خلال الأغشية ذات أحجام مسام من 800 و 400، 200، و 100 نانومتر على التوالي. كان انخفاض مماثل في محاذاة المغناطيسي أكدت إشارة إنكسار مزدوج التناقص والانخفاض في المطلقو بينما كانت تقترب من الصفر في الرقم 7B. وأكدت النتائج إمكانية التحكم في حجم بسيلي والمحاذاة المغناطيسي عن طريق الخياطة من الحويصلات بقذف عند 60 درجة مئوية والتبريد مرة أخرى إلى 5 درجة مئوية.

    Figure 7
    الشكل 7: محاذاة المغناطيسي دمبك/تشول-أوه/دمب-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) عينة مقذوف من خلال مرشحات غشاء لمختلف أبعاد المسامية. A) Δn′ إشارة إنكسار مزدوج كدالة لقوة الحقل المغناطيسي ب عند التعلية صعودا وهبوطاً للعينة مقذوف من خلال 800 نانومتر المسام. وتم التوصل إلى إنكسار مزدوج الذروة في 5.5 طن وفقا للمعادلة 1. وترد هذه القيمة القصوى إنكسار مزدوج في ب)- وكان مقذوف نفس العينة من خلال 400 نانومتر المسام. المحاذاة المغناطيسي تم تقييم كل القياسات إنكسار مزدوج (المربعات السوداء) في 5.5 طن (المثل لما حدث للخطوة السابقة البثق في ألف)، وحساب عوامل المحاذاةو (دوائر حمراء) في 8 ر المرسومة كدالة قطر هيدرودينامية دح التي حصل عليها DLS. وجرى تقييم المحاذاة المغناطيسي المثل على نفس العينة مقذوف من خلال 200 نانومتر المسام، والمرة الأخيرة بعد القذف من خلال 100 نانومتر المسام. وأجريت جميع القياسات في 5 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    عرض مفصل لكيفية استخدام مقاييس إنكسار مزدوج في تركيبة مع بلا تجارب لتقييم الطرق لتوليد استجابة عالية مغناطيسيا Ln3 + خالب فوسفوليبيدات الجمعيات في إيسابيتيني et al. 23 البروتوكولات تلفيق المقترحة تنطبق أيضا للجمعيات التي تتألف من فوسفوليبيدات إثيوبية ودب دتبا أطول أو لتلك التي تحتوي على مشتقات ستيرويد المهندسة كيميائيا في بيلايير بهم. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 والشرط الوحيد هو أن يتم تسخين العينة بدرجات حرارة عالية بما فيه الكفاية في الخطوات 1.3.2 1.3.3 و 1.3.4 و 1.4.2. يجب أن تسمح درجات حرارة الدهون بلير الدخول في مرحلة اضطرابه سائلة، مما ترطيب الأمثل التجديد الفيلم أو عينة الدهن الجاف. إثيوبية/دبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) جمعيات، على سبيل المثال، تحتاج إلى تسخين فوق المرحلة الانتقالية درجة حرارة إثيوبية في 42 درجة مئوية، في حين أن النظام القائم على دمبك مماثلة يجب أن تكون ساخنة أعلاه 24 درجة مئوية. درجة حرارة عالية بما فيه الكفاية ضروري أيضا لضمان تشكيل الحويصلات اكسترودابل التي تحدث عندما يكون بلير الدهن في حالة اضطرابه في الخطوة 1، 4. دورات ذوبان التجميد في خطوة 1-3-2 يجوز الاستعاضة تماما ح & ج دورات. 23 ومع ذلك، يحتاج إلى مزيد من الوقت لهيدرات تماما الفيلم المادة الدهنية مع هذا الإجراء العينة ويجب أن تكون فورتيكسيد 20 دقيقة عند الساعة 5 درجة مئوية و 2 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ح إضافي & ج دورات يتم الاضطلاع بها إذا ما زال يلاحظ عناصر الفيلم الدهن الجاف على جدران زجاجية قارورة.

    الخرائط المواضيعية3 + شيلاتينغ بيسيليس قدم في هذا البروتوكول محاذاة خط عمودي على اتجاه المجال المغناطيسي. ينشأ هذا الاتجاه المحاذاة من قابلية مغناطيسية إيجابية كبيرة Tm3 +. 11 , 14 أيونات لانثانيدات الأخرى مثل دي3 + والماليزي3 + يمكن أيضا أن تطبق. 11 , 13 , 19 تباين مغناطيسية مختلفة Ln3 + يوفر وسائل إضافية للخياطة محاذاة المغناطيسية بيسيليس. على سبيل المثال، دي3 + يعزز قابلية مغناطيسية سلبية جوهرها فوسفوليبيدات بلير، أدى إلى درجة عالية من محاذاة بيسيليس موازية لاتجاه المجال المغناطيسي. 13 تم الكشف عن هذا التغيير في اتجاه المحاذاة بإجراء تغيير في علامة إشارة إنكسار مزدوج وعوامل المحاذاة المحسوبة من 2D متباين بلا أنماط. من المهم أن نلاحظ أن قابلية مغناطيسية لا تمليه فقط بطبيعة الكيميائية Ln3 + ولكن بهندسة كلات Ln3 +-فسفوليبيد المعقدة. 19 , 38 يجوز هندسيا قابلية مغناطيسية بتجميع مختلف Ln3 + خالب هيدجروبس فسفوليبيد، تحديد الاستجابة المغناطيسية للتجميعات الناتجة. 38

    كل عينة بصريا مختلفة تبعاً لطبيعة الدهون التي تشكل المستخدمة. رصد التعكر العينة كدالة لدرجة الحرارة وسيلة مكملة لتقييم درجة الحرارة الناجمة عن التحولات الهيكلية في الجمعيات. على الرغم من أن هذه القياسات تجري عادة في حالة عدم وجود حقل مغناطيسي في جهاز المطياف الضوئي، رصد كثافة التيار المباشر الليزر Equation 7 في إعداد هذه الوثيقة واقترحت يقدم نفس المعلومات حضور المغناطيسي الحقل. 11 , دمبك/دمبي-دتبا/Tm 16 3 + (المولى نسبة 4:1:1) عينات عادة أقل عكر نظرائهن شول-أوه المحتوية على دمبك/تشول-أوه/دمبي-دتبا/Tm3 + (نسبة المولى 16:4:5:5) في 5 درجة مئوية. العينات التي تشبه الماء في 5 درجة مئوية عموما ليست النابل في حقل مغناطيسي. في غرفة درجة الحرارة، كلا عينات تبدو شفافة لأنه دمبك/دمب-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) عينات في مرحلة انتقالية بين بيسيليس وحويصلات وتظهر ثقوب كبيرة متحدة في دمبك/تشول-أوه/دمب-دتبا/Tm3 + بيسيليس (نسبة المولى 16:4:5:5). 11 , 16 , 23 حالة انتقالية بيسيليس إلى حويصلات في دمبك/دمب-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) هو أيضا يترافق مع زيادة في اللزوجة العينة في درجة حرارة الغرفة. هذا التغيير تعتمد على درجة الحرارة في تعكر يجعل اختيار حساسية الصحيح في الخطوة 2.11 صعبة. إذا يتم ضبط الحساسية عالية جداً على عينة عكر في 5 درجة مئوية، قد يسبب طبيعة أكثر شفافية من العينة في تدفئة زائد مكبرات الصوت. وعلاوة على ذلك، عينات عكر جداً ستزيد إلى حد كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء وقد لا تكون مناسبة لقياس إنكسار مزدوج. يجب أن يكون ضوء الليزر قادرة على الذهاب من خلال العينة من أجل الكشف عن.

    مقذوف عدم العينات دائماً أكثر عكره ولديهم الميل إلى تجميع عند التخزين على المدى القصير في الثلاجة. ومع ذلك، سهولة إعادة إنشاء العينات مغناطيسيا متجاوبة مع ح & دورة ج. كما يمكن تخزين العينات عدم مقذوف في حالة تجمد، وسهولة إعادة إنشاء طريق ح & ج دورات. يوضع في الثلاجة عينات مقذوف ويقاس عادة في غضون أسبوع بعد إعداد العينة. لا توجد دراسات تقريرا عن فترة طويلة تخزين الأنواع العلف في سائل أو دولة مجمدة. ولذلك، لا يمكن ضمان توزيع حجم التجميعات التي تم الحصول عليها من قذف على مخزن لفترات طويلة.

    المثل لأي نظام بسيلي، هذه التجميعات مستو مغناطيسيا النابل موجودة فقط في مجموعة محددة من تكوين الدهن وتركيز. سيؤدي إلى تغيير نسب الدهون في أبنية الجمعية المختلفة، بما في ذلك تشكيل المذيلات وشرائط وحويصلات. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 تركيز العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة في خطوة 1-1-3 تلعب دوراً حاسما في تشكيل بيسيليس واستجابتها المغناطيسية. المخزن المؤقت الذي يعرف التفاعلات الفيزيائية-الكيميائية تنظم ماء البيئة المحيطة بالجمعيات بوليموليكولار. تركيزات أقل من المخزن المؤقت يؤدي إلى أبنية الجمعية المختلفة، في حين تسبب تركيزات أعلى تجميع العينة وهطول الأمطار بسبب فحص مقابل فائض.تحت الظروف الحمضية مع قيم الأس الهيدروجيني بين 3 و 4، هي مويتيس حمض الكربوكسيلية بوصفه يغاندس دمبي-دتبا/Ln3 + مجمع البروتونية. وهذا يسفر عن تدمير الجمعيات بوليموليكولار استجابة مغناطيسيا، لاحظ بالتجميع وهطول الأمطار في العينة. وقد تستجيب مغناطيسيا Ln3 + بوليموليكولار الجمعيات مقاومة معقولة نحو قيم الأس الهيدروجيني أكثر أساسية. ومع ذلك، دمبك/دمبي-دتبا/Tm3 + (المولى نسبة 4:1:1) عرضت بيسيليس لتفريق في المذيلات في قيم الأس الهيدروجيني من 12.9. 11 يجب ابدأ أن تكون العينات عرضه بماء الصنبور أو الأملاح الأخرى. أي أيون الأخرى سوف تخل Ln3 + خالب العملية أو يؤدي إلى تجميع الجمعيات بسبب رسوم الفحص. لبلا قياسات، أعد المخزن المؤقت كما هو موضح في الخطوة 1-1-3 د2س بدلاً من النقاوة ح2O. علما أن قراءة العداد pH 7.0 (المقابلة لقيمة المشتريات من 7.4).

    التحولات الهيكلية التي تحدث في بوليموليكولار الجمعيات تخضع لتدفئة والتبريد دورة يتم عكسها الحرارية. ولذلك ينبغي الإشارة إنكسار مزدوج النهائي في 5 درجة مئوية نفس قبل الدورة درجة الحرارة. 11 , 16 إذا إشارة إنكسار مزدوج أعلى بعد الدورة، العينة قد لا بشكل صحيح إعادة إنشاء في الخطوة 1.3.4. وهذا يحدث عادة في العينات المخزنة لفترة طويلة من الزمن. أدنى إشارة إنكسار مزدوج بعد دورة درجة الحرارة كما هو ملاحظ في الشكل 6 يشير إلى وجود مشكلة في برنامج الإعداد التجريبية. الأكثر شيوعاً، انزعجت مسار ضوء الليزر بإعادة نثر أو كائن آخر. وهذه مشكلة خاصة مع مسبار درجة الحرارة إدراجها مباشرة في العينة (راجع الخطوة 2.8) التي ينبغي أن توضع بشأن عدم التدخل في المسار المباشر لضوء الليزر. مسار ضوء الانزعاج أسباب انخفاض Equation 7 ، إشارة صاخبة، و/أو قمم غير طبيعي في المنحنيات إنكسار مزدوج-درجة الحرارة. على سبيل المثال، الذروة التي تحدث في تدفئة في حوالي 35 درجة مئوية في الشكل 6 بسبب توسع أنابيب الماء إلى المسار المباشر لضوء الليزر. قد لا تكون إشارة إنكسار مزدوج موثوق به من هذه النقطة فصاعدا. على الرغم من أن الشكل العام لمنحنى التبريد العادي، بسبب إشارة إنكسار مزدوج أقل الحصول على 5 درجة مئوية التدخل.

    إنكسار مزدوج القيم التي تم الحصول عليها من أثر هذا البروتوكول ليست مطلقة ويتم استخدامه لمقارنة العينات فيما بينها. للمقارنة مع قيم الأدب، مطلوب بمعايرة مع نظام مرجعي. على سبيل المثال، يعتمد على المحاذاة للإنشاء العلامة للتخلف العقلي المقاسة وقد راجعت مع التولوين، الذي لديه ثابت القطن-موتون من 3.27 × 109 ر2. 39 , 40

    قد انفصلت إشارة إنكسار مزدوج الناشئة عن التغييرات في محاذاة المغناطيسي للعينة من إشارة الناجمة عن ترتيبات جديدة الجزيئية في بيلايير. حسبت عوامل المحاذاة من بلا 2D متباين الأنماط التي تم الحصول عليها تحت حقل مغناطيسي تتأثر فقط بمحاذاة الجزء الأكبر من الجمعيات بوليموليكولار. الطريقتين يكملان بعضهما البعض والسماح بفصل المساهمات إلى إشارة إنكسار مزدوج. يمكن أن يكون الكمال الإعداد المقترحة إنكسار مزدوج عن طريق تقسيم شعاع الليزر، مما يسمح للرصد المتزامن للعينات مع أو بدون التعرض للمجال المغناطيسي الخارجي. يمكن تطبيعها إنكسار مزدوج النتائج المتحصل عليها للعينة في المجال المغناطيسي بالإشارات التي تم الحصول عليها للعينة في 0 ر، فعالية المحاسبة للخلفية.

    مقاييس إنكسار مزدوج لا تقتصر على التحديد الكمي لمحاذاة بيسيليس المغناطيسي. مواد لينة عديدة تولد إشارة إنكسار مزدوج بسبب ترتيب هيكلها الداخلي. يسمح الإعداد المقترحة لرصد إنكسار مزدوج لمثل هذه المواد كدالة لدرجة الحرارة مع أو بدون حقل مغناطيسي خارجي. ألياف أورجانوجيل انثراسين، المذيلات وورمليكي تحت التدفق والسليولوز خوصات اميلويد-الحديد3س4 ييفات هي بضعة أمثلة السلوك إنكسار مزدوج التي قيمت بنجاح مع الإعداد المقترحة. 29 , 30 , 32 , 41

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgments

    يعترف الكتاب "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" لتمويل سمهاردبي (المشروع رقم 200021_150088/1). وأجريت تجارب بلا مصدر النيوترون النيترونات السويسرية سينك، معهد بول شيرر، فيليجين، سويسرا. يشكر المؤلفون ترحيبا حارا الدكتور يواكيم كوهلبريتشير لقيادته مع التجارب بلا. إعداد قياس إنكسار مزدوج تحت المجالات المغناطيسية عالية مستوحاة من الإعداد الموجودة في عالية-الحقل المغناطيسي مختبر هفمل، نيجميجن، هولندا. ونحن نشكر فيستر برونو لمساعدته في تطوير إلكترونيات الإعداد إنكسار مزدوج، يان كورسانو ودانيال كييتشل لبناء أطر تسمح بالمحاذاة الدقيقة والسطحية من الليزر، والدكتور برنهارد كولر للدعم التقني المستمر.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics