Procedimientos de fabricación y medidas de birrefringencia para diseñar Ion lantánido magnéticamente sensibles quelantes ensamblajes de fosfolípidos

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Summary

Se presentan procedimientos de fabricación para el ion lantánido altamente magnéticamente sensibles quelantes conjuntos polimoleculares. La respuesta magnética se basa en el tamaño de la Asamblea, que se adapta por extrusión a través de membranas nanopore. Las Asambleas alignability magnética y los cambios estructurales inducidos por la temperatura son monitoreados por las mediciones de birrefringencia, una técnica gratuito para resonancia magnética nuclear y dispersión de neutrones de ángulo pequeño.

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Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

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Abstract

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco ajustables formados de una gran variedad de mezclas de lípidos. Las aplicaciones van desde estudios estructurales de proteínas de membrana por resonancia magnética nuclear (RMN) a desarrollos nanotecnológicos incluyendo la formación de geles ópticamente activos y magnéticamente conmutables. Estas tecnologías requieren un control alto del tamaño de la Asamblea, respuesta magnética y resistencia térmica. Mezclas de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfocolina (DMPC) y sus iones lantánidos (Ln3 +) quelante conjugado de fosfolípidos, 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfo-etanolamina-dietilenglicol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), montar en conjuntos altamente magnéticamente sensibles tales como DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (proporción molar de 4:1:1) bicelles. Introducción de colesterol (Chol-OH) y derivados esteroides en la bicapa resulta en otro conjunto de ensamblados que ofrece propiedades fisico-químicas únicas. Para una composición de lípidos determinado, la alignability magnética es proporcional al tamaño del bicelle. La complejación de Ln3 + resulta en respuestas magnéticas sin precedentes en términos de magnitud y alineación de dirección. El colapso de la termo-reversible del disco-como las estructuras en vesículas al calentarse permite adaptación de dimensiones de las asambleas por extrusión a través de filtros de membrana con tamaño de poro definido. Las bicelles magnética alignable se regeneran por refrigeración a 5 ° C, resultando en conjunto las dimensiones definidas por los precursores de la vesícula. En este documento, se explica este procedimiento de fabricación y el alignability magnético de las Asambleas se cuantifica por mediciones de birrefringencia bajo un campo de magnético 5.5 T. La señal de la birrefringencia, procedente de la bicapa de fosfolípidos, además permite la monitorización de polimoleculares cambios que ocurren en la bicapa. Esta técnica simple es complementaria a los experimentos de NMR que comúnmente se emplean para caracterizar bicelles.

Introduction

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco como de numerosas mezclas de lípidos. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 son ampliamente utilizados para la caracterización estructural de biomoléculas de membrana por espectroscopia de RMN. 6 , 7 sin embargo, los esfuerzos recientes tienen por objeto ampliar el campo de posibles aplicaciones. 5 , 8 , 9 el sistema de bicelle más estudiado se compone de una mezcla de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfocolina (DMPC), constituyendo la parte plana de la Asamblea y 1, 2-dihexanoyl -sn- glycero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolípido que cubre el borde. 1 , 2 , 3 la geometría molecular de las composición de la bicapa de fosfolípidos determinan la arquitectura de la estructura de uno mismo-montado polimoleculares. 4 , 5 reemplazo de DHPC con DTPA DMPE genera sistemas de bicelle altamente magnético sensible y armonioso. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (proporción molar de 4:1:1) bicelles asociado con muchos más iones lantánidos paramagnéticos (Ln3 +) en la superficie de la bicapa, resultando en una mayor respuesta magnética. 10 por otra parte, reemplazando las moléculas solubles en agua de DHPC con3 + permite DMPE-DTPA/Ln la formación de bicelles resistente a la dilución. 11

Su energía magnética en general, obedece a la alignability magnética de conjuntos polimoleculares planar

Equation 1(1)

donde B es la fuerza del campo magnético, Equation 2 el magnético n constante, el número de agregación y Equation 3 la anisotropía de susceptibilidad diamagnético molecular de las composición de la bicapa de lípidos. Por lo tanto, la respuesta de DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles a los campos magnéticos se adapta por su tamaño (número n total) y el Δχ de anisotropía de susceptibilidad diamagnético molecular. Este último se obtiene fácilmente cambiando la naturaleza de los quelatos Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 introducción colesterol (Chol-OH) u otros derivados esteroides en la bicapa ofrece la posibilidad de templar el agregado número n y la Δχ de la susceptibilidad magnética de las Asambleas. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 para una composición de lípidos determinado, asambleas más grandes contienen más lípidos capaces de contribuir a la Emag (n número total más grande), dando lugar a especies más alignable. Por ejemplo, el tamaño de bicelles DMPC/DHPC, convencionalmente se controla a través de la optimización de la concentración de lípidos en relación o total composición. 20 , 21 , 22 aunque esto es posible en DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, su transformación termo-reversible de bicelle vesículas sobre la calefacción ofrece había añadido opciones de adaptación. Mecánica: por ejemplo la extrusión a través de filtros de membrana permite la formación de las vesículas. Las bicelles magnética alignable se regeneran en refrigeración a 5 ° C y sus dimensiones son dictadas a partir de los precursores de la vesícula. 11 adjunto, nos centramos en el potencial de los procedimientos de fabricación mecánica con DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) como sistemas de referencia. El proceso funciona de manera análoga cuando se trabaja con otros Ln3 + que Tm3 +. La amplia gama de posibilidades que ofrecen estas técnicas se destaca en la figura 1 y ampliamente discutido en otros lugares. 23

Figure 1
Figura 1: Descripción esquemática de los procedimientos de fabricación posible. Las estudiadas magnéticamente alignable Ln3 + quelantes polimoleculares asambleas están compuestas de cualquier DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5). La película lipídica seca se hidrata con un 50 mM de tampón fosfato a un pH de 7.4 y la concentración total de lípidos es 15 mM. Una hidratación eficaz de la película de lípidos requiere ya sea congelación descongelación ciclos (FT), o calefacción y ciclos de refrigeración (H & C). H & C ciclos son necesarios para la regeneración de las muestras después de la última helada descongelación paso o regenerar muestras mantuvo congeladas durante un período prolongado de tiempo si han de usarse sin más la protuberancia. Estos pasos se discuten extensivamente por Isabettini et al. Se consiguen 23 polimoleculares máximo alignable asambleas, ofrecer arquitecturas ensamblado diferente basadas en la composición de lípido. El tamaño de la bicelle y la alignability magnética es sintonizable por extrusión (Ext) a través de filtros de membrana nanopore. La alineación presentada factores Af se computaron a partir de patrones de dispersión (SANS) 2D ángulo pequeño neutrón de una DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) muestra que se saca a través de 800, 400, 200 o 100 nm poros. SANS las mediciones son un medio complementario de cuantificación de la alineación de bicelle que no se tratarán más detalladamente en este documento. 11 , 16 elf oscila entre -1 (dispersión de neutrones paralelo o alineación perpendicular de la bicelles con respecto a la dirección del campo magnético) a 0 para dispersión isotrópica.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La estructura del bicelles ha sido extensamente estudiada por una amplia gama de técnicas de caracterización. 13 la alineación de bicelles expuestas a un campo magnético se ha cuantificado mediante espectroscopia RMN o ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) de experimentos. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 sin embargo, el cambio y ensanchamiento de los picos de NMR que ocurre en presencia de Ln3 + son serias limitaciones al método. 15 , 26 , 27 , 28 aunque SANS experimentos no sufren de esta limitación, alternativa y técnicas más accesibles son deseables para la cuantificación rutinaria de alineación magnéticamente inducida de asambleas en la solución. Medidas de birrefringencia son una alternativa viable y relativamente simple. Análogamente a los experimentos de NMR, mediciones de birrefringencia revelan información valiosa sobre los cambios de lípidos y lípidos fases que ocurren en la bicapa. Por otra parte, transformaciones geométricas que se producen en el conjunto polimoleculares con cambio de condiciones ambientales como la temperatura se controlan. 11 , 12 , 13 , 16 Δn′ de birrefringencia inducida magnéticamente se ha utilizado para estudiar varios tipos de sistemas de fosfolípido. 13 , 29 , 30 medidas de birrefringencia basadas en la técnica de modulación de fase en un campo magnético es un método viable para detectar orientación de bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 la posibilidad de investigar bicelles con birrefringencia en altos campos magnéticos de hasta 35 T también fue demostrada por M. Liebi et al. 13

Cuando la luz polarizada entre un material anisotrópico, se refracta en una onda ordinaria y extraordinaria. 11 las dos ondas tienen diferentes velocidades y se cambia de puesto en fase por una δ de retraso. El grado de retardo δ es medido y convertido en una señal de birrefringencia Equation 5 para cuantificar el grado de anisotropía en el material

Equation 6(2)

donde λ es la longitud de onda del láser y d es el espesor de la muestra. Los fosfolípidos son ópticamente anisotropic y su eje óptico coincide con sus ejes moleculares largo, paralelos a la cola de hidrocarburo. 11 , 12 ningún retraso se mide si los fosfolípidos están orientados aleatoriamente en solución. Retraso se mide cuando los fosfolípidos están alineados paralelos uno al otro. La birrefringencia inducida magnéticamente Equation 5 puede tener un signo positivo o negativo dependiendo de la orientación de las moléculas en el campo magnético; Vea la figura 2. Los fosfolípidos alineados paralelos al eje x dará como resultado un negativo Equation 5 , mientras que ésos alineados a lo largo del eje z como resultado positivo Equation 5 . Birrefringencia no se observa cuando el eje óptico coincide con la dirección de propagación de la luz como el fosfolípido alinea paralelo al eje y.

Figure 2
Figura 2: Alineación de los fosfolípidos y el signo correspondiente de la birrefringencia inducida magnéticamente Equation 12 . El signo de la medida Equation 12 depende de la orientación de los fosfolípidos en el campo magnético. Las líneas punteadas indican el eje óptico de la molécula. La luz está polarizada a 45° y se propaga en la dirección y. El campo magnético B es en la dirección z. Esta figura ha sido modificada de M. Liebi. 11 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de una suspensión coloidal isotrópica de bicelles, la orientación inducida por el arreglo de los fosfolípidos en la bicapa se perderá, poner a cero el δ de retraso. La bicelles también debe quedar alineada con el fin de orientar los fosfolípidos ópticamente activos en sus bicapas, causando una retraso δ de la luz polarizada. En consecuencia, la birrefringencia es una herramienta sensible para cuantificar la alignability magnética de conjuntos polimoleculares. Bicelles alineado perpendicularmente al campo magnético producirá un positivo Equation 5 , mientras que ésos alineados paralelos dará una negativa Equation 5 . El signo depende de la alineación de la instalación y se puede verificar con una muestra de referencia.

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Protocol

1. procedimiento fabricación de DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) y DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) conjuntos polimoleculares

  1. Preparaciones preliminares
    1. Lave toda la cristalería por lavado una vez con etanol estabilizado cloroformo (> 99% cloroformo) y seque con aire comprimido.
    2. Producir 2 distintas 10 mg/mL soluciones de DMPC y DMPE-DTPA en cloroformo estabilizado con etanol (> cloroformo 99%), una solución stock de 10 mM de Chol-OH en cloroformo estabilizado con etanol (> cloroformo 99%) y una solución 10 mM de TmCl3 en metanol.
    3. Preparar un 50 mM de tampón fosfato a un pH de 7.4 mezclando 0,121 g de Sodio dihidrogenofosfato dihidrato y 0,599 g de di-sodio anhidro fosfato de hidrógeno en 100 mL de alta pureza de H2O.
  2. Preparación de la película seca de lípidos
    1. Pesar las cantidades necesarias de Anfífilos (DMPC DMPE-DTPA y opcionalmente Chol-OH) y Ln3 + las soluciones madre en snap-tazas de cristal separado 3 mL con una jeringa de vidrio de 2,5 mL.
      1. Para un volumen de muestra de 3 mL de DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (proporción molar de 4:1:1, concentración total de lípidos de 15 mM), peso de 3,6435 g de la solución madre de DMPC, 1,4731 g de la solución madre DMPE-DTPA y 0,7126 g de la solución madre TmCl3 .
      2. Para un volumen de muestra de 3 mL de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (16:4:5:5 de fracción molar, concentración total de lípidos de 15 mM), peso de 2,9148 g de la solución madre de DMPC, 1,4731 g de la solución madre DMPE-DTPA, 1,0749 g de solución madre Chol-OH y 0,7126 g de la TmCl3 solución.
        PRECAUCIÓN: Cloroformo y metanol son tóxicos y son volátiles a temperatura ambiente. Trabajar bajo una campana de humos y continuar rápidamente con las mediciones de masa.
    2. Transferir el contenido de las tazas de complemento a un 25 mL redondo matraz de fondo. Lave cada copa del broche de presión en el matraz de fondo redondo con alrededor de 2,5 mL del disolvente correspondiente.
    3. Eliminar el disolvente al vacío en un evaporador rotatorio a 40 ° C. Ajuste la presión inicial a de 30 000 Pa hasta que se elimine la mayor parte del solvente. Reducir la presión de 100 Pa y secar la muestra en rotación durante un mínimo de 2 h. obtención una película uniforme seco lípidos en las paredes de vidrio del frasco.
    4. Coloque la película lipídica seco durante 1 minuto en una corriente de argón para evitar la oxidación lipídica en aire y almacenar la muestra en el congelador antes de rehidratación constante.
  3. Hidratación de la película seca de lípidos
    1. Añadir 3 mL de tampón fosfato al matraz de fondo redondo para alcanzar una concentración total de lípidos de 15 mM.
    2. Llevar a cabo un ciclo hielo-deshielo de (FT) hundiendo el matraz bajo rotación en nitrógeno líquido hasta que está completamente congelado (las paradas de nitrógeno líquido hirviendo), luego calentar hasta 60 ° C de nuevo colocando la muestra durante 5 min en un baño de agua, girando el frasco continuamente a ayuda el proceso de fusión. Aplicar 30 s de Vortex antes de cada ciclo de congelamiento cuando la muestra es líquida para facilitar la hidratación de la película de lípidos.
      Nota: Ninguna película de lípidos debe ser visible en las paredes del frasco después de la segunda congelación ciclo de descongelación.
    3. Repita 1.3.2 un total de cinco veces. Cerrar el frasco con una tapa para evitar la evaporación innecesaria del buffer fosfato cuando la muestra está caliente. El protocolo puede pausarse cuando la muestra es congelada.
    4. Proceder a dos de calefacción y refrigeración (H & C) ciclos para estabilizar la muestra saliendo de la última etapa de congelación, o mantener congelado hasta por dos meses. Calentar la muestra a 40 o 60 ° C para DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5), respectivamente, antes de la refrigeración a 5 ° C a 1 ° C/min mantener la muestra 5 minutos en máximo y mínimo temperaturas del ciclo.
    5. Ahora, ya sea determinar la señal de la birrefringencia de la muestra en un campo magnético externo (paso 2) o más, sacar la muestra para ajustar las dimensiones de bicelle y alignability magnética (paso 1.4).
      Nota: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) las muestras se componen principalmente de bicelles con un diámetro hidrodinámico medio DH de 70 nm según lo revelado por una distribución de números obtenidos de mediciones de la dispersión ligera dinámica (DLS) a 5 ° C. Estas muestras también contienen grandes conjuntos polimoleculares con una media DH de 500 nm según lo revelado por una distribución de intensidad. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) las muestras son muy polidispersas en tamaño con las distribuciones de intensidad típica revelando una media DH de 700 nm, mientras que las distribuciones número revelan una población dominada por pequeños bicelles en el rango de tamaño de 200 nm. Más detallado de las distribuciones de tamaño y crio imágenes de microscopia electrónica de transmisión de estas muestras han sido reportados por Isabettini et al. 23
  4. Extrusión de los conjuntos polimoleculares.
    1. Montar la extrusora como se muestra en la figura 3. Utilizar guantes y pinzas con tubos de silicona para la manipulación de protección. Moje el papel de filtro (5) con unas gotas de buffer para permitir una óptima colocación del filtro de membrana (6). Asegúrese de que el papel no tiene pliegues después de colocar la junta tórica (7) en la parte superior.
      Nota: El proceso de extrusión se probó en los filtros de membrana (6) con un diámetro de poro de 800, 400, 200 y 100 nm; Vea la figura 7.
    2. Ajuste el baño de agua a 40 ° C para DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) muestras o 60 ° C para DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) las muestras garantizar la formación de vesículas de extrusión.
    3. Conecte el extrusor a una botella de nitrógeno a presión utilizando un tubo de PVC de alta presión (> 4 MPa) equipados con adaptadores de serto y extrudir el material líquido a través de la membrana. 1 MPa de presión se requiere para la protuberancia a través de filtros de membrana (6) con un diámetro de poros de 200 nm y superiores. 1.5-2.5 MPa son necesarios para los más pequeños filtros de membrana (6) con un diámetro de poro de 100 nm.
      Nota: Cambiar el filtro de membrana si anormalmente altas presiones (> 2,5 MPa) se necesitan para sacar la muestra (este es el primer signo de obstrucción).
    4. Abrir la tapa (10) e introducir la muestra con una pipeta de vidrio de 2 mL. Luego cierre la tapa (10) y abra la válvula de presión (12) mientras sujeta el tubo de salida de muestra (2). Cierre la válvula de presión (12) después de completa el ciclo de extrusión, de ventilación y continuar con el siguiente ciclo.
      Nota: No deje la muestra en contacto mucho tiempo con el recipiente encamisado caliente (8) para evitar la pérdida excesiva de la muestra por evaporación.
30-60 s es bastante tiempo para una muestra de 3 mL se equilibren en la extrusora antes de abrir la válvula de presión (12).
  • Proceder a 10 ciclos de extrusión para una dimensión de poro de membrana dado como se muestra en la figura 3. La mayoría de los sistemas bicelle se saca 10 veces a través de membranas con un diámetro de poro de 200 y otros 10 veces a través de membranas con poros de diámetro de 100 nm, garantizando la comparabilidad de la muestra.
  • Ahora, determinar la señal de la birrefringencia de la muestra en un campo magnético externo (paso 2).
  • Figure 3
    Figura 3: extrusora de laboratorio utilizado para preparaciones bicelle y vesícula. La extrusora está montada desde la parte inferior hacia arriba: (1) soporte, (2) muestra que recoge el espacio con un tubo de plástico salida de 2,4 mm (diámetro interno) y junta tórica (3) y malla estabilizadora (4) grande y pequeña, (5) papel de filtro, filtros de membrana (6), (7) junta tórica, recipiente (8) encamisado, (9. ) cubierta con cubierta (10), tornillos de mariposa (11), conexión de entrada y la presión, válvula de presión (12) superior. Se muestra un bosquejo de la extrusora montado de la mano derecha. El nitrógeno gaseoso (N2) es suministrada por un recipiente a presión y el recipiente encamisado (9) está conectado a un baño de agua para control de temperatura. La muestra somete a 10 ciclos de extrusión para cualquier diámetro de poro de filtro de membrana dada (ruta muestra en azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    2. medidas birrefringencia de DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) y DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) conjuntos polimoleculares.

    1. Construir y conectar la instalación de birrefringencia como presentado en la figura 4 y suministrar energía a los elementos electrónicos respectivos. No coloque el PEM, la muestra y el segundo polarizador en la trayectoria del laser en este momento. Evitar la detección de luz láser dispersada detrás cubriendo superficies reflectantes, por ejemplo aluminio espejo titulares, con papel negro.
    2. Ajustar los espejos para maximizar la intensidad del láser en el detector, que está representada por la intensidad de la corriente directa Equation 7 obtiene el filtro de paso bajo en la Figura 4B.
      PRECAUCIÓN: Use protección apropiada al ajustar los espejos y consulte con un instructor de seguridad de láser si manipulando láser por primera vez.
    3. Gire el primer polarizador lineal cruzado (mantenido perpendicular al haz láser incidente) para maximizar la Equation 7 .

    Figure 4
    Figura 4: representación esquemática de la configuración de birrefringencia y conexiones de las señales ópticas. A) un electroimán superconductor provee un campo de magnético T 5.5. La luz de un láser diodo de 635 nm está polarizada por dos polarizadores cruzados. Un modulador Fotoelásticos PEM-90 funciona a 50 KHz con una amplitud0 de 2,405 rad y colocado entre los dos polarizadores. La muestra se encuentra en el imán entre el PEM y el segundo polarizador. Espejos de polarización no dirigir la luz a través de los diferentes elementos y es finalmente detectado por un fotodetector. El primer y segundo armónico Equation 10 y Equation 11 de la señal de AC son monitoreados, permitiendo el cálculo de la señal de birrefringencia dando información sobre la alignability magnética del Ln3 + quelantes conjuntos polimoleculares. La cubeta de muestra está conectada a un baño de agua externo para control de temperatura (azul). Se controla la temperatura de la muestra con una sonda de temperatura (rojo). B) la señal del fotodetector se alimenta en un segundo filtro de paso bajo orden de Sallen-Key (fuente de alimentación de 24 V CA) con una frecuencia de 360 Hz corte a través de ±12 V DC braded cable de alimentación (3). El filtro de paso bajo extrae el componente de la C.C. Equation 7 y lo entrega a la interfaz de PC (4) a través de cable BNC 50 Ω. La señal del fotodetector se entrega a los dos amplificadores lock-in (que extrae el primer y segundo armónico Equation 10 y Equation 11 ) a través de un cable BNC 50 de Ω (1) & (2). Las intensidades armónicas son detectadas por un sensible a la fase de detección. En consecuencia, la señal PEM se utiliza como señal de referencia para los amplificadores lock-in (1f-salida del PEM en el primer amplificador lock-in y salida 2f en el segundo, conectado con BNC 50 cables Ω). Las señales de salida se entregan a la unidad de interfaz de la PC a través de cables de BNC 50 Ω. Adquisición analógica unidades PPC-AI-110 y PPC-CB-1 digitalizar la señal que se transfiere a la computadora mediante un cable RS 232 para el control. La sonda de temperatura tipo K también está conectada a la unidad de interfaz de la PC donde adquisición analógica unidades PPC-CB-3 y cFP-TC-120 digitaliza la señal antes de transferir a la computadora mediante un cable RS 232 para el control. C) la imagen de la configuración esquemática en elementos claves de B. se identifican con números correspondientes del 1 al 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    1. Coloque el segundo polarizador lineal cruzado perpendicular al haz láser incidente, como se muestra en la Figura 4A. Minimizar la Equation 7 , colocando el segundo polarizador en un ángulo de 90° con respecto a la primera.
    2. Lugar el modulador Fotoelásticos (PEM) en 0° entre los dos polarizadores lineales cruzados y perpendiculares al haz láser incidente tal como se muestra en la Figura 4A. Ajustar el PEM a una frecuencia de 50 kHz y amplitud A0 a 2,405 rad como se muestra en la figura 5A. Esto hace que la componente de CC independiente de birrefringencia y aumenta la Equation 7 .
      Nota: El eje óptico del PEM puede ajustarse por unos pocos grados para mantener una constante Equation 7 en el aire antes de medir cualquier muestra.
    3. Espere 1 hora después de encender el láser y equipos electrónicos para estabilizar la señal.
    La señal es estable una vez que la eliminación automática de los amplificadores lock-in se mantiene constante.
  • Colocar la muestra en una cubeta de cuarzo de temperatura controlada con una longitud de ruta de acceso de 10 mm y conectarse a un baño de agua externo establecido inicialmente a 5 ° C.
  • Coloque un termopar de tipo grueso K de 0,5 mm (sonda de temperatura) directamente en la muestra a controlar la temperatura de la muestra. Verificar que la sonda no interfiera con la luz del láser colocando un papel blanco en la trayectoria del laser (después de la cubeta) y buscando las sombras causadas por la sonda.
    Nota: Hay una diferencia de 2-3 ° C entre el registro de la temperatura de la bañera de agua y la temperatura de la muestra.
  • Coloque la cubeta en el agujero del imán, como se muestra en la Figura 4A. La luz láser se propaga horizontalmente a través de la muestra, es desviada por los espejos no polarizante y detectada por un fotodetector.
    Nota: El láser es dirigido hacia abajo, a través de la muestra y volver por el mismo camino para tener en cuenta para efectos de Faraday (es decir, la rotación del plano de polarización de la luz causada por el campo magnético cuando bajando se cancela al regreso hacia fuera en la dirección opuesta).
  • Aplique un flujo de aire constante de aire comprimido a temperatura ambiente y 10000 Pa en la cubeta para evitar la condensación de agua en las paredes celulares, lo que reduciría la intensidad de la señal y aumentar el ruido. Esto es especialmente importante cuando se mide a 5 ° C.
  • Detectar el primer y segundo armónico Equation 10 y Equation 11 de la señal de AC con dos amplificadores lock-in. Auto fase los amplificadores lock-in con la tecla (2) se muestra en la figura 5B y ajustar la sensibilidad como se muestra en la figura 5B (1). Asegúrese de que no hay más de cuatro barras rojas en los amplificadores como se muestra en la figura 5B (3) para evitar la sobrecarga de la señal. Anotar la sensibilidad propia de ambos amplificadores lock-in en el programa Tesla_Magnet_Const_V092 como se muestra en la figura 5 (8). El programa se ofrece como información complementaria.
  • Rampa el campo magnético hasta 5.5 T mediante el suministro de corriente el imán a través del programa Tesla_Magnet_Const_V092 como se muestra en la figura 5 (5).
  • Obtener la birrefringencia Equation 5 usando la ecuación 2, donde se calcula el retraso con
    Equation 13(3)
    donde Equation 14 y Equation 15 son funciones de Bessel de primera clase, con Equation 16 y Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 parcela el retraso en el programa Tesla_Magnet_Const_V092, como se muestra en la figura 5 (4).
    Nota: El retraso del programa no debería utilizarse para calcular la señal de birrefringencia si no funcionan los dos amplificadores lock-in en la misma sensibilidad (ver paso 2.12). Las intensidades armónicas registradas Equation 10 y Equation 11 tiene que ser multiplicado por la sensibilidad de los amplificadores lock-in para obtener las dimensiones correctas. Por otra parte, la señal de birrefringencia medida bajo un campo de imán debe normalizarse al restar la señal de birrefringencia media obtenida en T. 0
  • Controlar señal de birrefringencia de la muestra en constante o el cambio de temperatura (1 ° C/min) mediante la regulación de la temperatura de la bañera de agua conectada a la cubeta que se muestra en la figura 4.
  • Registrar los datos experimentales de relleno en la descripción experimental de la figura 5 (8), proporcionando un nombre de archivo (9) y presionando el botón de "START log" (10).
  • Figure 5
    Figura 5: las ilustraciones de la propia configuración y programa imágenes. A) configuración de PEM: retraso 2,405 rad, longitud de onda 635 nm, frecuencia 50 Hz. White círculos indican qué ajustes para activarse (USR = retraso definido por el usuario, LOC = local modo de operación). B) configuraciones del amplificador Lock-in. La sensibilidad (1) debe seleccionarse antes de cada medición como se requiere en paso 2.11. No debe haber más de cuatro barras rojas en la pantalla (3) para evitar una sobrecarga de la señal. Se produce una sobrecarga cuando el led (1) rojo se enciende, haciendo imposible una medición. Presione el botón de la fase de auto (2) antes de cada medición. C) imágenes del programa Tesla_Magnet_Const_V092 como información complementaria. El programa permite la grabación de todo la señal de salida en función del tiempo y control del campo magnético. La fuerza del campo magnético y la temperatura de la muestra se trazan en (1). El primer y segundo armónico Equation 10 y Equation 11 de la señal AC medida por los dos amplificadores lock-in se trazan en (2). La intensidad de la corriente directa Equation 7 se traza en (3). El retraso se calcula como se describe en el paso 2.13 y traza en (4). La fuerza del campo magnético se encuentra en (5). La medida directa de la temperatura registrada por el termopar tipo K se presenta en (6) y las señales de salida (Equation 23 y Equation 22 ) en (7). Información adicional de la muestra puede introducirse en (8) como la sensibilidad propia de los amplificadores, nombre de la muestra, etcetera. Los datos pueden iniciar sesión y exportados a un archivo .txt en (9). Iniciar y detener la adquisición de datos con el botón de "START log" (10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Representative Results

    La señal de la birrefringencia de una no sacó DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) muestra fue supervisada en un campo de magnético 5.5 T durante un calentamiento y enfriamiento ciclo de 5 a 40 ° C y a una velocidad de 1 ° C/min (figura 6). Los resultados de birrefringencia confirman alineaciones magnéticas alta a 5 ° C con un valor de 1.5 x 10-5, dos veces tan fuerte en cuanto a los sistemas de extrusión divulgados. 6 , 7 , 23 la reducción a cero de la señal de la birrefringencia por encima de la Tm de DMPC a 24 ° C fue causada por la formación de vesículas no alignable. La aparición del movimiento de la fase líquida desordenada provocó importantes cambios en los conjuntos polimoleculares. Estos cambios son termo-reversible. Especies alignable fueron regeneradas en refrigeración por debajo de Tm y la señal de birrefringencia siguió la misma tendencia como en calefacción. Los distintos picos que ocurren alrededor de Tm marcan el reemplazo de las Asambleas alignable no alignable vesículas. 23 la lenta cinética de los cambios moleculares con respecto a la aplicación calefacción y refrigeración de 1 ° C/min explicar por qué no se superposición de los picos. En cambio, ambos picos comenzaron a Tm de DMPC, sugiriendo que los lípidos de la bicapa deben tener un cierto grado de orden a favor de la formación de especies alignable.

    Figure 6
    Figura 6: Señal de birrefringencia en función de la temperatura para un no sacó DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) muestra (rojo) de calefacción y refrigeración (azul) en 1 ° C/min La muestra fue preparada siguiendo los pasos del protocolo 1 a 1.3.5. Las mediciones de birrefringencia se realizaron siguiendo el paso 2 del protocolo. La fuerza del campo magnético fue aumentado hasta 5.5 T y la muestra se mantuvo a 5 °, logrando una señal de birrefringencia de 1.5 x 10-5 antes de continuar con el ciclo de calefacción y refrigeración. La birrefringencia señal reanima a temperaturas superiores a 35 ° C donde ningún alineamiento se observó que la muestra estaba compuesta únicamente de vesículas. En refrigeración, se regeneraron el bicelles y una señal de final de la birrefringencia de 7.2 x 10-6 fue alcanzada de 5,5 T y 5 ° C. La fuerza del campo magnético fue aumentado hasta 0 T, y la muestra se mantuvo a 5 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Una muestra de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) fue hidratado después de la calefacción y refrigeración procedimiento en paso 1.3.4 y posteriormente saca 10 veces a 60 º C a través de filtros de membrana de poros diferentes tamaños, consulte el paso 1.4. A 60 ° C, la mezcla de lípidos se monta en las vesículas, que son formadas por el proceso de extrusión. 16 , 35 , 36 , 37 después de completar la extrusión, los bicelles fueron regenerados por refrigeración a 5 ° C y se midió el diámetro hidrodinámico DH por DLS. La alignability magnética de la bicelles se evaluó a 5 ° C por computación Af con SANS en 8 T y midiendo la señal de la birrefringencia en 5.5 T; Vea la figura 7. La señal de birrefringencia se obtuvo por el campo hasta 5.5 T a 0 T en rampa como se muestra en la Figura 7A. La birrefringencia de pico ocurrió en 5.5 T donde esperaba el mayor grado de alineación según la ecuación 1. El diámetro hidrodinámico DH de la bicelles fue reducido a 220, 190, 106 y 91 nm por extrusiones sucesivas a través de membranas con poros de tamaños de 100, 800, 400 y 200 nm respectivamente. La disminución correspondiente en la alineación magnética fue confirmado por la señal decreciente de birrefringencia y la reducción en absoluto unaf como acercó a cero en figura 7B. Los resultados confirmaron la posibilidad de controlar bicelle tamaño y alineación magnética a través de la confección de las vesículas por extrusión a 60 ° C y enfriamiento a 5 º C.

    Figure 7
    Figura 7: Alineación magnética de una muestra de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) sacada a través de filtros de membrana de diferentes dimensiones del poro. A) Δn′ de señal de birrefringencia en función de la fuerza del campo magnético B cuando rampa hacia arriba y hacia abajo para la muestra sacada a través de poros nm 800. La birrefringencia de pico fue alcanzada en 5.5 T según la ecuación 1. Este valor de la máxima birrefringencia se divulga en B). La misma muestra fue sacada a través de poros nm 400. La alineación magnética fue evaluada por ambas mediciones birrefringencia (cuadrados negros) a 5,5 T (análogamente a lo que se hizo para el paso anterior de la protuberancia en la A) y por el cómputo de los factores de la alineación Af (círculos rojos) en 8 T trazado en función de la diámetro hidrodinámico DH obtenida por las DLS. La alineación magnética se evaluó de manera análoga en la misma muestra sacada con 200 poros nm y una última vez después de la extrusión a través de poros nm 100. Todas las mediciones se realizaron a 5 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    Un relato detallado de cómo las mediciones de la birrefringencia se usaron en combinación con SANS experimentos para evaluar los métodos de generación altamente magnéticamente sensibles Ln3 + quelantes fosfolípidos asambleas es de Isabettini et al. 23 los protocolos de fabricación propuesto también son aplicables para asambleas compuestas de los fosfolípidos más de DPPC y DPPE-DTPA o para aquellos que contienen derivados esteroides químicamente modificados en su bicapa. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 el único requisito es que la muestra se calienta a temperaturas suficientemente altas en pasos 1.3.2, 1.3.3 y 1.3.4 1.4.2. Las temperaturas deben permitir que los lípidos de la bicapa entrar en una fase líquida desordenada, garantizando una hidratación óptima de la regeneración de la película o la muestra de lípido seco. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) asambleas, por ejemplo, necesitan ser calentado por encima de la temperatura de transición de fase de DPPC en 42 ° C, mientras que el sistema análogo de DMPC debe calentarse por encima de 24 ° C. También es necesaria garantizar la formación de vesículas de extrusión que se produce cuando la bicapa lipídica está en un estado desordenado en el paso 1.4 una temperatura suficientemente alta. Los ciclos hielo-deshielo en paso 1.3.2 pueden ser totalmente reemplazados por H & C ciclos. 23 sin embargo, la muestra necesita más tiempo para hidratar completamente la película lipídica con este procedimiento y debe agitarse 20 min cuando a 5 ° C y 2 min cuando a 60 ° C. H adicional & C ciclos son realizados si aún se observan elementos de la película seca de lípidos en las paredes de vidrio del frasco.

    Las Tm3 + quelantes bicelles presentados en el presente Protocolo alinear perpendicularmente a la dirección del campo magnético. Esta dirección de alineación se origina de la susceptibilidad magnética positiva grande de Tm3 +. 11 , 14 otros iones lantánidos como Dy3 + Yb3 + también pueden ser aplicados. 11 , 13 , 19 anisotropy magnético diferentes del Ln3 + ofrece un medio adicional de adaptación de la alineación magnética de la bicelles. Por ejemplo, Dy3 + mejora la susceptibilidad magnética intrínsecamente negativa de los fosfolípidos de la bicapa, lo que resulta en un alto grado de alineación de la bicelles paralela a la dirección del campo magnético. 13 este cambio en la dirección de alineación se detecta por un cambio en el signo de la señal de birrefringencia y los factores de alineación computados de 2D anisotrópico sin patrones. Es importante tener en cuenta que la susceptibilidad magnética no es dictada únicamente por la naturaleza química de la Ln3 + pero por la geometría del quelato del Ln3 +-fosfolípidos complejos. 19 , 38 la susceptibilidad magnética puede diseñarse sintetizando diferentes Ln3 + que contiene fosfolípidos, definiendo la respuesta magnética de los conjuntos resultantes. 38

    Cada muestra es ópticamente diferente dependiendo de la naturaleza de los lípidos constitutivos empleados. Monitoreo de turbidez de la muestra en función de la temperatura es un método complementario para evaluar las transformaciones estructurales inducidas por la temperatura en las Asambleas. Aunque estas mediciones se realizan generalmente en ausencia de un campo magnético en un espectrofotómetro, monitoreo de la intensidad de la corriente directa del láser Equation 7 con la configuración propuesta en el presente documento ofrece la misma información en presencia de un magnético campo. 11 , 16 el DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) las muestras son generalmente menos turbias que su Chol-OH contiene DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (fracción molar 16:4:5:5) equivalentes a 5 ° C. Muestras de agua a 5 ° C no son generalmente alignable en un campo magnético. En la temperatura, ambas muestras mirada transparente ambiente porque el DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) las muestras están en una fase de transición entre bicelles y vesículas y grandes agujeros concéntricos aparecen en el DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (cociente molar 16:4:5:5) bicelles. 11 , 16 , 23 el estado de transición de bicelles a las vesículas en DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) también se acompaña con un aumento en la viscosidad de la muestra a temperatura ambiente. Este cambio de temperatura en la turbidez dificulta elegir la sensibilidad correcta en el paso 2.11. Si la sensibilidad se ajusta demasiado alto en una muestra turbia a 5 ° C, la más transparente naturaleza de la muestra en la calefacción puede causar una sobrecarga de los amplificadores. Por otra parte, las muestras altamente turbias aumentarán considerablemente el relación señal ruido y pueden no ser apto para la medición de la birrefringencia. La luz láser debe ser capaz de ir a través de la muestra con el fin de ser detectado.

    Muestras de extrusión no son siempre más turbios y tienen la tendencia a agregado al almacenamiento a corto plazo en la nevera. Sin embargo, las muestras sensibles magnéticamente se regeneran fácilmente con un H & C ciclo. Muestras no sacó también pueden almacenarse en estado congelado y fácilmente regenerado por H & C ciclos. Sacado muestras se guardan en la nevera y comúnmente medidas en una semana después de la preparación de la muestra. No informe de estudios sobre el almacenamiento prolongado de especies extruidos en un líquido o en un estado congelado. Por lo tanto, la distribución de tamaño de las Asambleas de la protuberancia no puede garantizarse durante un almacenamiento prolongado.

    Análogamente a cualquier sistema de bicelle, estas asambleas planares magnéticamente alignable sólo existen en un rango definido de composición lipídica y la concentración. Alterando las proporciones de lípidos resultará en arquitecturas de montaje diferentes, incluyendo la formación de micelas, cintas y vesículas. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 la concentración de tampón fosfato y pH en paso 1.1.3 desempeña un papel crucial en la conformación de la bicelles y su respuesta magnética. El búfer define las interacciones fisicoquímicas que rigen el entorno hidrófilo que rodea los conjuntos polimoleculares. Menores concentraciones de tampón como resultado en las arquitecturas de montaje diferentes, mientras que concentraciones más elevadas causan muestra agregación y precipitación debido a la proyección de un exceso de carga.Bajo condiciones ácidas con valores de pH entre 3 y 4, las moléculas de ácido carboxílico que sirven como ligandos en la DMPE-DTPA/Ln3 + complejo están protonada. Esto resulta en la destrucción de los conjuntos polimoleculares magnéticamente sensibles, observado por la agregación y precipitación de la muestra. El Ln3 + polimoleculares asambleas magnéticamente sensibles tienen una razonable resistencia a valores de pH más básicos. Sin embargo, DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (proporción molar de 4:1:1) bicelles fueron demostrados para romper en micelas en valores de pH de 12.9. 11 las muestras nunca deben ser expuestas a agua del grifo o de otras sales. Cualquier otro ion se disturba el Ln3 + quelantes proceso o resultado de agregación de las Asambleas debido a la proyección de la carga. Para SANS las mediciones, el tampón está preparado como se describe en el paso 1.1.3 D2O en lugar de ultrapura de H2O. Nota que la lectura del medidor de pH será de 7.0 (correspondiente a un valor pD de 7.4).

    Las transformaciones estructurales que se producen en conjuntos polimoleculares sometidos a un calentamiento y refrigeración ciclo son termo-reversible. Por lo tanto, la señal de final de la birrefringencia en 5 ° C debe ser igual que antes del ciclo de temperatura. 11 , 16 si la señal de la birrefringencia es mayor después del ciclo, la muestra no fue bien regenerada en paso 1.3.4. Esto ocurre comúnmente en las muestras almacenadas por un período prolongado de tiempo. Baja birrefringencia señal después de que el ciclo de temperatura, como se observa en la figura 6 indica un problema en la instalación experimental. Por lo general, la trayectoria de la luz láser fue perturbada por dispersión hacia atrás u otro objeto. Esto es especialmente problemático con la sonda de temperatura directamente en la muestra (ver paso 2.8) que deben colocarse para no interferir en la trayectoria directa de la luz laser. Un camino de luz perturbado provoca una caída en el Equation 7 , una señal ruidosa o picos anormales en las curvas de temperatura de birrefringencia. Por ejemplo, el pico que ocurre en la calefacción a unos 35 ° C en la figura 6 fue causado por la expansión de los tubos de refrigeración por agua en la trayectoria directa de la luz laser. La señal de la birrefringencia puede no ser fiable a partir de ese punto. Aunque la forma general de la curva de enfriamiento era normal, la señal más baja de la birrefringencia en 5 ° C fue causada por la interferencia.

    Los valores de birrefringencia obtenidos siguiendo este Protocolo no son absolutos y se utilizan para comparar las muestras entre sí. Comparación con los valores de la literatura, se requiere una calibración con un sistema de referencia. Por ejemplo, el signo de retardo medido depende de la alineación de la estructura y puede verificarse con tolueno, que tiene una constante del algodón-Mouton de 3,27 × 10−9 T−2. 39 , 40

    La señal de birrefringencia origina cambios en la alineación magnética de la muestra puede desvinculada de la señal causada por los cambios moleculares en la bicapa. Factores de alineación computan de anisotropic SANS 2D patrones obtenidos bajo un campo magnético sólo están influenciados por la alineación de a granel de los conjuntos polimoleculares. Los dos métodos son complementarios y permiten la disociación de las contribuciones a la señal de birrefringencia. La configuración propuesta birrefringencia podría perfeccionarse dividiendo el rayo láser, que permite la monitorización simultánea de las muestras con y sin exposición al campo magnético externo. Los resultados de birrefringencia obtenidos para la muestra en el campo magnético podrían ser normalizados por la señal obtenida para la muestra en 0 T, efectivamente contabilidad para el fondo.

    No se limitan a cuantificar la alineación magnética de bicelles medidas de birrefringencia. Numerosos materiales de suave generan una señal de birrefringencia debido al ordenamiento de su estructura interna. La configuración propuesta permite monitorear la birrefringencia de materiales tales como función de la temperatura con o sin un campo magnético externo. Antraceno organogel fibras, micelas wormlike bajo flujo, celulosa nanocristalinos y fibrillas de amiloide-Fe3O4 son algunos ejemplos cuyo comportamiento de birrefringencia se evaluó con éxito con la configuración propuesta. 29 , 30 , 32 , 41

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    Disclosures

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgments

    Los autores reconocen la Swiss National Science Foundation para la financiación de SMhardBi (proyecto número 200021_150088/1). Se realizaron los experimentos SANS en la fuente de neutrón del spallation suizo SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Suiza. Los autores agradecen con gusto el Dr. Joachim Kohlbrecher para su dirección con los experimentos SANS. La configuración de medida de birrefringencia bajo campos magnéticos altos se inspiró de la configuración existente en el laboratorio magnético de alto campo HFML, Nijmegen, Países Bajos. Agradecemos a Bruno Pfister por su ayuda en el desarrollo de la electrónica de la configuración de la birrefringencia, Jan Corsano y Daniel Kiechl para la construcción de los marcos que fina y fácil alineación del láser y Dr. Bernhard Koller para apoyo técnico continuo.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

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    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

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