Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

Engineering

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Summary

Procedure di fabbricazione per lo ione altamente magneticamente reattivo dei lantanidi chelanti polimolecolari assembly sono presentate. La risposta magnetica è dettata dalle dimensioni di montaggio, che sono su misura per estrusione attraverso membrane nanopore. Alignability magnetica indotta da temperatura cambiamenti strutturali e le assemblee sono monitorati da misurazioni di birifrangenza, una tecnica gratuita per risonanza magnetica nucleare e lo scattering di neutroni piccolo angolo.

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Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

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Abstract

Bicelles sono assembly sintonizzabile discoidale polimolecolari formato da una grande varietà di miscele del lipido. Le applicazioni spaziano da studi strutturali di proteine di membrana di risonanza magnetica nucleare (NMR) agli sviluppi nanotecnologici, compresa la formazione di gel otticamente attivi e magneticamente commutabile. Tali tecnologie richiedono elevato controllo delle dimensioni di montaggio, risposta magnetica e resistenza termica. Miscele di 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfocolina (DMPC) e suoi ioni lantanidi (Ln3 +) chelanti coniugato del fosfolipide, 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfo-etanolamina-dietilenico triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), assemblare in assembly altamente magneticamente reattivo ad esempio DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (rapporto molare 4:1:1) bicelles. Introduzione di colesterolo (Chol-OH) e steroidi derivati in doppio strato si traduce in un altro insieme di assembly che offre proprietà fisico-chimiche uniche. Per una composizione lipidica dato, il alignability magnetico è proporzionale alla dimensione di bicelle. La complessazione di Ln3 + si traduce in risposte magnetiche senza precedenti in termini di direzione sia di grandezza e di allineamento. Il crollo di termo-reversibile del disco-come le strutture in vescicole su riscaldamento permette di sartoria di dimensioni degli assiemi per estrusione attraverso filtri a membrana con pori definiti. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate mediante raffreddamento a 5 ° C, con conseguente montaggio dimensioni definite da precursori della vescicola. Qui, questa procedura di montaggio è spiegata e la alignability magnetica delle assemblee è quantificata mediante misure di birifrangenza sotto un 5,5 campo magnetico T. Il segnale di birifrangenza, proveniente dal bilayer del fosfolipide, ulteriormente consente il monitoraggio di polimolecolari cambiamenti che si verificano in doppio strato. Questa semplice tecnica è complementare agli esperimenti NMR che sono comunemente impiegati per caratterizzare bicelles.

Introduction

Bicelles sono assembly polimolecolari discoidale ottenuti dalle numerose miscele di lipidi. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 essi sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di biomolecole di membrana tramite spettroscopia NMR. 6 , 7 tuttavia, i recenti sforzi mirano a espandere il campo delle possibili applicazioni. 5 , 8 , 9 il sistema di bicelle più studiato è composto da una miscela di 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfocolina (DMPC), che costituiscono la parte piana dell'Assemblea e 1,2-dihexanoyl -sn- glicero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolipide che copre il bordo. 1 , 2 , 3 la geometria molecolare dei fosfolipidi che compongono il bilayer dettare l'architettura della struttura polimolecolari auto-assemblati. 4 , 5 sostituzione DHPC con DMPE-DTPA genera sistemi altamente magneticamente reattivo e sintonizzabile bicelle. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (rapporto molare 4:1:1) bicelles associare con molti più ioni paramagnetici lantanidi (Ln3 +) sulla superficie di doppio strato, conseguente a una risposta magnetica migliorata. 10 inoltre, sostituendo le molecole solubili in acqua di DHPC con3 + consente di DMPE-DTPA/Ln la formazione di diluizione-resistente bicelles. 11

La alignability magnetica di planare polimolecolari assembly è dettata dalla loro energia nel complesso magnetico,

Equation 1(1)

dove B è l'intensità del campo magnetico, Equation 2 il magnetico costante, n il numero di aggregazione e Equation 3 l'anisotropia diamagnetica molecolare suscettibilità dei lipidi che compongono il bilayer. Di conseguenza, la risposta di DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles ai campi magnetici è su misura dal loro formato (aggregazione numero n) e il Δχ di anisotropia diamagnetica molecolare di suscettibilità. Quest'ultima è realizzata prontamente modificando la natura del chelato Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 Introduzione colesterolo (Chol-OH) o altri derivati steroidi in doppio strato offre la possibilità di tuning sia il numero n di aggregato e la Δχ di suscettività magnetica degli assembly. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 per una composizione lipidica determinato, grandi assemblee contengono più lipidi capaci di contribuire alla Emag (più grande aggregazione numero n), con conseguente più regolabile in specie. La dimensione del DMPC/DHPC bicelles, ad esempio, convenzionalmente è controllata tramite l'ottimizzazione la composizione lipidica rapporto totale della concentrazione di o. 20 , 21 , 22 anche se questo è possibile in DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, loro trasformazione termo-reversibile da bicelle a vescicole su riscaldamento offerte aggiunto opzioni di sartoriale. Meccanica significa come estrusione attraverso filtri a membrana permette di modellare delle vescicole. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate sul raffreddamento a 5 ° C e le loro dimensioni sono dettate da precursori della vescicola. 11 qui, ci concentriamo sul potenziale delle procedure di fabbricazione meccanica con DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) come sistemi di riferimento. Il processo funziona Analogamente quando si lavora con altri Ln3 + Tm3 +. L'ampia gamma di possibilità offerte da queste tecniche sono evidenziati in Figura 1 e ampiamente discussa altrove. 23

Figure 1
Figura 1: Panoramica schematica delle procedure di fabbricazione possibile. Studiato magneticamente allineabile Ln3 + chelante polimolecolari assembly sono composti da entrambi DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5). Il film lipidico asciutto è idratato con un tampone fosfato 50 mM ad un valore di pH di 7,4 e la concentrazione dei lipidi totale è di 15 mM. Un'efficace idratazione del film lipidico richiede sia congelare scongelamento cicli (FT) o riscaldamento e raffreddamento cicli (H & C). H & C cicli sono necessari per rigenerare i campioni dopo il gelo ultimo passaggio di scioglimento o per rigenerare i campioni tenuti congelati per un periodo prolungato di tempo, se devono essere usati senza ulteriore estrusione. Questi passaggi sono ampiamente discussa da Isabettini et al. 23 al massimo allineabile polimolecolari assembly vengono raggiunti, offrendo architetture di assembly diverso sulla base della composizione lipidica. La dimensione di bicelle e la alignability magnetica è sintonizzabile per estrusione (Ext) attraverso filtri a membrana nanopore. L'allineamento presentato fattori Af sono stati computati da modelli di dispersione (SANS) 2D angolo piccolo neutrone di un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) campione estruso attraverso 800, 400, 200 o 100 nm pori. SANS misurazioni sono un mezzo complementare di quantificare l'allineamento di bicelle che non verrà trattato in dettaglio nel presente documento. 11 , 16 l'Af varia tra -1 (scattering di neutroni parallela o perpendicolare allineamento di bicelles rispetto alla direzione del campo magnetico) e 0 per scattering isotropo.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La struttura del bicelles è stata studiata estesamente da una vasta gamma di tecniche di caratterizzazione. 13 l'allineamento del bicelles esposti ad un campo magnetico è stato quantificato mediante spettroscopia NMR o esperimenti di scattering (SANS) angolo piccolo neutrone. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 tuttavia, lo spostamento e l'ampliamento dei picchi NMR che si verificano in presenza di Ln3 + sono gravi limitazioni al metodo. 15 , 26 , 27 , 28 sebbene SANS esperimenti non soffrono di questa limitazione, alternativa e tecniche più accessibili sono desiderabili per quantificazione sistematica di allineamento magneticamente indotta degli assembly nella soluzione. Birifrangenza misurazioni sono un'alternativa praticabile e relativamente semplice. Analogamente agli esperimenti NMR, birifrangenza misure rivelano preziose informazioni su riorganizzazioni del lipido e fasi del lipido che si verificano in doppio strato. Inoltre, vengono monitorate trasformazioni geometriche che si verificano nell'assembly polimolecolari con mutevoli condizioni ambientali come la temperatura. 11 , 12 , 13 , 16 Δn′ birifrangenza magneticamente indotta è stato utilizzato per studiare vari tipi di sistemi del fosfolipide. 13 , 29 , 30 misure di birifrangenza basate sulla tecnica della modulazione di fase in un campo magnetico è un metodo praticabile per rilevare l'orientamento del bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 la possibilità di studiare bicelles con Birifrangenza in alti campi magnetici fino a 35 T inoltre è stata dimostrata da Liebi M. et al. 13

Quando la luce polarizzata entra un materiale anisotropo, esso sarà rifratti in un'ondata di ordinaria e straordinaria. 11 le due onde hanno velocità differenti e sono spostate in fase di un δ di ritardo. Il grado di ritardo δ è misurato e convertito in un segnale di birifrangenza Equation 5 per quantificare il grado di anisotropia nel utilizzando materiale

Equation 6(2)

dove λ è la lunghezza d'onda del laser e d è lo spessore del campione. I fosfolipidi sono otticamente anisotropici e loro asse ottico coincide con le loro ascie lungo molecolare, parallele alle code dell'idrocarburo. 11 , 12 nessun ritardo è misurato se i fosfolipidi sono orientati in modo casuale in soluzione. Il ritardo è misurato quando i fosfolipidi sono allineati parallelamente a vicenda. La birifrangenza magneticamente indotta Equation 5 può avere un segno positivo o negativo a seconda dell'orientamento delle molecole nel campo magnetico; vedere la Figura 2. Fosfolipidi allineati parallelamente all'asse x si tradurrà in un negativo Equation 5 , mentre quelli allineati lungo l'asse z, che provocare un positivo Equation 5 . Nessun birifrangenza è osservata quando l'asse ottico coincide con la direzione di propagazione della luce come il fosfolipide allinea parallelo all'asse y.

Figure 2
Figura 2: Allineamento dei fosfolipidi e corrispondente segno della birifrangenza magneticamente indotta Equation 12 . Il segno di quella misurata Equation 12 dipende dall'orientamento del fosfolipide nel campo magnetico. Le linee tratteggiate indicano l'asse ottico della molecola. La luce è polarizzata a 45° e si propaga in direzione y. Il campo magnetico B è nella direzione z. Questa figura è stata modificata da M. Liebi. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel caso di una sospensione colloidale isotropica di bicelles, l'orientamento indotta tramite la disposizione dei fosfolipidi in doppio strato andranno perso, azzerando il δ di ritardo. Il bicelles inoltre deve allineare al fine di orientare i fosfolipidi otticamente attivi in loro strati lipidici, causando un ritardo δ della luce polarizzata. Di conseguenza, la birifrangenza è uno strumento sensibile per quantificare la alignability magnetica di polimolecolari assembly. Bicelles allineato perpendicolarmente al campo magnetico produrrà un positivo Equation 5 , mentre quelli allineati parallelamente produrrà un negativo Equation 5 . Il segno dipende l'allineamento dell'installazione e può essere controllato con un campione di riferimento.

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Protocol

1. procedura di fabbricazione DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) e DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) polimolecolari assembly

  1. Preparazioni preliminari
    1. Lavare tutta la vetreria di vampate di calore una volta con etanolo stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e asciugare con aria compressa.
    2. Produrre 2 soluzioni di riserva distinti 10 mg/mL di DMPC e DMPE-DTPA in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio), una soluzione stock di 10 mM di Chol-OH in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e una soluzione stock di 10 mM di TmCl3 in metanolo.
    3. Preparare un tampone fosfato 50 mM ad un valore di pH di 7,4 mescolando 0,121 g di sodio diidrogeno fosfato diidrato e 0,599 g di anidro di-sodio idrogeno fosfato in 100 mL di ultrapura H2O.
  2. Preparazione del film secco del lipido
    1. Pesare la quantità necessaria di amphiphiles (DMPC, DMPE-DTPA e facoltativamente Chol-OH) e soluzioni di Ln3 + riserva in snap-Coppe di vetro separate da 3 mL con una siringa di vetro 2,5 mL.
      1. Per un volume di campione di 3 mL di DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (rapporto molare 4:1:1, concentrazione lipidica totale di 15 mM), pesare in 3,6435 g di soluzione di riserva DMPC, 1,4731 g di soluzione di riserva DMPE-DTPA e 0,7126 g della soluzione madre3 TmCl.
      2. Per un volume di campione di 3 mL di DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5, concentrazione lipidica totale di 15 mM), pesare in 2,9148 g di soluzione di riserva DMPC, 1,4731 g di soluzione di riserva DMPE-DTPA, 1,0749 g di soluzione di riserva Chol-OH e 0,7126 g di la soluzione di riserva3 TmCl.
        Attenzione: Cloroformio e metanolo sono tossici e volatili a temperatura ambiente. Lavorare sotto una cappa aspirante e prontamente procedere con le misurazioni di massa.
    2. Trasferire il contenuto del snap-tazze su un pallone da 25 mL. Lavare ogni snap-tazza nel pallone fondo tondo con circa 2,5 mL del solvente corrispondente.
    3. Rimuovere il solvente sotto vuoto in un evaporatore rotante a 40 ° C. Impostare la pressione iniziale a 30 000 Pa finché non viene rimossa la maggior parte del solvente. Ridurre la pressione a 100 Pa e a secco il campione in rotazione per un minimo di 2 h. ottenere un film uniforme del lipido secco sulle pareti del pallone di vetro.
    4. Posizionare la pellicola lipidica asciutto per 1 minuto sotto un costante flusso di argon per evitare l'ossidazione del lipido in aria e conservare il campione in freezer prima di reidratazione.
  3. Idratazione del film secco del lipido
    1. Aggiungere 3 mL di tampone fosfato al pallone fondo tondo per raggiungere una concentrazione di lipidi totali di 15 mM.
    2. Effettuare un ciclo di congelamento-scongelamento (FT) immergendo il pallone in rotazione in azoto liquido fino a quando esso è completamente congelato (le fermate di azoto liquido bollente), quindi scaldare indietro fino a 60 ° C posizionando il campione per 5 min in un bagno di acqua, agitando continuamente il pallone favorire il processo di fusione. Applicare 30 s di Vortex prima di ogni ciclo di congelamento quando il campione è liquido per favorire l'idratazione del film lipidico.
      Nota: Nessun film lipidico deve essere visibile sulle pareti muffola dopo il secondo ciclo di scongelamento del congelamento.
    3. 1.3.2 ripetere per un totale di cinque volte. Tappare il recipiente con un tappo per evitare l'evaporazione inutile del buffer fosfato quando il campione è caldo. Il protocollo può essere messo in pausa quando il campione è congelato.
    4. Procedere a due di riscaldamento e raffreddamento (H & C) cicli di stabilizzare il campione che esce l'ultimo passo di congelamento, o di tenere congelati fino a due mesi. Riscaldare il campione a 40 o 60 ° C per DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5), rispettivamente, prima di raffreddamento-5 ° C a 1 ° C/min mantenere il campione 5 min al massimo e minimo temperature del ciclo.
    5. Ora, o determinare il segnale di birifrangenza del campione in un campo magnetico esterno (passaggio 2) o estrudere ulteriormente l'esempio per adattare le dimensioni di bicelle e alignability magnetico (punto 1.4).
      Nota: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) i campioni sono costituiti principalmente da bicelles con un diametro medio di idrodinamico DH di 70 nm come rivelato da una distribuzione numerica ottenuta da misure di dispersione della luce dinamica (DLS) a 5 ° C. In questi esempi contengono anche grandi polimolecolari assemblee con una media di DH di 500 nm, come rivelato da una distribuzione di intensità. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) campioni sono altamente polidispersi dimensioni con distribuzioni di intensità tipica rivelando una media DH di 700 nm, mentre le distribuzioni numero rivelano una popolazione dominata dal più piccolo bicelles nell'intervallo di dimensioni di 200 nm. Distribuzioni di dimensione più dettagliate e immagini di microscopia elettronica di trasmissione cryo di questi campioni sono stati segnalati da Isabettini et al. 23
  4. Estrusione delle assemblee polimolecolari.
    1. Montare l'estrusore come mostrato nella Figura 3. Utilizzare guanti e pinzette con proteggere tubi di silice per la movimentazione. Bagnare la carta da filtro (5) con poche gocce di tampone per consentire un posizionamento ottimale del filtro membrana (6). Assicurarsi che la carta non deve presentare piegature dopo aver posizionato l'o-ring (7) sulla parte superiore.
      Nota: Il processo di estrusione è stato testato su filtri a membrana (6) con un diametro dei pori di 800, 400, 200 e 100 nm; vedere la Figura 7.
    2. Impostare il bagno di acqua a 40 ° C per DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) campioni o 60 ° C per DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) campioni garantire la formazione delle vescicole estrudibili.
    3. Collegare l'estrusore ad una bombola di azoto pressurizzato utilizzando un tubo in PVC ad alta pressione (> 4 MPa) dotato di adattatori serto ed estrudere il materiale liquido attraverso la membrana. 1 MPa di pressione è richiesto solitamente per estrusione attraverso filtri a membrana (6) con un diametro dei pori di 200 nm e sopra. 1.5-2.5 MPa sono necessari per i più piccoli filtri a membrana (6) con un diametro dei pori di 100 nm.
      Nota: Cambiare il filtro a membrana se anormalmente alte pressioni (> 2,5 MPa) sono necessari per estrudere il campione (questo è il primo segno di intasamento).
    4. Aprire il coperchio (10) e inserire l'esempio utilizzando una pipetta di vetro da 2 mL. Chiudere il coperchio (10), quindi aprire la valvola (12) tenendo il tubo di uscita del campione (2). Chiudere la valvola di pressione (12) dopo aver completato il ciclo di estrusione, sfogare e continuare con il successivo ciclo.
      Nota: Non lasciare il campione a contatto troppo a lungo con il vaso rivestito caldo (8) per evitare la perdita eccessiva di campione per evaporazione.
30-60 s è abbastanza tempo per un campione di 3 mL equilibrare nell'estrusore prima di aprire la valvola di pressione (12).
  • Procedere per 10 cicli di estrusione per una dimensione del poro della membrana dato come mostrato nella Figura 3. La maggior parte dei sistemi bicelle sono estrusi 10 volte attraverso le membrane con un diametro dei pori di 200 e un altro 10 volte attraverso membrane con pori del diametro di 100 nm, garantendo la comparabilità del campione.
  • Ora, determinare il segnale di birifrangenza del campione in un campo magnetico esterno (passaggio 2).
  • Figure 3
    Figura 3: laboratorio estrusore usato per preparazioni bicelle e vescicola. L'estrusore è assemblato dal basso fino: Monte (1), (2) campione raccolta spazio con un tubo di plastica uscita 2,4 mm (diametro interno) e o-ring, (3) e (4) grandi e piccole mesh stabilizzante, (5) carta da filtro, filtri a membrana (6), (7) o-ring, la nave (8) rivestita, (9. ) copertura con coperchio (10), viti a farfalla (11), connessione di aspirazione e pressione, valvola di pressione (12) superiore. Uno schizzo dell'estrusore assemblato è mostrato di destra-mano-lato. L'azoto (N2) è fornita da un recipiente a pressione e il recipiente rivestito (9) è collegato ad un bagno di acqua per controllo della temperatura. Il campione subisce 10 cicli di estrusione per qualsiasi diametro dei pori di membrana determinato filtro (percorso di esempio visualizzato in blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    2. misure birifrangenza di DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) e DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) polimolecolari assembly.

    1. Costruire e collegare il programma di installazione di birifrangenza come mostrato nella Figura 4 e fornire alimentazione ai rispettivi elementi elettronici. Non collocare il PEM, il campione e il secondo polarizzatore nel percorso del laser in questa fase. Evitare la luce laser retro-sparsi di rilevazione mediante la copertura di superfici riflettenti, ad esempio supporti specchio di alluminio, con la carta nera.
    2. Regolare gli specchi per massimizzare l'intensità del laser al rivelatore, che è rappresentato dall'intensità della corrente continua Equation 7 ottenuti dal filtro passa-basso in Figura 4B.
      Attenzione: Indossare appropriati occhiali di protezione quando si regolano gli specchi e consultarsi con un istruttore di sicurezza laser se manipolando i laser per la prima volta.
    3. Girare il primo polarizzatore lineare incrociato (tenuto perpendicolarmente al fascio laser incidente) per massimizzare la Equation 7 .

    Figure 4
    Figura 4: rappresentazione schematica del programma di installazione di birifrangenza e connessioni per i segnali ottici. A) un elettromagnete superconduttore fornisce un 5,5 campo magnetico T. La luce da un diodo laser a 635 nm è polarizzata da due polarizzatori incrociati. Un modulatore fotoelastica PEM-90 funziona a 50 KHz con un'ampiezza0 di 2,405 rad e collocato tra i due polarizzatori. L'esempio si trova nel magnete tra il PEM e il secondo polarizzatore. Specchi non-polarizzazione guida la luce attraverso i diversi elementi e infine viene rilevato da un rivelatore di foto. La prima e la seconda armonica Equation 10 e Equation 11 del segnale AC sono monitorati, permettendo il calcolo del segnale birifrangenza dando informazioni sulla alignability magnetica del Ln3 + chelanti polimolecolari assembly. La provetta del campione è collegata ad un bagno di acqua esterno per controllo di temperatura (blu). La temperatura del campione è monitorata con una sonda di temperatura (rossa). B) il segnale del rivelatore di foto in un secondo filtro di passa-basso ordine Sallen-Key (24 alimentazione V AC) con una frequenza di cut-off di 360 Hz attraverso un ± 12 V DC braded cavo di alimentazione (3). Il filtro passa-basso estrae la componente DC Equation 7 e lo consegna all'interfaccia PC (4) attraverso un cavo di BNC 50 Ω. Il segnale del rivelatore di foto viene consegnato ai due amplificatori lock-in (che estrarre la prima e la seconda armonica Equation 10 e Equation 11 ) attraverso un cavo Ω BNC 50 (1) & (2). Le intensità armoniche vengono rilevate da un rilevamento di fase sensibile. Di conseguenza, il segnale PEM è utilizzato come segnale di riferimento per gli amplificatori lock-in (1f-uscita del PEM nel primo lock-in amplifier e 2f-uscita nel secondo, collegata con BNC 50 cavi Ω). I segnali in uscita vengono consegnati all'unità di interfaccia PC tramite cavi di BNC 50 Ω. Unità di acquisizione analogica cFP-AI-110 e cFP-CB-1 digitalizzare il segnale che viene trasferito al computer tramite un cavo RS 232 per il monitoraggio. La sonda di temperatura tipo K è anche collegata all'unità di interfaccia PC dove acquisizione analogica unità cFP-CB-3 e cFP-TC-120 digitalizzare il segnale prima di trasferirla al computer tramite un cavo RS 232 per il monitoraggio. C) foto del setup schematico presentato in elementi di B. chiave vengono identificati con i numeri corrispondenti da 1 a 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    1. Posizionare il secondo polarizzatore lineare incrociato perpendicolari al fascio laser incidente, come mostrato in Figura 4A. Ridurre al minimo la Equation 7 impostando il polarizzatore secondo un'angolazione di 90° rispetto al primo.
    2. Posto il modulatore fotoelastica (PEM) a 0° tra i due ha attraversato polarizzatori lineari e perpendicolare al fascio laser incidente come mostrato in Figura 4A. Regolare il PEM ad una frequenza di 50 kHz e ampiezza A0 a 2,405 rad come mostrato in Figura 5A. In questo modo il componente DC indipendente di birifrangenza e aumenta la Equation 7 .
      Nota: L'asse ottico del PEM può essere sintonizzata da pochi gradi di mantenere una costante Equation 7 in aria prima di qualsiasi campione di misura.
    3. Attendere 1 ora dopo aver acceso il laser e apparecchiature elettroniche per stabilizzare il segnale.
    Dopo l'auto-eliminazione graduale degli amplificatori lock-in rimane costante, il segnale è stabile.
  • Il campione viene posto in una cuvetta di quarzo a temperatura controllata con una lunghezza di percorso di 10 mm e collegarlo ad un bagno di acqua esterno inizialmente impostato a 5 ° C.
  • Posizionare una 0,5 mm spessore termocoppia K (sonda di temperatura) direttamente nel campione per monitorare la temperatura del campione. Verificare che la sonda non interferisca con la luce laser posizionando un libro bianco nel percorso del laser (dopo la cuvetta) e cercando le ombre causate dalla sonda.
    Nota: C'è una differenza di 2-3 ° C tra la registrazione di temperatura del bagno d'acqua e la temperatura del campione.
  • Disponga la provetta nel foro del magnete, come mostrato in Figura 4A. La luce laser si propaga orizzontalmente attraverso il campione, è deviata da specchi di non-polarizzazione e rilevata da un fotorilevatore.
    Nota: Il laser è diretto verso il basso, attraverso l'esempio ed eseguire il backup lo stesso percorso per tenere conto degli effetti di Faraday (cioè la rotazione del piano di polarizzazione della luce causata dal campo magnetico quando scendendo viene annullata quando uscendo in direzione opposta).
  • Applicare un flusso costante di aria di aria compressa a temperatura ambiente e 10000 Pa sulla cuvetta per evitare la condensazione dell'acqua sulle pareti della cella, che potrebbe ridurre l'intensità del segnale e aumentare il rumore. Ciò è particolarmente importante quando si misura a 5 ° C.
  • Rilevare la prima e la seconda armonica Equation 10 e Equation 11 del segnale AC con due amplificatori lock-in. Auto l'amplificatori lock-in di fase premendo il pulsante (2) mostrato in figura 5B e regolare la sensibilità, come mostrato in figura 5B (1). Assicurarsi che non ci sono più di quattro barre rosse sugli amplificatori come mostrato in figura 5B (3) per evitare il sovraccarico del segnale. Annotare la sensibilità autonomo per entrambi amplificatori lock-nel programma Tesla_Magnet_Const_V092 come mostrato in Figura 5 (8). Il programma è fornito come informazioni supplementari.
  • Rampa del campo magnetico fino a 5.5 T fornendo corrente al magnete attraverso il programma Tesla_Magnet_Const_V092 come mostrato in Figura 5 (5).
  • Ottenere la birifrangenza Equation 5 utilizzando l'equazione 2, dove il ritardo è calcolato con
    Equation 13(3)
    dove Equation 14 e Equation 15 sono funzioni di Bessel del primo tipo, con Equation 16 e Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 trama il ritardo nel programma Tesla_Magnet_Const_V092, come mostrato in Figura 5 (4).
    Nota: Il ritardo previsto dal programma non dovrebbe essere utilizzato per calcolare il segnale di birifrangenza se i due amplificatori lock-in non sono operativi presso la stessa sensibilità (Vedi punto 2.12). Le intensità armoniche connesso Equation 10 e Equation 11 devono essere moltiplicate per la sensibilità degli amplificatori lock-in per ottenere le dimensioni corrette. Inoltre, il segnale di birifrangenza misurato sotto un campo magnetico dovrà essere normalizzato sottraendo il segnale di birifrangenza medio ottenuto a t 0.
  • Monitorare il segnale birifrangenza del campione costante o la variazione di temperatura (1 ° C/min) regolando la temperatura del bagno d'acqua collegato alla cuvetta illustrata nella Figura 4.
  • Registrare i dati sperimentali di riempimento nella descrizione sperimentale in Figura 5 (8), fornendo un nome di file (9) e premendo il pulsante "START log" (10).
  • Figure 5
    Figura 5: illustrazioni delle impostazioni autonomo e programma screenshot. A) impostazioni PEM: ritardo 2,405 rad, lunghezza d'onda 635 nm, frequenza 50 Hz. White cerchi indicano quali impostazioni deve essere attivato (USR = ritardo definito dall'utente, LOC = funzionamento in modalità locale). B) impostazioni amplificatore Lock-in. La sensibilità (1) deve essere selezionato prima di ogni misurazione come richiesto al punto 2.11. Non dovrebbero esserci più di quattro barre rosse sul display (3) per evitare un sovraccarico del segnale. Quando si accende il led (1) rosso, rendendo impossibile una misurazione, si verifica un sovraccarico. Premere il pulsante di fase di auto (2) prima di ogni misurazione. C) screenshot del programma Tesla_Magnet_Const_V092 fornito come informazioni supplementari. Il programma permette il controllo del campo magnetico e la registrazione di tutto il segnale uscite come funzione del tempo. Il campo magnetico e la temperatura del campione vengono tracciate in (1). La prima e la seconda armonica Equation 10 e Equation 11 del segnale AC misurato dagli amplificatori lock-in due tracciati in (2). L'intensità della corrente continua Equation 7 viene tracciata in (3). Il ritardo è calcolato come descritto al punto 2.13 e tracciato in (4). L'intensità del campo magnetico è impostato in (5). La misura diretta della temperatura registrata dalla termocoppia tipo K è presentata in (6) e i segnali di uscita (Equation 23 e Equation 22 ) (7). Informazioni di esempio aggiuntivi possono essere inserite in (8) come la sensibilità autonomo del nome esempio, amplificatori, ecc. I dati possono essere registrati ed esportati in un file. txt fornito (9). Avviare e arrestare l'acquisizione di dati con il pulsante "START log" (10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Representative Results

    Il segnale di birifrangenza di una non-estruso DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) campione è stato monitorato sotto un 5,5 campo magnetico T durante un riscaldamento e raffreddamento da 5 a 40 ° C e ritorno a un tasso di 1 ° C/min (Figura 6). I risultati di birifrangenza confermano alti allineamenti magnetici a 5 ° C con un valore di 1.5 x 10-5, due volte più forte per quanto riguarda i sistemi di estrusi segnalati. 6 , 7 , 23 l'azzeramento del segnale birifrangenza sopra i Tm di DMPC a 24 ° C è stata causata dalla formazione di vescicole non regolabile. L'aspetto di movimento della fase liquida disordinata innescato importanti riorganizzazioni negli assembly polimolecolari. Queste riorganizzazioni sono termo-reversibile. Regolabile in specie sono stati rigenerati sul raffreddamento inferiore a Tm e il segnale di birifrangenza seguito lo stesso andamento come il riscaldamento. Picchi distinti che si verificano intorno a Tm per contrassegnare la sostituzione degli assembly regolabile in vescicole non regolabile. 23 la cinetica lenta dei riarrangiamenti molecolari per quanto riguarda il riscaldamento applicato e raffreddamento di 1 ° C/min spiegare perché le cime non sono stati sovrapposti. Invece, due cime ha iniziato ai Tm di DMPC, suggerendo che i lipidi del doppio strato devono avere un certo grado di ordine per favorire la formazione di specie regolabile.

    Figure 6
    Figura 6: Segnale di birifrangenza in funzione della temperatura per un non-estruso DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) campione (rosso) di riscaldamento e raffreddamento (blu) a 1 ° C/min Il campione è stato preparato seguendo i passi di protocollo 1 a 1.3.5. Le misurazioni di birifrangenza sono stati condotti seguendo il passo del protocollo 2. L'intensità del campo magnetico è stato rampa fino a 5.5 T e il campione è stato mantenuto a 5 °, ottenendo un segnale di birifrangenza di 1.5 x 10-5 prima di procedere con il ciclo di riscaldamento e raffreddamento. La birifrangenza segnale rimane neutrale a temperature superiori a 35 ° C dove nessun allineamento è stato osservato come il campione era composto esclusivamente di vescicole. Sul raffreddamento, il bicelles sono stati rigenerati e un segnale di birifrangenza finale di 7,2 x 10-6 è stato realizzato a 5.5 T e 5 ° C. L'intensità del campo magnetico è stato rampa fino a 0 T ed il campione è stato mantenuto a 5 ° C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Un campione di DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) è stato idratato dopo il riscaldamento e procedura di raffreddamento nel passaggio 1.3.4 e successivamente estruso 10 volte a 60 ° C attraverso filtri a membrana di differente porosità, vedi punto 1.4. A 60 ° C, la miscela di lipidi assembla in vescicole, che sono a forma di processo di estrusione. 16 , 35 , 36 , 37 dopo aver completato l'estrusione, il bicelles sono stati rigenerati da un raffreddamento a 5 ° C e il diametro idrodinamico DH è stato misurato da liste di distribuzione. La alignability magnetica della bicelles è stata valutata a 5 ° C, calcolando Af con SANS a 8 T e misurando il segnale di birifrangenza a 5,5 T; vedere la Figura 7. Il segnale di birifrangenza è stato ottenuto dalla rampa il campo fino a 5,5 T e tornare giù 0 T, come mostrato nella figura 7A. La birifrangenza di picco si è verificato a 5,5 T dove era previsto il più alto grado di allineamento secondo l'equazione 1. Il diametro idrodinamico DH della bicelles è stata ridotta a 220, 190, 106 e 91 nm di estrusioni successive attraverso membrane con pori di 800, 400, 200 e 100 nm rispettivamente. La corrispondente diminuzione allineamento magnetico è stata confermata tramite il segnale di birifrangenza decrescente e la riduzione in assoluto unaf come si è avvicinato zero in figura 7B. I risultati hanno confermato la possibilità di controllare bicelle dimensione e l'allineamento magnetico attraverso sartoria delle vescicole di estrusione a 60 ° C e raffreddamento torna a 5 ° C.

    Figure 7
    Figura 7: Allineamento magnetico di un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) campione estruso attraverso filtri a membrana di varie dimensioni dei pori. A) Δn′ segnale Birifrangenza in funzione dell'intensità del campo magnetico B quando rampa su e giù per il campione estruso attraverso 800 nm pori. La birifrangenza di picco è stato raggiunto a 5,5 T conformemente all'equazione 1. Questo valore di massima birifrangenza è segnalato B). Lo stesso campione è stato estruso attraverso 400 nm pori. L'allineamento magnetico è stata valutata mediante entrambe misure di birifrangenza (quadrati neri) a 5.5 T (analogamente a quanto fatto per il precedente passaggio di estrusione nel A) e dal calcolo dei fattori di allineamento unf (cerchi rossi) a 8 T tracciata come una funzione dei diametro idrodinamico DH ottenuti da DLS. L'allineamento magnetico è stata valutata Analogamente sullo stesso campione estruso attraverso 200 nm i pori e un'ultima volta dopo estrusione attraverso 100 nm pori. Tutte le misurazioni sono state eseguite a 5 ° C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Un resoconto dettagliato di come birifrangenza misure sono state usate in combinazione con SANS esperimenti per valutare i metodi per la generazione altamente magneticamente reattivo Ln3 + chelanti fosfolipidi assembly è in Isabettini et al. 23 i protocolli di fabbricazione proposto sono anche applicabili per gli assembly composti dei fosfolipidi DPPC e DPPE-DTPA più lunghi o per quelli contenenti derivati steroidi chimicamente derivati dal loro doppio strato. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 l'unico requisito è che il campione viene riscaldato a temperature sufficientemente alte in passi 1.3.2, 1.3.3 e 1.3.4 1.4.2. Le temperature devono consentire i lipidi di doppio strato entrare in una fase liquida disordinata, garantendo un'idratazione ottimale della rigenerazione del lipido asciutto pellicola o campione. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) gli assembly, ad esempio, devono essere riscaldati a temperature superiori alla temperatura di transizione di fase di DPPC a 42 ° C, mentre il sistema basato su DMPC analogo deve essere riscaldato sopra i 24 ° C. È anche necessaria garantire la formazione di vescicole estrudibili che si verificano quando il doppio strato lipidico è in uno stato disordinato nel passaggio 1.4 una temperatura sufficientemente elevata. I cicli di congelamento-scongelamento nel passaggio 1.3.2 possono essere completamente sostituiti da H & cicli C. 23 tuttavia, il campione ha bisogno di più tempo per idratare completamente il film lipidico con questa procedura e dovrà essere agitati con vortex 20 min quando a 5 ° C e 2 min a 60 ° C. Altre H & C cicli siano effettuati se gli elementi del film secco del lipido sono ancora osservati sulle pareti di vetro del pallone.

    Il bicelles chelante del3 + di Tm ha presentato in questo protocollo allineare perpendicolarmente alla direzione del campo magnetico. Questa direzione di allineamento proviene da grande suscettività magnetica positiva di Tm3 +. 11 , 14 altri ioni lantanidi come Dy3 + e Yb3 + possono anche essere applicati. 11 , 13 , 19 l'anisotropia magnetica differente del Ln3 + offre mezzi supplementari di sartoria l'allineamento magnetico della bicelles. Ad esempio, Dy3 + aumenta la predisposizione magnetica intrinsecamente negativa dei fosfolipidi doppio strato, conseguente a un alto grado di allineamento il bicelles parallelo alla direzione del campo magnetico. 13 questo cambiamento nella direzione di allineamento viene rilevato da un cambiamento nel segno della sia il segnale di birifrangenza e i fattori di allineamento calcolati da 2D anisotropo SANS modelli. È importante notare che la suscettività magnetica non è esclusivamente dettata dalla natura chimica del Ln3 + ma dalla geometria chelata del Ln3 +-complesso del fosfolipide. 19 , 38 la suscettività magnetica può essere costruita mediante la sintesi di diversi Ln3 + chelanti del fosfolipide idrofobiche, definendo la risposta magnetica degli assembly risultante. 38

    Ogni campione è otticamente diversi a seconda della natura dei lipidi che costituiscono impiegato. Monitoraggio di torbidità del campione in funzione della temperatura è un metodo complementare per valutare la temperatura-indotto trasformazioni strutturali negli assembly. Anche se queste misure sono solitamente condotte in assenza di un campo magnetico in uno spettrofotometro, monitoraggio dell'intensità di corrente diretta del laser Equation 7 con il programma di installazione qui proposto offre le stesse informazioni in presenza di un magnetico campo. 11 , 16 the DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) i campioni sono di solito meno torbidi più Chol-OH contenente DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) controparti a 5 ° C. Campioni di acqua a 5 ° C di somiglianza non sono generalmente regolabile in un campo magnetico. At camera temperatura, entrambi campioni sguardo trasparente perché la DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) i campioni sono in una fase di transizione tra bicelles e vescicole e grandi fori concentrici appaiono nella DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + bicelles (rapporto molare 16:4:5:5). 11 , 16 , 23 dello stato di transizione del bicelles alle vescicole in DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) è anche accompagnata da un aumento nella viscosità del campione a temperatura ambiente. Questo cambiamento di temperatura-dipendente di torbidità rende difficile scegliere la giusta sensibilità al punto 2.11. Se la sensibilità è regolata troppo alta su un campione torbido a 5 ° C, la natura più trasparente del campione il riscaldamento può causare un sovraccarico degli amplificatori. Inoltre, campioni molto torbidi aumenteranno notevolmente il rapporto segnale rumore e potrebbero non essere adatti per misure di birifrangenza. La luce laser deve essere in grado di passare attraverso il campione per essere rilevato.

    Campioni non-estruso sono sempre più torbido e hanno la tendenza ad aggregare durante la conservazione a breve termine in frigo. Tuttavia, i campioni magneticamente sensible a reagire prontamente vengono rigenerati con una H & ciclo C. Campioni non-estruso possono anche essere conservati allo stato congelato e prontamente rigenerato di H & cicli C. Estrusi campioni sono conservati in frigorifero e comunemente misurati in una settimana dopo la preparazione del campione. Nessun rapporto di studi sulla conservazione prolungata di specie estruso in un liquido o un stato congelato. Pertanto, la distribuzione delle dimensioni delle assemblee ottenuti dall'estrusione non può essere garantita nel corso di una conservazione prolungata.

    Analogamente a qualsiasi sistema di bicelle, questi assembly planari magneticamente allineabile esistono solo in un intervallo definito della composizione lipidica e concentrazione. Alterando i rapporti del lipido si tradurrà in architetture di assembly diverso, compresa la formazione di micelle, nastri e vescicole. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 la concentrazione di tampone fosfato e pH nel passaggio 1.1.3 Gioca un ruolo fondamentale nel plasmare il bicelles e la loro risposta magnetica. Il buffer definisce le interazioni fisico-chimiche che regolano l'ambiente idrofilo che circonda gli assembly polimolecolari. Le concentrazioni più basse di buffer causare architetture assembly diverso, mentre le più alte concentrazioni causano campione aggregazione e precipitazione a causa di uno screening di carica in eccesso.In condizioni acide con valori di pH tra 3 e 4, le moiety acido carbossilico che serve come ligandi DMPE-DTPA/Ln3 + complessi sono protonata. Questo provoca la distruzione delle assemblee polimolecolari magneticamente reattivo, osservati da aggregazione e precipitazione nel campione. I magneticamente reattivo Ln3 + polimolecolari assembly hanno una ragionevole resistenza verso valori di pH più di base. Tuttavia, DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) bicelles sono stati indicati per rompere in micelle a valori di pH di 12,9. 11 i campioni mai devono essere esposto all'acqua di rubinetto o altri sali. Qualsiasi altro ione sarà disturbare la Ln3 + processo di chelatazione o provocare aggregazione degli assembly dovuto la selezione di carica. Per SANS misurazioni, il buffer viene preparato come descritto nel passaggio 1.1.3 D2O invece ultrapura H2O. nota che la lettura del tester di pH sarà 7.0 (corrispondente a un valore di pD 7.4).

    Le trasformazioni strutturali che si verificano negli assembly polimolecolari soggette a un riscaldamento e raffreddamento sono termo-reversibile. Pertanto, il segnale di birifrangenza finale a 5 ° C dovrebbe essere lo stesso come prima del ciclo di temperatura. 11 , 16 se il segnale di birifrangenza è più alto dopo il ciclo, il campione non è stato correttamente rigenerato nel passaggio 1.3.4. Ciò si verifica comunemente in campioni conservati per un periodo prolungato di tempo. Un segnale di birifrangenza inferiore dopo il ciclo di temperatura come osservato nella Figura 6 indica un problema nel setup sperimentale. Più comunemente, il percorso della luce laser è stato disturbato da back scattering o un altro oggetto. Questo è particolarmente problematico con la sonda di temperatura inserita direttamente nel campione (Vedi punto 2.8) che dovrebbero essere collocati in modo da non interferire con il percorso diretto della luce laser. Un percorso di luce disturbato causa una caduta nella Equation 7 , un segnale rumoroso, e/o picchi anormali nelle curve birifrangenza-temperatura. Ad esempio, il picco che si verificano su riscaldamento a circa 35 ° C nella Figura 6 è stato causato dall'espansione dei tubi raffreddamento ad acqua nel percorso diretto della luce laser. Il segnale di birifrangenza potrebbe non essere attendibile da quel punto in poi. Anche se la forma generale della curva di raffreddamento era normale, il segnale di birifrangenza inferiore ottenuto a 5 ° C è stato causato tramite l'interferenza.

    I valori di birifrangenza ottenuti dal seguire questo protocollo non sono assoluti e vengono utilizzati per confrontare campioni tra di loro. Per il confronto con i valori della letteratura, è necessaria una calibrazione con un sistema di riferimento. Ad esempio, il segno del ritardo misurato dipende l'allineamento della messa a punto e può essere controllato con toluene, che ha una costante di cotone-Mouton di 3.27 × 10− 9 T− 2. 39 , 40

    Il segnale di birifrangenza proveniente da cambiamenti nell'allineamento magnetico del campione può essere disaccoppiato dal segnale causato da riarrangiamenti molecolari in doppio strato. Fattori di allineamento calcolato da anisotropo SANS 2D modelli ottenuti nell'ambito di un campo magnetico sono influenzati solo mediante l'allineamento di massa degli assembly polimolecolari. I due metodi sono complementari e permettono di disaccoppiamento dei contributi per il segnale di birifrangenza. Il programma di installazione di birifrangenza proposto potrebbe essere perfezionato suddividendo il raggio laser, che consente il monitoraggio simultaneo di campioni con e senza esposizione al campo magnetico esterno. I risultati di birifrangenza ottenuti per il campione nel campo magnetico potrebbero essere normalizzati tramite il segnale ottenuto per il campione a 0 T, efficacemente contabilità per lo sfondo.

    Misurazioni di birifrangenza non sono limitati a quantificare l'allineamento magnetico di bicelles. Soft-materiali numerosi generano un segnale di birifrangenza a causa dell'ordine della loro struttura interna. L'impostazione proposta permette di monitorare la birifrangenza di tali materiali in funzione della temperatura con o senza un campo magnetico esterno. Antracene organogel fibre, wormlike micelle sotto flusso, nanocristallino cellulosa e fibrille di amiloide-Fe3O4 sono alcuni esempi in cui comportamento birifrangenza è stata valutata con successo con il programma di installazione proposta. 29 , 30 , 32 , 41

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    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Acknowledgments

    Gli autori riconoscono la Swiss National Science Foundation per finanziamento SMhardBi (progetto numero 200021_150088/1). I SANS esperimenti sono stati eseguiti presso la sorgente di neutroni di spallazione svizzero SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Svizzera. Gli autori ringraziano calorosamente il Dr. Joachim Kohlbrecher per la sua guida con gli esperimenti SANS. Il setup di misura birifrangenza sotto alti campi magnetici è stato ispirato dal programma di installazione esistente presso il laboratorio di magnetico ad alto campo HFML, Nijmegen, Paesi Bassi. Ringraziamo Bruno Pfister per il suo aiuto nello sviluppo dell'elettronica del setup birifrangenza, Jan Corsano e Daniel Kiechl per la costruzione dei quadri permettendo bene e facile allineamento del laser e Dr. Bernhard Koller per supporto tecnico continuo.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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